CN107135947A - 柳树幼胚成苗组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种柳树幼胚成苗组织培养方法，包括：采集未成熟的柳树种子；将所述柳树种子消毒处理并从所述柳树种子中取得幼胚；将所述幼胚经由诱导培养形成胚性愈伤组织；将所述胚性愈伤组织经由芽分化培养形成丛生芽；将所述丛生芽经由生根培养形成柳树苗。本发明解决了在利用室内杂交的柳树种子播种，成苗率低的问题。

Description

柳树幼胚成苗组织培养方法
技术领域
本发明涉及农业种植技术领域，具体涉及一种柳树幼胚成苗组织培养方法。
背景技术
柳树自然杂交的种子很细小，千粒重也就在0.4克左右，而在室内杂交的柳树种子千粒重就更低。利用室内杂交的柳树种子在后期播种成苗过程中，由于柳树种子本身的营养成份不足，在生长过程中抵御外界不利环境因素的能力差，进而导致成苗率低，成苗的比率约为30％。
发明内容
为克服现有技术所存在的缺陷，现提供一种柳树幼胚成苗组织培养方法，以解决在利用室内杂交的柳树种子播种，成苗率低的问题。
为实现上述目的，提供一种柳树幼胚成苗组织培养方法，包括：
采集未成熟的柳树种子；
将所述柳树种子消毒处理并从所述柳树种子中取得幼胚；
将所述幼胚经由诱导培养形成胚性愈伤组织；
将所述胚性愈伤组织经由芽分化培养形成丛生芽；
将所述丛生芽经由生根培养形成柳树苗。
进一步的，所述采集未成熟的柳树种子的步骤包括于柳树蒴果的果皮开裂前且所述果皮呈黄色时，从所述柳树蒴果中采集所述柳树种子。
进一步的，所述将所述幼胚经由诱导培养形成胚性愈伤组织步骤包括将所述幼胚无菌接种到诱导培养基中，使所述幼胚形成所述胚性愈伤组织。
进一步的，所述将所述胚性愈伤组织经由芽分化培养形成丛生芽步骤包括将所述胚性愈伤组织转接到芽分化培养基中，使所述胚性愈伤组织形成所述丛生芽。
进一步的，所述将所述丛生芽经由生根培养形成柳树苗步骤包括将所述丛生芽转接到生根培养基中，使所述丛生芽生根形成所述柳树苗。
进一步的，所述诱导培养基、所述芽分化培养基及所述生根培养基均以改良型WPM培养基为基础培养基，所述改良型WPM培养基包括浓度为 270mg/L～290mg/L的NH4NO3、浓度为760mg/L～770mg/L的K2SO4、浓度为90mg/L～110mg/L的KH2PO4、浓度为145mg/L～155mg/L的MgSO4·7H2O 以及浓度为390mg/L～400mg/L的Ca(NO3)2·4H2O。
进一步的，所述诱导培养基为每升所述改良型WPM培养基添加 0.8mg～1.2mg的二氯苯氧乙酸、2mg～2.4mg的6-苄氨基腺嘌呤、195mg～ 205mg盐酸硫素。
进一步的，所述芽分化培养基为每升所述改良型WPM培养基添加 0.5mg～0.7mg的6-苄氨基腺嘌呤、0.15mg～0.25mg的萘乙酸、290mg～ 310mg的赤霉素。
进一步的，所述生根培养基为每升所述改良型WPM培养基添加 0.75mg～0.85mg的萘乙酸、950mg～1050mg的活性炭。
本发明的有益效果在于，本发明柳树幼胚成苗组织培养方法尤为适用于室内杂交柳树的种子幼胚成苗，在适宜的时机采集未成熟的室内杂交柳树种子，进而获得柳树幼胚并通过组织培养成柳树树苗，能有效提高室内杂交柳树的种子成苗率。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明柳树幼胚成苗组织培养方法适用于柳树种子。柳树是植物界被子植物门双子叶植物纲原始花被亚纲杨柳目杨柳科柳属，主要产自北半球温带地区，寒带次之，热带和南半球极少，原产地为中国大陆南方。柳树是一类植物的总称，柳树的品种包括旱柳、腺柳、垂柳等品种。柳属多为灌木，稀乔木，无顶芽，合轴分枝，雄蕊数目较少，虫媒花等特征表明，较杨属与钻天柳属进化。
柳属的形态特征如下：乔木或匍匐状、垫状、直立灌木。枝圆柱形，髓心近圆形。无顶芽，侧芽通常紧贴枝上，芽鳞单一。叶互生，稀对生，通常狭而长，多为披针形，羽状脉，有锯齿或全缘；叶柄短；具托叶，多有锯齿，常早落，稀宿存。葇荑花序直立或斜展，先叶开放，或与叶同时开放，稀后叶开放；苞片全缘，有毛或无毛，宿存，稀早落；雄蕊2-多数，花丝离生或部分或全部合；腺体1-2(位于花序轴与花丝之间者为腹腺，近苞片者为背腺)；雌蕊由2心皮组成，子房无柄或有柄，花柱长短不一，或缺，单1或分裂，柱头1-2，分裂或不裂。柳树的果实为蒴果，成熟后 2瓣裂，内藏种子多枚，种子上具有一丛绵毛，柳树种子小。在成熟的过程中，蒴果由黄色向暗褐色慢慢转变并干燥开裂。
柳树自然杂交的种子很细小，千粒重约为0.4克，而在室内杂交的柳树种子千粒重更小。直接利用室内杂交的柳树种子播种成苗，后期的成苗率极低。本发明柳树幼胚成苗组织培养方法尤为适用于室内杂交柳树的种子幼胚成苗，能有效提高室内杂交柳树的种子成苗率，柳树试管苗成活率达70％，比采用播种成苗的成活率提高30％左右。
本发明提供了一种柳树幼胚成苗组织培养方法，包括以下步骤：
S1：采集未成熟的柳树种子。
在室内柳树杂交授粉后的25天～26天时，采集呈黄色快成熟且还末开裂的柳树蒴果，并从上述柳树蒴果中取出柳树种子。
S2：将未成熟的柳树种子消毒处理并于消毒后的柳树种子中取得幼胚。
具体的，包括以下步骤：
将采集的柳树种子，先用无菌水冲洗10分种后，移至超净工作台上。
继续用75％的酒精对超净工作台内的柳树种子进行表面消毒30秒。
将已用75％的酒精消毒的柳树种子置于0.1％的升汞溶液中灭菌10分钟。
从升汞溶液中取出柳树种子并用无菌水冲洗3次～4次，再用滤纸吸干柳树种子的表面的水分。
将表面的水分已吸干的柳树种子的种皮切开，挑出柳树种子的幼胚。
S3：将幼胚无菌接种到以改良型WPM培养基为基本培养基的诱导培养基中，使幼胚 形成胚性愈伤组织。
具体的，包括以下步骤：
诱导培养基的制备。
准备改良型的WPM培养基。
本发明针对传统WPM培养基配方进行了改进，形成改良型WPM培养基。
传统的WPM培养基配方如下：
本发明的改良型WPM培养基的配方如下：
作为一种较佳的实施方式，本发明的改良型WPM培养基的配方如下：
诱导培养基是以改良型WPM培养基为基础培养基。
具体的，诱导培养基为每升改良型WPM培养基中添加0.8mg～1.2mg 的二氯苯氧乙酸(2,4-D)、2mg～2.4mg的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、195mg～ 205mg盐酸硫素。
作为一种较佳的实施方式，诱导培养基为每升所述改良型WPM培养基添加1.0mg的二氯苯氧乙酸(2,4-D)、2.2mg的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、 200mg盐酸硫素。
将幼胚无菌接种到诱导培养基中，使幼胚形成胚性愈伤组织。
将接种到诱导培养基中的幼胚先暗培养2周后，再光照培养约26天形成胚性愈伤组织后。
S4：将胚性愈伤组织转接到以改良型WPM培养基为基本培养基的芽分化培养基中， 使胚性愈伤组织形成丛生芽。
具体的，包括以下步骤：
芽分化培养基的制备。
芽分化培养基是以上述改良型WPM培养基为基本培养基。芽分化培养基为每升改良型的WPM培养基在添加0.5mg～0.7mg的6-苄氨基腺嘌呤、0.15mg～0.25mg的萘乙酸(NAA)、290mg～310mg的赤霉素(GA3)。
作为一种较佳的实施方式，芽分化培养基为每升改良型的WPM培养基添加0.6mg的6-苄氨基腺嘌呤、0.2mg的萘乙酸(NAA)、300mgd赤霉素 (GA3)。
再将胚性愈伤组织转接到芽分化培养基中约35天，使胚性愈伤组织形成高达4cm～5cm丛生芽。
S5：将丛生芽转接到以改良型WPM培养基为基本培养基的生根培养基中，使丛生芽 生根形成柳树苗。
具体的，包括以下步骤：
S51：制备生根培养基。
生根培养基以上述改良型WPM培养基为基本培养基。生根培养基为每升所述改良型的WPM培养基添加0.75mg～0.85mg的萘乙酸、950mg～ 1050mg的活性炭。
作为一种较佳的实施方式，生根培养基为每升改良型的WPM培养基中添加0.8mg的萘乙酸、1000mg的活性炭。
S52：将高达4cm～5cm的丛生芽切接成单芽。
S53：将单芽转接在生根培养基中，培养32天后即可生根成柳树试管苗。柳树试管苗成苗培养期间，外部环境以普通日光灯为光源，光照强度为 1500-2000Lx，每天光照时间为20小时，温度25±2℃，相对湿度在65％～ 70％。
S54：炼苗、栽培。
将柳树试管苗在常温下开瓶进行炼苗2天。
取出并洗净柳树试管苗，将洗净的柳树试管苗移栽到基质(质量比为石炭土：蛭石＝1：2)保持温度24℃左右，相对湿度75％左右，培养两个星期可适应存活，柳树试管苗成活率达70％，比采用播种成苗的成活率提高30％左右。
柳树自然杂交的种子很细小，千粒重约为0.4克，而在室内杂交的柳树种子千粒重更小。直接利用室内杂交的柳树种子播种成苗，后期的成苗率极低。本发明柳树幼胚成苗组织培养方法尤为适用于室内杂交柳树的种子幼胚成苗，在适宜的时机采集未成熟的室内杂交柳树种子，进而获得柳树幼胚并通过组织培养成柳树树苗，能有效提高室内杂交柳树的种子成苗率。在采用以改良型的WPM培养基为基本培养基的诱导培养基、芽分化培养基以及生根培养基，能使得柳树幼胚组培成苗率达到90％以上。
需要说明的是，本说明书所示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
以上结合实施例对本发明进行了详细说明，本领域中普通技术人员可根据上述说明对本发明做出种种变化例。因而，实施例中的某些细节不应构成对本发明的限定，本发明将以所附权利要求书界定的范围作为保护范围。

Claims (9)

1.一种柳树幼胚成苗组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
采集未成熟的柳树种子；
将所述柳树种子消毒处理并从所述柳树种子中取得幼胚；
将所述幼胚经由诱导培养形成胚性愈伤组织；
将所述胚性愈伤组织经由芽分化培养形成丛生芽；
将所述丛生芽经由生根培养形成柳树苗。
2.根据权利要求1所述的柳树幼胚成苗组织培养方法，其特征在于，所述采集未成熟的柳树种子的步骤包括于柳树蒴果的果皮开裂前且所述果皮呈黄色时，从所述柳树蒴果中采集所述柳树种子。
3.根据权利要求1所述的柳树幼胚成苗组织培养方法，其特征在于，所述将所述幼胚经由诱导培养形成胚性愈伤组织步骤包括将所述幼胚无菌接种到诱导培养基中，使所述幼胚形成所述胚性愈伤组织。
4.根据权利要求3所述的柳树幼胚成苗组织培养方法，其特征在于，所述将所述胚性愈伤组织经由芽分化培养形成丛生芽步骤包括将所述胚性愈伤组织转接到芽分化培养基中，使所述胚性愈伤组织形成所述丛生芽。
5.根据权利要求4所述的柳树幼胚成苗组织培养方法，其特征在于，所述将所述丛生芽经由生根培养形成柳树苗步骤包括将所述丛生芽转接到生根培养基中，使所述丛生芽生根形成所述柳树苗。
6.根据权利要求5所述的柳树幼胚成苗组织培养方法，其特征在于，所述诱导培养基、所述芽分化培养基及所述生根培养基均以改良型WPM培养基为基础培养基，所述改良型WPM培养基包括浓度为270mg/L～290mg/L的NH4NO3、浓度为760mg/L～770mg/L的K2SO4、浓度为90mg/L～110mg/L的KH2PO4、浓度为145mg/L～155mg/L的MgSO4·7H2O以及浓度为390mg/L～400mg/L的Ca(NO3)2·4H2O。
7.根据权利要求6所述的柳树幼胚成苗组织培养方法，其特征在于，所述诱导培养基为每升所述改良型WPM培养基添加0.8mg～1.2mg的二氯苯氧乙酸、2mg～2.4mg的6-苄氨基腺嘌呤、195mg～205mg盐酸硫素。
8.根据权利要求6所述的柳树幼胚成苗组织培养方法，其特征在于，所述芽分化培养基为每升所述改良型WPM培养基添加0.5mg～0.7mg的6-苄氨基腺嘌呤、0.15mg～0.25mg的萘乙酸、290mg～310mg的赤霉素。
9.根据权利要求6所述的柳树幼胚成苗组织培养方法，其特征在于，所述生根培养基为每升所述改良型WPM培养基添加0.75mg～0.85mg的萘乙酸、950mg～1050mg的活性炭。
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