CN109392716A - 一种及已叶片再生体系的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种及已叶片再生体系的建立方法，及已采用常规的方法繁殖系数低,生长周期长，同时易受外界环境条件等因素的影响。而采用组织培养的方法，繁殖系数高，可以在任意生长阶段进行选材扩繁，对及已优良品种的选育和工厂化育苗提供了便利的条件。本发明以及已叶片为外植体，经过分化培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等步骤获得了及已叶片离体再生植株，建立了及已叶片再生体系，为今后工厂化育苗及驯化栽培奠定坚实的基础，从而解决及已引种驯化难度高的问题。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种及已叶片再生体系的建立方法。
背景技术
及已为金粟兰科植物，取其干燥根及根茎作为药用植物。气芳香，味微苦。具有祛风除湿，活血散瘀。用于跌打损伤，风湿麻木，筋骨疼痛，疥疮，疖肿及蛇咬伤。随着人们开发力度的加大，植物种群的数量急剧下降。因此应该釆取一些必要的保护措施和方法，以维护野生种质资源的数量。及已的野生资源极其有限，近年来人们任意的采摘和盲目的挖掘，使其数量遭到了严重的破坏。主要采用播种、扦插、嫁接等方式进行繁殖，但繁殖系数低，生长周期长，同时易受外界环境条件等因素的影响。而釆用组织培养的方法，繁殖系数高，可以在任意生长阶段进行选材扩繁，对及已优良品种的选育和工厂化育苗提供了便利的条件。本发明以及已叶片为外植体，经过分化培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等步骤获得了及已叶片离体再生植株，建立了及已叶片再生体系，为今后工厂化育苗及驯化栽培奠定坚实的基础。对比文件1，申请号：CN201711305198，发明名称：一种粉防己种苗的组培方法，包括选取粉防己带腋芽茎段作为外植体，灭菌后接种到MS培养基中进行培养，然后进行诱导培养、继代培养、生根培养和炼苗。本案与对比文件的不相同。
发明内容
本发明的目的在于提供以及已叶片为外植体，经过分化培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等步骤获得了及已叶片离体再生植株，建立了及已叶片再生体系，从而实现了一种及已叶片再生体系的建立方法。
本发明的一种及已叶片再生体系的建立方法，包括以下的步骤：
步骤1，外植体消毒：采集及已健康植株细嫩叶片，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗3.5h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒15.5s后用无菌水洗6次，再用0.1%升汞溶液消毒9min，用无菌水冲洗7次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用；
步骤2，分化培养：将经步骤1处理后的叶片叶柄切除，用无菌解剖刀在叶片上轻划几刀，以叶背面与培养基接触的方式接种于分化培养基中进行愈伤组织及丛生芽诱导,接种后先在29℃条件下全暗培养31天，然后置于每天光照17小时，光照强度为4100lx，置于培养温度为29℃的条件下培养26天后统计愈伤组织诱导率，41天后统计分化率；分化培养基为：MS+0.6mg/L TDZ+1.1mg/L IBA+31g/L蔗糖+6.1g/L琼脂，pH为5.3；
步骤3，增殖培养：将步骤2诱导分化产生的带有丛生芽的愈伤组织分割成0.6cm左右的小块并接种到继代培养培养基进行增殖培养,接种后先在29℃条件下全暗培养8天，然后置于每天光照17小时，光照强度为2900lx，培养温度为29℃的条件下培养51天后以不定芽长度≥1.1cm为有效芽统计增殖倍数；继代培养基为：MS+1.1mg/L TDZ+0.6mg/L IBA+31g/L蔗糖+6.1g/L琼脂，pH为5.3；
步骤4，生根培养：选取步骤3生长状态一致的组培苗，剪成3.5cm长的茎段并接种至生根培养中诱导生根,接种后置于每天光照17小时，光照强度为5100lx，培养温度为29℃的条件下培养41天后观察苗的生长状况并统计生根率；生根培养基为：1/2MS+3.5mg/L IBA+2.1mg/L ABT1+31g/L蔗糖+6.1g/L琼脂，pH为5.3；
步骤5，炼苗移栽：选取经生根培养后，根系发达且植株生长健壮的组培苗进行炼苗移栽，首先洗去组培苗基部附着的琼脂，之后将其移栽到事先浇透的河沙基质中，之后向小苗进行喷雾，搭建简易塑料拱棚，保证棚内空气相对湿度达99%，覆盖塑料薄膜，以保证炼苗期间棚内的湿度，之后逐渐掀膜通风透光并注意棚内的湿度，沙培26天后，将其移栽至由草炭土:腐殖土:珍珠岩=3:1:1组成的混合基质中，栽植后绕浇透水，日常养护时注意保证盆土湿润忌积水，并时常向叶片喷水，移栽21天后统计移栽成活率。
与现有技术相比本发明的优点是：繁殖系数高，可以在任意生长阶段进行选材扩繁，对优良品种的选育和工厂化育苗提供了便利的条件。经过分化培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等步骤获得了离体再生植株，建立了再生体系，为今后工厂化育苗及驯化栽培奠定坚实的基础,从而解决引种驯化难度高的问题。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1：
（1）外植体消毒：采集及已健康植株细嫩叶片，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗3h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒9s后用无菌水洗4次，再用0.1%升汞溶液消毒6min，用无菌水冲洗6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用。
（2）分化培养：将经步骤（1）处理后的叶片叶柄切除，用无菌解剖刀在叶片上轻划几刀，以叶背面与培养基接触的方式接种于分化培养基中进行愈伤组织及丛生芽诱导。接种后先在26℃条件下全暗培养21天，然后置于每天光照15小时，光照强度为3100lx，置于培养温度为26℃的条件下培养26天后统计愈伤组织诱导率为97%，41天后统计分化率为98%。所述的分化培养基为：MS+1.6mg/L TDZ+0.4mg/L IBA+26g/L蔗糖+4.8g/L琼脂，pH为5.9。
（3）增殖培养：将步骤（2）诱导分化产生的带有丛生芽的愈伤组织分割成0.6cm左右的小块并接种到继代培养培养基进行增殖培养。接种后先在26℃条件下全暗培养6天，然后置于每天光照15小时，光照强度为3100lx，培养温度为26℃的条件下培养51天后以不定芽长度≥1.1cm为有效芽统计增殖倍数为36。所述的继代培养基为：MS+0.6mg/L TDZ+0.2mg/L IBA+31g/L蔗糖+3.6g/L琼脂，pH为5.9。
（4）生根培养：选取步骤（3）生长状态一致的组培苗，剪成4cm长的茎段并接种至生根培养中诱导生根。接种后置于每天光照15小时，光照强度为3600lx，培养温度为26℃的条件下培养41天后生根率94%。所述的生根培养基为：1/2MS+1.6mg/L IBA+1.1mg/L ABT1+16g/L蔗糖+3.6g/L琼脂，pH为5.9。
（5）炼苗移栽：选取经生根培养后，根系发达且植株生长健壮的组培苗进行炼苗移栽，首先洗去组培苗基部附着的琼脂，之后将其移栽到事先浇透的河沙基质中，之后向小苗进行喷雾，搭建简易塑料拱棚，保证棚内空气相对湿度达99%，覆盖塑料薄膜，以保证炼苗期间棚内的湿度，之后逐渐掀膜通风透光并注意棚内的湿度，沙培16天后，将其移栽至由草炭土:腐殖土:珍珠岩=3:1:1组成的混合基质中，栽植后绕浇透水，日常养护时注意保证盆土湿润忌积水，并时常向叶片喷水，移栽21天后统计移栽成活率为94%。
实施例2：
（1）外植体消毒：采集及已健康植株细嫩叶片，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗5h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒11s后用无菌水65次，再用0.1%升汞溶液消毒9min，用无菌水冲洗6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用。
（2）分化培养：将经步骤（1）处理后的叶片叶柄切除，用无菌解剖刀在叶片上轻划几刀，以叶背面与培养基接触的方式接种于分化培养基中进行愈伤组织及丛生芽诱导。接种后先在28℃条件下全暗培养26天，然后置于每天光照16小时，光照强度为3600lx，置于培养温度为28℃的条件下培养26天后统计愈伤组织诱导率为94%，41天后统计分化率为92%。所述的分化培养基为：MS+2.1mg/L TDZ+0.1mg/L IBA+26g/L蔗糖+5.6g/L琼脂，pH为5.6。
（3）增殖培养：将步骤（2）诱导分化产生的带有丛生芽的愈伤组织分割成0.6cm左右的小块并接种到继代培养培养基进行增殖培养。接种后先在28℃条件下全暗培养8天，然后置于每天光照16小时，光照强度为4100lx，培养温度为28℃的条件下培养51天后以不定芽长度≥1.1cm为有效芽统计增殖倍数为34。所述的继代培养基为：MS+1.1mg/L TDZ+0.2mg/LIBA+31g/L蔗糖+4.9g/L琼脂，pH为5.6。
（4）生根培养：选取步骤（3）生长状态一致的组培苗，剪成5cm长的茎段并接种至生根培养中诱导生根。接种后置于每天光照14小时，光照强度为3600lx，培养温度为28℃的条件下培养41天后生根率96%。所述的生根培养基为：1/2MS+1.9mg/L IBA+1.1mg/L ABT1+31g/L蔗糖+5.6g/L琼脂，pH为5.6。
（5）炼苗移栽：选取经生根培养后,根系发达且植株生长健壮的组培苗进行炼苗移栽,首先洗去组培苗基部附着的琼脂,之后将其移栽到事先浇透的河沙基质中,之后向小苗进行喷雾,搭建简易塑料拱棚,保证棚内空气相对湿度达99%，覆盖塑料薄膜,以保证炼苗期间棚内的湿度,之后逐渐掀膜通风透光并注意棚内的湿度,沙培25天后，将其移栽至由草炭土:腐殖土:珍珠岩=3:1:1组成的混合基质中，栽植后绕浇透水,日常养护时注意保证盆土湿润忌积水,并时常向叶片喷水，移栽21天后统计移栽成活率97%。
Claims (1)
1.一种及已叶片再生体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1，外植体消毒：采集及已健康植株细嫩叶片，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗3.5h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒15.5s后用无菌水洗6次，再用0.1%升汞溶液消毒9min，用无菌水冲洗7次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用；
步骤2，分化培养：将经步骤1处理后的叶片叶柄切除，用无菌解剖刀在叶片上轻划几刀，以叶背面与培养基接触的方式接种于分化培养基中进行愈伤组织及丛生芽诱导,接种后先在29℃条件下全暗培养31天，然后置于每天光照17小时，光照强度为4100lx，置于培养温度为29℃的条件下培养26天后统计愈伤组织诱导率，41天后统计分化率；分化培养基为：MS+0.6mg/L TDZ+1.1mg/L IBA+31g/L蔗糖+6.1g/L琼脂，pH为5.3；
步骤3，增殖培养：将步骤2诱导分化产生的带有丛生芽的愈伤组织分割成0.6cm左右的小块并接种到继代培养培养基进行增殖培养,接种后先在29℃条件下全暗培养8天，然后置于每天光照17小时，光照强度为2900lx，培养温度为29℃的条件下培养51天后以不定芽长度≥1.1cm为有效芽统计增殖倍数；继代培养基为：MS+1.1mg/L TDZ+0.6mg/L IBA+31g/L蔗糖+6.1g/L琼脂，pH为5.3；
步骤4，生根培养：选取步骤3生长状态一致的组培苗，剪成3.5cm长的茎段并接种至生根培养中诱导生根,接种后置于每天光照17小时，光照强度为5100lx，培养温度为29℃的条件下培养41天后观察苗的生长状况并统计生根率；生根培养基为：1/2MS+3.5mg/L IBA+2.1mg/L ABT1+31g/L蔗糖+6.1g/L琼脂，pH为5.3；
步骤5，炼苗移栽：选取经生根培养后，根系发达且植株生长健壮的组培苗进行炼苗移栽，首先洗去组培苗基部附着的琼脂，之后将其移栽到事先浇透的河沙基质中，之后向小苗进行喷雾，搭建简易塑料拱棚，保证棚内空气相对湿度达99%，覆盖塑料薄膜，以保证炼苗期间棚内的湿度，之后逐渐掀膜通风透光并注意棚内的湿度，沙培26天后，将其移栽至由草炭土:腐殖土:珍珠岩=3:1:1组成的混合基质中，栽植后浇透水，日常养护时注意保证盆土湿润忌积水，并时常向叶片喷水，移栽21天后统计移栽成活率。
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