CN116548308A

CN116548308A - 一种柳树外植体用的一步生根培养基及生根组培方法

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Publication number: CN116548308A
Application number: CN202310540486.7A
Authority: CN
Inventors: 卢振宇; 杨欢; 刘健; 许建锋; 焦传礼; 张开心; 刘世杰; 王聪明; 高树涛; 李文斌; 孙艳刚; 周亮
Original assignee: Shandong Binzhou National Agricultural Science And Technology Park Management Service Center Binzhou Yellow River Delta Efficient Ecological Industry Modern Technology Research Institute
Current assignee: Shandong Binzhou National Agricultural Science And Technology Park Management Service Center Binzhou Yellow River Delta Efficient Ecological Industry Modern Technology Research Institute
Priority date: 2023-05-11
Filing date: 2023-05-11
Publication date: 2023-08-08

Abstract

本发明涉及苗木培育技术领域，具体涉及一种柳树外植体用的一步生根培养基及生根组培方法。一步生根培养基的pH值为5.8‑6.0，组分包括MS培养基、NAA、IBA、6‑BA、PVA、蔗糖，生根组培方法为将外植体接种至所述培养基中进行培养30‑60天，外植体生长为生根组培苗。本发明将外植体接种到一步生根培养基上，无需更换培养基即可直接培养出生根的柳树组培苗。与频繁更换继代和生根培养基的传统组培方法相比，本发明极大地简化了柳树组织培养程序，提高了柳树组织培养效率；使用本发明进行柳树种苗快繁，可实现工厂化育苗，种苗性状优良；本发明的培养基可以适用于茎尖、茎段和种胚等多种外植体的组培，扩大了外植体的选择范围，提高繁殖效率的同时也具有更强的普适性。

Description

一种柳树外植体用的一步生根培养基及生根组培方法

技术领域

本发明涉及苗木培育技术领域，具体涉及一种柳树外植体用的一步生根培养基及生根组培方法。

背景技术

柳树是杨柳科(Salicaceae)柳属(Salix)植物的通称，在全国范围内均有分布。柳树用途广泛，是常用的园林绿化树种，也是重要的用材林、防护林树种，因此柳树繁育技术的发展对园林绿化行业有着重要的意义。

现有技术中，最常用的柳树扩繁方式是扦插，即从长势较好的柳树上摘取15cm左右的枝条，将其直插在湿润的土壤里使枝条生根发芽生长成完整植株。扦插繁殖虽然能使种苗继承母本的优良性状，但难以实现种苗的工厂化、规模化和商品化，且受环境条件影响较大、种苗成活率受到一定限制。

植物组织培养是柳树的另一种繁育方法。植物组织培养(简称组培)技术是近几十年发展起来的一项无性繁殖新技术。根据植物细胞全能性理论，在无菌条件下，将植物器官或组织(如芽、茎尖、根尖或花药)的一部分切下来作为外植体，通过处理使之露出原生质体，然后接种在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的愈伤组织。在适合的光照、温度、一定的营养物质和激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种组织和器官，进而发育成一棵完整的植株，所得组培苗可以继承母本优良性状。此外，由于组培苗是在培养基中培养生根，实验室中的环境条件易于控制，组培苗培育过程中不受外界自然条件影响、成活率高，因此可实现工厂化、标准化育苗，易于种苗大规模商品化。但由于柳树为多年生木本植物，生长周期长于草本植物，研究难度较大、短期经济效益预期较低，因此对柳树组织培养的研究较少，柳树的组培技术未得到大规模的应用。

在现有的柳树组培方法中，外植体的可选范围较小，一般仅采用分化能力强的新生茎尖和种胚作为外植体；组培过程需对外植体进行初代培养、继代培养和生根培养，通过初代培养和继代培养使外植体脱分化和再分化，得到无根组培苗；再通过生根培养诱导无根组培苗生根。因继代培养和生根培养过程中需要使用两种不同成分的培养基，这样的组培方式操作较为繁琐、需耗费较多的人力物力，同时由于需更换培养基，过程中组培苗产生损伤或无菌条件控制不彻底进而遭到污染的风险较高。

发明内容

针对现有柳树组培技术中外植体可选择范围小、过程中需要更换培养基、操作繁琐、损伤和污染风险高等问题，本发明提供一种柳树外植体用的一步生根培养基及生根组培方法。将柳树外植体接种到一步生根培养基上，无需更换培养基即可直接培养出生根的柳树组培苗，极大地简化了柳树组织培养程序，缩短了柳树组培苗培养时间，提高了柳树组织培养的效率，节省了大量人力物力和时间成本；使用本发明进行柳树种苗快繁，可实现工厂化育苗，种苗性状优良；本发明的培养基可以适用于茎尖、茎段和种胚等多种外植体的组培，扩大了外植体的选择范围，提高繁殖效率的同时也具有更强的普适性。

第一方面，本发明提供一种柳树外植体用的一步生根培养基，一步生根培养基的pH值为5.8-6.0，组分包括MS培养基、NAA、IBA、6-BA、PVA、蔗糖。

针对一步生根培养基各组分的说明如下：

NAA即萘乙酸，是一种生长素类似物，常用于扦插生根，也可用在组培培养基中，作用是促进植物根系生长，诱导植物产生不定根；

IBA即吲哚乙酸，是一种生长素类似物，能起到诱导植物生根的作用；

6-BA即6-苄氨基腺嘌呤，是一种细胞分裂素类似物，可促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织的发生；

PVA即聚乙烯醇，是一种有机高分子聚合物，具有良好的机械性能和高生物相容性，低浓度PVA加入培养基可以促进植物细胞代谢。在培养基中加入少量PVA可以有效减轻玻璃化这一严重影响组培苗质量的现象，还可以平衡激素水平，降低培养基pH。

蔗糖可以作为能量物质供给植物生长，还可以诱导愈伤组织的再分化，促进植物生根。一定浓度的蔗糖能更好地维持培养基内的低渗环境，避免植物因失水导致生长不良。

进一步的，在一步生根培养基中，NAA的浓度为0.5mg/L、IBA的浓度为0.5mg/L、6-BA的浓度为0.5mg/L、PVA的浓度为2.0g/L、蔗糖的浓度为15.0g/L。

进一步的，MS培养基的主要成分及使用浓度为：NH₄NO₃ 1650mg/L、KNO₃ 1900mg/L、CaCl₂·2H₂O 440mg/L、MgSO₄·7H₂O 370mg/L、KH₂PO₄ 170mg/L、KI 0.83mg/L、H₃BO₃ 6.2mg/L、MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CuSO₄·5H₂O0.025mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2.0mg/L。

进一步的，一步生根培养基为使用MS培养基、PVA与NAA母液、6-BA母液、IBA母液、蔗糖复配而成，在MS培养基成分与各母液混合后，使用1mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至5.8-6.0。

其中，NAA母液的配制方法为：使用微量95％酒精预溶NAA固体，再加入蒸馏水定容；

IBA母液的配制方法为：使用微量0.1mol/L氢氧化钠溶液或0.1mol/L盐酸溶液预溶IBA固体，再加入蒸馏水定容；

6-BA母液的配制方法为：使用微量95％酒精或0.1mol/L的氢氧化钠溶液预溶6-BA固体，再加入蒸馏水定容。

母液配制过程中，因NAA、IBA、6-BA均不溶或难溶于水，故需要酸碱溶液或有机溶剂作为预溶剂助溶，预溶剂用量为配制每升母液使用6-8滴。

第二方面，本发明提供一种使用上述一步生根培养基进行生根组培的方法，将外植体接种至一步生根培养基中直接培养为生根组培苗，接种后30天左右开始生根，最多60天可达到移栽标准，培养时间为30-60天。

进一步的，培养温度为24-26℃，培养过程中每天光照14-16h，光照度为1500-2000lx。

进一步的，外植体经过预处理，外植体选自柳树的茎尖、茎段、种胚，预处理包括消毒处理。木本植物不同的组织或部位处于不同的生长阶段或生理状态，在器官发生能力上存在着较大的差距，因此并不是每个器官和组织都能用于组织培养，使用本发明的技术方案可使用茎尖、茎段和种胚等多种外植体原料，扩大外植体的选择范围，在提高效率的同时具有更强的普适性。

进一步的，当外植体为柳树的茎尖时，预处理依次包括剪去茎尖的叶片、消毒处理、剪取0.5-1.0cm长的茎尖，制得茎尖外植体。

进一步的，当外植体为柳树的茎段时，预处理依次包括剪去茎段的叶片、消毒处理、剪取留1-2个腋芽或顶芽的1-2cm长茎段，制得茎段外植体。

进一步的，当外植体为柳树的种胚时，种胚的制备步骤包括：

(1)在柳树蒴果果皮呈黄色且开裂前采集未成熟柳树种子；

(2)将采集到的未成熟柳树种子除去外种皮、中种皮和内种皮，分离出种胚；

预处理为对种胚进行消毒处理。

进一步的，消毒处理的具体步骤为：在无菌操作台下依次对外植体用70％的酒精处理30s、8％的次氯酸钠溶液处理7min、无菌水冲洗3-5次，然后用无菌滤纸吸去外植体表面的水分。使用70％酒精和8％的次氯酸钠进行外植体消毒，避免了使用氯化汞等有毒的消毒剂，同时与传统20％次氯酸钠消毒液相比，8％的次氯酸钠溶液不会因浓度过高灼伤叶片导致叶片黄化，更适合对外植体进行消毒，不仅能保证消毒效果，还减少了有毒试剂对自然环境的污染和对操作人员的毒害，使用次氯酸钠还能起到降低处理成本的效果。

生根组培过程中，当外植体生长为生根组培苗后，对其进行闭口炼苗、开口炼苗、移栽驯化，最后移栽至大田中。具体步骤为：

(1)闭口炼苗、开口炼苗，选取生长健壮、叶色正常、根数≥5条、最大根长≥8cm的生根组培苗，温室自然光闭口炼苗10-15天，开口炼苗5-9天，炼苗期间温度保持22-28℃，使用60％-70％的遮阴网遮阴。

(2)移栽驯化，炼苗结束、小苗长出新叶后，洗净残留在组培苗上的培养基，移栽到无纺布容器中驯化。栽培基质采用细河沙+珍珠岩+草炭土，其体积比为1∶1∶2，使用前12-24h用0.5％-0.7％的高锰酸钾消毒，驯化期间保持温度20-30℃，空气湿度70％-80％，光照强烈时可适度遮光，每7-10天喷施叶面肥一次，经过25-30天驯化后即可移栽至大田。

移栽驯化后幼苗转移到大田，移栽苗统一使用泡沫箱包装，可再加外包装，装车时切勿倒置。选用有遮阴设施的车辆进行运输，高温和严寒季节则选用冷藏车。运输途中温度保持8-15℃，路途时间不能超过48h。

对生根组培苗进行闭口炼苗、开口炼苗、移栽驯化，移栽驯化过程中辅以喷施叶面肥和高锰酸钾消毒，使组培苗在移栽初期生长健壮且不被细菌真菌感染发生病变。另外，在炼苗过程之后，本技术给出了幼苗移出组培瓶后转移到大田过程中包括包装、运输、温度保持等注意事项，降低运输过程对种苗的损失。

本发明的有益效果在于：

1.本发明将柳树外植体预处理后接种于一步生根培养基中，经过培养后可直接获得生根组培苗，省去了将继代培养的无根苗接种到生根培养基上生根的步骤，组培过程中无需更换培养基，缩短了柳树组培苗培养时间，极大地简化了柳树组织培养程序，提高了柳树组织培养的效率，节省了大量人力物力和时间成本，降低了对组培苗进行二次接种产生损伤和更换培养基过程中产生污染的风险。

2.使用本发明的组培技术进行柳树种苗快繁，可使生产出的种苗继承母本的优良特性，组培过程不受季节和环境条件的制约，能显著提高繁殖速率，快速获得一些优良柳树品种和理想的受体材料，为柳树的转基因育种提供技术支持；同时可以更为简便高效地实现柳树的工厂化育苗，规模化培育根系发达的柳树无菌苗，易于商品化。

3.本发明的一步生根培养基可以适用于茎尖、茎段、种胚等多种外植体，扩大了外植体的选择范围，在提高繁殖效率的同时也具有更强的普适性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例2培养过程的照片。

图2是实施例2培养35天后生根组培苗的长势状态图。

图3是实施例2培养35天后生根组培苗根系的长势状态图。

图4是实施例2培养45天后生根组培苗的长势状态图。

图5是实施例2培养45天后生根组培苗根系的长势状态图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种柳树外植体用的一步生根培养基，一步生根培养基使用MS培养基、PVA、蔗糖、NAA母液、IBA母液、6-BA母液复配而成，pH值为5.8-6.0，其中NAA：0.5mg/L、IBA：0.5mg/L、6-BA：0.5mg/L、PVA：2g/L、蔗糖：15g/L。

MS培养基可使用市售产品或采用固定配方制作，实施例1中MS培养基为采用固定配方制作，主要成分及使用浓度为：NH₄NO₃ 1650mg/L、KNO₃ 1900mg/L、CaCl₂·2H₂O 440mg/L、MgSO₄·7H₂O 370mg/L、KH₂PO₄ 170mg/L、KI 0.83mg/L、H₃BO₃ 6.2mg/L、MnSO₄·4H₂O22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2.0mg/L。

NAA母液的质量浓度为40mg/L，配制方法为取0.04gNAA，用6-8滴95％酒精预溶，再加蒸馏水定容至1L；

IBA母液的质量浓度为300mg/L，配制方法为取0.3g6-BA，用6-8滴0.1mol/L氢氧化钠溶液预溶，再加蒸馏水定容至1L；

6-BA母液的质量浓度为100mg/L配制方法为取0.1gIBA，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液预溶，再加蒸馏水定容至1L。

一步生根培养基的制备方法为：取NAA母液12.50mL、IBA母液1.67mL、6-BA母液5.00mL、蔗糖15g，与2gPVA混合，后加入MS培养基并使用1mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至5.8-6.0，定容为1L。得到一步生根培养基。

实施例2

一种使用实施例1的一步生根培养基进行生根组培的方法，外植体为柳树的茎尖，选择仁居柳2号作为外植体的取样品种。选取1-2年生生长健壮、具有品种典型性状的优良单株，取幼苗外围当年生幼嫩枝条，采集时间在3-4月。

具体步骤为：

(1)制备外植体，对采集到的柳树茎尖进行预处理，剪去茎尖的叶片，用肥皂水擦洗，然后用自来水冲洗干净，再在无菌操作台下依次用70％酒精处理30s，8％次氯酸钠溶液处理7min，无菌水冲洗3-5次，用无菌滤纸吸去茎尖表面的水分后剪取0.5-1.0cm长的茎尖，制得茎尖外植体，转入已消毒的培养皿中备用；

(2)外植体接种，在无菌状态下，将培养皿中的茎尖外植体用镊子直插式接种于盛有实施例1制备的一步生根培养基的培养瓶中，每瓶接种2-3个，接种后及时捆绑封口膜；

(3)一步生根培养，将培养瓶中的茎尖外植体直接培养为生根组培苗，培养温度为24-26℃，每天光照14-16h，光照度1500-2000lx。

步骤(3)培养过程中，当外植体生长为生根组培苗后，选取生长健壮、叶色正常、根数≥5条、最大根长≥8cm的生根组培苗，温室自然光闭口炼苗10-15天，开口炼苗5-9天，炼苗期间温度保持22-28℃，使用60％-70％的遮阴网遮阴；小苗长出新叶后，洗净残留在组培苗上的培养基，移栽到无纺布容器中驯化。栽培基质采用细河沙+珍珠岩+草炭土，其体积比为1∶1∶2，使用前12-24h用0.5％-0.7％的高锰酸钾消毒，驯化期间保持温度20-30℃，空气湿度70％-80％，光照强烈时可适度遮光，每7-10天喷施叶面肥一次，经过25-30天驯化后即可移栽至大田。

实施例3

一种使用实施例1的一步生根培养基进行柳树组培的方法，外植体为柳树的茎段，选择仁居柳2号作为外植体的取样品种。选取1-2年生生长健壮、具有品种典型性状的优良单株，取幼苗外围当年生幼嫩枝条，采集时间在3-4月。

具体步骤为：

(1)制备外植体，对采集到的柳树茎段进行预处理，剪去茎段的叶片，用肥皂水擦洗，然后用自来水冲洗干净，再在无菌操作台下依次用70％酒精处理30s，8％次氯酸钠溶液处理7min，无菌水冲洗3-5次，用无菌滤纸吸去茎段表面的水分后剪取留1-2个腋芽或顶芽的1-2cm长茎段，制得茎段外植体，转入已消毒的培养皿中备用；

(2)外植体接种，在无菌状态下，将培养皿中的茎段外植体用镊子直插式接种于盛有实施例1制备的一步生根培养基的培养瓶中，每瓶接种2-3个，接种后及时捆绑封口膜；

(3)一步生根培养，将茎段外植体培养瓶中的外植体直接培养为生根组培苗，培养温度为24-26℃，每天光照14-16h，光照度1500-2000lx。

实施例4

一种使用实施例1的一步生根培养基进行柳树组培的方法，外植体为柳树的种胚，选择仁居柳2号作为外植体的取样品种。选取1-2年生生长健壮、具有品种典型性状的优良单株，在柳树蒴果果皮呈黄色且开裂前采集未成熟的柳树种子，种子采集时间为10月上中旬，沙藏贮存70-90天。种核除去外种皮、中种皮和内种皮，分离出种胚。

具体步骤为：

(1)制备外植体，对采集到的柳树种胚进行预处理，用肥皂水擦洗，然后用自来水冲洗干净，再在无菌操作台下依次用70％酒精处理30s，8％次氯酸钠溶液处理7min，无菌水冲洗3-5次，用无菌滤纸吸去种胚表面的水分，制得种胚外植体，转入已消毒的培养皿中备用；

(2)外植体接种，在无菌状态下，将培养皿中的种胚外植体用镊子直插式接种于盛有实施例1制备的一步生根培养基的培养瓶中，每瓶接种2-3个，接种后及时捆绑封口膜；

(3)一步生根培养，将培养瓶中的种胚外植体直接培养为生根组培苗，培养温度为24-26℃，每天光照14-16h，光照度1500-2000lx。

步骤(3)培养过程中，当外植体生长为生根组培苗后，选取生长健壮、叶色正常、根数≥5条、最大根长≥8cm的组培苗，温室自然光闭口炼苗10-15天，开口炼苗5-9天，炼苗期间温度保持22-28℃，使用60％-70％的遮阴网遮阴；小苗长出新叶后，洗净残留在组培苗上的培养基，移栽到无纺布容器中驯化。栽培基质采用细河沙+珍珠岩+草炭土，其体积比为1∶1∶2，使用前12-24h用0.5％-0.7％的高锰酸钾消毒，驯化期间保持温度20-30℃，空气湿度70％-80％，光照强烈时可适度遮光，每7-10天喷施叶面肥一次，经过25-30天驯化后即可移栽至大田。

统计实施例2-4组培35天后的生根率及移栽后成活率，得到实施例2-4组培35天后的生根率为100％，平均移栽后成活率为99.8％。

作为对比，使用传统配方及组培方法对仁柳居2号柳树的种胚外植体进行初代培养、继代培养和生根培养，培养过程共需60-80天，培养后生根率率为94.2％，移栽后成活率为98.3％。

对实施例2-4组培35天后的平均根数、平均单棵最大根长，组培35天及45天后的平均根长进行统计，结果如表1所示。

表1实施例2-4组培后平均根数及根长

其中，平均单棵最大根长为单个实施例中所有生根组培苗最大根长的平均数；平均根长的计算方法为单个实施例中(所有生根组培苗全部根的长度和/所有生根组培苗的根数和)。

尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种柳树外植体用的一步生根培养基，其特征在于，一步生根培养基的pH值为5.8-6.0，组分包括MS培养基、NAA、IBA、6-BA、PVA、蔗糖。

2.如权利要求1所述的一步生根培养基，其特征在于，一步生根培养基中：NAA的浓度为0.5mg/L、IBA的浓度为0.5mg/L、6-BA的浓度为0.5mg/L、PVA的浓度为2.0g/L、蔗糖的浓度为15.0g/L。

3.一种使用如权利要求1所述的一步生根培养基进行生根组培的方法，其特征在于，将外植体接种至一步生根培养基中直接培养为生根组培苗，培养时间为30-60天。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，培养温度为24-26℃，培养过程中每天光照14-16h，光照度为1500-2000lx。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，外植体经过预处理，外植体选自柳树的茎尖、茎段、种胚，预处理包括消毒处理。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，外植体为柳树的茎尖，预处理依次包括剪去茎尖的叶片、消毒处理、剪取0.5-1.0cm长的茎尖。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，外植体为柳树的茎段，预处理依次包括剪去茎段的叶片、消毒处理、剪取留1-2个腋芽或顶芽的1-2cm长茎段。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，外植体为柳树的种胚，种胚的制备步骤包括：

(1)在柳树蒴果果皮呈黄色且开裂前采集未成熟柳树种子；

预处理为对种胚进行消毒处理。

9.如权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，消毒处理的具体步骤为：在无菌操作台下依次对外植体用70％的酒精处理30s、8％的次氯酸钠溶液处理7min、无菌水冲洗3-5次，然后用无菌滤纸吸去外植体表面的水分。