CN103392607A - 微型观赏红叶石楠叶片离体培养方法 - Google Patents
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Abstract
微型观赏红叶石楠叶片离体培养方法，采用多年生微型观赏红叶石楠当年生嫩叶片为外植体，经消毒灭菌后，接种于诱导愈伤组织培养基中，先置于黑暗条件下10-15天，再置于普通日光灯下，每日光照15小时，温度20-25℃、湿度50％-60％，培养48天，诱导形成愈伤组织；将形成的愈伤组织，剪切，转接于经消毒分化增殖培养基中，进行增殖培养，不断增殖，将增殖的试管芽苗剪切后接种于经消毒壮苗培养基中，进行壮苗培养，30天后去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-4片叶片，接种于经消毒的生根培养基中，进行生根培养8-10天，取出清洗，移栽到含有泥炭和黄心土体积比为泥炭：黄心土＝3∶2的基质中，15天后生根成活，生根率达96％以上。
Description
技术领域
本发明涉及植物培养组织进行快速繁殖的方法，具体为微型观赏红叶石楠叶片为外植体的组织培养方法。
背景技术
微型观赏红叶石楠(Photinia lochengensis Yü)为常绿灌木或小乔木，是红叶石楠中一个矮生、小叶的优良变异品种。它具备的优势：1)耐寒性好，耐最低温度-20℃，能在北京以南地区正常生长，较其它红叶石楠品种耐寒性更好；2)在春季直到5月中下旬，嫩枝、新叶均呈鲜红亮丽色，9月下旬秋叶萌发再次呈鲜红色，与其他红叶石楠品种比，红叶期更长，色泽鲜亮，枝叶密集而细小，萌芽能力强，其株型较矮小，分枝力强，观赏效果较好；3)生长速度适中，但较其他品种慢，能广泛用于色块和绿蓠，枝干细嫩，株型紧凑，可以减少修剪次数降低用工成本。国内外学者已经开展了扦插、以芽为外植体的组培快繁研究。在现有繁殖技术中，组织培养的方法已有报道，但报道中研究采用当年生嫩枝的芽为外植体的芽生芽方式进行组培繁殖，使用外植体多，增殖周期较长，增殖系数偏低，繁殖的效率不高等问题。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明目的在于提供一种适合微型观赏红叶石楠叶片为外植体的组织培养方法，可以节省外植体的使用量，同时进行愈伤组织诱导分化方式培养，产生的不定芽更多，繁殖系数更高，可以大大提高离体培养的效率。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
微型观赏红叶石楠叶片离体培养方法，按下列步骤进行：
(1)准备基本培养基，有2种。
一种是诱导愈伤组织形成的培养基，每升基本培养基中含有：硝酸钾1520-1900mg，硝酸铵1320-1650mg，磷酸二氢钾136-170mg，硫酸镁296-370mg，二水氯化钙440mg，碘化钾0.83mg，硼酸6.2mg，四水硫酸锰22.3mg，七水硫酸锌8.6mg，二水钼酸钠0.25mg，五水硫酸铜0.025mg，氯化钴0.025mg，七水硫酸亚铁27.8mg，乙二胺四乙酸钠37.3mg，维生素B10.1mg，维生素B60.5mg，VB50.5mg，甘氨酸2.0mg，肌醇100mg，蔗糖30000mg，卡拉胶6500mg。
另一种是除了诱导愈伤组织形成培养外的分化增殖培养、壮苗培养、生根培养的培养基，每升基本培养基中含有：四水硝酸钙371-556mg，硝酸铵268-400mg，硫酸钾600-990mg，七水硫酸镁248-370mg，磷酸二氢钾115-170mg，二水氯化钙72-96mg，四水硫酸锰22.4mg，七水硫酸锌8.6mg，硼酸6.2mg，五水硫酸铜0.25mg，二水钼酸钠0.25mg，七水硫酸亚铁34.1mg，乙二胺四乙酸钠46.6mg，维生素B11.0mg，维生素B60.5mg，VB50.5mg，甘氨酸2.0mg，肌醇100mg，蔗糖20000mg，卡拉胶6500mg。
(2)外植体的接种
采用经选育的微型观赏红叶石楠当年生嫩叶为外植体，经70％酒精消毒20秒，再用0.1％的升汞溶液消毒8-10分钟，用无菌水冲洗3-5次，作为外植体进行培养；
(3)愈伤组织诱导培养
在超净的工作台上，无菌条件下，将外植体接种在经消毒的含有诱导愈伤组织形成的培养基的三角瓶中，先将其置于黑暗条件下10-15天后，再置于普通日光灯为光源、光照强度为1500-20001x下，每日光照15小时，温度20-25℃、湿度为50％-60％，培养48天，形成愈伤组织，
所述的诱导愈伤产生的培养基由以下重量含量的原料组成：
每升基本培养基含：
玉米素(ZT)0.5-1.0毫克；
6-苄基嘌呤(BA)0.5-1.0毫克；
α-萘乙酸(NAA)0.1-0.2毫克；
2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5-1.0毫克；
(4)分化增殖培养
将上述(3)步中形成的愈伤组织，剪切，转接于经消毒的含有分化增殖培养基的三角瓶中，进行增殖培养，不断增殖，视繁殖生产需要达2000瓶进入下一步，
所述的分化增殖培养基为：
每升基本培养基含：
玉米素(ZT)1.0-2.0毫克；
6-苄基嘌呤1.0-2.0毫克；
α-萘乙酸(NAA)0.05-0.1毫克；
(5)壮苗培养
将(4)中培养的试管芽苗，剪切，接种于经消毒的含有壮苗培养基的三角瓶中，进行壮苗培养，30天后进入下一步。
所述的壮苗培养基为：
每升基本培养基含：
玉米素(ZT)0.5-1.0毫克、
6-苄基嘌呤0.5-1.0毫克、
α-萘乙酸(NAA)0.1-0.2毫克。
(6)生根培养
将(5)步中的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-4片叶片，接种于经消毒的含有生根培养基的三角瓶中，进行生根培养8-10天。
所述的生根培养基为：
每升基本培养基含：
α-萘乙酸(NAA)0.3-0.5毫克；
吲哚乙酸(IAA)0.4-0.8毫克；
柠檬酸(Citric acid)50-100毫克。
(7)移栽
将(6)步生长的带根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭和黄心土体积比为泥炭：黄心土＝1∶1的基质中，浇透水，保持温度28℃左右，相对湿度85％以上，前10天遮光70％，后逐渐见光，15天后生根成活，生根率达96％以上，50天左右，全光照。
上述微型观赏红叶石楠叶片离体培养方法，所有培养基其pH值均调至5.8左右，所述的基本培养基配方有2种，具体见表1，表2。
表1每升基本培养基中含有物质种类和质量(诱导愈伤组织培养)
| 化学名称 | 中文名称 | 浓度mg/L |
| KNO3 | 硝酸钾 | 1520-1900 |
| NH4NO3 | 硝酸铵 | 1320-1650 |
| MgSO4·7H2O | 七水硫酸镁 | 248-370 |
| KH2PO4 | 磷酸二氢钾 | 136-170 |
| CaCl2·2H20 | 二水氯化钙 | 440 |
| MnSO4·4H2O | 四水硫酸锰 | 22.3 |
| ZnSO4·7H2O | 七水硫酸锌 | 8.6 |
| H3BO3 | 硼酸 | 6.2 |
| CuSO4·5H2O | 五水硫酸铜 | 0.025 |
| CoCl2.6H2O | 氯化钴 | 0.025 |
| Na2MoO4·2H2O | 二水钼酸钠 | 0.25 |
| FeSO4·7H2O | 七水硫酸亚铁 | 34.1 |
| Na2-EDTA | 乙二胺四乙酸钠 | 46.6 |
| thiamine·HCl(维生素B1) | 盐酸硫胺素VB1 | 1.0 |
| pyr idoxin·HCl(维生素B6) | 盐酸吡哆辛VB6 | 0.5 |
| nicotinic acid(Vit B5) | 烟酸VB5 | 0.5 |
| Glycine | 甘氨酸 | 2.0 |
| myo-inosito1 | 肌醇 | 100 |
| 蔗糖 | 30000 | |
| 卡拉胶 | 6500 |
表2每升基本培养基中含有物质种类和质量(除诱导愈伤组织培养外)
| 化学名称 | 中文名称 | 浓度mg/L |
| Ca(NO3)2·4H2O | 四水硝酸钙 | 371-556 |
| NH4NO3 | 硝酸铵 | 268-400 |
| KNO3 | 硫酸钾 | 600-900 |
| MgSO4·7H2O | 七水硫酸镁 | 248-370 |
| KH2PO4 | 磷酸二氢钾 | 115-170 |
| CaCl2·2H2O | 二水氯化钙 | 72-96 |
| MnSO4·4H2O | 四水硫酸锰 | 22.5 |
| ZnSO4·7H2O | 七水硫酸锌 | 8.6 |
| H3BO3 | 硼酸 | 6.2 |
| CuSO4·5H2O | 五水硫酸铜 | 0.25 |
| Na2MoO4·2H2O | 二水钼酸钠 | 0.25 |
| FeSO4·7H2O | 七水硫酸亚铁 | 34.1 |
| Na2-EDTA | 乙二胺四乙酸钠 | 46.6 |
| thiamine·HCl(维生素B1) | 盐酸硫胺素VB1 | 1.0 |
| pyridoxin·HCl(维生素B6) | 盐酸吡哆辛VB6 | 0.5 |
| nicot inic acid(Vit B5) | 烟酸VB5 | 0.5 |
| Glycine | 甘氨酸 | 2.0 |
| myo-inositol | 肌醇 | 100 |
| 蔗糖 | 20000 | |
| 卡拉胶 | 6500 |
本发明的有益效果是：本发明的微型观赏红叶石楠叶片的离体培养方法，在短期内生产大量优质种苗，繁殖速度快，效率高。
具体实施方式
实施例1
微型观赏红叶石楠叶片的离体培养所用的基本培养基配方如表3、表4
表3每升基本培养基中含有物质种类和质量(诱导愈伤组织培养)
| 化学名称 | 中文名称 | 浓度mg/L |
| KNO3 | 硝酸钾 | 1520 |
| NH4NO3 | 硝酸铵 | 1320 |
| MgSO4·7H2O | 七水硫酸镁 | 248 |
| KH2PO4 | 磷酸二氢钾 | 136 |
| CaCl2·2H2O | 二水氯化钙 | 440 |
| MnSO4·4H2O | 四水硫酸锰 | 22.3 |
| ZnSO4·7H2O | 七水硫酸锌 | 8.6 |
| H3BO3 | 硼酸 | 6.2 |
| CuSO4·5H2O | 五水硫酸铜 | 0.025 |
| CoCl2.6H2O | 氯化钴 | 0.025 |
| Na2MoO4·2H2O | 二水钼酸钠 | 0.25 |
| FeSO4·7H2O | 七水硫酸亚铁 | 34.1 |
| Na2-EDTA | 乙二胺四乙酸钠 | 46.6 |
| thiamine·HCl(维生素B1) | 盐酸硫胺素VB1 | 1.0 |
| pyridoxin·HCl(维生素B6) | 盐酸吡哆辛VB6 | 0.5 |
| nicotinic acid(Vit B5) | 烟酸VB5 | 0.5 |
| Glvcine | 甘氨酸 | 2.0 |
| myo-inositol | 肌醇 | 100 |
| 蔗糖 | 30000 | |
| 卡拉胶 | 6500 |
表4每升基本培养基中含有物质种类和质量(除诱导愈伤组织培养外)
| 化学名称 | 中文名称 | 浓度mg/L |
| Ca(NO3)2·4H2O | 四水硝酸钙 | 371 |
| NH4NO3 | 硝酸铵 | 268 |
| KNO3 | 硫酸钾 | 600 |
| MgSO4·7H2O | 七水硫酸镁 | 248 |
| KH2PO4 | 磷酸二氢钾 | 115 |
| CaCl2·2H2O | 二水氯化钙 | 72 |
| MnSO4·4H2O | 四水硫酸锰 | 22.5 |
| ZnSO4·7H2O | 七水硫酸锌 | 8.6 |
| H3BO3 | 硼酸 | 6.2 |
| CuSO4·5H2O | 五水硫酸铜 | 0.25 |
| Na2MoO4·2H2O | 二水钼酸钠 | 0.25 |
| FeSO4·7H2O | 七水硫酸亚铁 | 34.1 |
| Na2-EDTA | 乙二胺四乙酸钠 | 46.6 |
| thiamine·HCl(维生素B1) | 盐酸硫胺素VB1 | 1.0 |
| pyridoxin·HCl(维生素B6) | 盐酸吡哆辛VB6 | 0.5 |
| nicotinic acid(Vit B5) | 烟酸VB5 | 0.5 |
| Glycine | 甘氨酸 | 2.0 |
| myo-inositol | 肌醇 | 100 |
| 蔗糖 | 20000 | |
| 卡拉胶 | 6500 |
愈伤组织培养：每升基本培养基(表3)+ZT0.5mg+BA0.5mg+NAA0.1mg+2，4-D0.5mg；
分化增殖培养：每升基本培养基(表4)+ZT1.0mg+BA1.0mg+NAA0.05mg；
壮苗培养：每升基本培养基(表4)+ZT0.5mg+BA0.5mg+NAA0.1mg；
生根培养：每升基本培养基(表4)+NAA0.3mg+IAA0.8mg+柠檬酸50mg。
将上述培养基注入三角瓶中，经高温高压消毒(120-125℃，1.1kg/cm2)20分钟，待用。
1、采用经筛选的多年生微型观赏红叶石楠当年生嫩叶为外植体，经70％酒精消毒20秒，再用0.1％的升汞溶液消毒8-10分钟，用无菌水冲洗3-5次；
2、在超净的工作台上，无菌条件下，将消毒的外植体接种在经消毒的含有形成愈伤组织培养基的三角瓶中，先将其置于黑暗条件下10-15天后，再置于普通日光灯为光源、光照强度为1500-20001x下，每日光照15小时，温度20-25℃、湿度为50％-60％，培养48天，形成愈伤组织；
3、将从步骤2中愈伤组织，剪切，转接于经消毒的含有分化增殖培养基的三角瓶中，进行增殖培养，不断增殖，一个周期35天的繁殖倍数为4.8，生长高度达3.9cm，视繁殖生产需要达2000瓶时进入下一步；
4、将步骤3中培养的试管芽苗，剪切，接种于经消毒的含有壮苗培养基的三角瓶中，进行壮苗培养，35天后进入下一步；
5、将步骤4中的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-4片叶片，按步骤2接种于经消毒的含有生根培养的培养基的三角瓶中，进行生根培养8-10天；
6、将步骤5中生长的带根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭和黄土体积比为泥炭：黄心土＝1∶1的基质中，浇透水，保持温度25℃左右，相对湿度85％以上，前10天遮光70％，后逐渐见光，20天后生根成活，生根率达96.2％，45天左右，全光照，可实现微型观赏红叶石楠的规模化生产。
实施例2
本实施例按实施例1的步骤进行操作，只是培养基的重量配比和原料组分不同，本实施例所用的基本培养基配方如表5、表6，增殖及壮苗培养35天的繁殖系数达5.2，高生长达4.3cm，生根率为98.3％。
表5每升基本培养基中含有物质种类和质量(诱导愈伤组织培养)
| 化学名称 | 中文名称 | 浓度mg/L |
| KNO3 | 硝酸钾 | 1900 |
| NH4NO3 | 硝酸铵 | 1650 |
| MgSO4·7H2O | 七水硫酸镁 | 370 |
| KH2PO4 | 磷酸二氢钾 | 170 |
| CaCl2·2H2O | 二水氯化钙 | 440 |
| MnSO4·4H2O | 四水硫酸锰 | 22.3 |
| ZnSO4·7H2O | 七水硫酸锌 | 8.6 |
| H3BO3 | 硼酸 | 6.2 |
| CuSO4·5H2O | 五水硫酸铜 | 0.025 |
| CoCl2.6H2O | 氯化钴 | 0.025 |
| Na2MoO4·2H2O | 二水钼酸钠 | 0.25 |
| FeSO4·7H2O | 七水硫酸亚铁 | 34.1 |
| Na2-EDTA | 乙二胺四乙酸钠 | 46.6 |
| thiamine·HCl(维生素B1) | 盐酸硫胺素VB1 | 1.0 |
| pyridoxin·HCl(维生素B6) | 盐酸吡哆辛VB6 | 0.5 |
| nicotinic acid(Vit B5) | 烟酸VB5 | 0.5 |
| Glvcine | 甘氨酸 | 2.0 |
| myo-inositol | 肌醇 | 100 |
| 蔗糖 | 30000 | |
| 卡拉胶 | 6500 |
表6每升基本培养基中含有物质种类和质量(除诱导愈伤组织培养外)
| 化学名称 | 中文名称 | 浓度mg/L |
| Ca(NO3)2·4H2O | 四水硝酸钙 | 556 |
| NH4NO3 | 硝酸铵 | 400 |
| KNO3 | 硫酸钾 | 900 |
| MgSO4·7H2O | 七水硫酸镁 | 370 |
| KH2PO4 | 磷酸二氢钾 | 170 |
| CaCl2·2H2O | 二水氯化钙 | 96 |
| MnSO4·4H2O | 四水硫酸锰 | 22.5 |
| ZnSO4·7H2O | 七水硫酸锌 | 8.6 |
| H3BO3 | 硼酸 | 6.2 |
| CuSO4·5H2O | 五水硫酸铜 | 0.25 |
| Na2MoO4·2H2O | 二水钼酸钠 | 0.25 |
| FeSO4·7H2O | 七水硫酸亚铁 | 34.1 |
| Na2-EDTA | 乙二胺四乙酸钠 | 46.6 |
| thiamine·HCl(维生素B1) | 盐酸硫胺素VB1 | 1.0 |
| pyridoxin·HCl(维生素B6) | 盐酸吡哆辛VB6 | 0.5 |
| nicotinic acid(Vit B5) | 烟酸VB5 | 0.5 |
| Glycine | 甘氨酸 | 2.0 |
| myo-inositol | 肌醇 | 100 |
| 蔗糖 | 20000 | |
| 卡拉胶 | 6500 |
愈伤组织培养：每升基本培养基(表5)+ZT1.0mg+BA1.0mg+NAA0.2mg+2，4-D1.0mg；
分化增殖培养基：每升基本培养基(表6)+ZT2.0mg+BA2.0mg+NAA0.1mg；
壮苗培养：每升基本培养基(表6)+ZT1.0mg+BA1.0mg+NAA0.2mg；
生根培养：每升基本培养基(表6)+NAA0.5mg+IAA0.4mg+柠檬酸100mg。
以上已以较佳实施例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换或者等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.微型观赏红叶石楠叶片离体培养方法，其特征是按下列步骤进行：
(1)准备基本培养基，有2种。
一种是诱导愈伤组织形成的培养基，每升基本培养基中含有：硝酸钾1520-1900mg，硝酸铵1320-1650mg，磷酸二氢钾136-170mg，硫酸镁296-370mg，二水氯化钙440mg，碘化钾0.83mg，硼酸6.2mg，四水硫酸锰22.3mg，七水硫酸锌8.6mg，二水钼酸钠0.25mg，五水硫酸铜0.025mg，氯化钴0.025mg，七水硫酸亚铁27.8mg，乙二胺四乙酸钠37.3mg，维生素B10.1mg，维生素B60.5mg，VB50.5mg，甘氨酸2.0mg，肌醇100mg，蔗糖30000mg，卡拉胶6500mg。
另一种是除了诱导愈伤组织形成培养外的分化增殖培养、壮苗培养、生根培养的培养基，每升基本培养基中含有：四水硝酸钙371-556mg，硝酸铵268-400mg，硫酸钾600-990mg，七水硫酸镁248-370mg，磷酸二氢钾115-170mg，二水氯化钙72-96mg，四水硫酸锰22.4mg，七水硫酸锌8.6mg，硼酸6.2mg，五水硫酸铜0.25mg，二水钼酸钠0.25mg，七水硫酸亚铁34.1mg，乙二胺四乙酸钠46.6mg，维生素B11.0mg，维生素B60.5mg，VB50.5mg，甘氨酸2.0mg，肌醇100mg，蔗糖20000mg，卡拉胶6500mg。
(2)采用多年生微型观赏红叶石楠的当年生嫩叶片为外植体，经70％酒精消毒20-30秒，再用0.1％的升汞溶液灭菌8-10分钟，用无菌水冲洗3-5次；
(3)在超净的工作台上，无菌条件下，将消毒的外植体接种在经消毒的含有诱导愈伤组织培养基的三角瓶中，先将其置于黑暗条件下10-15天后，再置于普通日光灯为光源、光照强度为1500-20001x下，每日光照15小时，温度20-25℃、湿度为50％-60％，培养48天，长成愈伤组织；
所述的诱导愈伤组织培养基为：每升基本培养基含：玉米素0.5-1.0毫克、6-苄基嘌呤0.5-1.0毫克、α-萘乙酸0.1-0.2毫克、2，4-二氯苯氧乙酸0.5-1.0毫克；
(4)将从(3)步中培养的愈伤组织，剪切，转接于经消毒的含有分化增殖培养基的三角瓶中，进行增殖培养，不断增殖，视繁殖生产规模需要达2000左右瓶进入下一步；
所述的分化增殖培养基为：每升基本培养基含：玉米素1.0-2.0毫克、6-苄基嘌呤1.0-2.0毫克、α-萘乙酸0.05-0.1毫克；
(5)将(4)步中培养的试管芽苗，剪切，接种于经消毒的含有壮苗培养基的三角瓶中，进行壮苗培养，30天后进入下一步；
所述的壮苗培养基为：每升基本培养基含：玉米素0.5-1.0毫克、6-苄基嘌呤0.5-1.0毫克、α-萘乙酸0.1-0.2毫克；
(6)将(5)步中的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-4片叶片，接种于经消毒的含有生根培养的培养基的三角瓶中，进行生根培养8-10天；
所述的生根培养基为：每升基本培养基含：α-萘乙酸0.3-0.5毫克、吲哚乙酸0.4-0.8毫克和柠檬酸50-100毫克；
(7)将(6)步中生长的生根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭和黄心土体积比为泥炭：黄心土＝1∶1的基质中，浇透水，保持温度28℃左右，相对湿度85％以上，前10天遮光70％，后逐渐见光，15天后生根成活，生根率达96％以上，50天左右，全光照。
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