CN104686332A - 一种茶树组织培养再生体系构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种茶树组织培养再生体系构建方法，涉及茶（Camellia sinensis L.）通过无性快繁技术获得株性稳定茶树种苗的技术方法。本发明以茶树未成熟胚为外植体，经过种子消毒、胚愈伤组织诱导、分化培养、生根培养、炼苗及移栽等步骤构建了茶树组织培养再生体系，既解决茶树优质种苗缺乏的问题，又可为今后开展茶树遗传转化工作奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种茶树组织培养再生体系构建方法。
背景技术
茶（Camellia sinensis L.）为山茶科山茶属多年生常绿乔木或灌木，具有悠久的栽培历史，是我国重要的经济作物之一。茶树喜光怕晒，喜温怕寒，对土壤含水量有一定的要求。我国山茶属植物资源丰富，是华南地区绿化荒山，保持水土的经济作物。
常规茶树育种技术具有局限性，如远缘杂交困难、有益突变频率低、选育优良品种耗时长、花期不遇等，制约了茶树优质资源的利用，使得茶树品种选育工作难以取得突破性的进展。而植物组织培养技术具有加速育种进程、缩短繁殖时间、改良植物品质、节省空间、减少劳动、可终年生产、不受自然条件限制等特点，可有效解决茶树品种选育耗时长的问题。近年来茶树组织培养研究方面取得了一定的进展，但依然存在一些问题，如外植体褐化现象严重、出梢率低、生根困难、移栽大田成活率低等，使组织培养技术在茶树中的应用受到很大的限制。因此，非常有必要建立系统的茶树离体快繁体系，为今后对茶树进行品质遗传改良奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供出一种茶树组织培养再生体系构建方法，本发明以茶树未成熟胚为外植体，经过种子消毒、胚愈伤组织诱导、分化培养、生根培养、炼苗及移栽等步骤构建了茶树组织培养再生体系，从而实现了本发明的目的。
本发明的一种茶树组织培养再生体系构建方法，包括以下的步骤：
（1）种子消毒：选择8月份底未成熟茶果，去叶后于洗衣粉水浸泡10～30min，刷净后自来水冲洗1～2h，取出尚未成熟的乳白或略带棕色的种子，在超净工作台中，剥开外种皮，先用75%乙醇消毒5～30s后用无菌水洗3～5次，再用0.1%升汞溶液消毒10～25min，用无菌水冲洗4～6次后备用。
（2）胚愈伤组织诱导：将经步骤（1）处理后未成熟种胚切成0.5cm×0.5cm×0.5cm接种到诱导培养基上,先在25～28℃条件下全暗培养30～45天，然后置于每天光照10～12小时，光照强度为1500～3000lx，直至诱导形成胚性愈伤组织。
（3）分化培养：将步骤（2）培养获得的呈绿色的子叶愈伤组织转入分化培养基上进行分化培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养7～14天，然后置于每天光照12～16小时，光照强度为3000～5000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成丛生芽。
（4）生根培养：将步骤（3）过程获得的高度约为2.5～3.5cm的丛生芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养7～14天，然后置于每天光照14～16小时，光照强度为2000～3000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根。
（5）炼苗移栽：将步骤（4）获得的高约6～8cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗5～7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和黄沙泥混合成的基质中并定植于大田中。
上述步骤（2）所述的诱导培养基为：ER+6-BA1.0～3mg/L+NAA0.1～0.5mg/L+GA33～5 mg/L+蔗糖15～30g/L+琼脂3.5～6.0g/L，pH为5.4～5.8。
上述步骤（3）所述的分化培养基为：ER+6-BA1.0～5.0mg/L+IBA0.1～0.5mg/L+蔗糖15～30g/L+琼脂3.5～6.0g/L，pH为5.4～5.8。
上述步骤（4）所述的生根培养基为：1/2MS+IBA0.2～1.0mg/L+GGR1.0～2.0mg/L+KT1.0～3.0mg/L+蔗糖15～30g/L+琼脂3.5～6.0g/L，pH为5.4～5.8。
与现有技术相比本发明的优点是：目前国内关于茶树组培快繁技术尚未成熟，而本发明具有简单、易行、经济的特点。通过本发明育成的茶树试管苗移栽成活率达到89%以上，可以有效解决茶树种苗缺乏的问题。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1：
（1）种子消毒：选择8月份底未成熟茶果，去叶后于洗衣粉水浸泡10min，刷净后自来水冲洗1h，取出尚未成熟的乳白或略带棕色的种子，在超净工作台中，剥开外种皮，先用75%乙醇消毒5s后用无菌水洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒10min，用无菌水冲洗4次后备用，接种一周后统计污染率可低至3%。
（2）胚愈伤组织诱导：将经步骤（1）处理后未成熟种胚切成0.5cm×0.5cm×0.5cm接种到诱导培养基上,先在28℃条件下全暗培养30天，然后置于每天光照10小时，光照强度为1500x，直至诱导形成胚性愈伤组织，愈伤组织诱导率为67%。所述的诱导培养基为ER+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+GA35 mg/L+蔗糖15g/L+琼脂3.5g/L，pH为5.8。
（3）分化培养：将步骤（2）培养获得的呈绿色的子叶愈伤组织转入分化培养基上进行分化培养，接种后先在28℃条件下全暗培养7天，然后置于每天光照12小时，光照强度为3000lx，置于培养温度为28℃的条件下培养直至形成丛生芽。所述的分化培养基为ER+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖15g/L+琼脂3.5g/L，pH为5.8。
（4）生根培养：将步骤（3）过程获得的高度约为2.5～3.5cm的丛生芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在28℃条件下全暗培养7天，然后置于每天光照14小时，光照强度为2000lx，培养温度为28℃的条件下培养至生根，生根率为88.3%。所述的生根培养基为1/2MS+IBA0.2mg/L+GGR1.0mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖15g/L+琼脂3.5g/L，pH为5.8。
（5）炼苗移栽：将步骤（4）获得的高约6～8cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗5～7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和黄沙泥混合成的基质中并定植于大田中，移栽成活率可达91.7%。
实施例2：
（1）种子消毒：选择8月份底未成熟茶果，去叶后于洗衣粉水浸泡15min，刷净后自来水冲洗2h，取出尚未成熟的乳白或略带棕色的种子，在超净工作台中，剥开外种皮，先用75%乙醇消毒8s后用无菌水洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒12min，用无菌水冲洗4次后备用，接种一周后统计污染率可低至5%。
（2）胚愈伤组织诱导：将经步骤（1）处理后未成熟种胚切成0.5cm×0.5cm×0.5cm接种到诱导培养基上,先在28℃条件下全暗培养30天，然后置于每天光照12小时，光照强度为1500x，直至诱导形成胚性愈伤组织，愈伤组织诱导率为63%。所述的诱导培养基为ER+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+GA33 mg/L+蔗糖15g/L+琼脂3.5g/L，pH为5.8。
（3）分化培养：将步骤（2）培养获得的呈绿色的子叶愈伤组织转入分化培养基上进行分化培养，接种后先在28℃条件下全暗培养7天，然后置于每天光照12小时，光照强度为3000lx，置于培养温度为28℃的条件下培养直至形成丛生芽。所述的分化培养基为ER+6-BA1.2mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖15g/L+琼脂3.5g/L，pH为5.8。
（4）生根培养：将步骤（3）过程获得的高度约为2.5～3.5cm的丛生芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在28℃条件下全暗培养7天，然后置于每天光照14小时，光照强度为2500lx，培养温度为28℃的条件下培养至生根，生根率为84.1%。所述的生根培养基为1/2MS+IBA0.4mg/L+GGR1.5mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖15g/L+琼脂3.5g/L，pH为5.8。
（5）炼苗移栽：将步骤（4）获得的高约6～8cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗5～7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和黄沙泥混合成的基质中并定植于大田中，移栽成活率可达89%。
Claims (4)
1.一种茶树组织培养再生体系构建方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）种子消毒：选择8月份底未成熟茶果，去叶后于洗衣粉水浸泡10～30min，刷净后自来水冲洗1～2h，取出尚未成熟的乳白或略带棕色的种子，在超净工作台中，剥开外种皮，先用75%乙醇消毒5～30s后用无菌水洗3～5次，再用0.1%升汞溶液消毒10～25min，用无菌水冲洗4～6次后备用；
（2）胚愈伤组织诱导：将经步骤（1）处理后未成熟种胚切成0.5cm×0.5cm×0.5cm接种到诱导培养基上,先在25～28℃条件下全暗培养30～45天，然后置于每天光照10～12小时，光照强度为1500～3000lx，直至诱导形成胚性愈伤组织；
（3）分化培养：将步骤（2）培养获得的呈绿色的子叶愈伤组织转入分化培养基上进行分化培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养7～14天，然后置于每天光照12～16小时，光照强度为3000～5000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成丛生芽；
（4）生根培养：将步骤（3）过程获得的高度约为2.5～3.5cm的丛生芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养7～14天，然后置于每天光照14～16小时，光照强度为2000～3000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根；
（5）炼苗移栽：将步骤（4）获得的高约6～8cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗5～7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和黄沙泥混合成的基质中并定植于大田中。
2.根据权利要求1所述的一种茶树组织培养再生体系构建方法，其特征在于步骤（2）所述的诱导培养基为：ER+6-BA1.0～3mg/L+NAA0.1～0.5mg/L+GA33～5 mg/L+蔗糖15～30g/L+琼脂3.5～6.0g/L，pH为5.4～5.8。
3.根据权利要求1所述的一种茶树组织培养再生体系构建方法，其特征在于步骤（3）所述的分化培养基为：ER+6-BA1.0～5.0mg/L+IBA0.1～0.5mg/L+蔗糖15～30g/L+琼脂3.5～6.0g/L，pH为5.4～5.8。
4.根据权利要求1所述的一种茶树组织培养再生体系构建方法，其特征在于步骤（4）所述的生根培养基为：1/2MS+IBA0.2～1.0mg/L+GGR1.0～2.0mg/L+KT1.0～3.0mg/L+蔗糖15～30g/L+琼脂3.5～6.0g/L，pH为5.4～5.8。
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