CN106069745A - 一种桃果实愈伤组织培养基及其培养方法 - Google Patents

一种桃果实愈伤组织培养基及其培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种桃果实愈伤组织培养基及其培养方法，该培养基包括如下成分：改良的WPM培养基为基本培养基、植物生长调节剂、蔗糖20‑40g/L和琼脂粉4.5‑6.5g/L，pH为5.5‑6.0；该培养方法，包括如下步骤：(1)桃果实的无菌化处理，(2)桃果实圆片培养；本发明愈伤组织培养基及其培养方法使得桃果实愈伤组织诱导率大大提高；通过培养桃果肉的愈伤组织能在短期内获得大量优质愈伤组织，解决桃叶片培养中愈伤组织状态不一致，愈伤组织培养成功率低的问题，为大规模培养愈伤组织提供有效途径，并且为桃的分子生物学以及基因工程研究提供了一条新的途径。

Description

一种桃果实愈伤组织培养基及其培养方法
技术领域
本发明涉及植物愈伤组织培养，具体涉及一种桃果实愈伤组织培养基及其培养方法。
背景技术
桃原产我国，目前在我国各省区广泛栽培，在世界各地也均有栽植。桃是一种兼具营养价值、经济价值以及观赏价值的果树。目前我国对桃基因组的研究也已经开始，桃基因组研究的方向主要涉及植株抗性、果实品质果实生产特性等几个大的方面，其中桃重要经济性状尤其是与果实品质形成相关的分子机理研究也成为是桃基因组研究的热点。在桃的分子生物学研究中，多年来一直困扰研究者的一大问题是桃的转基因，目前有报道的桃的转基因仅有1-2篇，而报道中转基因效率都是极低的，因此在桃的分子生物学研究中，亟待探究一条新的方向来完成桃的某些基因功能验证。在植物分子机理研究方面，愈伤组织是常用的试验材料，也是基因工程研究中进行基因转化所必需的试验材料。愈伤组织是指外植体在离体培养条件下，形成的一团无极性、能旺盛分裂的薄壁细胞团，在培养过程中，经过诱导分化可以发育成完整的再生植株。愈伤组织是植物的外植体经过脱分化形成的，多种外植体都可以经过组织培养诱导形成愈伤组织，而植物愈伤组织因为具有以下特点而被广泛应用于植物分子机理和基因工程研究中。愈伤组织的特点：①无性繁殖，大量扩繁；②为细胞悬浮培养和次生代谢产物生产与利用、原生质体培养和细胞融合提供材料；③为植物体细胞无性系变异、细胞突变体筛选创造适宜的体系和基础；④为外源基因的遗传转化提供便于保存和利用的操对象；⑤为离体研究植物组织和细胞分裂、分化、代谢和状态的转变创造适宜的材料和体系。
目前对于桃愈伤组织的研究多集中研究叶片的愈伤组织，然而，随着桃分子生物学研究的不断深入，仅仅研究单一器官或者组织的的愈伤组织培养，显然不能满足研究需要。而对于桃来说理论上虽然所有器官和组织都可以作为外植体，但是实现的过程比较复杂，也很难。目前桃的研究中，对果实品质形成以及果实成熟发育的分子机理研究是一大热点，因此，想要研究果实的发育，就必须获得相应果实的愈伤组织来研究桃果实品质形成以及果实成熟发育分子机理。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种桃果实愈伤组织培养基及其培养方法；本发明使得桃果实愈伤组织诱导率大大提高；通过培养桃果肉的愈伤组织能在短期内获得大量优质愈伤组织，解决桃叶片培养中愈伤组织状态不一致，愈伤组织培养成功率低的问题，为大规模培养愈伤组织提供有效途径，并且为桃的分子生物学以及基因工程研究提供了一条新的途径。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明提供一种桃果实愈伤组织培养基，包括如下成分：改良的WPM培养基为基本培养基、植物生长调节剂、蔗糖20-40g/L、琼脂粉4.5-6.5g/L，pH为5.5-6.0。
作为优选，所述改良的WPM培养基为每一升WPM培养基含有：KNO3硝酸钾300-500mg/L、K2SO4硫酸钾800-1000mg/L、MgSO4.7H2O七水合硫酸镁350-400mg/L、KH2PO4磷酸二氢钾150-200mg/L、MnSO4.4H2O四水合硫酸锰15-25mg/L、ZnSO4.7H2O七水合硫酸锌8.0-9.0mg/L、H3BO3硼酸6.0-6.5mg/L、CuSO4.5H2O五水合硫酸铜0.03-0.08mg/L、NaMoO4.2H2O二水合钼酸钠0.1-0.4mg/L、Fe-EDDHA乙二胺邻二羟基乙酸铁8-12mg/L、CaCl2.2H2O二水合氯化钙80-120mg/L、Ca(NO3)2.4H2O四水硝酸钙550-650mg/L、肌醇80-120mg/L、烟酸0.8-1.2mg/L、维生素B10.8-1.2mg/L、维生素B6 1.5-2.5mg/L、维生素C 1.5-2.5mg/L。
作为优选，所述植物生长调节剂为TDZ 1-2mg/L、2，4-D 0.2-2mg/L、ZT 1-3mg/L、6-BA 0.2-0.8mg/L、IBA 0.1-0.3mg/L中的任意几种的组合。
TDZ是一种新型植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，且可以对植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程，是一个作用力很强的植物生长调节剂，在农业上有广泛的应用和推广价值。
2,4-D对于愈伤组织的诱导和生长非常有效，是组织培养中常用的植物生长调节剂，本发明中添加2,4-D能够很好的诱导桃愈伤组织的形成。
ZT为玉米素(Zeatin)，是存在于高等植物的一种天然植物细胞分裂素不仅促进侧芽生长，刺激细胞分化(侧端优势)，促进愈伤组织和种子发芽，还能防止叶片衰老，逆转芽部受到的毒素伤害和抑制过度根部形成。高浓度的玉米素还能产生不定芽分化，玉米素在之前报道的愈伤组织培养中很少用到，因为桃果实材料的特殊性，因此使用玉米素来诱导愈伤组织。
IBA为吲哚丁酸，是组织培养中常用的植物生长调节剂，对于愈伤组织的诱导和生长非常有效。
6-BA是6-苄氨基腺嘌呤，是一种细胞分裂素类的物质，具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点是组织培养者最喜爱的细胞分裂素，可以诱导愈伤组织发生。但是一般在诱导愈伤组织发生时浓度不宜过高，本发明中添加6-BA能够很好的诱导‘玉露’桃果实愈伤组织的形成。
蔗糖在植物组织培养基中起到能源物质和渗透调节剂的作用，除供能之外，还能诱导愈伤组织的再分化，使用工业生产的分析纯的蔗糖，在本发明中，因为所选植物材料是果肉，果肉本身含有糖分，因此培养时蔗糖浓度不宜过高，本试验中所用蔗糖为30g/L。
琼脂粉在培养基中主要的作用是固定支撑的作用，一般使用纯度较高，没有杂质的琼脂粉。
本发明还提供一种桃果实愈伤组织的培养方法，包括如下步骤：
(1)桃果实的无菌化处理：选取桃果实，将果实表面洗干净，在无菌条件下进行消毒，消毒完成后削去表面果皮，从果实中间切开，选取果心到果皮的中间部分，切成圆片，接种于愈伤组织培养基上；
(2)桃果实圆片培养：将步骤(1)中接种圆片的愈伤组织培养基在黑暗条件下20-30℃培养10-25天后，果实原片周围会有不规则形状的愈伤组织长出，在无菌条件下切下果肉边缘的愈伤组织接种于愈伤组织培养基中，培养25-30天；愈伤体积变为原来体积的3-4倍大小，增殖后的愈伤组织一部分可以用来做分子生物学以及基因工程相关试验，剩余的一部分可以再次接种于培养基中继续增殖培养，供后续试验所用。
作为优选，所述步骤(1)中桃果实为‘玉露’桃花后30-70天的桃果实。
作为优选，所述步骤(1)中切成圆片为切成0.2-0.4厘米的圆片。
所述步骤(1)将果实表面洗干净包括将桃表面的毛清理干净。将桃表面的毛清理干净不容易导致污染。
作为优选，所述步骤(1)在无菌条件下进行消毒具体步骤为：用70-80％的乙醇消毒1-2分钟后用无菌去离子水冲洗2-4次，然后用0.05-0.15％的升汞消毒7-9分钟，再用无菌去离子水冲洗8-10次，用无菌滤纸吸干果皮表面水分。
本发明所用果肉来直接来自于桃果实，而果实取材时只需要根据开花后的天数取，实验材料的年龄和生理状态能够保持高度的一致性。从一个果实上取全部果肉就能够培养出大量的愈伤组织，而来自于同一果实的愈伤组织无论是生理状态还是基因型还是年龄都是完全一致的，无论后期将愈伤组织用于任何试验，都能够保证实验基础高度一致，不会对试验造成误差。这一优点是其他外植体，比如叶片、茎段或者根完全不能够做到的。
其次果实果肉本身无菌无病毒，不需要对果肉进行消毒处理，仅仅需要对果皮进行简单的消毒处理，而这个处理不会对果肉造成任何的伤害。果肉培养时不受消毒剂的影响，同时也能够消除病毒病害对愈伤组织的影响。而且相同生理状态的果实培养的果肉愈伤组织性状稳定，增殖能力强，材料能够保持高度的一致性，对于需要使用愈伤组织的试验来说，果肉愈伤组织是最稳定，最一致，增值系数最高的材料。本发明提供了一种桃果实愈伤组织培养基及其培养方法，为今后桃的分子生物学以及基因工程研究提供了一条新的途径，同时也为桃果实愈伤的培养提供了参考和借鉴。
有益效果：与现有技术相比，本发明桃果实愈伤组织培养基及其培养方法具有如下优点：本发明使得桃果实愈伤组织诱导率大大提高可以达到80％以上；通过培养桃果肉的愈伤组织能在短期内获得大量优质愈伤组织，解决桃叶片培养中愈伤组织状态不一致，愈伤组织培养成功率低的问题，为大规模培养愈伤组织提供有效途径，并且为桃的分子生物学以及基因工程研究提供了一条新的途径，为桃基因工程研究和基因转化提供一种新的试验材料，同时也为桃果实愈伤的培养提供了参考和借鉴。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
培养基：
改良的WPM、TDZ1mg/L、2，4-D 0.2mg/L、6-BA 0.2mg/L、蔗糖20g/L和琼脂粉4.5g/L，pH为5.5；
所述改良的WPM培养基为每一升WPM培养基含有：KNO3硝酸钾300mg/L、K2SO4硫酸钾800mg/L、MgSO4.7H2O七水合硫酸镁350mg/L、KH2PO4磷酸二氢钾150mg/L、MnSO4.4H2O四水合硫酸锰15mg/L、ZnSO4.7H2O七水合硫酸锌8.0mg/L、H3BO3硼酸6.0mg/L、CuSO4.5H2O五水合硫酸铜0.03mg/L、NaMoO4.2H2O二水合钼酸钠0.1mg/L、Fe-EDDHA乙二胺邻二羟基乙酸铁8mg/L、CaCl2.2H2O二水合氯化钙80mg/L、Ca(NO3)2.4H2O四水硝酸钙550mg/L、肌醇80mg/L、烟酸0.8mg/L、维生素B10.8mg/L、维生素B6 1.5mg/L、维生素C 1.5mg/L。
培养方法：
(1)桃果实的无菌化处理：选取“玉露”桃花后30天的桃果实，将果实表面用流水冲洗干净，并将桃表面的毛清理干净；在无菌条件下进行消毒，用70％的乙醇消毒2分钟后用无菌去离子水冲洗2次，然后用0.05％的升汞消毒9分钟，再用无菌去离子水冲洗8次，用无菌滤纸吸干果皮表面水分；消毒完成后用无菌的手术刀片小心削去表面果皮，从果实中间切开，选取果心到果皮的中间部分，用打孔器切直径0.2厘米的圆片，接种于愈伤组织培养基上；
(2)桃果实圆片培养：将步骤(1)中接种圆片的愈伤组织培养基在没有光照的黑暗培养箱中20℃培养25天后，果实原片周围会有不规则形状的愈伤组织长出，在无菌条件下切下果肉边缘的愈伤组织接种于愈伤组织培养基中，培养25天；愈伤体积变为原来体积的3倍大小，增殖后的愈伤组织一部分可以用来做分子生物学以及基因工程相关试验，剩余的一部分可以再次接种于培养基中继续增殖培养，供后续试验所用。
实施例2
培养基：
改良的WPM、2，4-D 2mg/L、ZT 3mg/L、6-BA 0.8mg/L、蔗糖40g/L、琼脂粉6.5g/L，pH为6.0；
所述改良的WPM培养基为每一升WPM培养基含有：KNO3硝酸钾500mg/L、K2SO4硫酸钾1000mg/L、MgSO4.7H2O七水合硫酸镁400mg/L、KH2PO4磷酸二氢钾200mg/L、MnSO4.4H2O四水合硫酸锰25mg/L、ZnSO4.7H2O七水合硫酸锌9.0mg/L、H3BO3硼酸6.5mg/L、CuSO4.5H2O五水合硫酸铜0.08mg/L、NaMoO4.2H2O二水合钼酸钠0.4mg/L、Fe-EDDHA乙二胺邻二羟基乙酸铁12mg/L、CaCl2.2H2O二水合氯化钙120mg/L、Ca(NO3)2.4H2O四水硝酸钙650mg/L、肌醇120mg/L、烟酸1.2mg/L、维生素B11.2mg/L、维生素B6 2.5mg/L、维生素C 2.5mg/L。
培养方法：
(1)桃果实的无菌化处理：选取选取“玉露”桃花后70天的桃果实，将果实表面用流水冲洗干净，并将桃表面的毛清理干净；在无菌条件下进行消毒，用80％的乙醇消毒1分钟后用无菌去离子水冲洗4次，然后用0.15％的升汞消毒7分钟，再用无菌去离子水冲洗10次，用无菌滤纸吸干果皮表面水分；消毒完成后用无菌的手术刀片小心削去表面果皮，从果实中间切开，选取果心到果皮的中间部分，用打孔器切直径0.4厘米的圆片，接种于愈伤组织培养基上；
(2)桃果实圆片培养：将步骤(1)中接种圆片的愈伤组织培养基在没有光照的黑暗培养箱中30℃培养10天后，果实原片周围会有不规则形状的愈伤组织长出，在无菌条件下切下果肉边缘的愈伤组织接种于愈伤组织培养基中，培养25天；愈伤体积变为原来体积的4倍大小，增殖后的愈伤组织一部分可以用来做分子生物学以及基因工程相关试验，剩余的一部分可以再次接种于培养基中继续增殖培养，供后续试验所用。
实施例3
培养基：
改良的WPM、ZT2.0mg/L、2，4-D0.2mg/L、IBA0.2mg/L、30g/L蔗糖、5.5g/L琼脂粉，pH为5.8；
所述改良的WPM培养基为每一升WPM培养基含有：KNO3硝酸钾400mg/L、K2SO4硫酸钾900mg/L、MgSO4.7H2O七水合硫酸镁370mg/L、KH2PO4磷酸二氢钾170mg/L、MnSO4.4H2O四水合硫酸锰20mg/L、ZnSO4.7H2O七水合硫酸锌8.6mg/L、H3BO3硼酸6.2mg/L、CuSO4.5H2O五水合硫酸铜0.05mg/L、NaMoO4.2H2O二水合钼酸钠0.25mg/L、Fe-EDDHA乙二胺邻二羟基乙酸铁10mg/L、CaCl2.2H2O二水合氯化钙100mg/L、Ca(NO3)2.4H2O四水硝酸钙600mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1mg/L、维生素B1 1mg/L、维生素B6 2mg/L、维生素C 2mg/L。
培养方法：
(1)桃果实的无菌化处理：选取选取“玉露”桃花后50天的桃果实，将果实表面用流水冲洗干净，并将桃表面的毛清理干净；在无菌条件下进行消毒，用75％的乙醇消毒1分钟后用无菌去离子水冲洗4次，然后用0.15％的升汞消毒8分钟，再用无菌去离子水冲洗9次，用无菌滤纸吸干果皮表面水分；消毒完成后用无菌的手术刀片小心削去表面果皮，从果实中间切开，选取果心到果皮的中间部分，用打孔器切直径0.3厘米的圆片，接种于愈伤组织培养基上；
(2)桃果实圆片培养：将步骤(1)中接种圆片的愈伤组织培养基在没有光照的黑暗培养箱中25℃培养20天后，果实原片周围会有不规则形状的愈伤组织长出，在无菌条件下切下果肉边缘的愈伤组织接种于愈伤组织培养基中，培养25天；愈伤体积变为原来体积的4倍大小，增殖后的愈伤组织一部分可以用来做分子生物学以及基因工程相关试验，剩余的一部分可以再次接种于培养基中继续增殖培养，供后续试验所用。
实施例4
培养基：
改良的WPM、TDZ 2mg/L、2，4-D 0.5mg/L、30g/L蔗糖、5.5g/L琼脂粉，pH为5.8；
所述改良的WPM培养基为每一升WPM培养基含有：KNO3硝酸钾400mg/L、K2SO4硫酸钾900mg/L、MgSO4.7H2O七水合硫酸镁380mg/L、KH2PO4磷酸二氢钾180mg/L、MnSO4.4H2O四水合硫酸锰20mg/L、ZnSO4.7H2O七水合硫酸锌8.5mg/L、H3BO3硼酸6.3mg/L、CuSO4.5H2O五水合硫酸铜0.06mg/L、NaMoO4.2H2O二水合钼酸钠0.3mg/L、Fe-EDDHA乙二胺邻二羟基乙酸铁10mg/L、CaCl2.2H2O二水合氯化钙100mg/L、Ca(NO3)2.4H2O四水硝酸钙600mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1mg/L、维生素B1 1mg/L、维生素B6 2mg/L、维生素C 2mg/L。
培养方法：
(1)桃果实的无菌化处理：选取选取“玉露”桃花后40天的桃果实，将果实表面用流水冲洗干净，并将桃表面的毛清理干净；在无菌条件下进行消毒，用75％的乙醇消毒1分钟后用无菌去离子水冲洗4次，然后用0.15％的升汞消毒8分钟，再用无菌去离子水冲洗9次，用无菌滤纸吸干果皮表面水分；消毒完成后用无菌的手术刀片小心削去表面果皮，从果实中间切开，选取果心到果皮的中间部分，用打孔器切直径0.3厘米的圆片，接种于愈伤组织培养基上；
(2)桃果实圆片培养：将步骤(1)中接种圆片的愈伤组织培养基在没有光照的黑暗培养箱中25℃培养15天后，果实原片周围会有不规则形状的愈伤组织长出，在无菌条件下切下果肉边缘的愈伤组织接种于愈伤组织培养基中，培养25天；愈伤体积变为原来体积的4倍大小，增殖后的愈伤组织一部分可以用来做分子生物学以及基因工程相关试验，剩余的一部分可以再次接种于培养基中继续增殖培养，供后续试验所用。
实施例5
培养基：
改良的WPM、TDZ 2mg/L、6-BA 0.5mg/L、30g/L蔗糖、5.5g/L琼脂粉，pH为5.8；
所述改良的WPM培养基为每一升WPM培养基含有：KNO3硝酸钾400mg/L、K2SO4硫酸钾900mg/L、MgSO4.7H2O七水合硫酸镁370mg/L、KH2PO4磷酸二氢钾170mg/L、MnSO4.4H2O四水合硫酸锰20mg/L、ZnSO4.7H2O七水合硫酸锌8.6mg/L、H3BO3硼酸6.2mg/L、CuSO4.5H2O五水合硫酸铜0.05mg/L、NaMoO4.2H2O二水合钼酸钠0.25mg/L、Fe-EDDHA乙二胺邻二羟基乙酸铁10mg/L、CaCl2.2H2O二水合氯化钙100mg/L、Ca(NO3)2.4H2O四水硝酸钙600mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1mg/L、维生素B1 1mg/L、维生素B6 2mg/L、维生素C 2mg/L。
培养方法：
(1)桃果实的无菌化处理：选取选取“玉露”桃花后60天的桃果实，将果实表面用流水冲洗干净，并将桃表面的毛清理干净；在无菌条件下进行消毒，用75％的乙醇消毒1分钟后用无菌去离子水冲洗4次，然后用0.15％的升汞消毒8分钟，再用无菌去离子水冲洗9次，用无菌滤纸吸干果皮表面水分；消毒完成后用无菌的手术刀片小心削去表面果皮，从果实中间切开，选取果心到果皮的中间部分，用打孔器切直径0.3厘米的圆片，接种于愈伤组织培养基上；
(2)桃果实圆片培养：将步骤(1)中接种圆片的愈伤组织培养基在没有光照的黑暗培养箱中25℃培养15天后，果实原片周围会有不规则形状的愈伤组织长出，在无菌条件下切下果肉边缘的愈伤组织接种于愈伤组织培养基中，培养25天；愈伤体积变为原来体积的4倍大小，增殖后的愈伤组织一部分可以用来做分子生物学以及基因工程相关试验，剩余的一部分可以再次接种于培养基中继续增殖培养，供后续试验所用。
实施例6
实施例6采用实施例3的培养基和培养方法，不同之处在于培养基中植物生长调节剂为2，4-D 0.2mg/L、ZT 2mg/L、6-BA 0.2mg/L。
实施例7
实施例7采用实施例3的培养基和培养方法，不同之处在于培养基中植物生长调节剂为TDZ 1mg/L、ZT 1mg/L、IBA 0.1mg/L。
实施例8
实施例8采用实施例3的培养基和培养方法，不同之处在于培养基中植物生长调节剂为ZT 3mg/L、6-BA 0.8mg/L、IBA 0.3mg/L。
实施例9
实施例9采用实施例3的培养基和培养方法，不同之处在于培养基中植物生长调节剂为TDZ 2mg/L、2，4-D 2mg/L、ZT 3mg/L、6-BA 0.8mg/L。
实施例10
实施例10采用实施例3的培养基和培养方法，不同之处在于培养基中植物生长调节剂为TDZ 1.5mg/L、2，4-D 0.1mg/L、ZT 2mg/L、IBA 0.2mg/L。
实施例11
实施例11采用实施例3的培养基和培养方法，不同之处在于培养基中植物生长调节剂为2，4-D 1mg/L、6-BA 0.8mg/L、IBA 0.2mg/L。
实施例12
实施例12采用实施例3的培养基和培养方法，不同之处在于培养基中植物生长调节剂为TDZ 1.5mg/L、2，4-D 1.1mg/L、6-BA 0.8mg/L、IBA 0.2mg/L。
实施例13
实施例13采用实施例3的培养基和培养方法，不同之处在于培养基中植物生长调节剂为TDZ 1mg/L、2，4-D 0.2mg/L、ZT 1mg/L、6-BA 0.2mg/L、IBA 0.1mg/L
实施例14
实施例14采用实施例3的培养基和培养方法，不同之处在于培养基中植物生长调节剂为TDZ 2mg/L、2，4-D 2mg/L、ZT 3mg/L、6-BA 0.8mg/L、IBA 0.3mg/L。
实施例15
实施例15采用实施例3的培养基和培养方法，不同之处在于培养基中植物生长调节剂为TDZ 1.5mg/L、2，4-D 1.1mg/L、ZT 2mg/L、6-BA 0.5mg/L、IBA0.2mg/L。
上述所有实施例的桃果实愈伤组织诱导率都可以达到80％以上，诱导率大大提高，在短期内可以获得大量优质愈伤组织。
试验例1
桃果肉愈伤组织质量评价指标，通过如下几个评价指标判断：
(1)愈伤组织的颗粒大小
以培养20天的果肉愈伤组织为准，测量不同培养基和不同培养条件下诱导果肉愈伤组织的大小，愈伤组织的直径小于3毫米为不合格愈伤组织，愈伤组织直径大于3毫米为合格。
(2)愈伤组织的颗粒散碎度
步骤(1)筛选完成后，筛选出大小合适的愈伤组织。颗粒散碎表示:愈伤组织容易松散，不紧密，愈伤组织表面毛刺状不平滑。颗粒致密表示：愈伤组织颗粒致密硬度高，愈伤组织表面光滑状，细胞致密，胞质密度高，愈伤组织边缘清晰。
(3)愈伤组织的色泽
愈伤组织合格颜色应该为黄白色，黄白色愈伤组织没有水渍化现象，组织颗粒致密，硬度高，愈伤组织表层细胞层清晰，有明显的表层致密层结构，是合格质量好的愈伤组织。
(4)愈伤组织的再分化能力
愈伤组织分化能力好坏取决于前面三个步骤，大小适中、组织颗粒致密、硬度较高、颜色黄白色的愈伤组织具有很强的分化能力，分化出的愈伤组织也有很高的质量。否则愈伤组织分化能力弱，分化出来的愈伤组织质量也不好。
培养基配方对‘玉露’桃果实愈伤组织的诱导的影响：
将桃‘玉露’的花后50天果肉分别接种于附加不同浓度TDZ、ZT、2，4-D、IBA、BA的改良WPM培养基上暗培养，研究不同配比的植物生长调节剂对桃‘玉露’果肉愈伤组织诱导培养的影响，培养基中附加蔗糖(30g/L)、琼脂粉(5.5g/L)，研究本发明中不同的激素配比对‘玉露’桃果实愈伤组织的诱导的影响，见表1。
表1 不同的激素配比对‘玉露’桃果实愈伤组织的诱导的影响
从试验结果可以得知，培养基中添加ZT(2.0mg/L)+2，4-D(0.2mg/L)+IBA(0.2mg/L)时，产生的愈伤组织大小适中，组织紧密。颜色黄白色，组织分化能力强，愈伤组织诱导率达到100％，是最合适的果实愈伤组织诱导激素配比。
试验例2
将桃‘玉露’的四个不同生长时期(花后30天、50天、70天、90天)的果肉分别接种于实施例3中改良WPM+ZT(2.0mg/L)+2，4-D(0.2mg/L)+IBA(0.2mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(5.5g/L)培养基PH值＝5.8的培养基上研究不同的果实生长时期对桃‘玉露’果实愈伤组织诱导的影响，结果见表2。
表2 桃果实的不同生长时期对‘玉露’果实愈伤组织的诱导的影响
果实的不同生长时期对愈伤组织的诱导有很大的影响，从试验结果可以看出，花后50天的果实比较容易诱导愈伤组织，诱导率达到100％。桃在花后30天果实发育非常小，但是因为桃果实整个发育期比较长，一般在果实发育后期愈伤组织不好诱导，因此，选择果实发育中期也就是花后50天的果实来培养愈伤组织。果实发育70天以后，愈伤组织都会长得非常疏松，不利于后期实验。
试验例3
将桃‘玉露’的果肉接种于实施例3中改良WPM+ZT(2.0mg/L)+2，4-D(0.2mg/L)+IBA(0.2mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(5.5g/L)培养基PH值＝5.8的培养基上，一部分在光照环境下培养，一部分在完全遮光的黑暗条件下培养，研究光照和暗培养对桃‘玉露’果实愈伤组织诱导的影响，结果见表3。
表3 果实的不同生长条件对‘玉露’果实愈伤组织的诱导的影响
果实的愈伤组织培养不同于叶片或者其他外植体愈伤组织，需要在完全黑暗的条件下培养，在试验中，如果按照我们平时普通外植体愈伤培养的条件培养果实愈伤，得到的愈伤不仅质量差，而且愈伤诱导率非常低。而在完全黑暗条件下培养的愈伤，诱导率可以达到100％，愈伤组织质量也很好，因此，果实愈伤培养不需要光照。

Claims (7)

1.一种桃果实愈伤组织培养基，其特征在于，包括如下成分：改良的WPM培养基为基本培养基、植物生长调节剂、蔗糖20-40g/L和琼脂粉4.5-6.5g/L，pH为5.5-6.0。
2.根据权利要求1所述桃果实愈伤组织培养基，其特征在于，所述改良的WPM培养基为每一升WPM培养基含有：KNO3硝酸钾300-500mg/L、K2SO4硫酸钾800-1000mg/L、MgSO4.7H2O七水合硫酸镁350-400mg/L、KH2PO4磷酸二氢钾150-200mg/L、MnSO4.4H2O四水合硫酸锰15-25mg/L、ZnSO4.7H2O七水合硫酸锌8.0-9.0mg/L、H3BO3硼酸6.0-6.5mg/L、CuSO4.5H2O五水合硫酸铜0.03-0.08mg/L、NaMoO4.2H2O二水合钼酸钠0.1-0.4mg/L、Fe-EDDHA乙二胺邻二羟基乙酸铁8-12mg/L、CaCl2.2H2O二水合氯化钙80-120mg/L、Ca(NO3)2.4H2O四水硝酸钙550-650mg/L、肌醇80-120mg/L、烟酸0.8-1.2mg/L、维生素B1 0.8-1.2mg/L、维生素B6 1.5-2.5mg/L、维生素C 1.5-2.5mg/L。
3.根据权利要求1所述桃果实愈伤组织培养基，其特征在于，所述植物生长调节剂为TDZ 1-2mg/L、2，4-D 0.2-2mg/L、ZT 1-3mg/L、6-BA 0.2-0.8mg/L、IBA 0.1-0.3mg/L中的任意几种的组合。
4.一种利用权利要求1所述桃果实愈伤组织培养基的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)桃果实的无菌化处理：选取桃果实，将果实表面洗干净，在无菌条件下进行消毒，消毒完成后削去表面果皮，从果实中间切开，选取果心到果皮的中间部分，切成圆片，接种于愈伤组织培养基上；
(2)桃果实圆片培养：将步骤(1)中接种圆片的愈伤组织培养基在黑暗条件下20-30℃培养10-25天后，果实原片周围会有不规则形状的愈伤组织长出，在无菌条件下切下果肉边缘的愈伤组织接种于愈伤组织培养基中，培养25-30天。
5.根据权利要求4的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中桃果实为‘玉露’桃花后30-70天的桃果实。
6.根据权利要求4的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中切成圆片为切成0.2-0.4厘米的圆片。
7.根据权利要求4的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)在无菌条件下进行消毒具体步骤为：用70-80％的乙醇消毒1-2分钟后用无菌去离子水冲洗2-4次，然后用0.05-0.15％的升汞消毒7-9分钟，再用无菌去离子水冲洗8-10次，用无菌滤纸吸干果皮表面水分。
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