CN104686323A - 二次脱毒法培育草莓种苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于草莓种苗繁育领域，尤其涉及一种二步脱毒法培育草莓种苗的方法，其特征在于：选取草莓匍匐茎尖分生组织进行第一次脱毒，其诱导的试管苗茎尖分生组织进行第二次脱毒等步骤。该方法利用田间草莓匍匐茎尖组织及其诱导的试管苗分生组织进行两次脱毒，培养出核心母株。培育出的脱毒草莓苗长势强健，结果率提高，产量高，品质优，经济效益高。
Description
技术领域
本发明属于草莓种苗繁育领域，尤其涉及一种二步脱毒法培育草莓种苗的方法。
背景技术
草莓(Fragaria X ananassa ) 是蔷薇科草莓属多年生草本植物。近年来草莓种植面积发展很快，世界总产量在浆果类水果中己经跃居第2位。我国是世界草莓属植物种类分布最多的国家，同时也是世界上草莓栽培面积最大、产量最多的国家。草莓长期无性繁殖和连作而导致种性退化以及植株被感染了病毒病，常表现为植株矮化、抗逆性降低、畸形果增加、果实品质下降，单位面积产量降低。草莓病毒病在世界各地分布广泛，其中草莓轻型黄边病毒( Strawberry mild yellow edge virus，SMYEV)是分布较广、危害较重的最主要的RNA病毒。
目前，草莓主要采用热疗法、化学抑制剂法和茎尖组培法培育脱毒苗。热疗法更适合木本果树，高温胁迫将影响草莓试管苗分生组织的分化。逆转录酶抑制剂能够抑制RNA病毒逆转录酶活性，同时也会影响胚性愈伤组织的分化成芽的诱导率。常规茎尖培养操作难点是解剖体积过大的茎尖组织 (大于5 mm)进行诱导，接种外植体可能任然感染微量病毒，从而降低了脱毒效率。然而使用更小体积的茎尖组织（小于0.1 mm）进行诱导，由于较低的不定芽诱导率从而降低脱毒种苗的产量。因此我们开展了二步脱毒法繁育种苗研究，先解剖大体积的匍匐茎分生组织为外植体诱导产生试管苗，再解剖小体积的试管苗茎尖组织为外植体诱导脱毒种苗。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种二步脱毒法培育优质脱毒草莓种苗的方法，先取草莓匍匐茎分生组织，诱导获得试管苗；再取试管苗茎尖分生组织（约1 mm），诱导获得脱毒母株。脱毒草莓苗长势强健，结果率提高，产量高，品质优，经济效益高。
解决以上技术问题的的本发明中的二步脱毒法培育草莓种苗的方法，包括杀菌、制备培养基、脱毒、炼苗和移栽步骤，其特征在于：所述脱毒为二次脱毒，即先取匍匐茎3-5 mm茎尖组织诱导成试管苗，再取试管苗0.5-1 mm茎尖组织诱导成脱毒种苗。
所述诱导为在培养基上诱导，依次经过不定芽诱导培养基、草莓增殖培养基和生根培养基，其中三种培养基配方分别为：
不定芽诱导培养基含有Ms培养基，6BA 1.5-2.5 mg/L，NAA 0.05-0.15 mg/L，蔗糖25-35 g/L，琼脂粉6-7 g/L；
草莓增殖培养基含有Ms培养基，6BA 0.3-0.8 mg/L+IBA 0.05-0.15 mg/L，水解酪蛋白0.05-0.15mg/L， 蔗糖15-23 g/L，琼脂粉5-6 g/L；
生根培养基：Ms培养基 ，蔗糖16-24 g/L ，琼脂粉5-6 g/L。
Ms培养基配方：
大量元素：KNO3 1.9 g/L、NH4NO3 1.65 g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KHPO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L
微量元素：MnSO4·4H2O 22.3 mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·7H2O 0.25mg/L、CuSO4.5H2O4 0.025mg/L、CoCL2.6H2O 0.025mg/L
铁盐：Na2-EDTA 37.3mg/L、FeSO4.4H2O 27.8mg/L
有机物：甘氨酸 2.0 mg/L、盐酸吡哆醇 0.5 mg/L、盐酸硫铵素 0.1 mg/L、烟酸 0.5 mg/L、肌酸 100 mg/L
优选方案中所述三种培养基配方分别为：
不定芽诱导培养基含有Ms培养基，6BA 2 mg/L，NAA 0.1 mg/L， 蔗糖30 g/L，琼脂粉6.5 g/L；
草莓增殖培养基含有Ms培养基，6BA 0.5 mg/L，IBA 0.1 mg/L，水解酪蛋白0.1mg/L，蔗糖20 g/L ，琼脂粉5.5 g/L；
生根培养基含有Ms 培养基，蔗糖20 g/L +琼脂粉5.5 g/L；
本发明中二步脱毒法培育草莓种苗的方法，其特征在于：制备方法具体步骤包括以下：
（1） 选取草莓匍匐茎，用湿润纸包裹， 4-5℃暂存；
（2） 杀菌：乙醇灭菌1-2 min，用灭菌水洗涤2-3次，1-2 min/次，再除去多余水分；然后升汞灭菌2-3 min，用灭菌水洗涤2-3次，1-2 min/次，再除去多余水分；乙醇和升汞进行组织的表面消毒，除去多余水分后接种于培养基表面，可让被诱导的茎尖组织充分接触到培养基。
（3） 制备培养基：不定芽诱导培养基、草莓增殖培养基和生根培养基；
（4） 第一次脱毒：解剖镜下取匍匐茎的茎尖分生组织3-5 mm，置于不定芽诱导培养基，诱导产生丛生状的不定芽；不定芽长至2-3 cm并具有两片以上的真叶，切下不定芽转至草莓增殖培养基长成小植株；小植株长至4-6 cm转移至生根培养基生根成试管苗，脱去细菌和真菌。
（5） 第二次脱毒：以步骤（4）中试管苗为材料，取其茎尖组织0.5-1 mm置于不定芽诱导培养基；按照步骤（4）中脱毒步骤进行脱毒，得生根的试管苗，即脱毒种苗；
（6） 炼苗：用灭菌水将脱毒种苗根上的培养基琼脂清洗干净后，装在盛有清水的瓶中在组培室中炼苗3-5 d；
（7） 移载：组培苗移栽盛有灭菌基质的花盆中，置于阴凉处抽发匍匐茎子苗。
所述乙醇为75%医用乙醇，升汞为0.1 % 升汞。
所述灭菌水为超纯水。
所述灭菌基质为草炭：蛭石=7：3的混合物。
本发明取草莓匍匐茎尖组织进行第一次茎尖脱毒，可以脱去细菌、真菌等微生物。以试管内组培苗的茎尖分生组织进行第二次茎尖脱毒，可以脱去草莓轻型黄边病毒（SMYEV），成功培育出脱毒种苗；再利用脱毒草莓种苗为母苗，繁育匍匐茎子苗。
利用本发明中的培育方法，培育出的脱毒草莓苗长势强健，抗逆性强，具有更优良的商品果率，产量高，品质优，经济效益也会显著提高，为冬草莓产业的健康发展提供了优质的种苗。
附图说明
图1为本发明中脱毒母株分别用普通PCR和Real time PCR分别扩增SMYEV病毒的外壳蛋白基因SMYEVcp（1,2,3和4分别代表经过二步脱毒法的母株5-1-2，母株5-2-2，感染病毒的阳性对照和清水阴性对照，其中M为Marker DL2000）
图2为本发明中Real time PCR检测经过二步脱毒法的母株匍匐茎繁育的子苗（1,2,3,4,5和6分别代表感染病毒的阳性对照、子苗9-1-1、子苗9-1-2、子苗9-1-1、子苗9-1-2和清水对照）
图3为本发明中Real time PCR检测只进行第一次脱毒的试管苗与经过二步脱毒法的母株匍匐茎繁育的子苗（1,2,3,4,5和6分别代表感染病毒的阳性对照、只进行第一次脱毒的试管苗TD-HY、只进行第一次脱毒的试管苗TD-FX、二步脱毒法的母株匍匐茎繁育的子苗9-1-1、二步脱毒法的母株匍匐茎繁育的子苗9-1-2和清水阴性对照）
图4为本发明中二步脱毒法培育草莓种苗图
图5为本发明中果实对照图
具体实施方式
以下实施例中MS培养基的配方为：大量元素：KNO3 1.9 g/L、NH4NO3 1.65 g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L
微量元素：MnSO4·4H2O 22.3 mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·7H2O 0.25mg/L、CuSO4.5H2O4 0.025mg/L、CoCL2.6H2O 0.025mg/L
铁盐：Na2-EDTA 37.3mg/L、FeSO4.4H2O 27.8mg/L
有机物：甘氨酸 2.0 mg/L、盐酸吡哆醇 0.5 mg/L、盐酸硫铵素 0.1 mg/L、烟酸 0.5 mg/L、肌酸 100 mg/L
实施例1
（1） 选取草莓匍匐茎，用湿润报纸包裹，4-5℃暂存；
（2） 杀菌：75%医用乙醇灭菌1 min，用灭菌水洗涤2次，1 min/次，再除去多余水分；然后0.1 %升汞灭菌2 min，用灭菌水洗涤2次，1 min/次，再除去多余水分；乙醇和升汞进行组织的表面消毒，除去多余水分后接种于培养基表面，可让被诱导的茎尖组织充分接触到培养基。
（3） 制备培养基：不定芽诱导培养基、草莓增殖培养基和生根培养基；
不定芽诱导培养基含有Ms培养基，6BA 1.5 mg/L，NAA 0.05 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂粉6 g/L；
草莓增殖培养基含有Ms培养基，6BA 0.3-0.8 mg/L+IBA 0.05 mg/L，水解酪蛋白0.05mg/L， 蔗糖15 g/L，琼脂粉5 g/L；
生根培养基：Ms培养基 ，蔗糖16 g/L ，琼脂粉5 g/L。
（4） 第一次脱毒：解剖镜下取匍匐茎的茎尖分生组织3-5 mm，置于不定芽诱导培养基，诱导产生丛生状的不定芽；不定芽长至2-3 cm并具有两片以上的真叶，切下不定芽转至草莓增殖培养基长成小植株；小植株长至4-6 cm转移至生根培养基生根成试管苗，脱去细菌和真菌。
（5） 第二次脱毒：以步骤（4）中试管苗为材料，取其茎尖组织0.5-1 mm置于不定芽诱导培养基；按照步骤（4）中脱毒步骤进行脱毒，得生根的试管苗，即脱毒种苗；
（6） 炼苗：用灭菌水将脱毒种苗根上的培养基琼脂清洗干净后，装在盛有清水的瓶中在组培室中炼苗3-5 d；
（7） 移载：组培苗移栽盛有灭菌基质的花盆中，置于阴凉处抽发匍匐茎子苗，灭菌基质为草炭：蛭石=7：3的混合物。
实施例2
二步脱毒法培育草莓种苗的方法， 包括以下步骤：
（1） 选取“丰香”草莓匍匐茎，用湿润报纸包裹保持组织不脱水，带回实验室4℃短暂保存；
（2） 杀菌：在超净工作台，75%医用乙醇灭菌1 min，再用灭菌的超纯水（18.3MΩ*cm）洗涤3次，1 min/次；置于灭菌滤纸上，吸收多余水分；0.1 % 升汞灭菌3 min，再用灭菌超纯水洗涤3次，1 min/次，置于灭菌滤纸上，吸收多余水分。其中，医用乙醇和升汞进行组织的表面消毒，吸水纸吸收多余水分后组织接种于培养基表面，让其充分接触到培养基。
（3） 制备培养基：
不定芽诱导培养基包含有Ms培养基，6BA 2 mg/L，NAA 0.1 mg/L，30 g/L 蔗糖，6.5 g/L琼脂粉；草莓增殖培养基包含有Ms培养基6BA 0.5 mg/L，IBA 0.1 mg/L， 水解酪蛋白0.1mg/L，蔗糖20 g/L，琼脂粉5.5 g/L；
生根培养基包含有Ms培养基,蔗糖20 g/L ，琼脂粉5.5 g/L；
（4） 第一次脱毒：解剖镜下取匍匐茎的茎尖分生组织3-5 mm大小，置于不定芽诱导培养基，诱导产生愈伤组织；愈伤组织再诱导产生丛生状的不定芽，不定芽诱导率达100%；不定芽长至2-3 cm并具有两片以上的真叶，切下不定芽转至草莓增殖培养基；小植株长至5 cm转移至生根培养基。最终获得生根试管苗并成功脱去细菌和真菌。
（5） 第二次脱毒：获得试管苗为材料，解剖镜下取其茎尖组织0.5-1 mm大小，共计57个分生组织置于不定芽诱导培养基。按照上述同样步骤，经过愈伤组织、不定芽，最后获得生根的试管苗。共计获得18株经过二次脱毒的组培苗，平均每株苗具有4.5根，根茎粗2 mm，其中种苗诱导存活率为31.6%，平均每株苗具有4.5根，根茎粗2 mm。提取草莓叶片总RNA，荧光定量PCR进行病毒病检测，成功脱去草莓轻型黄边病毒（SMYEV）。
（6） 炼苗：用灭菌超纯水将根上培养基琼脂清洗干净后，装在盛有清水的瓶中在组培室中炼苗3-5 d。
（7） 移载：组培苗移栽盛有灭菌基质（草炭：蛭石=7：3）的花盆中，置于阴凉处抽发匍匐茎子苗。
提取草莓叶片总RNA，Real time PCR进行草莓轻型黄边病毒（SMYEV）检测。
实施例3
二步脱毒法培育草莓种苗的方法，包括以下步骤：
（1） 选取“丰香”草莓匍匐茎，用湿润报纸包裹保持组织不脱水，带回实验室4℃短暂保存；
（2） 杀菌：在超净工作台，75%医用乙醇灭菌1 min，再用灭菌的超纯水（18.3MΩ*cm）洗涤3次，1 min/次；置于灭菌滤纸上，吸收多余水分；0.1 % 升汞灭菌3 min，再用灭菌超纯水洗涤3次，1 min/次，置于灭菌滤纸上，吸收多余水分。其中，医用乙醇和升汞进行组织的表面消毒，吸水纸吸收多余水分后组织接种于培养基表面，让其充分接触到培养基。
（3） 制备培养基：
不定芽诱导培养基含有Ms培养基，6BA 2.5 mg/L，NAA 0.15 mg/L，蔗糖35 g/L，琼脂粉7 g/L；
草莓增殖培养基含有Ms培养基，6BA 0.8 mg/L+IBA 0.15 mg/L，水解酪蛋白0.15mg/L， 蔗糖23 g/L，琼脂粉6 g/L；
生根培养基：Ms培养基 ，蔗糖24 g/L ，琼脂粉6 g/L。
（4） 第一次脱毒：解剖镜下取匍匐茎的茎尖分生组织约3-5 mm大小，置于不定芽诱导培养基，诱导产生愈伤组织；愈伤组织再诱导产生丛生状的不定芽，不定芽诱导率达100%；不定芽长至2-3 cm并具有两片以上的真叶，切下不定芽转至草莓增殖培养基；小植株长至5 cm转移至生根培养基。最终获得生根试管苗并成功脱去细菌和真菌。
（5） 第二次脱毒：获得试管苗为材料，解剖镜下取其茎尖组织0.5-1 mm大小，共计57个分生组织置于不定芽诱导培养基。按照上述同样步骤，经过愈伤组织、不定芽，最后获得生根的试管苗。共计获得18株经过二次脱毒的组培苗，平均每株苗具有4.5根，根茎粗2 mm（种苗诱导存活率为31.6%）。
（6） 炼苗：用灭菌超纯水将根上培养基琼脂清洗干净后，装在盛有清水的瓶中在组培室中炼苗3-5 d。
（7） 移载：组培苗移栽盛有灭菌基质（草炭：蛭石=7：3）的花盆中，置于阴凉处抽发匍匐茎子苗。
（8） 提取草莓叶片总RNA，Real time PCR进行草莓轻型黄边病毒（SMYEV）检测。
实施例4
其它内容如实施例1，其中不定芽诱导培养基含有Ms培养基，6BA 1.8 mg/L，NAA 0.012 mg/L，蔗糖32 g/L，琼脂粉6.8 g/L；
草莓增殖培养基含有Ms培养基，6BA 0.6 mg/L+IBA 0.08 mg/L，水解酪蛋白0.9mg/L， 蔗糖18 g/L，琼脂粉5.8 g/L；
生根培养基：Ms培养基 ，蔗糖19 g/L ，琼脂粉5.8 g/L。
实施例5
其它内容如实施例1，不定芽诱导培养基含有Ms培养基，6BA 2.2 mg/L，NAA 0.09 mg/L，蔗糖28 g/L，琼脂粉6.3 g/L；
草莓增殖培养基含有Ms培养基，6BA 0.4 mg/L+IBA 0.12 mg/L，水解酪蛋白0.12mg/L， 蔗糖21 g/L，琼脂粉5.3 g/L；
生根培养基：Ms培养基 ，蔗糖17 g/L ，琼脂粉5.4 g/L。
实施例6
其它内容如实施例1，不定芽诱导培养基含有Ms培养基，6BA 1.6 mg/L，NAA 0.13 mg/L，蔗糖31 g/L，琼脂粉6.6 g/L；
草莓增殖培养基含有Ms培养基，6BA 0.7 mg/L+IBA 0.11 mg/L，水解酪蛋白0.08mg/L， 蔗糖20.5 g/L，琼脂粉5.6 g/L；
生根培养基：Ms培养基 ，蔗糖21 g/L ，琼脂粉5.7 g/L。
实施例7
从四川新都基地选取“丰香”草莓匍匐茎，用湿润报纸包裹后带回实验室。在超净工作台，75%医用乙醇灭菌1 min，再用灭菌水洗涤3次，1 min/次。置于灭菌滤纸上，吸收多余水分。0.1 % 升汞灭菌3 min，再用灭菌水洗涤3次，1 min/次。置于灭菌滤纸上，吸收多余水分。解剖镜下取匍匐茎的3-5 mm左右的茎尖分生组织（图4 A），置于不定芽诱导培养基中（Ms+6BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+ 30 g/L 蔗糖+6.5 mg/L琼脂粉）。匍匐茎尖分生组织，诱导产生愈伤组织。在愈伤组织中，诱导不定芽的产生（图4B）。丛生状的不定芽长至2-3 cm（图3 C和D），切下转至草莓增殖培养基（Ms+6BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L+ 水解酪蛋白0.1 mg/L+ 蔗糖20 g/L +琼脂粉5.5 mg/L）。获得的不定芽转移至生根培养基中（Ms +蔗糖20 g/L +琼脂粉5.5 mg/L），诱导生根（图4 E）。以上获得草莓试管苗为材料，继续取其0.5-1 mm茎尖，共计57个分生组织为外植体进行不定芽诱导（图4 F）。按照第一次不定芽诱导步骤，共计获得18株经过二次脱毒的组培苗，平均每株苗具有4.5根，根茎粗2 mm（图4 H）。用灭菌水将根上培养基琼脂清洗干净后，装在盛有清水的瓶中在组培室中炼苗3-5 d。最后将二次脱毒的组培苗移栽在灭菌基质的花盆中，置于阴凉处抽发匍匐茎子苗（图4 I），子苗定植于田间。
仅以草莓匍匐茎尖组织（3-5 mm）培育出的试管苗，尽管脱去了炭疽病（细菌）和白粉病（真菌）等微生物，但是还是没有脱去微量SMYEV病毒。而第二次以试管苗茎尖分生组织（0.5-1 mm）为材料进行脱毒，成功培育出脱毒种苗。利用经过二步脱毒法的母株繁育的匍匐茎子苗，与农民自繁苗（上季生产苗的匍匐茎繁育子苗，由于长期自繁造成品种退化和病毒病感染）相比，脱毒苗具有更优良的商品果率。本实验成功研制了一种“二步脱毒法培育优质草莓种苗”的方法，为冬草莓产业发展提供了优质的母本种苗。
试验一
分别使用普通PCR和Real time PCR分别检测经过二次脱毒的母株5-1-2和5-2-2号，都不含有SMYEV病毒（图1 A和B）。草莓匍匐茎尖组织（大约3-5 mm）进行第一次茎尖脱毒，成功脱去细菌、真菌等微生物。以试管苗的茎尖分生组织（大约0.5-1 mm）进行第二次茎尖脱毒，可以脱去草莓轻型黄边病毒（图1 A，C和D）。脱毒母株5-1-2的匍匐茎繁殖能力强，2014年夏季大量繁殖子苗（图1 B）。不同样本都可以扩增出草莓的内参基因片段（Actin）。但只有阳性对照样本的普通PCR扩增得到SMYEV病毒的外壳蛋白基因片段。此外只有阳性对照样本的Real time PCR扩增曲线在22个循环时发生起跳，即样本感染目标病毒。
试验二
Real time PCR分别检测3-1样本（阳性对照）、9-1-1（脱毒母株匍匐茎繁育子苗）、9-1-2（子苗）、9-3-1（子苗）、9-3-2（子苗）和CK-（清水对照）。高分辨率溶解曲线只有3-1样本（阳性对照）有峰而其他样本没有峰（图2 C）。另外，草莓匍匐茎子苗9-1-1、9-1-2、9-3-1、9-3-2和清水对照在35个循环内都没有起跳（图2 D）。这说明脱毒母株繁育匍匐茎子苗都是成功脱去病毒。
试验三
Real time PCR分别检测只经过第一次脱毒的试管苗（TD-HY和TD-FX，图3 B），在30个循环左右起跳（TD-HY和TD-FX，图3 A）。这说明第一次脱毒的试管苗仍然感染了微量SMYEV病毒。与之比较，经过二步脱毒法的母株匍匐茎繁育的子苗9-1-1和9-1-2，依然没有被感染SMYEV病毒。
试验四
“丰香”脱毒苗和农民自繁苗（对照）于2014年8月底定植于四川省双流县三星镇。2014年12月3日、12月19日分别采样进行果实品质比较研究。脱毒草莓（图5中A）和对照果实（图5中B）相比较，脱毒草莓果型呈圆锥形。脱毒草莓果实纵横茎分别大于对照（图5中D和C）。脱毒草莓单果重也高于对照（图5中E）。果实表皮颜色采用Hunterlab色度计分别测量L*a*b（图5中F），脱毒草莓果实颜色更红艳（a/b=1.513），而对照果实颜色偏黄（a/b=1.397）。同时，脱毒草莓果实硬度高于对照（图5中G）。然而，脱毒草莓与对照的果实可溶性固形物差异不大（图5中H）。因此，脱毒草莓苗比农民自繁苗具有更佳的果实品质，其产量更高、商品性状更好。
Claims (7)
1.二步脱毒法培育草莓种苗的方法，包括杀菌、制备培养基、脱毒、炼苗和移栽步骤，其特征在于：所述脱毒为二次脱毒，即先取匍匐茎3-5 mm茎尖组织诱导成试管苗，再取试管苗0.5-1 mm茎尖组织诱导成脱毒种苗。
2.根据权利要求1中所述的二步脱毒法培育草莓种苗的方法，其特征在于：所述诱导为在培养基上诱导，依次经过不定芽诱导培养基、草莓增殖培养基和生根培养基，其中三种培养基配方分别为：
不定芽诱导培养基含有Ms培养基，6BA 1.5-2.5 mg/L，NAA 0.05-0.15 mg/L，蔗糖25-35 g/L，琼脂粉6-7 g/L；
草莓增殖培养基含有Ms培养基，6BA 0.3-0.8 mg/L+IBA 0.05-0.15 mg/L，水解酪蛋白0.05-0.15mg/L， 蔗糖15-23 g/L，琼脂粉5-6 g/L；
生根培养基：Ms培养基 ，蔗糖16-24 g/L ，琼脂粉5-6 g/L。
3.根据权利要求2中所述的二步脱毒法培育草莓种苗的方法，其特征在于：所述三种培养基配方分别为：
不定芽诱导培养基含有Ms培养基，6BA 2 mg/L，NAA 0.1 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂粉6.5 g/L；
草莓增殖培养基含有Ms培养基，6BA 0.5 mg/L，IBA 0.1 mg/L，水解酪蛋白0.1mg/L，蔗糖20 g/L ，琼脂粉5.5 g/L；
生根培养基含有Ms 培养基，蔗糖20 g/L +琼脂粉5.5 g/L。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的二步脱毒法培育草莓种苗的方法，其特征在于：制备方法具体步骤包括以下：
选取草莓匍匐茎，用湿润纸包裹， 4-5℃暂存；
杀菌：乙醇灭菌1-2 min，用灭菌水洗涤2-3次，1-2 min/次，再除去多余水分；然后升汞灭菌2-3 min，用灭菌水洗涤2-3次，1-2 min/次，再除去多余水分；
制备培养基：不定芽诱导培养基、草莓增殖培养基和生根培养基；
第一次脱毒：解剖镜下取匍匐茎的茎尖分生组织3-5 mm，置于不定芽诱导培养基，诱导产生丛生状的不定芽；不定芽长至2-3 cm并具有两片以上的真叶，切下不定芽转至草莓增殖培养基长成小植株；小植株长至4-6 cm转移至生根培养基生根成试管苗；
第二次脱毒：以步骤（4）中试管苗为材料，取其茎尖组织0.5-1 mm置于不定芽诱导培养基；按照步骤（4）中脱毒步骤进行脱毒，得生根的试管苗，即脱毒种苗；
炼苗：用灭菌水将脱毒种苗根上的培养基琼脂清洗干净后，装在盛有清水的瓶中在组培室中炼苗3-5 d得组培苗；
移载：组培苗移栽盛有灭菌基质的花盆中，置于阴凉处抽发匍匐茎子苗。
5.根据权利要求4中所述的二步脱毒法培育草莓种苗的方法，其特征在于：所述乙醇为75%医用乙醇，升汞为0.1 % 升汞。
6.根据权利要求4中所述的二步脱毒法培育草莓种苗的方法，其特征在于：所述灭菌水为超纯水。
7.根据权利要求4中所述的二步脱毒法培育草莓种苗的方法，其特征在于：所述灭菌基质为草炭：蛭石=7：3的混合物。
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