CN108040872B - 一种白菊的离体快速繁殖培养方法 - Google Patents

一种白菊的离体快速繁殖培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种白菊的离体快速繁殖培养方法，属于植物组织培养技术领域，本发明选取外植体的灭菌处理，通过愈伤组织诱导、不定芽诱导、不定芽增值、壮苗培养、生根培养和炼苗移栽后，得到白菊的完整植株；本发明通过对仙女杯属白菊的组织培养诱导研究，建立了白菊的组织培养快繁体系，具有诱导效率高、增殖系数高、根系发达、移栽成活率高、生长周期短等特点，大大提高了白菊的育苗效率，增加白菊的繁殖方法，为多肉植物白菊的研究和开发利用提供理论数据，为白菊种苗产业化、市场化提供技术支持。

Description

一种白菊的离体快速繁殖培养方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体的说，涉及一种白菊的离体快速繁殖培养方法。
背景技术
白菊，又名格瑞内（Dudleya greenei），为景天科仙女杯属多肉植物，叶片无毛，生长在莲座基部，叶片颜色通常从绿色至灰色，观赏价值较高。原产墨西哥及美国，现世界多地可栽培。白菊喜温暖干燥和阳光充足环境，不耐寒，耐半阴和干旱，怕水湿和强光暴晒，夏天有休眠期。需要接受充足日照叶色才会艳丽，株型才会更紧实美观。日照太少则叶色浅，叶片排列松散，拉长。
目前，白菊无法叶插繁殖，只能采用播种与砍头进行繁殖，繁殖方式单一，种源稀少，繁殖速度较慢。播种繁殖难于维持母株的优良性状，砍头繁殖影响母株的美观效果，两种繁殖方式都存在很大的局限性，造成市场价值较高，非常不利于白菊的种植推广。
发明内容
为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种白菊的离体快速繁殖培养方法，建立了白菊的组织培养快繁体系，增加白菊的繁殖方法，为多肉植物白菊的研究和开发利用提供理论数据，为白菊种苗产业化、市场化提供技术支持。
为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
所述的白菊的离体快速繁殖培养方法，具体包括以下步骤：
（1）外植体的灭菌处理：选取外植体用自来水清洗表面的赃物，流水冲洗30min-40min，在超净工作台上用75%酒精侵泡30s，无菌水清洗3-4次，再用0.1%升汞滴入2滴吐温消毒6-10min，期间不时振荡，无菌水冲洗4-5次，用无菌滤纸吸干水分，切去切口消毒受伤的部分；
（2）愈伤组织诱导：将步骤（1）得到的消毒后的外植体接种于愈伤组织诱导培养基MS+0.5-1 .0mg/L6-BA+0.01-0.1mg/LNAA+0.1-0.5mg/LKT+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，诱导培养3-5d后外植体基部开始萌动膨大，培养 7-14d 后基部周围形成团状愈伤组织；
（3）不定芽诱导：将步骤（2）诱导形成的愈伤组织切割成0.4-0.8cm大小的切块，接种到不定芽诱导培养基MS+0.2-0.6mg/L6-BA+0.01-0.1mg/LNAA+0.05-0.1mg/LKT+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，诱导培养5-7d后愈伤组织开始分化形成不定芽；
（4）不定芽增殖：将步骤（3）得到的不定芽分割成2-4株为一丛，接种到增殖培养基MS+0.2-0.6mg/L6-BA+0.05-0.2mg/LNAA+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，培养30-40d后，增殖3-5倍；
（5）壮苗培养：将步骤（4）得到的增殖苗分割成2-3株为一丛，接种到壮苗培养基MS+0.2-0.6mg/L6-BA+0.1-0.3mg/LNAA+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，培养40-50d后，形成1.5-2cm的小苗株；
（6）生根培养：将步骤（5）中得到的小苗株分割成单株接种到生根培养基MS+0.05-0.1mg/L6-BA+0.5-1.0mg/LNAA+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，培养30-40d后，得到生根苗；
（7）炼苗移栽：将步骤（6）得到的生根苗移到温室内驯化5-7d，然后取出苗洗净植株根系附着培养基，用50%多菌灵可湿性粉剂800倍～1000倍全株浸泡10 min，取出放置于阴凉处晾干水分，栽植于基质中，遮光70-80%，保持通风，相对湿度60-80%；栽植2周后逐渐增加光照；3-4周后，植株开始生长，发新根，得到白菊完整植株。
进一步的，步骤（1）中，所述外植体为白菊的侧芽。
进一步的，步骤（2）-步骤（6）中，培养条件为温度20±2℃、光照强度3000～5000lx、光照15h/d，相对湿度 50-60％。
进一步的，步骤（7）中，生根苗放置于阴凉处晾干水分至苗轻微萎焉。
进一步的，步骤（7）中，所述基质包括腐殖土、蛭石、珍珠岩，其比例为1：1：1。
进一步的，步骤（7）中，生根苗栽植于基质后，每周喷施一次1/4MS营养液和0.1%多菌灵。
本发明的有益效果：
1、本发明通过建立白菊的组织培养快繁体系，解决了白菊不能叶插繁殖，只能靠砍头繁殖和播种繁殖的局限，增加仙女杯属植物白菊的繁殖方式，有效的增加了市场的供应，为广大爱好者提供优良充足的种苗来源；
2、本发明通过对白菊侧芽进行诱导培养，愈伤组织诱导率达到90%以上，愈伤组织诱导不定芽分化率达到85%以上，繁殖系数达到3-5倍，生根率100％，移栽成活率89％以上，便于工厂化、规模化育苗，为多肉植物白菊的研究和开发利用提供理论数据，为白菊种苗产业化、市场化提供技术支持。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
实施例1
（1）外植体的消毒处理：选择白菊的侧芽作为外植体，用自来水清洗表面的赃物，流水冲洗30min-40min，在超净工作台上用75%酒精侵泡30s，无菌水清洗3-4次，再用0.1%升汞（质量比）滴入2滴吐温消毒6-10min，期间不时振荡，无菌水冲洗4-5次，用无菌滤纸吸干水分，切去切口消毒受伤的部分。
（2）愈伤组织诱导：将步骤（1）得到的外植体接种于愈伤组织诱导培养基MS+0.5-1.0mg/L6-BA+0.01-0.1mg/LNAA+0.1-0.5mg/LKT+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度3000～5000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行诱导培养，培养3-5d基部开始萌动膨大，培养 7-14d 后基部周围形成团状愈伤组织。1周后统计成活苗数，污染率10.5%，成活率达到64%以上。21d后统计白菊侧芽愈伤组织诱导率达到90%以上。
（3）不定芽诱导：将步骤（2）诱导形成的愈伤组织切割成0.4-0.8cm大小的切块，接种到不定芽诱导培养基MS+0.2-0.6mg/L6-BA+0.01-0.1mg/LNAA+0.05-0.1mg/LKT+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度3000～5000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行诱导培养，培养5-7d后愈伤组织开始分化形成不定芽。培养20-30d后统计，愈伤组织诱导不定芽分化率达到85%以上。
（4）不定芽增殖：将步骤3得到的不定芽分割成2-4株为一丛，接种到增殖培养基MS+0.2-0.6mg/L6-BA+0.05-0.2mg/LNAA+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度3000～5000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行增殖培养。培养30-40d后，增殖可达3-5倍。
（5）壮苗培养：将步骤（4）得到的增殖苗分割成2-3株为一丛，接种到壮苗培养基MS+0.2-0.6mg/L6-BA+0.1-0.3mg/LNAA+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度3000～5000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行壮苗培养。培养40-50d后，形成1.5-2cm的小苗株。
（6）生根培养：将步骤（5）中得到的小苗株分割成单株接种到生根培养基MS+0.05-0.1mg/L6-BA+0.5-1.0mg/LNAA+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度3000～5000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行生根培养。培养30-40天，直到株高达到1-2cm，根长2cm以上，即得到生根苗，可移栽，生根率100%。
（7）炼苗移栽：将步骤（6）得到的生根苗移到温室内驯化5-7d，以适应栽培场地的光温条件。然后取出苗洗净植株根系附着培养基，用50%多菌灵可湿性粉剂800倍～1000倍全株浸泡10 min，取出放置于阴凉处晾干水分至苗轻微萎焉，栽植于基质（腐殖土：蛭石：珍珠岩=1:1:1）中，遮光70-80%，保持通风，相对湿度60-80%，每周喷施一次1/4MS营养液和0.1%多菌灵，栽植2周后逐渐增加光照。3-4周后，植株开始生长，发新根，成活率达到89%以上。
实施例2
（1）外植体的消毒处理：选择白菊的侧芽作为外植体，用自来水清洗表面的赃物，流水冲洗30min-40min，在超净工作台上用75%酒精侵泡30s，无菌水清洗3-4次，再用0.1%升汞（质量比）滴入2滴吐温消毒6-10min，期间不时振荡，无菌水冲洗4-5次，用无菌滤纸吸干水分，切去切口消毒受伤的部分，接种到愈伤组织诱导培养基中。
（2）愈伤组织诱导：将步骤（1）得到的外植体接种于愈伤组织诱导培养基MS+0.5-1.0mg/LKT +0.01-0.1mg/LNAA +20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度3000～5000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行诱导培养，培养3-5d基部开始萌动膨大，培养 7-14d 后基部周围形成团状愈伤组织。1周后统计成活苗数，污染率10.5%，成活率达到64%以上。21d后统计白菊侧芽愈伤组织诱导率达到80%以上。
（3）不定芽诱导：将步骤（2）诱导形成的愈伤组织切割成0.4-0.8cm大小的切块，接种到不定芽诱导培养基MS+0.2-0.6mg/L6-BA+0.01-0.1mg/LNAA+0.05-0.1mg/LKT+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度2000～3000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行诱导培养，培养5-7d后愈伤组织开始分化形成不定芽。培养20-30d后统计，愈伤组织诱导不定芽分化率达到80%。
（4）不定芽增殖：将步骤3得到的不定芽分割成2-4株为一丛，接种到增殖培养基MS+0.2-0.6mg/L6-BA+0.05-0.2mg/LNAA+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度2000～3000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行增殖培养。培养30-40d后，增殖达到2-3倍。
（5）壮苗培养：将步骤（4）得到的增殖苗分割成2-3株为一丛，接种到壮苗培养基MS+0.2-0.6mg/L6-BA+0.1-0.3mg/LNAA+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度2000～3000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行壮苗培养。培养40-50d后，形成2-3cm的小苗株。
（6）生根培养：将步骤（5）中得到的小苗株分割成单株接种到生根培养基MS+0.05-0.1mg/L6-BA+0.5-1.0mg/LNAA+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度2000～3000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行生根培养。培养30-40天，直到株高达到2.5-3cm，根长2cm以上，即得到生根苗，可移栽，生根率100%。
（7）炼苗移栽：将步骤（6）得到的生根苗移到温室内驯化5-7d，以适应栽培场地的光温条件。然后取出苗洗净植株根系附着培养基，用50%多菌灵可湿性粉剂800倍～1000倍全株浸泡10 min，取出放置于阴凉处晾干水分至苗轻微萎焉，栽植于基质（腐殖土：珍珠岩=1:1）中，遮光70-80%，保持通风，相对湿度60-80%，每周喷施一次1/4MS营养液和0.1%多菌灵，栽植2周后逐渐增加光照。3-4周后，植株开始生长，发新根，成活率达到75%。
实施例3
（1）外植体的消毒处理：选择白菊的侧芽作为外植体，用自来水清洗表面的赃物，流水冲洗30min-40min，在超净工作台上用75%酒精侵泡30s，无菌水清洗3-4次，再用0.1%升汞（质量比）滴入2滴吐温消毒6-10min，期间不时振荡，无菌水冲洗4-5次，用无菌滤纸吸干水分，切去切口消毒受伤的部分，接种到愈伤组织诱导培养基中。
（2）愈伤组织诱导：将步骤（1）得到的外植体接种于愈伤组织诱导培养基MS+0.5-1.0mg/L6-BA+0.01-0.1mg/LNAA+0.1-0.5mg/LKT+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度2000～3000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行诱导培养，培养3-5d基部开始萌动膨大，培养 7-14d 后基部周围形成团状愈伤组织。1周后统计成活苗数，污染率10.5%，成活率达到64%以上。21d后统计白菊侧芽愈伤组织诱导率达到85%以上。
（3）不定芽诱导：将步骤（2）诱导形成的愈伤组织切割成0.4-0.8cm大小的切块，接种到不定芽诱导培养基MS+0.1-0.5mg/L ZT+0.01-0.1mg/LNAA +20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度3000～5000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行诱导培养，培养5-7d后愈伤组织开始分化形成不定芽。培养20-30d后统计，愈伤组织诱导不定芽分化率达到40%以上。
（4）不定芽增殖：将步骤3得到的不定芽分割成2-4株为一丛，接种到增殖培养基MS+0.2-0.6mg/L6-BA+0.05-0.2mg/LNAA+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度2000～3000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行增殖培养。培养30-40d后，增殖达到2-3倍。
（5）壮苗培养：将步骤（4）得到的增殖苗分割成2-3株为一丛，接种到壮苗培养基MS+0.2-0.6mg/L6-BA+0.1-0.3mg/LlNAA+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度2000～3000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行壮苗培养。培养40-50d后，形成2-3cm的小苗株。
（6）生根培养：将步骤（5）中得到的小苗株分割成单株接种到生根培养基MS+0.05-0.1mg/L6-BA+0.5-1.0mg/LNAA+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度2000～3000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行生根培养。培养30-40天，直到株高达到2.5-3cm，根长2cm以上，即得到生根苗，可移栽，生根率100%。
（7）炼苗移栽：将步骤（6）得到的生根苗移到温室内驯化5-7d，以适应栽培场地的光温条件。然后取出苗洗净植株根系附着培养基，用50%多菌灵可湿性粉剂800倍～1000倍全株浸泡10 min，取出放置于阴凉处晾干水分至苗轻微萎焉，栽植于基质（腐殖土：蛭石：珍珠岩=1:1:1）中，遮光70-80%，保持通风，相对湿度60-80%，每周喷施一次1/4MS营养液和0.1%多菌灵，栽植2周后逐渐增加光照。3-4周后，植株开始生长，发新根，成活率达到89%以上。
实施例4
（1）外植体的消毒处理：选择白菊的侧芽作为外植体，用自来水清洗表面的赃物，流水冲洗30min-40min，在超净工作台上在用75%酒精侵泡30s，无菌水清洗3-4次，再用5%体积比的次氯酸钠消毒8-10min，期间不时振荡，无菌水冲洗4-5次，用无菌滤纸吸干水分，切去切口消毒受伤的部分，接种到愈伤组织诱导培养基中。
（2）愈伤组织诱导：将步骤（1）得到的外植体接种于愈伤组织诱导培养基MS+0.5-1.0mg/L6-BA+0.01-0.1mg/LNAA+0.1-0.5mg/LKT+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度3000～5000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行诱导培养，培养3-5d基部开始萌动膨大，培养 7-14d 后基部周围形成团状愈伤组织。1周后统计成活苗数，污染率82.6%，成活率达到70.4%。21d后统计白菊侧芽愈伤组织诱导率达到90%以上。
（3）不定芽诱导：将步骤（2）诱导形成的愈伤组织切割成0.4-0.8cm大小的切块，接种到不定芽诱导培养基MS+0.2-0.6mg/L6-BA+0.01-0.1mg/LNAA+0.05-0.1mg/LKT+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度3000～5000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行诱导培养，培养5-7d后愈伤组织开始分化形成不定芽。培养20-30d后统计，愈伤组织诱导不定芽分化率达到85%以上。
（4）不定芽增殖：将步骤3得到的不定芽分割成2-4株为一丛，接种到增殖培养基MS+0.2-0.6mg/L6-BA+0.05-0.2mg/LNAA+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度3000～5000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行增殖培养。培养30-40d后，增殖达到3-5倍。
（5）壮苗培养：将步骤（4）得到的增殖苗分割成2-3株为一丛，接种到壮苗培养基MS+0.2-0.6mg/L6-BA+0.1-0.3mg/LNAA+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度3000～5000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行壮苗培养。培养40-50d后，形成1.5-2cm的小苗株。
（6）生根培养：将步骤（5）中得到的小苗株分割成单株接种到生根培养基1/2MS+0.05-0.1mg/L6-BA+0.5-1.0mg/LNAA+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，在温度20±2℃、光照强度3000～5000lx、光照15h/d，相对湿度 50％-60％的条件下进行生根培养。培养30-40天，生根率80%。
（7）炼苗移栽：将步骤（6）得到的生根苗移到温室内驯化5-7d，以适应栽培场地的光温条件。然后取出苗洗净植株根系附着培养基，用50%多菌灵可湿性粉剂800倍～1000倍全株浸泡10 min，取出放置于阴凉处晾干水分至苗轻微萎焉，栽植于基质（腐殖土：蛭石：珍珠岩=1:1:1）中，遮光70-80%，保持通风，相对湿度60-80%，每周喷施一次清水，栽植2周后逐渐增加光照。3-4周后，植株开始生长，发新根，成活率达到80%。
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.一种白菊Dudleya greenei的离体快速繁殖培养方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
（1）外植体的灭菌处理：外植体为白菊Dudleya greenei的侧芽，选取外植体用自来水清洗表面的赃物，流水冲洗30min-40min，在超净工作台上用75%酒精浸泡30s，无菌水清洗3-4次，再用0.1%升汞滴入2滴吐温消毒6-10min，期间不时振荡，无菌水冲洗4-5次，用无菌滤纸吸干水分，切去切口消毒受伤的部分；
（2）愈伤组织诱导：将步骤（1）得到的消毒后的外植体接种于愈伤组织诱导培养基MS+0.5-1 .0mg/L6-BA+0.01-0.1mg/LNAA+0.1-0.5mg/LKT+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，诱导培养3-5d后外植体基部开始萌动膨大，培养 7-14d 后基部周围形成团状愈伤组织；
（3）不定芽诱导：将步骤（2）诱导形成的愈伤组织切割成0.4-0.8cm大小的切块，接种到不定芽诱导培养基MS+0.2-0.6mg/L6-BA+0.01-0.1mg/LNAA+0.05-0.1mg/LKT+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，诱导培养5-7d后愈伤组织开始分化形成不定芽；
（4）不定芽增殖：将步骤（3）得到的不定芽分割成2-4株为一丛，接种到增殖培养基MS+0.2-0.6mg/L6-BA+0.05-0.2mg/LNAA+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，培养30-40d后，增殖3-5倍；
（5）壮苗培养：将步骤（4）得到的增殖苗分割成2-3株为一丛，接种到壮苗培养基MS+0.2-0.6mg/L6-BA+0.1-0.3mg/LNAA+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，培养40-50d后，形成1.5-2cm的小苗株；
（6）生根培养：将步骤（5）中得到的小苗株分割成单株接种到生根培养基MS+0.05-0.1mg/L6-BA+0.5-1.0mg/LNAA+20-30g/L糖+7g/L琼脂中，pH值为5.8-6.0，培养30-40d后，得到生根苗；
（7）炼苗移栽：将步骤（6）得到的生根苗移到温室内驯化5-7d，然后取出苗洗净植株根系附着培养基，用50%多菌灵可湿性粉剂800倍～1000倍全株浸泡10 min，取出放置于阴凉处晾干水分，栽植于基质中，遮光70-80%，保持通风，相对湿度60-80%；栽植2周后逐渐增加光照；3-4周后，植株开始生长，发新根，得到白菊Dudleya greenei完整植株。
2.根据权利要求1所述的一种白菊Dudleya greenei的离体快速繁殖培养方法，其特征在于：步骤（2）-步骤（6）中，培养条件为温度20±2℃、光照强度3000～5000lx、光照15h/d，相对湿度 50-60％。
3.根据权利要求1所述的一种白菊Dudleya greenei的离体快速繁殖培养方法，其特征在于：步骤（7）中，生根苗放置于阴凉处晾干水分至苗轻微萎焉。
4.根据权利要求1所述的一种白菊Dudleya greenei的离体快速繁殖培养方法，其特征在于：步骤（7）中，所述基质包括腐殖土、蛭石、珍珠岩，其比例为1：1：1。
5.根据权利要求1所述的一种白菊Dudleya greenei的离体快速繁殖培养方法，其特征在于：步骤（7）中，生根苗栽植于基质后，每周喷施一次1/4MS营养液和0.1%多菌灵。
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