CN102308749B - 一种红王子锦带花药诱导花粉植株培养基 - Google Patents
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Abstract
一种红王子锦带花药诱导花粉植株培养基,它涉及植物组织培养技术领域,是一种红王子锦带花药愈伤组织诱导的专用培养基,它解决了红王子锦带获得纯系育种材料的问题,通过花药培养获得红王子锦带纯系,从而加速优良绿化树种红王子锦带育种进程。一种红王子锦带花药诱导花粉植株培养基由MS培养基、激素和碳源组成。本发明采用红王子花药作为外植体,采用光照培养和暗培养相结合的方法交替培养,进行花药愈伤组织的诱导,并获得花粉植株。本发明培养基愈伤组织增殖明显,易形成花粉植株,从而加快红王子锦带育种速度,缩短培育周期。
Description
技术领域:
本发明属于植物组织培养技术领域,是一种红王子锦带花药诱导花粉植株的专用培养基。
背景技术:
我国北方的苗木市场,植物种类和色彩与南方相比较为单调,适合东北栽种的花灌木品种很少,为了弥补这一缺憾,园林工作者近年来从美国引进红王子锦带,以此来丰富我国北方园林绿化品种,提高城市绿化的色彩水平和档次。红王子锦带(Weigela florida cv.‘Red-prince’)为忍冬科锦带花属,落叶灌木,系锦带花的一个变种,株高1.5-2.0m,冠幅1.5m,叶椭圆形至卵状长椭圆形,花冠胭脂红色,花期长,其性喜光,耐荫,耐寒,对土壤要求不严,适应性和抗逆性强,园林中可孤植、丛植,对氯化氢气体抗性强,是一种极具潜力的抗污染园林绿化新品种。
近年来,红王子锦带在东北地区人工栽培规模不断扩大,种苗需求量也随之不断增长。但引种后由于地理环境的改变,其呈花粉退化趋势,栽培后不易结籽,目前生产上红王子锦带主要是采用扦插分株方法繁殖种苗,严重阻碍这一优良品种的推广应用及新品种选育。
关于红王子锦带离体培育的报道很少,就目前的资料来看,仅限于红王子锦带无菌苗体系的建立、增殖培养、生根培养、培养条件的研究以及无性繁育等相关报道。目前对红王子锦带的研究都以茎、芽和叶为研究对象,进行再生植株的研究,但对于红王子锦带花药离体培养及诱导花粉植株尚未见报道。
发明内容:
本发明解决了红王子锦带获得纯系育种材料的问题,从而加速优良绿化树种红王子锦带育种进程,为红王子锦带育种工作奠定基础。采用红王子花药作为外植体,进行花药愈伤组织的诱导,通过明、暗交替培养,便可获得花粉植株,从而增加了红王子锦带新类型,加快育种速度。
本发明从筛选花粉发育时期、基本培养基、调整植物生长调节剂及碳源入手,合理配比各种激素和碳源,目的是提供一种诱导红王子锦带花粉愈伤组织的专用培养基,以解决诱导花粉植株。
本发明利用正交试验设计筛选基本培养基、激素及碳源水平,并经过各种单因子的多次试验,最终确定适宜的培养基与激素种类及用量。实验表明,本发明培养基愈伤组织增殖明显,易形成花粉植株。
本发明采取以下技术方案实现:
红王子锦带花药诱导花粉植株培养基由MS培养基、激素和碳源组成。
本发明诱导花粉愈伤、诱导花粉植株及诱导花粉植株生根培养基配方如下:
(1)诱导花粉愈伤组织培养基:MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D0.2mg/L,蔗糖2%,PH=5.8;
(2)诱导花粉植株培养基:MS+ZT1.0mg/L+NAA0.05mg/L,蔗糖2%,PH=5.8;
(3)诱导花粉植株生根培养基:1/2MS+NAA0.2mg/L+IBA0.1mg/L,蔗糖2%,PH=5.8。
所述的MS培养基包括大量元素、微量元素、铁盐和有机质。大量元素包括:NH4NO3,KNO3,KH2PO4,MgSO4·7H2O,CaCl2·2H2O;微量元素包括:KI,H3BO3,MnSO4·4H2O,ZnSO4·7H2O,Na2MoO4·2H2O,CuSO4·5H2O,CoCl2·6H2O;铁盐包括:Na2-EDTA,FeSO4·7H2O;有机质包括:肌醇,烟酸,盐酸硫胺素,盐酸吡哆醇,甘氨酸。
所述的激素包括:6-BA(6-苄基腺嘌呤),NAA(萘乙酸),IBA(吲哚丁酸),ZT(玉米素)和2,4-D(二氯苯氧乙酸);
所述的碳源为蔗糖。
花药培养具有重要的意义:
一是获得纯系育种材料和进行单倍体育种,以利用杂种优势,缩短育种年限和提高育种效率;
二是用所获得的纯合二倍体材料进行遗传变异规律研究;使园艺植物育种有坚实的遗传理论依据,减少育种的盲目性;
三是克服远缘杂种不育,获得具有双亲优良特性可育远缘杂种;
四是利用在远缘杂交F1代的花药培养中出现的混倍体和丰富的染色体变异材料,进行园艺植物细胞遗传学等基础性研究。
另外,在分子生物技术迅速发展和日趋成熟的今天,花药培养的应用领域不断扩大,其研究意义日益突出。
本发明提供了一种诱导红王子锦带花粉植株的专用培养基,采用红王子花药为外植体,进行花药愈伤组织的诱导,采用光照培养和暗培养相结合的方法交替培养,获得花粉植株。本发明培养基愈伤组织增殖明显,易形成花粉植株,从而获得红王子锦带新类型,加快育种速度。
表-1 本发明营养元素配方
表-2 本发明激素配方
具体实施方式:
本发明技术资金来源于黑龙江省科技厅重点科技攻关项目“优良景观树种高效扩繁技术研究”课题(GB07B303-02)。课题组经过2年的研究,利用红王子锦带花药作为外植体,进行花药愈伤组织的诱导,通过明、暗交替培养,从而获得花粉植株。
材料采集与处理:红王子锦带花药采自黑龙江省森林植物园珍贵树种园,母树为3年生,生长健壮。花蕾采集于6-8月生长季节进行,这时的花粉处于生长旺盛期,采集时间选在晴朗的天气,上午9-10点进行。花蕾采集从现蕾到开花期间每隔2d采集一次花蕾,采集后将花蕾放置4℃的冰箱内冷藏处理48h备用。接种前,通过镜检进行花粉发育时期的鉴定,以确定花粉所处的发育时期。花粉所处的发育时期,是花药培养成败的关键,单核早期诱导率高,因此花粉植株诱导采用处在单核早期的花药。
培养条件:培养条件采用光照培养和暗培养相结合的方法。光照培养光源采用日光灯,培养室内白天温度为24℃-28℃,照明12h-14h,光照强度15μmol·m-2·s-1-20μmol·m-2·s-1。暗培养温度控制在24℃-26℃。
消毒方法:将低温预处理后的花蕾取出,先用洗涤剂作表面清洗,去除表面尘土,清水冲洗,然后放在超净工作台上用75%乙醇灭菌30s,无菌水冲洗3-5次后放在滤纸上吸干花蕾表面水分。
接种方法:接种选择单核早期的花药。首先用镊子剥开花蕾,取出花药,接种到MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D0.2mg/L,蔗糖2%,PH=5.8诱导培养基上,并将花丝、空瘪的花药剔除。每瓶接种6-12个。接种后,先放入黑暗条件下培养,待诱导出愈伤组织后将其转入光照培养,当愈伤组织由淡黄色变成淡绿色后转接到MS+ZT1.0mg/L+NAA0.05mg/L,蔗糖2%,PH=5.8培养基中,诱导花粉植株。
细胞学观察:花粉发育时期的观察。用镊子撕去花冠,取出花药放入醋酸:洋红(3∶1)固定液中,固定2小时,然后取出花药,用蒸馏水冲洗3-4次,将花药置于洁净的载玻片上,用解剖刀将花药切开,滴上1滴醋酸洋红,并将花药壁碎片弃去,对花药进行染色1-2分钟,盖上盖片,制作成临时压片,在酒精灯上轻烤后,在显微镜下观察花粉所处的发育时期,同时拍照。
实验结果表明:基本培养基对诱导花药愈伤组织存在明显的差异,MS培养基诱导率较高达43.33%;诱导红王子锦带花药愈伤组织的最好时期为单核早期,诱导率达48%;诱导花药愈伤组织选用2,4-D,但浓度对愈伤组织的诱导影响较大,高浓度的2,4-D并不利于愈伤组织的诱导;诱导芽分化选择ZT效果较好,当愈伤组织表面形成绿色光亮的芽点,将其转入含ZT的培养基中,小芽点逐渐长大,长出嫩茎和小叶,形成无根花粉植株。
将花粉植株转入继代分化培养基上继续增殖培养,经过20d培养,可获得花粉植株的丛生苗。
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