CN116855535B - ZjCML41基因在提高酸枣愈伤组织抗寒性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了ZjCML41基因在提高酸枣愈伤组织抗寒性中的应用，ZjCML41基因在提高愈伤组织抗寒性中的应用；ZjCML41基因在提高酸枣愈伤组织抗寒性中的应用；过表达ZjCML41基因在提高酸枣愈伤组织抗寒性中的应用。本发明提供的酸枣愈伤组织遗传转化方法简单、耗时短、转化效率高，最高可达56.3％，且重复性好、适用品种广泛；本发明首次公开通过过表达ZjCML41基因，可以显著提高酸枣的抗寒性能，在提高酸枣本身对寒害抵抗能力的同时，还有望通过采用抗寒能力强的酸枣作为砧木来提高枣树对寒害的抗性，有效降低寒害对枣树产业造成的不利影响，为枣树产业的稳产、增收保驾护航。
Description
技术领域
本发明涉及ZjCML41基因的应用技术领域，尤其是涉及ZjCML41基因在提高酸枣愈伤组织抗寒性中的应用。
背景技术
枣（Ziziphus jujuba Mill.）原产于我国，为鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Ziziphus Mill.）植物。枣树的栽培历史长久，早在七千多年前我国就已进行栽种和利用，是我国优势特色干果树种。
据统计，我国现有枣树约2000万亩，年产鲜枣800多万吨，居于干果类第一，面积和产量占世界的98%以上。枣是我国出口创汇的重要农产品，从枣产品的国际贸易统计数据来看，我国是主要出口国，我国在枣树生产和贸易中占有绝对的主导地位，枣树将成为我国果树产业中最具国际竞争力的优势树种之一。
枣树具有耐贫瘠、耐干旱、耐低温、抗盐碱、便于管理等优点，但是，幼龄枣树在冬季易受到极端低温的影响，而产生不同程度的冻害，越冬寒害对新疆、青海、宁夏、甘肃、陕西等北方地区枣业的发展危害尤为严重。近年来，基因工程技术在果树品种选育上的运用越来越广泛，但枣树遗传背景复杂、组培再生难度大，其遗传转化研究进展缓慢，目前虽有枣遗传转化体系建立的报道，但体系不够成熟，存在遗传转化效率低，重复性差等问题，制约了该技术在枣树上的广泛应用。
酸枣（Ziziphus jujuba var. spinosa）是鼠李科枣属植物的野生祖先种，适应能力强，具有较强的抗干旱、抗瘠薄和耐盐碱能力，是干旱贫瘠地区的先锋树种之一，适生范围广，根系十分发达，对水土保持，防风固沙和绿化荒山都起到十分重要的作用；酸枣本身还具有非常高的经济价值，果实可鲜食，果肉中的维生素C含量较高，是一种营养丰富的水果，果皮、种仁和叶片可入药，能够养心安神，具有很高的营养价值和药用价值；除此之外，酸枣还是一种重要的经济树种，作为砧木常用于与其他枣树的嫁接，发挥自身的优良特性。
发明内容
本发明的目的是提供ZjCML41基因在提高酸枣愈伤组织抗寒性中的应用，以提供一种遗传转化效率高的酸枣ZjCML41基因的过表达愈伤组织的建立方法，以期利用基因工程的手段提高酸枣、枣树的抗寒性，降低寒害对酸枣、枣树的危害。
为实现上述目的，本发明提供ZjCML41基因在提高酸枣愈伤组织抗寒性中的应用。
ZjCML41基因在提高愈伤组织抗寒性中的应用。
ZjCML41基因在提高酸枣愈伤组织抗寒性中的应用。
过表达ZjCML41基因在提高酸枣愈伤组织抗寒性中的应用。
ZjCML41基因的酸枣过表达愈伤组织的建立方法，步骤如下：
S1、用枣ZjCML41基因的CDS序列与过表达载体连接并转入DH5α感受态细胞中，涂板，37℃培养，挑取单个圆形菌斑进行菌落PCR，将相应菌液送公司测序；
S2、将测序正确的重组质粒转入农杆菌GV3101，涂板，28℃恒温培养箱中培养2d，选择单个圆形菌斑，挑菌至过表达载体所具有相应抗性的LB液体培养基中，28℃摇菌12-16h；
S3、将培养好的菌液离心，弃上清，将沉淀用重悬液进行重悬，调OD值至0.5-0.8后，室温静置2-3h，然后在超净工作台中将菌液分装至50mL锥形瓶中，每瓶25mL；
S4、选取生长健康、无病虫害的成熟期的酸枣果实，消毒后，将果肉剥净，撬开枣核，取出种胚，接种于愈伤诱导培养基中，暗培养30-40d；
S5、选取生长良好的愈伤组织于步骤S3中分装好的重悬液中，侵染5-10min，期间不停地晃动锥形瓶；
S6、侵染结束后，用无菌的无尘纸吸干愈伤组织上残留的菌液，并将其转移至共培养培养基中，于25℃下暗培养2d；
S7、共培养结束后，将侵染后的愈伤组织放入无菌水中冲洗，用无菌滤纸和无尘纸吸干愈伤组织上残留的水分后，将其转移至筛选培养基中进行暗培养，取新长处的愈伤组织进行取样鉴定。
优选的，所述过表达载体为Cam35S::GFP，具有利福平和硫酸卡那霉素抗性；所述步骤S2中的LB液体培养基中含有0.01mg/mL的利福平，0.05mg/mL的硫酸卡那霉素；所述步骤S7中的无菌水含0.1g/L利福平；所述暗培养的温度为25℃。
优选的，所述重悬液中包含4.23g/L MS粉、40g/L蔗糖、20g/L葡萄糖、2g/L AS。
优选的，所述诱导培养基为4.23g/L MS +20 g/L麦芽糖+5.5 g/L琼脂+0.5 mg/LNAA +3.0mg/L TDZ，pH为5.8。
优选的，所述共培养培养基包含4.23g/L MS粉、20g/L麦芽糖、5.5g琼脂、3.0mg/LTDZ、0.5mg/L NAA、200μM/L AS，pH为5.8。
优选的，所述筛选培养基包含4.23g/L MS粉、20g/L麦芽糖、5.5g琼脂、3.0mg/LTDZ、0.5mg/L NAA、200mg/L Cef、40mg/L Kana，pH为5.8。
因此，本发明提供的ZjCML41基因在提高酸枣愈伤组织抗寒性中的应用，其具体技术效果如下：
（1）本发明提供的酸枣愈伤组织遗传转化方法简单、耗时短、转化效率高，最高可达56.3%，且重复性好、适用品种广泛；
（2）本发明首次公开通过过表达ZjCML41基因，可以显著提高酸枣的抗寒性能，在提高酸枣本身对寒害的抵抗能力的同时，还有望通过作为砧木提高枣树对寒害的抗性，有效降低寒害对枣树产业造成的不利影响，为枣树产业的稳产、增收保驾护航。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是制备ZjCML41基因过表达酸枣愈伤的流程图；
图2是5个酸枣基因型的阳性愈伤；
图3是5个酸枣基因型的阳性愈伤PCR产物的电泳鉴定结果；
图4是5个酸枣基因型阳性愈伤的qRT-PCR结果；
图5是北奇4号的阳性愈伤与野生型愈伤于-20℃处理前后的照片。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
为了使得本申请的目的、技术方案及优点更加明确、透彻和完整，下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下详细说明均是实施例的说明，旨在对本发明提供进一步详细说明。除非另有指明，本发明所采用的所有技术术语与本申请所属领域的一般技术人员通常理解的含义相同。
实施例中所用的试剂、材料、试剂盒和仪器均为普通市售品，皆可于市场购得。
实施例一
配制重悬液及培养基，方法如下：
配制1L重悬液
准确称取4.23g MS粉、40g蔗糖、20g葡萄糖、2g AS，加入500mL双蒸水，搅拌，使各组分充分溶解，加双蒸水定容至1L，调节pH 至5.8，置于高温高压灭菌锅中121 ℃条件下灭菌20 min。
配制1L诱导培养基
准确称取4.23g MS粉、20g麦芽糖、5.5g琼脂加入800mL双蒸水，然后加入3.0mgTDZ和0.5mg NAA，搅拌使各组分充分溶解，加双蒸水定容至1L，调节pH至5.8，置于高温高压灭菌锅中121℃条件下灭菌20min。
配制1L共培养培养基
方法与配制诱导培养基完全相同，只是每L培养基包含4.23g MS粉、20g麦芽糖、5.5g琼脂、3.0mg TDZ、0.5mg NAA、200μM AS。
配制1L筛选培养基
方法与诱导培养基完全相同，只是每L培养基包含4.23g MS粉、20g麦芽糖、5.5g琼脂、3.0mg TDZ、0.5mg NAA、200mg Cef、40mg Kana。
实施例二
构建ZjCML41基因的过表达载体，方法如下：
（1）利用试剂盒提取冬枣叶片的总RNA，通过反转录试剂盒将获得的RNA反转录成cDNA，对获得的cDNA进行PCR扩增，引物F为：5′- ATGGCAAATAGTGATAATCGAG-3′；引物R为：5′- TTAAGCCACCATCATTTGGTGA -3′。
（2）通过同源重组法，将ZjCML41扩增片段插入到Cam35S::GFP载体的酶切位点之间。
（3）通过冰浴、热激等常规操作将步骤（2）获得的重组载体转化入DH5α感受态细胞中，涂板，37℃培养，挑取单菌落，进行菌落PCR鉴定，测序，将测序正确的重组质粒转入农杆菌受体GV3101，涂板，28℃恒温培养箱中培养2d，选取单个圆形菌斑，挑菌至具有利福平和硫酸卡那霉素抗性的LB液体培养基中，28℃摇菌12-16h。
（4）将培养好的菌液吸取1mL置于-80℃留存，剩余菌液5000rpm离心10min，弃上清，将沉淀用实施例一配制的重悬液进行重悬，调OD值至0.6后，室温静置3h，然后在超净工作台中将菌液分装至50mL锥形瓶中，每瓶25mL。
实施例三
建立ZjCML41基因的酸枣过表达愈伤组织，方法如下：
1）分别选取生长健康、无病虫害的酸枣17、酸枣A、酸枣68、酸枣32和北奇4号5个基因型的酸枣成熟期果实，在超净工作台上用75%酒精浸泡40s，用无菌水冲洗1~2次，然后用0.1% HgCl2消毒8min，用无菌水冲洗3~5遍，去除果肉，撬开枣核，取出种胚，接种于实施例一制备的诱导培养基中，于25℃条件下暗培养30-40d直至长出愈伤。
2）分别于5个酸枣基因型中选取生长良好的愈伤组织于实施例二分装好的重悬液中，加入愈伤组织的量以重悬液没过愈伤组织为宜，侵染8min，期间不停地晃动锥形瓶。侵染结束后，用无菌的无尘纸吸干愈伤组织上残留的菌液，并将其转移至实施例一配制的共培养培养基中，于25℃下暗培养2d。
3）共培养结束后，将侵染后的愈伤组织放入无菌水中冲洗，用无菌滤纸和无尘纸吸干愈伤组织上残留的水分后，将其转移至实施例一配制的筛选培养基中进行暗培养，取新长处的愈伤组织进行取样鉴定，流程图见图1。
实施例四
ZjCML41基因的酸枣过表达愈伤组织的鉴定，方法如下：
A、在超净工作台中对实施例三的筛选培养基上新长出的愈伤进行取样，将切取的愈伤组织放于灭菌的1.5mL离心管中，充分研磨，然后用CTAB法提取愈伤组织的DNA，以GFP标签特异性引物GFP-F：5′-ACAAGCAGAAGAACGGCATCAA-3′，GFP-R：5′-GCGGTCACGAACTCCAGCA-3′进行PCR扩增，条带大小为238bp，以未侵染的愈伤组织为阴性对照，扩增条件如下：
94℃，4min；（94℃，50s，57℃，40s，72℃，60s），25个循环；72℃，10min；4℃保存。
将得到的PCR产物电泳跑胶，不同基因型酸枣获得的ZjCML41基因的过表达愈伤的PCR产物的电泳鉴定结果见图3，其中1-5泳道分别为酸枣17、酸枣A、北奇4号、酸枣32和酸枣68的未进行侵染的愈伤组织鉴定结果，6-10泳道分别为过表达ZjCML41基因的酸枣17、酸枣A、北奇4号、酸枣32和酸枣68的鉴定结果；上述5个酸枣基因型的阳性愈伤见图2，阳性愈伤率统计结果见表1。
B、在超净工作台中对实施例三的筛选培养基上新长出的愈伤进行取样，将切取的愈伤组织放于灭菌的1.5mL离心管中，充分研磨，用RNA提取试剂盒提取筛选培养基上新长出的愈伤组织的RNA，以相同的方法提取未侵染愈伤组织的RNA为对照。
将获得的RNA利用反转录试剂盒反转录成cDNA，然后以引物ZjCML41-qRT-PCR-F：5′-ACCAAGAATCAACAGCGGC-3′，ZjCML41-qRT-PCR-R：5′-TACTCACCGACCGATCCGAA-3′进行qRT-PCR，扩增条件设置为95℃ 15min；（95℃ 5s、55℃ 30s、72℃ 20s），40个循环；4℃保存。结果见图4。
表1
；
效果例
将实施例四中鉴定阳性的相对表达水平最高的北奇4号愈伤组织，和与阳性愈伤大小相近的未进行侵染的愈伤组织移至不含抗生素的诱导培养基中，于25℃条件下暗培养5d后，-20℃条件下处理2h，然后常温恢复24h后观察表型变化，结果见图5。
结果分析
图3的电泳鉴定结果显示，阳性愈伤扩增条带大小与GFP特异性引物的理论片段大小一致，阴性对照均未出现条带，结果表明应用本发明提供的ZjCML41基因的酸枣过表达愈伤组织建立方法成功建立了酸枣17、酸枣A、酸枣68、酸枣32和北奇4号5个酸枣基因型的ZjCML41基因的过表达愈伤，图2为这5个酸枣基因型的过表达愈伤组织。
由表1的统计结果可以看出，共得到阳性愈伤54个，酸枣17、酸枣A、酸枣68、酸枣32和北齐4号5个酸枣基因型均获得了愈伤组织，表面本发明提供的酸枣过表达愈伤组织建立方法可以应用于多种酸枣基因型愈伤组织的遗传转化。其中北奇4号的转化成功率最高，达到了56.3%，说明本发明提供的酸枣过表达愈伤组织建立方法对不同基因型酸枣的转化率不同。
由图4可以看出，酸枣17、酸枣A、酸枣68、酸枣32和北奇4号5个酸枣基因型的阳性愈伤的表达水平均显著高于未进行遗传转化的愈伤组织，说明应用本发明提供的酸枣过表达愈伤组织的建立方法成功获得了转ZjCML41基因的酸枣愈伤。
由图5可以看出，-20℃低温处理2h后，北奇4号ZjCML41基因过表达愈伤和对照愈伤均有损伤，但北奇4号ZjCML41基因过表达愈伤没有褐化，损伤程度更小，当愈伤处于适宜环境下仍然可以继续生长。表明ZjCML41基因可以提高酸枣愈伤组织的抗寒性。
因此，本发明提供的酸枣愈伤组织遗传转化方法简单、耗时短、转化效率高，最高可达56.3%，且重复性好、适用品种广泛；本发明首次公开通过过表达ZjCML41基因，可以显著提高酸枣的抗寒性能，在提高酸枣本身对寒害的抵抗能力的同时，还有望通过作为砧木提高枣树对寒害的抗性，有效降低寒害对枣树产业造成的不利影响，为枣树产业的稳产、增收保驾护航。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (4)
1.过表达ZjCML41基因在提高酸枣愈伤组织抗寒性中的应用，其特征在于，所述ZjCML41基因的制备方法为：利用试剂盒提取冬枣叶片的总RNA，通过反转录试剂盒将获得的RNA反转录成cDNA，对获得的cDNA进行PCR扩增，引物F为：5′-ATGGCAAATAGTGATAATCGAG-3′；引物R为：5′-TTAAGCCACCATCATTTGGTGA-3′。
2.ZjCML41基因的酸枣过表达愈伤组织的建立方法，其特征在于，步骤如下：
S1、用枣ZjCML41基因的CDS序列与过表达载体连接并转入DH5α感受态细胞中，涂板，37℃培养，挑取单个圆形菌斑进行菌落PCR鉴定，将相应菌液送公司测序；
S2、将测序正确的重组质粒转入农杆菌GV3101，涂板，28℃恒温培养箱中培养2d，选择单个圆形菌斑，挑菌至过表达载体所具有相应抗性的LB液体培养基中，28℃摇菌12-16h；
S3、将培养好的菌液离心，弃上清，将沉淀用重悬液进行重悬，调OD值至0.5-0.8后，室温静置2-3h，然后在超净工作台中将菌液分装至50mL锥形瓶中，每瓶25mL；
S4、选取生长健康、无病虫害的成熟期的酸枣果实，消毒后，将果肉剥净，撬开枣核，取出种胚，接种于愈伤诱导培养基中，暗培养30-40d；
所述诱导培养基为4.23g/L MS +20 g/L麦芽糖+5.5 g/L琼脂+0.5mg/L NAA +3.0mg/LTDZ，pH为5.8；
S5、选取生长良好的愈伤组织于步骤S3中分装好的重悬液中，侵染5-10min，期间不停地晃动锥形瓶；
S6、侵染结束后，用无菌的无尘纸吸干愈伤组织上残留的菌液，并将其转移至共培养培养基中，于25℃下暗培养2d；
所述共培养培养基包含4.23g/L MS粉、20g/L麦芽糖、5.5g琼脂、3.0mg/L TDZ、0.5mg/LNAA、200μM/L AS，pH为5.8；
S7、共培养结束后，将侵染后的愈伤组织放入无菌水中冲洗，用无菌滤纸和无尘纸吸干愈伤组织上残留的水分后，将其转移至筛选培养基中进行暗培养，取新长处的愈伤组织进行取样鉴定；
所述筛选培养基包含4.23g/L MS粉、20g/L麦芽糖、5.5g琼脂、3.0mg/L TDZ、0.5mg/LNAA、200mg/L Cef、40mg/L Kana，pH为5.8；
所述ZjCML41基因的制备方法为：利用试剂盒提取冬枣叶片的总RNA，通过反转录试剂盒将获得的RNA反转录成cDNA，对获得的cDNA进行PCR扩增，引物F为：5′-ATGGCAAATAGTGATAATCGAG-3′；引物R为：5′-TTAAGCCACCATCATTTGGTGA-3′。
3.根据权利要求2所述的ZjCML41基因的酸枣过表达愈伤组织的建立方法，其特征在于：所述过表达载体为Cam35S::GFP，具有利福平和硫酸卡那霉素抗性；所述步骤S2中的LB液体培养基中含有0.01mg/mL的利福平，0.05mg/mL的硫酸卡那霉素；所述步骤S7中的无菌水含0.1g/L利福平；所述暗培养的温度为25℃。
4.根据权利要求2所述的ZjCML41基因的酸枣过表达愈伤组织的建立方法，其特征在于：所述重悬液中包含4.23g/L MS粉、40g/L蔗糖、20g/L葡萄糖、2g/L AS。
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