CN111149699B - 培养基及红阳猕猴桃的遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于猕猴桃基因工程技术领域，具体涉及培养基及红阳猕猴桃的遗传转化方法。该遗传转化方法包括依次进行的以下步骤：农杆菌培养、叶片预培养、农杆菌侵染叶片、愈伤筛选培养、芽伸长培养、芽生根培养和阳性苗移栽；叶片预培养、农杆菌侵染叶片、愈伤筛选培养、芽伸长培养和芽生根培养步骤，均采取本发明所提供的对应的培养基。本发明可以缩短猕猴桃遗传转化时间，提高遗传转化效率，其中特别是找到快速且高效获得阳性苗的培养基配方，对缩短红阳猕猴桃遗传转化时间，提高遗传转化效率具有重要作用。

Description

培养基及红阳猕猴桃的遗传转化方法
技术领域
本发明属于猕猴桃基因工程技术领域，具体涉及培养基及红阳猕猴桃的遗传转化方法。
背景技术
猕猴桃因其独特的风味、富含维生素C、膳食纤维和多种矿物营养而深受人们的喜爱，成为近百年以来驯化最成功的水果种类之一，被赞为“水果之王”。我国猕猴桃产业发展迅猛。据统计2017年我国猕猴桃的总面积已达200多万亩，产量237万吨，两者均已跃居世界第一。商业种植的猕猴桃主要为中华猕猴桃和美味猕猴桃。‘红阳’猕猴桃是我国主栽中华猕猴桃品种之一，二倍体，红色果肉，肉细嫩，风味极佳，因其较高的商品价值，已在全国各地广泛种植。
现代基因工程技术的应用是培育品质优良、抗病性强、耐贮性佳的猕猴桃新品种的重要途径之一。目前应用最成熟、最广泛的遗传转化方法是农杆菌介导的遗传转化叶盘法。农杆菌介导法中，预培养时间、侵染时间、共培养时间、菌液浓度和各时期培养基配方是整个遗传转化中最重要的因素。预培养过程中叶片伤口的细胞分裂旺盛有利于外源基因整合；侵染和共培养阶段是农杆菌的附着、T-DNA的转移整合的关键时期，菌液的浓度是外源基因整合效率的重要因素，浓度过高可能导致猕猴桃细胞受农杆菌侵害过重死亡，浓度过低可能导致外源基因整合效率不高，阳性率偏低；同时，适宜的培养基组合有利于提高猕猴桃的转化效率和效果。因此，建立了一个高效的红阳猕猴桃农杆菌介导的遗传转化体系，对开展红阳猕猴桃分子生物学研究和品种培育具有重要意义。
目前一些文献上面公布的关于红阳猕猴桃遗传转化效率均不高，且转化时间较长。本发明的红阳猕猴桃遗传转化具体方法及培养基配方均与此类公布文献相差较大。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了培养基及红阳猕猴桃的遗传转化方法。本发明可以缩短猕猴桃遗传转化时间，提高遗传转化效率，其中特别是找到快速且高效获得阳性苗的培养基配方，对缩短红阳猕猴桃遗传转化时间，提高遗传转化效率具有重要作用。
本发明所提供的技术方案如下：
一种叶片预培养培养基，包括以下含量的各组分：乙酰丁香酮47.5～52.5μM/L，6-苄基腺嘌呤0.95～1.05mg/L，萘乙酸0.095～0.105mg/L，玉米素2.9～3.1mg/L，蔗糖28～32g/L，植物凝胶2.5g/L，不含维他命的MS培养基2.2g/L，维他命103.1mg/L，溶剂为双蒸水，pH为5.75～5.85。
相比较现有的叶片预培养培养基，上述技术方案所提供叶片预培养培养基因为含有适宜浓度的玉米素及合适的6-苄基腺嘌呤、萘乙酸、玉米素的激素比例，而具有更好的促进细胞分裂效果。
本发明还提供了一种共培养液体培养基，包括以下含量的各组分：乙酰丁香酮95～105μM/L液，蔗糖19～21g/L，不含维他命的MS培养基2.2g/L，维他命103.1mg/L，溶剂为双蒸水，pH为5.95～6.05。
相比较现有的共培养液体培养基，上述技术方案所提供共培养液体培养基因为含有适宜浓度的乙酰丁香酮，而具有更好的侵染效果。
本发明还提供了一种共培养固体培养基，包括以下含量的各组分：乙酰丁香酮47.5～52.5μM/L，6-苄基腺嘌呤0.95～1.05mg/L，萘乙酸0.095～0.105mg/L，玉米素2.9～3.1mg/L，蔗糖28～32g/L，植物凝胶2.5g/L，不含维他命的MS培养基2.2g/L，维他命103.1mg/L，溶剂为双蒸水pH为5.75～5.85。
相比较现有的共培养固体培养基，上述技术方案所提供的共培养固体培养基因为含有适宜浓度的乙酰丁香酮以及合适的6-苄基腺嘌呤、萘乙酸、玉米素的激素比例和浓度，而具有更好的侵染和促进细胞分裂效果。
本发明还提供了一种筛选培养基，包括以下含量的各组分：吲哚丁酸0.195～0.205mg/L，6-苄基腺嘌呤1.95～2.05mg/L，特美汀295～305mg/L，玉米素0.95～1.05mg/L，植物组织培养抗菌保护剂450～550mg/L，卡那霉素190～210mg/L，蔗糖28～32g/L，植物凝胶2.5g/L，不含维他命的MS培养基2.2g/L，维他命103.1mg/L，溶剂为双蒸水，pH为5.75～5.85。
相比较现有的筛选培养基，上述技术方案所提供的筛选培养基因为含有合适的吲哚丁酸、6-苄基腺嘌呤、玉米素比例及浓度且含高浓度卡那霉素、适宜浓度植物组织培养抗菌保护剂和使用1/2MS培养基，而具有更好的诱导愈伤、愈伤分化长芽、高效筛选、防止杂菌滋生、减少愈伤褐化效果。
本发明还提供了一种芽伸长培养基，包括以下含量的各组分：吲哚丁酸0.095～0.105mg/L，6-苄基腺嘌呤2.95～3.05mg/L，特美汀295～305mg/L，玉米素1.95～2.05mg/L，植物组织培养抗菌保护剂450～550mg/L，蔗糖28～32g/L，植物凝胶2.5g/L，含维他命MS培养基4.4g/L，溶剂为双蒸水，pH为5.75～5.85。
相比较现有的芽伸长培养基，上述技术方案所提供的芽伸长培养基因为含有合适的吲哚丁酸、6-苄基腺嘌呤、玉米素比例及浓度，未添加卡那霉素且添加适宜浓度植物组织培养抗菌保护剂，具有更好的芽生长、防止菌滋生效果。
本发明提供了一种生根培养基，包括以下含量的各组分：吲哚丁酸0.63～0.77mg/L，特美汀295～305mg/L，玉米素0.095～1.05mg/L，植物组织培养抗菌保护剂450～550mg/L，蔗糖19～21g/L，琼脂粉7g/L，不含维他命的MS培养基2.2g/L，维他命103.1mg/L，溶剂为双蒸水，pH为5.75～5.85。相比较现有的生根培养基,上述技术方案所提供的生根培养基因为含有合适的吲哚丁酸、玉米素比例及浓度，未添加卡那霉素且添加了适宜浓度植物组织培养抗菌保护剂，具有更好的芽伸长及防止杂菌滋生的效果。
本发明还提供了一种红阳猕猴桃的遗传转化方法，包括依次进行的以下步骤：农杆菌培养、叶片预培养、农杆菌侵染叶片、愈伤筛选培养、芽伸长培养、芽生根培养和阳性苗移栽，所述叶片侵染农杆菌步骤中使用到共培养液体培养基和共培养固体培养基，其特征在于：所述叶片预培养、所述农杆菌侵染叶片、所述愈伤筛选培养、所述芽伸长培养和所述芽生根培养步骤中，至少有一个步骤对应的采用本发明所提供的培养基。
上述各技术方案中，含维他命的MS培养基为DUCHEFA公司型号M0222.0050商品；不含维他命的MS培养基为DUCHEFA公司型号M0221.0050商品；维他命为DUCHEFA公司型号M0904.0250商品；植物凝胶为SIGMA公司型号SIGMA—P8169-1KG商品；植物组织培养抗菌保护剂为西美杰科技有限公司货号PPM商品。
基于上述技术方案，能缩短红阳猕猴桃遗传转化时间，并能提高遗传转化的阳性率。
具体的，红阳猕猴桃的遗传转化方法，包括以下步骤：
1)农杆菌培养；
2)采用所述的叶片预培养培养基进行叶片预培养；
3)将步骤1)得到的农杆菌培养液离心去除上清液，加入到含有在所述的共培养液体培养基的容器中，并向容器中加入步骤2)得到的预培养的叶片侵染后再分离掉容器中的悬浮液得到叶片，并对叶片用所述的共培养液体培养基冲洗，再将叶片在所述的共培养固体培养基中共培养；
4)采用所述的筛选培养基进行叶片筛选培养；
5)采用所述的芽伸长培养基进行芽伸长培养；
6)将步骤5)得到的阳性猕猴桃芽采用所述的生根培养基进行芽生根培养；
7)阳性苗移栽。
基于上述技术方案，能显著缩短红阳猕猴桃遗传转化时间，并能显著提高遗传转化的阳性率。
更具体的，红阳猕猴桃的遗传转化方法，包括以下步骤：
1)将目的基因GWD1-RFP转入农杆菌菌株EHA105(菌株购自武汉鼎国生物技术有限公司，该菌株含有筛选标签—利福平抗性基因，Ti质粒含有筛选标签—壮观霉素抗性基因，赋予菌株利福平和壮观霉素抗性)后在含有100μg/L壮观霉素和25μg/L利福平的液体LB培养基中培养16～20小时，摇床速度225～275rpm，温度28℃；
2)取红阳猕猴桃无菌嫩叶，在无菌条件下剪裁成2～5mm的叶片，并平铺于所述的叶片预培养培养基中培养1.5～2.5天，所述叶片与所述叶片预培养培养基的用量比为30片：20mL；
3a)取体积为V2的所述的共培养液体培养基；当农杆菌菌液浓度OD600值达到3～4时，取体积为V1的农杆菌菌液离心8～12min，再分离掉上清液部分，再将剩余部分重新悬于体积为V2的所述的共培养液体培养基中，得到侵染用的OD600值为0.7的农杆菌菌液，其中，V1＝(0.7*V2)/菌液OD600值；
3b)将步骤2)经过预培养得到的预培养叶片重悬于所述侵染用的农杆菌菌液，再将容器上下颠倒放置12～18min，使侵染更加充分，所述预培养叶片与所述共培养农杆菌菌液的用量比为60片：25mL，去除悬浮液，并用所述侵染用液体培养基冲洗4～5次，最后取出叶片在灭菌滤纸上晾干，得到晾干的叶片，并将所述晾干的叶片平铺于覆有滤纸的在所述的共培养固体培养基中，共培养1.5～2.5天；
其中：
步骤3a)中，所述菌液与所述所述的共培养液体培养基的用量比为4.4～5.8mL：25mL；
步骤3b)中，所述预培养叶片与所述侵染用的农杆菌菌液的用量比为60片：25mL；
步骤3b)中，所述晾干的叶片与所述共培养固体培养基的用量比为30片：20mL；
4)步骤3)共培养结束后，取出叶片转入到所述的筛选培养基进行抗性筛选，四周继代一次，直到长出新芽；
5)将新芽转入到所述的芽伸长培养基中，四周继代一次，直至芽长到2～3cm高，培养环境为温度22～25℃，光照14～18h、黑暗6～10h，光照强度6500～7500lux，湿度70～85％；
6)将鉴定出的2～3cm高的阳性猕猴桃芽转入到所述的生根培养基中培养，四周继代一次，直至长出根，培养环境为温度22～25℃，光照14～18h、黑暗6～10h，光照强度6500～7500lux，湿度70～85％；
7)将阳性苗移栽。
进一步的，步骤2)中，猕猴桃叶片在叶片预培养培养基中遮光培养1.5～2.5天。
上述技术方案中，遮光培养可避免叶片伤口处细胞分裂产生的细胞受到光损伤且更易于接受农杆菌侵染。
进一步的，步骤3b中，农杆菌侵染浓度为OD600＝0.7；加入所述的预培养的叶片后将容器盖紧后上下颠倒放置以进行侵染，侵染时间为12～18min；共培养时间为1.5～2.5天。
上述技术方案中，农杆菌侵染浓度过高会导致叶片伤口处细胞受农杆菌侵染伤害过大难以恢复，以至无法正常诱导愈伤，易出现褐化情况，过低会到导致侵染不充分，阳性率偏低；侵染时间过长会导致叶片伤口处细胞受农杆菌侵染伤害时间过长，伤害大，难以恢复，以至无法正常诱导愈伤，易出现褐化情况，侵染时间过短会导致侵染不充分，阳性率偏低。
进一步的，步骤4)中，但叶片由于形成愈伤，面积增加3～4倍，使愈伤无法接触培养基时，将叶片连同的愈伤切成小块转入新的所述的共培养液体培养基中进行培养，培养环境为温度22～25℃，光照14～18h、黑暗6～10h，光照强度6500～7500lux，湿度70～85％。
进一步的，步骤6)中，在超净台中用手持式荧光检测器鉴定猕猴桃芽是否为阳性，剔除非阳性苗。
本发明所提供的技术方案如下：
本发明较好的解决了现有红阳猕猴桃遗传转化方法和培养基配方存在的转化周期长、转化效率低的问题。
本发明的积极效果是：
1)本遗传转化方法选取的农杆菌侵染浓度、侵染时间以及共培养固体培养基和筛选培养基能有效提高红阳猕猴桃遗传转化效率。
2)本遗传转化培养基能有效缩短红阳猕猴桃遗传转化时间。
3)本遗传转化培养基添加了适宜浓度的植物组织培养抗菌保护剂能减少杂菌滋生和农杆菌污染的情况，目前所做实验的杂菌滋生率为0％，农杆菌污染率为0％。
4)本遗传转化筛选培养基使用的MS培养基浓度，可以有效的防止猕猴桃愈伤因非抗生素筛选而出现的褐化情况(在组培实验中褐化率减少近一半)，且对愈伤的诱导率为100％。
5)本遗传转化方法使用手持式荧光检测器，可以在芽转入生根培养基前剔除非阳性苗，减少了操作的时间投入。培养基成分易获得，配置及使用方便。
附图说明
图1红阳猕猴桃遗传转化叶盘法的流程图。
图2手持式荧光检测器检测红阳猕猴桃阳性芽荧光照射图。
图3红阳猕猴桃转化成功待移栽苗的光学照片。
图4红阳猕猴桃移栽苗GWD1-RFP基因凝胶电泳图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
叶片预培养培养基(M1)配制：加入30g/L蔗糖、2.2g/L MS(不含维他命)、103.1mg/L维他命，溶剂为双蒸水，溶质溶解后用pH计测定pH，并用氢氧化钠溶液将pH调为5.8，加入2.5g/L植物凝胶，121℃灭菌15min，冷却至65℃，加入50μM/L乙酰丁香酮、1mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、3mg/L玉米素即得。
实施例2
共培养固体培养基(M2)配制：加入30g/L蔗糖、2.2g/L MS(不含维他命)、103.1mg/L维他命，溶剂为双蒸水，溶质溶解后用pH计测定pH，并用氢氧化钠溶液将pH调为5.8，加入2.5g/L植物凝胶，121℃灭菌15min，冷却至65℃，加入50μM/L乙酰丁香酮、1mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、3mg/L玉米素即得。
实施例3
共培养液体培养基(M3)配制：加入20g/L蔗糖、2.2g/L MS培养基(不含维他命)，溶剂为双蒸水，溶质溶解后用pH计测定pH，并用氢氧化钠溶液将pH调为6.0，121℃灭菌15min，冷却至65℃，加入100μM/L乙酰丁香酮即得。
实施例4
筛选培养基(M4)配制：加入30g/L蔗糖、2.2g/L MS培养基(不含维他命)、103.1mg/L维他命，溶剂为双蒸水，溶质溶解后用pH计测定pH，并用氢氧化钠溶液将pH调为5.8，加入2.5g/L植物凝胶，121℃灭菌15min，冷却至65℃，加入0.2mg/L吲哚丁酸、2mg/L 6-苄基腺嘌呤、300mg/L特美汀、1mg/L玉米素、500mg/L植物组织培养抗菌保护剂(PPM)、200mg/L卡那霉素即得。
实施例5
芽伸长培养基(M5)配制：加入30g/L蔗糖、4.4g/L MS培养基(含维他命)，溶剂为双蒸水，溶质溶解后用pH计测定pH，并用氢氧化钠溶液将pH调为5.8，加入2.5g/L植物凝胶，121℃灭菌15min，冷却至65℃，加入0.1mg/L吲哚丁酸、3mg/L 6-苄基腺嘌呤、300mg/L特美汀、2mg/L玉米素、500mg/L植物组织培养抗菌保护剂(PPM)即得。
实施例6
生根培养基(M6)配制：加入20g/L蔗糖、2.2g/L MS培养基(不含维他命)、103.1mg/L维他命，溶剂为双蒸水，溶质溶解后用pH计测定pH并用氢氧化钠溶液将pH调为5.8，加入7g/L琼脂粉，121℃灭菌15min，冷却至65℃，加入0.7mg/L吲哚丁酸、300mg/L特美汀、0.1mg/L玉米素、500mg/L植物组织培养抗菌保护剂(PPM)即得。
实施例7
运用该发明获取含GWD1-RFP基因的红阳猕猴桃转基因苗。其过程如下：
将GWD1-RFP基因转入农杆菌菌株EHA105后放置于-80℃冰箱保存，取适量的红阳猕猴桃无菌嫩叶，在超净台中用无菌锋利剪刀剪60片2～5mm宽叶片平铺于M1培养基中2d(滤纸覆盖减少光线)，第二天将少量含GWD1-RFP基因的农杆菌在35mL利福平浓度为25μg/mL和壮观霉素浓度为100μg/mL的液体LB培养基中培养，摇床速度250rpm，温度28℃，当菌液浓度为OD600＝3.7时，取4.7mL菌液，5000g离心10min，重悬于25mL M3中，得到侵染用的OD600值为0.7的农杆菌菌液。取一个无菌50mL离心管，将M1中预培的猕猴桃叶片用无菌镊子夹入离心管，倒入重悬于M3中的农杆菌，盖紧盖子，上下颠倒15min。小心去除去悬浮液，并用M3冲洗5次，最后取出叶片在灭菌滤纸上晾干，并平铺于覆有滤纸的共培养培养基M2中(一个皿30片叶)，共培养2d(滤纸覆盖减少光线)。共培养结束后，取出叶片转入M4培养基进行抗性筛选，第8天长出明显的小愈伤，四周后继代，将长大的叶片愈伤切成小块，筛选第30天时可看到明显芽点，第60天将明显的芽转入到M5培养基中，第28天时部分芽已长至2～3cm高，在超净台中用手持式荧光检测器鉴定猕猴桃芽是否为阳性，剔除非阳性苗，鉴定结果为阳性苗13株，非阳性苗为3株，阳性率达81.25％。将猕猴桃芽转入到M6培养基中培养，四周后长出较长的根，生根率为100％。将泥炭土、育苗基质、蛭石按体积比1:1:1配成猕猴桃生长土，装至10cm方形培养杯中，把培养杯放置于大托盘中，加清水至培养杯高度1/3，吸水2小时。用清水将猕猴桃幼苗上的琼脂块洗净，摘除老叶，剩下两叶一心或三叶一心。在培养土上挖开一个小坑，轻轻放入小坑中，用培养土盖好，用喷壶喷洒清水，去除叶片上的泥土，让根系和土充分接触。用透明一次性塑料杯罩住苗子进行保湿，在25℃下的生长室培养。
一周缓苗后去除透明塑料杯，得到待移栽苗，如图3所示，为红阳猕猴桃转化成功待移栽苗的光学照片图。
取移栽苗嫩叶进行PCR阳性鉴定，图4是红阳猕猴桃移栽苗GWD1-RFP基因凝胶电泳图，结果为13株移栽苗均为阳性苗，阳性率为81.25％。
另外采用手持式荧光检测器阳性鉴定，准确率为100％，图2是手持式荧光检测器检测红阳猕猴桃阳性芽荧光照射图。
本发明所提供的红阳猕猴桃的遗传转化方法较国内现有文献报道最高阳性率64.3％还要高16.95％，遗传转化时间也缩短一个月左右。
该批猕猴桃愈伤在二十天后又长出一批可转入M5培养基中培养的猕猴桃小芽，芽伸长培养30天后，获得六株高2-3cm的猕猴桃芽，经手持式荧光检测器检测，鉴定结果为5株阳性苗，1株非阳性苗，阳性率为83.33％，转入M6培养基中培养四周后生根率为100％，移栽成活后进行PCR阳性鉴定，阳性准确率为100％，较国内现有文献报道最高阳性率64.3％还要高19.03％。
在第二批猕猴桃愈伤分化的小芽转入M5后第30天，该批猕猴桃愈伤新分化的小芽转入M5培养基中芽伸长培养30天后，获得11株高2-3cm的猕猴桃芽，经手持式荧光检测器检测，鉴定结果为9株阳性苗，2株非阳性苗，阳性率为81.82％，转入M6培养基中培养31天后生根率为100％，移栽成活后进行PCR阳性鉴定，阳性准确率为100％，较国内现有文献报道最高阳性率64.3％还要高17.52％。
该批材料先后获得三批阳性苗，分别为13株、5株、9株，阳性率分别为81.25％、83.33％和81.82％，三批转基因苗的总阳性率为81.82％，较报道最高阳性率高17.52％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种红阳猕猴桃的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)农杆菌培养；
2)采用叶片预培养培养基进行叶片预培养，所述叶片预培养培养基，包括以下含量的各组分：乙酰丁香酮47.5～52.5μM/L，6-苄基腺嘌呤0.95～1.05mg/L，萘乙酸0.095～0.105mg/L，玉米素2.9～3.1mg/L，蔗糖28～32g/L，植物凝胶2.5g/L，不含维他命的MS培养基2.2g/L，维他命103.1mg/L，溶剂为双蒸水，pH为5.75～5.85；
3)将步骤1)得到的农杆菌培养液离心去除上清液，加入到含有共培养液体培养基的容器中，并向容器中加入步骤2)得到的预培养的叶片，侵染后再分离掉容器中的悬浮液得到叶片，并对叶片用所述的共培养液体培养基冲洗，再将叶片在共培养固体培养基中共培养，其中，所述共培养液体培养基，包括以下含量的各组分：乙酰丁香酮95～105μM/L液，蔗糖19～21g/L，不含维他命的MS培养基2.2g/L，维他命103.1mg/L，溶剂为双蒸水，pH为5.95～6.05，所述共培养固体培养基，包括以下含量的各组分：乙酰丁香酮47.5～52.5μM/L，6-苄基腺嘌呤0.95～1.05mg/L，萘乙酸0.095～0.105mg/L，玉米素2.9～3.1mg/L，蔗糖28～32g/L，植物凝胶2.5g/L，不含维他命的MS培养基2.2g/L，维他命103.1mg/L，溶剂为双蒸水pH为5.75～5.85；
4)采用筛选培养基进行叶片筛选培养，所述筛选培养基，包括以下含量的各组分：吲哚丁酸0.195～0.205mg/L，6-苄基腺嘌呤1.95～2.05mg/L，特美汀295～305mg/L，玉米素0.95～1.05mg/L，植物组织培养抗菌保护剂450～550mg/L，卡那霉素190～210mg/L，蔗糖28～32g/L，植物凝胶2.5g/L，不含维他命的MS培养基2.2g/L，维他命103.1mg/L，溶剂为双蒸水，pH为5.75～5.85；
5)采用芽伸长培养基进行芽伸长培养，所述伸长培养基，包括以下含量的各组分：吲哚丁酸0.095～0.105mg/L，6-苄基腺嘌呤2.95～3.05mg/L，特美汀295～305mg/L，玉米素1.95～2.05mg/L，植物组织培养抗菌保护剂450～550mg/L，蔗糖28～32g/L，植物凝胶2.5g/L，含维他命MS培养基4.4g/L，溶剂为双蒸水，pH为5.75～5.85；
6)将步骤5)得到的阳性猕猴桃芽采用生根培养基进行芽生根培养，所述生根培养基，包括以下含量的各组分：吲哚丁酸0.63～0.77mg/L，特美汀295～305mg/L，玉米素0.095～1.05mg/L，植物组织培养抗菌保护剂450～550mg/L，蔗糖19～21g/L，琼脂粉7g/L，不含维他命的MS培养基2.2g/L，维他命103.1mg/L，溶剂为双蒸水，pH为5.75～5.85；
7)阳性苗移栽。
2.根据权利要求1所述的红阳猕猴桃的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将目的基因转入农杆菌菌株后在含有相应抗生素的液体LB培养基中培养16-20小时，摇床速度225～275rpm，温度27-29℃；
2)取红阳猕猴桃无菌嫩叶，在无菌条件下剪裁成2-5mm的叶片，并平铺于所述的叶片预培养培养基中培养1.5～2.5天，所述叶片与所述叶片预培养培养基的用量比为30片：20mL；
3a)；
当农杆菌菌液浓度OD600值达到3～4时，取体积为V1的农杆菌菌液离心8～12min，再分离掉上清液部分，再将剩余部分重新悬于体积为V2的所述的共培养液体培养基中，得到侵染用的OD600值为0.7农杆菌菌液，其中，V1＝(0.7*V2)/菌液OD600值；
3b)再在无菌条件下将步骤2)经过预培养得到的预培养叶片重新悬于所述侵染用的农杆菌菌液，再将容器上下颠倒放置12～18min，所述预培养叶片与所述侵染用的农杆菌菌液的用量比为60片：25mL，去除悬浮液，并用所述的共培养液体培养基冲洗4-5次，最后取出叶片在灭菌滤纸上晾干，得到晾干的叶片，并将所述晾干的叶片平铺于覆有灭菌滤纸的在所述的共培养固体培养基中，共培养1.5～2.5天；
其中：
步骤3a)中，所述侵染用的OD600值为0.7农杆菌菌液与所述共培养液体培养基的用量比为4.4～5.8mL：25mL；
步骤3b)中，所述预培养叶片与所述侵染用的农杆菌菌液的用量比为60片：25mL；
步骤3b)中，所述晾干的叶片与所述共培养固体培养基的用量比为30片：20mL；
4)步骤3)共培养结束后，取出叶片转入到所述的筛选培养基中培养以进行抗性筛选，四周继代一次，直到长出新芽，筛选培养的环境为温度22～25℃，光照14～18h、黑暗6～10h，光照强度6500～7500lux，湿度70～85％；
5)将新芽转入到所述的芽伸长培养基中，四周继代一次，直到芽长到2～3cm高，培养环境为温度22～25℃，光照14～18h、黑暗6～10h，光照强度6500～7500lux，湿度70～85％；
6)将鉴定出的2～3cm高的阳性猕猴桃芽转入到所述的生根培养基中培养，四周继代一次，直至长出根，培养环境为温度22～25℃，光照14～18h、黑暗6～10h，光照强度6500～7500lux，湿度70～85％；
7)将阳性苗移栽。
3.根据权利要求2所述的红阳猕猴桃的遗传转化方法，其特征在于：
步骤2)中猕猴桃叶片在叶片预培养培养基中遮光培养1.5～2.5天；
步骤3b中，加入所述的预培养的叶片后将容器盖紧后上下颠倒放置以进行侵染，侵染时间为12～18分钟；共培养时间为1.5～2.5天；
步骤4)中，当叶片由于形成愈伤无法接触培养基时，将叶片连同的愈伤切成小块，并来转入新的所述的筛选培养基中培养以进行抗性筛选，四周继代一次，直到长出新芽，筛选培养的环境为温度22～25℃，光照14～18h、黑暗6～10h，光照强度6500～7500lux，湿度70～85％；
步骤6)中，在超净台中用手持式荧光检测器鉴定猕猴桃芽是否为阳性，剔除非阳性苗。
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