CN111411122B

CN111411122B - 稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用

Info

Publication number: CN111411122B
Application number: CN202010248590.5A
Authority: CN
Inventors: 林菲; 罗晓; 徐汉虹
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-04-01
Filing date: 2020-04-01
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2040-04-01
Also published as: CN111411122A

Abstract

本发明公开了一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用。本发明发现MoHXT2编码的转运蛋白接受多种糖作为底物，即MoHXT2基因是稻瘟病菌的己糖转运蛋白，利用CRISPR/Cas9基因敲除系统敲除MoHXT2后，发现其突变体菌丝黑色素含量明显减少，致病性大幅度下降，且根皮苷能对MoHXT2转运己糖产生一定的抑制，从而抑制稻瘟菌的生长。因此，MoHXT2基因可以用于调控植物糖转运功能、调控稻瘟病菌的致病能力和调控稻瘟病菌生长发育，还可以作为新型农药的药物靶标，为合成靶向杀菌剂提供了更可靠的方向。

Description

稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用

技术领域

本发明属于真菌基因工程领域，特别涉及一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用。

背景技术

稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)是一个复杂的、异宗配合的子囊菌，它能侵染包括水稻、麦类作物、以及玉米等50多种禾本科植物。在高湿度条件下，稻瘟病菌分生孢子接触水稻叶片后，迅速萌发并产生称为附着胞的特化侵染结构。附着孢通过黑化作用聚集甘油类溶质从而产生高水平的内膨压帮助稻瘟病菌侵入水稻细胞^[1]。进入水稻细胞之后，稻瘟病菌开始形成厚球状的初生侵染菌丝，持续3～5天之后才显示症状。稻瘟病菌侵染水稻具体过程如下：1)越冬菌丝萌发产生分生大量的孢子，在风力等介质帮助下最终接触到水稻叶片，此时孢子尖端产生的粘液帮助孢子吸附在叶片表面从而有利于下一步侵染；2)孢子萌发产生芽管，芽管顶端也能产生粘液以便于进一步稳定的吸附在叶片表面；3)形成附着胞，首先在芽管顶端卷曲形成钩状体，紧接着逐渐膨大形成附着胞，附着胞成熟后产生大量黑色素沉积在细胞壁内形成黑色素层，黑色素层有利于细胞内渗透物质的积累和膨压的产生，产生的膨压能侵染栓穿透水稻叶片角质层和表皮细胞壁；4)侵染栓能分化形成次生菌丝，菌丝继续生长扩散侵染到相邻的表皮细胞中，并进而深入到叶肉细胞，最终形成大面积的侵染病斑^[2-3]。有研究称，稻瘟病菌侵染寄主依赖于稻瘟病菌中的6-P葡萄糖的传感器Tpsl，它可对葡萄糖做出反应，并融合氮源和碳源代谢^[5-6]。

己糖转运蛋白是一种重要的糖转运蛋白，用于吸收和转运己糖。目前，酿酒酵母己糖载体蛋白的研究比较深入，己鉴定出的有20个己糖载体蛋白，发现酿酒酵母的hxtl-7基因缺失突变体，在葡萄糖、甘露糖、半乳糖和果糖培养基上无法生长，将基因Hxt1，Hxt2，Hxt3，Hxt4，Hxt6，Hxt7和Gal2分别互补hxtl-7基因缺失突变体后，得到著名已经缺陷型酿酒酵母菌株EBY.VW4000，菌株恢复利用葡萄糖的能力^[7]。此外，在Neurospora crcma，Aspergillusnidulans和Colletotrichum graminicola中也有数个己糖载体蛋白基因被鉴定。全基因扫描发现稻瘟病菌具有66个糖转运蛋白编码基因，而这些基因在稻瘟病菌致病过程中的作用仍然未知^[8]。Hiromasa Saitoh等首次发现了稻瘟病菌中的一个己糖载体蛋白基因MoST1^[4]，MoST1对分生孢子和附着孢的黑化作用起必不可少的作用，暗示了光合产物糖营养的转移和输送也参与了水稻和稻瘟病菌的识别和互作。进化分析表明，在66个己糖转运蛋白样基因中，MGG_01446、MGG_00040和MGG_06203三个基因与MoST1的亲缘关系最为密切，由NCBI数据分析得知MoST1的氨基酸序列与MGG_00040的同源性为31.9％。将其命名为MOHXT2。

高等生物通常都有复杂的基因网络来确保细胞内的生物活动有条不紊地进行。真菌的多种性状如致病性、复杂代谢合成途径、重要信号传导途径、重要功能的蛋白复合体等都涉及到了多个基因的共同作用。基因敲除技术是真菌功能基因组研究中必不可少的手段。建立一个核糖核蛋白CRISPR-Cas9(RNP-CRISPR-Cas9)系统，该系统利用纯化的核定位Cas9(Cas9-NLS)和体外合成的sgRNA^[9]，当携带可选择标记序列并能修复DSB的供体DNA与RNP共转化为真菌原生质体时^[10]，该过程在基因组靶序列上产生高效的稻瘟病菌突变率。

传统化学合成杀菌剂不但对环境污染大，还容易造成病原菌抗性的增加，用药成本增高。因此，利用CRISPR Cas9基因敲除技术，明确病原菌糖转运蛋白的功能，将病原菌和植物中的糖互作关系运用于病害的控制，有利于生态环境的发展且提高防治效率。

参考文献

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[8].许俊洁等,稻瘟病菌中己糖载体蛋白的生物信息学分析.武夷科学,2014.30(00):第187-194页.

[9].Cho S W,Lee J,Carroll D.,et al.Heritable Gene Knockout inCaenorhabditis Elegans by Direct Injection of Cas9-sgRNA Ribonucleoproteins[J].Genetics,2013,195.

[10].Foster,A.J.,et al.,CRISPR-Cas9ribonucleoprotein-mediated co-editing and counterselection in the rice blast fungus.Scientific Reports,2018.8(1).

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌致病力中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌生长中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种稻瘟病菌基因MoHXT2在杀菌剂靶标中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用；其中，所述的稻瘟病菌基因MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列：

(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(b)由如SEQ ID NO.2所示的上游同源臂核苷酸序列以及如SEQ ID NO.3所示的下游同源臂核苷酸序列组成的序列。

所述的植物优选为水稻。

所述的糖为单糖；优选为己糖；包括葡萄糖，半乳糖，甘露糖和果糖中的至少一种。

所述的稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用，为通过基因敲除(敲除稻瘟病菌基因MoHXT2)来降低糖转运能力(减少黑色素沉积)，或通过转入稻瘟病菌基因MoHXT2来恢复或提高糖转运能力。

所述的基因敲除的载体为CRISPR Cas9载体。

所述的基因敲除优选为通过如下步骤实现：

(1)利用Kpn I酶切pHPT1质粒，得到酶切产物；然后将酶切产物进行脱磷反应后纯化回收，得到pHPT1线性化产物；

(2)将稻瘟病菌基因MoHXT2上游片段连接到pEASY-T1载体(

Cloningvector)上，得到pTA-MGGFlank1；然后使用接头引物Flank3F和Flank3R扩增pTA-MGGFlank1，得到扩增产物I；再用Infusion连接酶连接扩增产物I和步骤(1)中得到的pHPT1线性化产物，转化大肠杆菌，提取质粒，得到质粒pTA-MGG Flank 1-hpt；其中，稻瘟病菌基因MoHXT2上游片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；接头引物Flank3F和Flank3R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8～9所示；

(3)利用XhoI酶切步骤(2)中得到的质粒pTA-MGG Flank 1-hpt，得到线性化载体pTA-MGG Flank1-hpt；

(4)将稻瘟病菌基因MoHXT2下游片段连接到pEASY-T1载体(

Cloningvector)上，得到pTA-MGGFlank2；然后使用接头引物Flank4F和Flank4R扩增pTA-MGGFlank2，得到扩增产物II；再用Infusion连接酶连接扩增产物II和步骤(3)中得到的线性化载体pTA-MGG Flank 1-hpt，转化大肠杆菌，提取质粒，得到质粒pMoHXT2Flank1-hpt-Flank2(作为donor DNA)；其中，稻瘟病菌基因MoHXT2下游片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；接头引物Flank4F和Flank4R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10～11所示；

(5)将Guide-it Recombinant Cas9与sgRNA混合后孵育，得到复合物；然后利用CRISPR Cas9系统，将复合物和步骤(4)中得到的质粒pMoHXT2Flank1-hpt-Flank2转入稻瘟菌原生质体，再转化真菌，筛选得到基因敲除后的突变体Mohxt2；其中，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

步骤(1)和(3)中所述的酶切的条件为：37℃酶切3h。

步骤(1)所述的脱磷反应的反应体系为：2.5mL 10×Alkaline PhosphataseBuffer，1μL Alkaline Phosphatase(CIAP)，去离子H₂O补足至25μL。

步骤(1)所述的脱磷反应的条件为：50℃、15min；37℃、5min。

步骤(2)所述的扩增产物I和pHPT1线性化产物的摩尔比为1：4～6；优选为1：4。

步骤(2)和(4)中所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌DH5α。

步骤(4)所述的扩增产物II和线性化载体pTA-MGG Flank 1-hpt的摩尔比为1：4～6；优选为1：4。

步骤(4)所述的孵育的条件优选为：37℃下孵育5分钟。

所述的基因敲除，在步骤(5)之后还包括进行验证的步骤，具体为：利用使用引物ΔMohxt2F1和Hpt R(SEQ ID NO.13～14)进行扩增，鉴定上游同源臂是否插入以及是否含有标记基因Hpt片段；使用引物ΔMohxt2F2和Hpt F(SEQ ID NO.15～16)进行扩增，鉴定下游同源臂是否插入以及是否含有标记基因Hpt片段；使用引物ΔMohxt2CDS F和ΔMohxt2CDS R(SEQ ID NO.17～18)进行扩增，鉴定是否含有CDS区域，选择能够扩增出条带(含有潮霉素片段)且无CDS区域的转化子，即为敲除成功的突变体。

所述的转入稻瘟病菌基因MoHXT2为通过如下步骤实现：将MoHXT2基因克隆至酵母异源表达载体pDR195中，构建pDR195::MoHXT2载体；然后将pDR195::MoHXT2载体转入酵母菌株中，以恢复或提高糖转运能力。

所述的酵母菌株优选为糖转运蛋白缺失突变体EBY.VW4000。

一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌致病力中的应用；其中，所述的稻瘟病菌基因MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列：

(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

所述的稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌致病力中的应用，为通过基因敲除(敲除稻瘟病菌基因MoHXT2)来降低稻瘟病菌致病力，或通过转入稻瘟病菌基因MoHXT2来恢复或提高稻瘟病菌致病力。

所述的基因敲除的载体为CRISPR Cas9载体。

一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌生长中的应用；其中，所述的稻瘟病菌基因MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列：

(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

所述的稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌生长中的应用，为通过基因敲除(敲除稻瘟病菌基因MoHXT2)后，稻瘟病菌的昼夜节律受到干扰，抑制稻瘟病菌(菌丝)的生长发育；或通过转入稻瘟病菌基因MoHXT2来促进稻瘟病菌(菌丝)的生长发育。

一种稻瘟病菌基因MoHXT2在农药基因靶标中的应用；其中，所述的稻瘟病菌基因MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列：

(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

所述的农药包括杀菌剂等；该稻瘟病菌基因MoHXT2能够作为杀菌剂的作用靶标位点。

阻断或抑制所述稻瘟病菌基因MoHXT2的表达的药物在制备防治稻瘟病的农药中的应用；其中，所述的稻瘟病菌基因MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列：

(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

所述的药物优选为己糖竞争性抑制剂；更优选为根皮苷，该根皮苷能对MoHXT2转运己糖产生抑制，从而抑制稻瘟病菌的生长。

所述的根皮苷的有效浓度优选为10mol/L。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明针对现有化学试剂防治水稻稻瘟菌的不足，基于CRISPR/Cas9基因敲除系统研究稻瘟病菌基因MoHXT2的糖转运功能，提供一种新的杀菌剂靶标，为有效防治稻瘟病提供新型农药合成方向。

(2)本发明通过CRISPR Cas9敲除系统可实现快速敲除，并高效的筛选到突变体，基于CRISPR/Cas9基因敲除系统研究稻瘟病菌基因MoHXT2的糖转运功能，是基于本发明发现MoHXT2基因是稻瘟病菌的己糖转运蛋白，利用CRISPR/Cas9基因敲除系统敲除MoHXT2后，发现其突变体菌丝黑色素含量明显减少，致病性大幅度下降，其分子结构可为新型农药提供靶标。

附图说明

图1为已糖转运蛋白进化树分析结果图。

图2为PCR扩增鉴定ΔMohxt2的凝胶电泳结果图；其中，A、B、C分别为上游同源臂扩增鉴定凝胶电泳图，下游同源臂扩增凝胶电泳图以及CDS区域扩增鉴定凝胶电泳图(泳道M为marker，泳道1-16为敲除转化子，泳道H20为阴性对照，泳道WT为阳性对照)；D为MUT与WT的核苷酸序列图谱(P1和P3:MOHXT2.6MUT F/HPT 5’R(A)；P2和P4:MOHXT2.6MUT R/HPT 3’F(B)；P5和P6:MOHXT2.6CDS mut F/MOHXT2.6CDS mut R(C))。

图3为PCR扩增鉴定ΔMohxt1的凝胶电泳结果图；其中，A、B、C分别为上游同源臂扩增鉴定凝胶电泳图，下游同源臂扩增凝胶电泳图以及CDS区域扩增鉴定凝胶电泳图(泳道M为marker，泳道1-9为敲除转化子，泳道H20为阴性对照，泳道WT为阳性对照)；D为MUT与WT的核苷酸序列图谱。

图4为ΔMohxt2在不同碳源培养基上的生长情况结果图。

图5为野生型菌株WT、ΔMohxt2以及ΔMohxt1在液体CM培养基培养50h后黑色素差异结果图。

图6为ΔMohxt2在不同碳源培养基上的生长情况结果图(A：野生型菌株WT；B：ΔMohxt2)。

图7为ΔMohxt1与ΔMohxt2在不同碳源上黑色素浓度测定结果图。

图8为野生型菌株WT与ΔMohxt2分生孢子梗拍摄结果图；其中，A为野生型菌株WT；B为ΔMohxt2。

图9为野生型菌株WT与ΔMohxt2水稻(CO39品种)叶片离体接种孢子后的致病性结果图。

图10为野生型菌株WT与ΔMohxt2水稻(CO39品种)叶片活体接种结果的致病性结果图。

图11为ΔMohxt2的酵母互补菌株在不同碳源上的生长结果图；其中，A为接种模式图(与B对应)；B为酵母互补菌株生长结果。

图12为野生型菌株WT与ΔMohxt2的菌丝带模式结果图(A：野生型菌株WT；B：ΔMohxt2)。

图13为MoHXT2同源建模结果图；其中，A为MoHXT2的同源性模型；B为MoHXT2的Ramachandran图(深绿色的点表示在有利区域中的残基；黄点表示允许区域中的残基，红叉表示非理性区域中的残基)；C为MoHXT2模型结构和模板结构叠加的结果(MoHXT2结构以紫色显示，模板结构以橙色显示，覆盖层的平均RMSD值为

)；D为MoHXT2和模板结构之间基于结构的序列比较(相同或相似的残基以蓝色突出显示，不相似的残基以红色突出显示，较深的颜色表示更多相似或不相似的残基；对应于α-螺旋的序列用红线标记；图中MGG_00040即本发明中的MoHXT2)。

图14为MoHXT2和D(+)-葡萄糖-50-99-7之间的结合模型图；其中，A为MoHXT2和D(+)-Glucose-50-99-7之间的2D绑定模型；B为MoHXT2和D(+)-葡萄糖50-99-7之间的3D绑定模型(D(+)-葡萄糖-50-99-7为青色，结合袋中周围的残基为黄色；受体的骨架被描绘为淡黄色卡通；氢键描绘为红色虚线)；C为D(+)-葡萄糖-50-99-7在MoHXT2分子表面上的结合模型(D(+)-葡萄糖-50-99-7为青色)。

图15为MoHXT2与D-(-)-果糖57-48-7之间的结合模型图；其中，A为MoHXT2和D-(-)-果糖-57-48-7之间的2D绑定模型；B为MoHXT2和D-(-)-果糖-57-48-7之间的3D绑定模型(D-(-)-果糖57-48-7为青色，结合袋中周围的残基为黄色；受体的骨架被描绘为淡黄色卡通；氢键描绘为红色虚线)；C为D-(-)-果糖-57-48-7在MoHXT2分子表面上的结合模型(D-(-)-果糖-57-48-7为青色)。

图16为MoHXT2和D-半乳糖-59-23-4之间的结合模型图；其中，A为MoHXT2和D-Galactose-59-23-4之间的2D绑定模型；B为MoHXT2和D-Galactose-59-23-4之间的3D绑定模型(D-Galactose-59-23-4为青色，结合袋中周围的残基为黄色；受体的骨架被描绘为淡黄色卡通；氢键描绘为红色虚线)；C为D-半乳糖-59-23-4在MoHXT2分子表面上的结合模型(D-Galactose-59-23-4为青色)。

图17为MoHXT2和D-甘露糖3458-28-4之间的结合模型图；其中，A为MoHXT2和D-甘露糖3458-28-4之间的2D绑定模型；B为MoHXT2和D-甘露糖3458-28-4之间的3D绑定模型(D-甘露糖3458-28-4为青色，结合袋中周围的残基为黄色；受体的骨架被描绘为淡黄色卡通；氢键描绘为红色虚线)；C为D-甘露糖-3458-28-4在MoHXT2分子表面上的结合模型(D-甘露糖3458-28-4为青色)。

图18为野生型菌株WT在含10mM根皮苷的CM的生长图；其中，图A为野生型菌株WT在单糖上的生长表型；图B为数据统计图。

图19为MoHXT2和根皮苷-7061-54-3之间的结合模型图；其中，A为MoHXT2与根皮苷-7061-54-3之间的2D结合模型；B为MoHXT2和根皮苷-7061-54-3之间的3D结合模型(根皮苷-7061-54-3被染成青色，结合袋中周围的残基被染成黄色；受体的骨架被描绘成淡黄色卡通；氢键描绘为红色虚线)；C为在水合物MoHXT2的分子表面上的水合根皮苷-7061-54-3的结合模型(根皮苷-7061-54-3被染成青色)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，皆为从商业途径得到的试剂和材料。

本发明实施例中涉及的大肠杆菌DH5α购自全式金生物科技有限公司；稻瘟菌为普通野生型菌株稻瘟病菌70-15(购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心)(简称WT)；酵母己糖转运蛋白缺失突变体EBY.VW4000(即己糖缺陷型酵母菌株EBY.VW4000)。pHPT1质粒购买于上海柯雷生物科技有限公司；酵母异源表达载体pDR195(空载体pDR195)购买于优宝生物公司。

本发明实施例中所使用的化学试剂均为进口或国产分析纯。

本发明实施例中所使用的引物由深圳华大基因公司合成，测序在深圳华大基因公司进行。

本发明中涉及的CM培养基的配方如下：

CM培养基配方

1mol NaOH调pH值至6.5，加水至1000mL；若配固体培养基，则加入15g/mL琼脂粉，高压灭菌。

其中，表中涉及的“20x Nitrate Salts”、“1000x Vitamin Solution”和“1000xTrace elements”的配方如下：

Nitrate Salts母液的配方

20×Nitrate Salts	1000mL
		NaNO<sub>3</sub>	120g
KCI	10.4g
		MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O	10.4g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	30.4g

用灭菌蒸馏水配制，逐个溶解后定容至1000mL，4℃黑暗保存。

Trace elements母液的配方

1000×Trace elements	80mL
		ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	2.2g
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>硼酸	1.1g
		MnCl<sub>2</sub> 4H<sub>2</sub>O	0.5g
FeSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O	0.5g
		CoCl<sub>2</sub> 6H<sub>2</sub>O	0.17g
CuSO<sub>4</sub> 5H<sub>2</sub>O	0.16g

以上药品逐个加入溶解后，单独溶解0.13g的Na₂MoO₄2H₂O加入；再加入4.45g的Na₂EDTA，少量多次加，混匀。用细菌过滤器除菌。刚配完的溶液为墨绿色，4℃黑喑保存后逐渐变为红色。溶液配成后会有沉淀，属正常现象，取上清使用即可。

Vitamin Solution母液的配培养

1000×Vitamin Solution	100mL
		生物素(Biotin)	0.01g(用热水溶解)
VB6(Pyridoxin)	0.01g
		VB1(Thiamine)	0.01g
VB2(Riboflavin)	0.01g
		对氨基苯甲酸(PABA)	0.01g
烟酸(Nicotinie acid)	0.01g

以上药品逐个溶解后加水定容至100mL，用细菌过滤器除菌，4℃黑暗保存。

实施例1 MoHXT2基因突变体的敲除与鉴定

(1)扩增目的片段

将野生型稻瘟病菌WT接种到CM固体培养基中，置于28℃培养箱中黑暗生长5d，收集菌丝，然后将菌丝切成碎块均匀分装到50mL CM液体培养基中，28℃，160rpm，培养48小时后，收集菌丝，无菌水清洗后提取野生型稻瘟病菌WT的基因组DNA(DNA提取为真菌基因组DNA提取试剂盒M5Fungal Genomic DNA Kit真菌基因组DNA提取试剂盒购买于北京聚合美生物科技有限公司)，保存于-20℃。将其作为模板，分别使用引物Flank1F/R及Flank2F/R对MoHXT2基因(SEQ ID NO.1)上下游同源臂序列进行PCR扩增，基因组DNA(gDNA)扩增浓度为5ng/μL，使用以下反应混合物：2μl 1×Taq缓冲液；2μl 0.25mM dNTPs；10μM每种引物各1μL；0.15μL 0.4U Taq聚合酶；1μL gDNA(5ng)；补H₂O至20μL。其中，

上游同源臂扩增引物序列如下：

Flank1F:5’-accgaatttctcccttcttgtt-3’(SEQ ID NO.4)；

Flank1R:5’-cattgaccctgatggacctgta-3’(SEQ ID NO.5)；

下游同源臂扩增引物序列如下：

Flank2F:5’-acgccaagcaaaggcctggtagc-3’(SEQ ID NO.6)；

Flank2R:5’-tctcctccatcacgggcagcaac-3’(SEQ ID NO.7)。

执行使用以下热循环条件进行PCR：1个循环：95℃3分钟；28个循环：95℃15秒；60℃1分钟；72℃30秒。

琼脂糖凝胶(1.0％)电泳鉴定，依次得到1000bp左右的PCR产物，

GelExtraction Kit(OMEGA)纯化。经过测序，1000bp左右的PCR产物具有如SEQ ID NO.2～3所示的核苷酸序列。并对核酸序列进行胶回收，使用

Cloning Kit试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)构建TA克隆。

37℃，15分钟。大肠杆菌转化，使用通用引物M13F/M13R(F:CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC(SEQ ID NO.39)；R:CACACAGGAAACAGCTATGAC(SEQ ID NO.40))进行菌落PCR筛选正确的克隆，命名为pTA-MGGFlank1及pTA-MGGFlank2。

MoHXT2基因(SEQ ID NO.1)：

atgcttggcggcaagtccatcagggtcaatggcgccgagtgcggcgtcgagtctctcttcctcggcgctgtcaccagcctgggtggctttcttttcggttacgacacgggtcagatctcgggcatgctcatcttcgaggactttcagcgccgcttcgccacgggccccgttggggagaatggcatccgggaatgggttcccatcattcagtccaccatggtgtccctgatgagcatcggaacgctcatcggtgctctttctggtgcctacactgccgactggtggggacgtcggaggagtttggcgttcggtgtcatcttgttcatcatcggcaacatcatccagattactgccatggagtcttggattcacatgatgatgggtcgcctgattgctggttttggtattggtaacctgtctgtcggtgtgcccatgttccagtcggagtgtgctccccgtgagattaggggtgccgttgtggccagctaccaactgctcatcactttcggaatcctcatctcaaacatcatcaactacggtgtcaggaacatccagggctccgacgcctcgtggagaatcgtgattggcctgggcatcttcttcagcgtgcctctcggtatcggcatcctgctcgtccccgagtctccccgttggctcgccggacgtcaggactgggatggtgctcgcatgtccatcgctcgtctccgcggcatgaagcacgaccccaacaacgtcctcgtcgagaccgacatcagcgagatgtacaagatcatcaaggaggagtccagcgtcggagtcggcagctgggccgaatgcttcaccggcaagggcggttccgaaggcattcccaaggttgtgtaccgcaccatcctgggcatgttcctgcactttacgcagcagtggaccggtgtaaactacttcttctactacggtgccacgattttccagtctgctggtgtcgacgaccctatcgtcacgcaattgatcctgggcgccgtcaacgtcgccatgaccttcttgggtctgtacattgtcgagaagtttggacgtcgtggtcccctctttattggtggcgcgtggcaggcggtctggctggctgtttttgctgccattggaaccgctctgccgcccacagagaaccgcgtctctggcatcgtcatgattgtgtccgcctgcatgtttattgcttcgttcgccagcacctggggtcccatctgctgggtcgtcatcggcgagaccttcccgctccgcacgcgtgccaagcaggcctcgctgtccacagccggcaactggctgggcaactttatgatttcgttcctcacgcccatcgccaccgacggcatctcgttctcctacggcttcgtgtttgccgccgtcaacttgtgcggtgccctgggcgtgtacttcttcctctacgagtcccgcatgctgtcgctcgagaacgtcgaccgcatgtacggcgacccgtccatcaagccctggaactcgcgcaagtggactccccccggatacatcaaccgccgcaccaaggacgagaagtacgtgcccgagggcgagcacgtccagggcggagtcaggggctcggtcggcagcgacaacaccgccgtccccggcgaggccgacgtcaaccacgaccacgccaagcaaaggcctggtagcgacggcgttcccacgacggagcagcacgagcaggctgtgctccggaacgcgtaa。

PCR产物1(SEQ ID NO.2)：

tgaccagcgatcttggggctattttttccatttgggacgtagagcaaaattcgaggatggatgccaatggttcccccgcactttgtggctgccccttggcaagggaagtttttttctgatctgatgcagccttctccaacaaagggagaaaataaattaggcgataaaaaaagaaaagagtttccaacggccagccggacacaaaaagcaaataaaaaaaaatgcaactttccagtacctggcccccttgtgtgccgtgttccgaaacggacttttttcccacaacgcgaaccgaatttctcccttcttgttactcggcacccagggactttaccttgattacctagcaaagccaaacgtcatggagacctgctccacccagtcggcgctttctcgtgcaaacaagacgaccacaccgcagacgtgggcccaggcgacgggctccgtcatcccgttattttgtggtctcttttgttttccaattttttttttaattccttttttttttcgtgaggcttttgctgctttgctgcaatttcgcggcacgtggtcctttcattttttgctccccctttgcggatcgtgaatgagtcgtgggtggctacagttttacaaaggaaaccgtgcaacgacgtcatcttggacggcctcttggcgtcttggtgatgcttgaaagaaaaaaaacccaccacggatcctcgacgcgcgccgtggttcaaaaacgcactcgtctgccgcatttcttctggttccggaatgtatttcttgtacagtgatctgctcgtctgtttcctcaatccgactttttttttttttcaatggacctcgagtgagcccgatctactgacacaaccgtaaagtggtcccccaagccaccaagacaccacctgttggccaaaatcccccagggcccggccgaacttttcttttcgattttgatcccttttcgtctgttttattttgtcaacctgtgataccctcttgcgtatacttcttttttcaacagcaatc。

PCR产物2(SEQ ID NO.3)：

tgttggcgggtggcttaatgtcttgaaacatcgatggttttgagagattttgtcttgtaggatactactaggttttctttgttgcagaaaactgactggtttagctgccagtgagagcatatatatacaaacataaatataaccgaaacctttgggtaaccccttggtcaaatgcatgcgagaaagtgatgagcttttgacgggataattgataataggttcacatttcgaacctcgcaggcgatgatgggccgtcaaactccatccttacttggaccccgtgtacacaagcaggcctagcccgccattgtacggcaaaactgtcatattgaacccactgtccggctgatcgacataatccaggagatcgcgatagcccgacttggcatcctcgatattgtccacaatgaccatggcaccctttttcatcattggctgtaccagcttgagagtcggaagggccagcggtgtccagactattgccaagtcgcggtcagcctgtcattggcagtatgaaaaaaaaagagccccgggagcaacttactgtcgagaagcaaaagatccacccgtggcagaccctgcttgagcgtctccaagatgtcaccctccctcagctcaatccacctcgccacatcctcaccagcagcggcccaattctccctcgccctcgccgccttttccggctcgttctccgtggcaatcaccctcgcaacccccgcgtcgtcgccggcgttctgcccgaccgccagcgcgagccagatggtcgagacgccaaagctggtccccgcctccaccacgcaacgcgcccccgaaccccgcaccagcaggtacgccagcgccgccttgtccgggtccagcgcgacgaacagctcccgcgtgtgtcgccgcagcgcctcctcgcgcgtctccgtctcggaggcgcgcgcgtccgtgctgacaaagggcggctccgccagcgcttgttcgtgcaggcgcgcgagggtttcgagtgcgcggttgctgcccgtgatggaggaga。

(2)构建TA克隆载体

(A)构建质粒pTA-MGG Flank 1-hpt

a、建立Kpn I酶切反应：1μL Kpn I(Takara，目录号1068S)；1.5μL 10×L buffer(Takara)；60至100ng完整pHPT1质粒；去离子H₂O至最终体积15μL。37℃酶切3h，混合酶切产物使用PCR产物胶回收试剂盒纯化混合物。

b、胶回收产物进行脱磷反应：以胶回收为模板；2.5mL 10×AlkalinePhosphatase Buffer(Takara，目录号:2021A)；1μL Alkaline Phosphatase(CIAP)(Takara)；去离子H₂O至最终体积25μL。15min，50℃；5min，37℃。脱磷产物使用纯化试剂盒纯化回收，获得pHPT1线性化产物。

c、连接反应：使用接头引物Flank3F/3R扩增pTA-MGGFlank1，使用胶回收试剂盒(OMEGA)纯化，得到pTA-MGGFlank1胶回收产物(作为载体)；然后将其与PCR产物1(SEQ IDNO.2，作为插入片段)进行Infusion连接酶连接(载体和每个插入物之间的摩尔比约为1：4至1：6；本实施例的摩尔比为多少1：4)，其连接体系如下：2μl pTA-MGGFlank1胶回收产物；1μl pHPT1线性化产物；1μl 5×In-Fusion HD Enzyme Premix(Takara)，补水至5μl。50℃反应15分钟。其中，涉及的引物序列如下：

Flank3F:5’-ggtaccagagaagggcaattccaccgaatttctcccttcttgtt-3’(SEQ IDNO.8)；

Flank3R:5’-ccttcaatatcagttaacgtcgcattgaccctgatggacctgta-3’(SEQ IDNO.9)。

d、使用以下程序在热循环仪(不使用加热盖)中进行反应：50℃、15分钟。

e、取2至3μL PCR产物用于电泳，1.0％琼脂糖凝胶电泳验证。

f、转化大肠杆菌DH5α，再提取质粒，得到质粒pTA-MGG Flank 1-hpt。

(B)构建质粒pMoHXT2Flank1-hpt-Flank2

g、将上述步骤构建的质粒pTA-MGG Flank 1-hpt建立XhoI酶切/连接反应：1μlXhoI(Takara，目录号1094S)；1.5μL 10×H buffer(Takara)；60至100ng完整pTA-MGGFlank 1-hpt质粒；去离子H₂O至最终体积15μL。37℃酶切3h，混合酶切产物使用PCR产物胶回收试剂盒纯化混合物，获得pTA-MGG Flank1-hpt线性化产物。

h、使用接头引物Flank4F/4R扩增pTA-MGGFlank2，使用胶回收试剂盒(OMEGA)纯化后，得到pTA-MGGFlank2胶回收产物(作为载体)；然后将其与PCR产物2(SEQ ID NO.3，作为插入片段)进行Infusion连接酶连接(载体和每个插入物之间的摩尔比约为1：4至1：6；本实施例的摩尔比为多少1：4)，其连接体系如下：2μl pTA-MGGFlank2胶回收产物；1μl pTA-MGGFlank 1-hpt线性化产物；1μl 5×In-Fusion HD Enzyme Premix(Takara)；补水至5μl。其中，引物序列如下：

Flank4F:5’-tcaccagccctgggttctcgagacgccaagcaaaggcctggtagc-3’(SEQ IDNO.10)；

Flank4R:5’-ccctctagatgcatgctcgagtctcctccatcacgggcagcaac-3’(SEQ IDNO.11)。

i、使用以下程序在热循环仪(不使用加热盖)中进行反应：50℃、15分钟。

j、取2至3μL PCR产物用于电泳，1.0％琼脂糖凝胶电泳验证。

k、转化大肠杆菌DH5α，再提取质粒，得到质粒pMoHXT2Flank1-hpt-Flank2(作为敲除donor DNA)。-20℃保存。

(3)利用CRISPR Cas9系统进行基因敲除

参照Takara基因编辑试剂盒说明书要求，进行CRISPR Cas9系统的敲除，具体步骤如下：

①通过http://www.clontech.com/sgRNA-design-tools在线设计sgRNA。

ΔMohxt2sgRNA:5’-ggcgtcgagtctctcttcct-3’(SEQ ID NO.12)。

②使用Guide-it sgRNA体外转录试剂盒(Takara，目录号632635)合成sgRNA，并使用Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit(Takara，目录号632638)将其进行了纯化。

③将Guide-it Recombinant Cas9(Takara，目录号632641)与sgRNA复合，37℃下孵育5分钟，得到Guide-it Recombinant Cas9与sgRNA复合物；再将Guide-it RecombinantCas9与sgRNA复合物以及donor DNA(质粒pMoHXT2Flank1-hpt-Flank2)转入稻瘟菌原生质体(参考文献：Talbot N J.On the Trail of a Cereal Killer:Exploring the Biologyof Magnaporthe grisea[J].Annual Review of Microbiology,2003,57(1):177-202.)中进行瞬时表达，得到敲除产物。

④对敲除产物采用PEG介导的葡聚糖生成的原生质体进行真菌(即野生菌株WT)转化(参考文献：Talbot N J.On the Trail of a Cereal Killer:Exploring the Biologyof Magnaporthe grisea[J].Annual Review of Microbiology,2003,57(1):177-202.)。将转化的原生质体在每管加入含有300μg/mL潮霉素B的CM固体培养基中混匀，倒平板，28℃下黑暗培养3～5d至长出转化子；挑取转化子到含有300μg/mL潮霉素B的CM平板上，28℃黑暗培养，再连续培养3代，筛选性状稳定的转化子。

⑤PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定：使用引物ΔMohxt2F1/Hpt R进行扩增鉴定上游同源臂是否插入以及是否含有标记基因Hpt片段；使用ΔMohxt2F2/Hpt F进行扩增鉴定下游同源臂是否插入以及是否含有标记基因Hpt片段；使用ΔMohxt2CDS F/ΔMohxt2CDS R引物扩增可鉴定是否含有CDS区域，转化子含有潮霉素片段且无CDS区域则为敲除成功的突变体。基因组DNA扩增浓度为5ng/μL，使用以下反应混合物：2μl 1×Taq缓冲液；2μl 0.25mM dNTPs；10μM每种引物各1μl；0.15μl 0.4U Taq聚合酶；1μl 5ng质粒；补H₂O至20μL。执行使用以下热循环条件进行PCR：1个循环：95℃3分钟；28个循环：95℃15秒；60℃1分钟；72℃30秒。琼脂糖凝胶(1.0％)电泳鉴定(随机挑选16个转化子)，结果如图2(泳道1-16为敲除转化子；H₂O为阴性对照；WT为野生型WT菌株，作为阳性对照)所示：由图2A和2B分析可知，在1-16个转化子中，含有潮霉素片段及上下游同源臂的转化子有1，2，3，5，7，8，9，10，11，12，13，15；由图2C分析可知不含有CDS区域的转化子有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，13，15。综上，敲除成功的转化子有1，2，3，5，7，8，9，10，12，13，15。

ΔMohxt2F1:5’-gctagccaatggaagccagct-3’(SEQ ID NO.13)；

Hpt R:5’-ataaagggaggaagggcgaac-3’(SEQ ID NO.14)；

ΔMohxt2R2:5’-aggttcgcagtcacgtacgtt-3’(SEQ ID NO.15)；

Hpt F:5’-tcttagccagacgagcgggttc-3’(SEQ ID NO.16)；

ΔMohxt2CDS F:5’-tcggaatcctcatctcaaacatc-3’(SEQ ID NO.17)；

ΔMohxt2CDS R:5’-cctggcgaacgaagcaataaac-3’(SEQ ID NO.18)。

将筛选后得到Mohxt2的菌株，无菌滤纸纸片保存于-80℃。

实施例2 Mohxt2在不同碳源培养基上的生长情况

(1)将实施例1步骤(3)⑤筛选得到的突变体Mohxt2(本实验选择泳道2、泳道7和泳道9的敲除转化子，依次命名为ΔMohxt2-2，ΔMohxt2-7，ΔMohxt2-9，同时以野生型WT菌株为对照)在CM培养基上培养5d后，沿菌落边缘用直径为3cm的打孔器打取菌丝块，转接到含有不同碳源的(葡萄糖，半乳糖，甘露糖，果糖；浓度均为2％(w/v)；实验所使用单糖均购买于Sigma)的CM固体培养基上进行生长观察，重复三次。培养5d后观察黑色积聚差异。在CM固体培养基上观察到不同碳源上野生型WT菌株与突变体Mohxt2的差异(图4)。同时，ΔMohxt2-9使用含有葡萄糖的CM液体培养基在28℃，180rpm培养50h后观察发现，液体培养基存在黑色素沉积的差异:与野生型WT相比黑色素沉积明显减少(图6)。

另外，我们发现同一个家族的另一个糖转运蛋白MoHXT1的转化子接种在含不同碳源((葡萄糖，半乳糖，甘露糖，果糖；浓度均为2％(w/v))CM固体培养基上，并无黑色素减少的情况(图5)，具体实验过程如下：

(a)扩增目的片段：参照实施例1的步骤，将稻瘟菌gDNA(基因组DNA)作为模板，分别使用引物Flank3F/R及Flank4F/R对MoHXT1基因(SEQ ID NO.19)上游同源臂以及下游同源臂序列进行PCR扩增，基因组DNA扩增浓度为5ng/μL，使用以下反应混合物：2μl 1×Taq缓冲液；2μl 0.25mM dNTPs；10μM每种引物各1μL；0.15μL 0.4U Taq聚合酶；1μL 5ng gDNA；补H₂O至20μL。其中，

上游同源臂扩增引物序列如下：

Flank5F:5’-ccactaccaggcaaacaaag-3’(SEQ ID NO.22)；

Flank5R:5’-aacaggagggaaggtgaggc-3’(SEQ ID NO.23)；

下游同源臂扩增引物序列如下：

Flank6F:5’-atcgccaccgagtctgccaaggagg’(SEQ ID NO.24)；

Flank6R:5’-tcaatttcgtccgtctgtacctg-3’(SEQ ID NO.25)。

琼脂糖凝胶(1.0％)电泳鉴定，依次得到1000bp左右的PCR产物，

GelExtraction Kit(OMEGA)纯化。经过测序，1000bp左右的PCR产物具有如SEQ ID NO.20～21所示的核苷酸序列。

MoHXT1基因(SEQ ID NO.19)

atgcccggctccgtcatcgggacggccgacgtctcgcgcgtcgaggctcccatcaccgtcaaggcctacctcgtttgtgcctttgccgcctttggtggtatcttcttcggttatgacacaggatggatgggtggtgtccagggcatgccctacttcatcagcatgtacactggcatgcaatacgactacgaggccgggcagcctatcggtgttgacaaggacaagttcattcttcccgaccaacagaaatctctcatgacctctatcctgtctgccggtaccttctttggcgctcttattgctggtgatattgccgactacattggccgccgtcccaccattatcgctggctgtggtatcttctccatcggtgccgtcctccaagccgcttccaccaaccaggaggccctcatggtcctcggccgtctgattgctggtctcggtgtcggtttcatctcggccatcatcattctctacatgtccgagatcgcccccaagaaggtccgtggtgccatggtctcgggataccagttttgcatcaccattggtattctgctggccaactgcgtcgtctacgccacccagaacagaaacgacaccggatcataccgtatccccgtggccatccagttcctatgggccatcatccttgccgttggtctgttcctgctgcccgagtctccccgttaccacgtcaagaagggcatgctcgagcaggccgccaaggacctctctgtcatccgtggccagcccgtcgactcggactacatcaaggacgagcttgccgagattgtcgccaacaacgagtacgagatggcccacatcccccagaccagctacatcggctcgtggactgccctcttcaagggttccctgtccaagggcaacagcaacatccgccgtaccattctcggcgttggtatgcagatgatgcaacagctcactggtatcaactttatcttctactttggtgttccctcttccagcagctgggcacaatttcagaccccttcctgatgggtctggtcaccaccctggtcaacgtttgctccactcccgtatcgttctggtctattgagaagttcggtcgtcgtttcctcctcatctacggagccatgggtatgatcgtctgtcagttcatcgtcgccattctcggtgtgactgagggtcgcaaggaggccggcaacgacaacgccgtcaaggccatgattgccttcatctgcatcaacatcagcttcttcgccatcacctggggtcccactgcctgggtcattgtcggcgagaccttctccctgcccatccgctcgcgcggtgtcggtatctcgaccgcctccaactggttctggaactgcatcatcggcatcatcaccccctacatggtcggtgagagtgacggctcagccggcctgggctctaaggtgttcttcatctggggcagtctgtgctgcgcatcgctcgccttcgcctacttcctggtccccgagatgaagggtctctccctggagcaggtcgacaagatgctcgaggagaccaccccccgcaagtccaagagctggatcccgacctccacctacgccgccgacatgggccacacccacggcgagaagagcggcattatcgccaccgagtctgccaaggaggagaccgtctaa。

SEQ ID NO.20(PCR产物3)：

ccactaccaggcaaacaaagtaaagtaaaaaaaaaaaaaaacccctgcatcatcatcaaagacatggaatcatatgtttgtgattggaccattccataccgccacgccgttttctcctttcaaaagtaaccgatttggatctcgcccgttgtgatcacctggtgggccatattcccggaggattggagagatggagaagagacagagagaaaagcccagtcggcctccattcggcgattcacgcgtatgatccacatgtttttgatccctgagcttgttggagacgagctgcatcgcaaggagggcgtatgtgggaagtacctacttgctgctgtatgtaagtactgtacctaggtaggtatgtatgtacggggtaggtgtgtgtggcgttgcagatgcattcgcacataccttttttttcccctttcgtagctctcccattgactttcctagctggagtttcttctctctatttcgtcaacatgcggttgtttaaacggctagcattttgttcttggtgctgaattacttttttcctctggcgaggctttgtctgggccggattatcgctaaactctttccaggcggatgccggatgtgaccgcctgtggatgtttgtgccgtagtaattaatttaccacgagggcacacgacaaccacaccccccagtctcttccttttctcgttttattgcacgtcgtcgttttttgtcaggctcctcctctccgccgcccacaccgcaaccccggcctggccctcctcgcccatccacaaccaattttcaatttgcggagtcccacgcatgcaacacatttccccaaccggccctaccttgccatccattaccaagacccttgcaactaaacaacaagcccacccctagagttcggtacggctcacgccccccccccccccccccccccctgcagctcactttgtgtacctaccgtacctacttcgtaggttgctttagctcgagtttcgtacaatttctgttcctcgggtgtgggctatatattgccctgcccatccccttccattcacctctgcctcaccttccctcctgtt。

SEQ ID NO.21(PCR产物4)：

gccaaggaggagaccgtctaaaatgtcttgtttattggcgaatccccgtaatctccagccatttggactcgtcggccaggacatggtccgctgggtatcatttggtttggaattgcaaaagaaaagagggatacaattggctttttactgttggtctcctacgtccgctatcgcggtaggatgacgctaggaactctaaatgataccatctcttatattataatacaaatccaactcgatttaatcaacgttactccgtgaaaagtgatcctcatattgatttttctcttcttaactgtgtcgttttcggtatgctcgtctctgtgtttcactgctaatgttgtttgcatgacttgtctaactaggtggttatatttcgaacaggaaaaaaaggtaaatttgtacccagcatgaaatagtcgagttgtgacaagatgcataccagtccaacgtctacttactcgaaaaggtataatccgctcactccattattccatctcttgtaagccaacaacacatctctttaggtcttcaacaagacccaatggccacgtggtaattagacctcgtccgaacattttggctgaagtttcaagcttaaggtcttttgttcaatgggatcaggaacacagaaacccaagatgaaaaaggagcacaagctggaaaagaaaagcaagtaccccacactgaagccgagccggggccaggccaattggcaaagcgcggcccgaatccgctagtccaaacggtcttgtcggagaataaaaggggcaagaagagacgatcaagcaaagaaaggaaactgcccccaagtgaatcaaaatgattcattctggctgtgcgcccagcgcgcccagctggttctttttgtgtcgcccagacctgaaaaacccgccctagtatgcaatttcaaaggcagttacgtatatctacagaaagagttggcaaatgggaacagttacaaactggtatttgtatcggcctgttttttttttcttttctttttttttgtcatcataagccctccaaaaagagacaggtacagacggacgaaattga。

(b)质粒构建以及基因敲除：参照实施例1的步骤，构建donor DNA模板质粒pMoHXT1Flank3-hpt-Flank4，并体外纯化sgRNA进行原生质体转化敲除，然后对筛选的转化子进行PCR扩增鉴定，PCR扩增体系同实施例1，只更换对应的转化子模板，对扩增结果进行同样的分析后，选出敲除成功的转化子。相应的接头引物以及鉴定引物如下：

Flank7F：5’-ggtaccagagaagggcaattccccactaccaggcaaacaaag-3’(SEQ IDNO.26)；

Flank7R：5’-ccttcaatatcagttaacgtcgaacaggagggaaggtgaggc-3’(SEQ IDNO.27)；

Flank8F：5’-tcaccagccctgggttctcgagatcgccaccgagtctgccaaggagg-3’(SEQ IDNO.28)；

Flank8R：5’-ccctctagatgcatgctcgagtcaatttcgtccgtctgtacctg-3’(SEQ IDNO.29)；

ΔMohxt1F3:5’-ctggacttggaatgaccaaa-3’(SEQ ID NO.30)；

Hpt R:5’-ataaagggaggaagggcgaac-3’(SEQ ID NO.31)；

ΔMohxt1R4:5’-gcgacggactctgaggcaatc-3’(SEQ ID NO.32)；

Hpt F:5’-tcttagccagacgagcgggttc-3’(SEQ ID NO.33)；

ΔMohxt1CDS F:5’-atgcccggctccgtcatcggg-3’(SEQ ID NO.34)；

ΔMohxt1CDS R:5’-ttagacggtctcctccttggc-3’(SEQ ID NO.35)；

ΔMohxt1sgRNA：gataccaccaaaggcggcaa(SEQ ID NO.36)。

将PCR扩增产物(随机挑选9个转化子)进行琼脂糖凝胶(1.0％)电泳鉴定(图3)，然后选择泳道5和泳道7的敲除转化子(ΔMohxt1-5，ΔMohxt1-7)按上述方法接种到含有不同碳源的CM固体培养基上进行培养，与实施例1步骤(3)⑤筛选得到的突变体Mohxt2(泳道4的转化子，ΔMohxt2-4)比较，结果如图5所示。

(2)挑选在不同碳源的黑化程度的不同基因的转化子，提取其黑色素进行检测，具体为：

分别将200mg WT、ΔMohxt1-9(上述敲除MoHXT1基因的转化子(泳道9)，下同)和ΔMohxt2-7(上述敲除MoHXT2基因的转化子(泳道7)菌丝体与液氮混合磨碎，在室温下用1mL70％(w/w)甲醇震荡5分钟；然后在每个样品中加入200μL的蒸馏水，涡旋两次，每次30秒，然后以最大离心速度14000rpm离心1分钟；去上清并加入1mL 10％(w/v)TCA(三氯乙酸)震荡30秒混匀，离心去上清，重复该步骤两次，并用1mL 100％乙醇洗涤两次；最终将沉淀悬浮在750μL的混合溶液(1mol/L NaOH+10％(v/v)DMSO(二甲基亚砜)(终浓度)中混匀，涡旋30秒，在60℃条件下静置过夜；然后在80℃下孵育20分钟，以最大速度14000rpm离心5分钟。以混合溶液(1mol/LNaOH+10％(v/v)DMSO(二甲基亚砜)(终浓度)为对照，上清液用分光光度计波长为600nm进行测定。表型观察结果与黑色素测定结果一致，在不同碳源的CM固体或液体培养基上均存在着一定的差异(图7)。

实施例3 Mohxt2致病性分析

将实施例1筛选得到的突变体(Mohxt2-9)的菌丝块接种在稻杆培养基(RDC)(配方如下：稻杆100g，玉米粉40g，琼脂粉15g；制备方法为：将100g稻杆加入1L的无菌水中煮沸20分钟后，用纱布过滤得到滤液，溶解玉米粉与琼脂，补水至1L高温灭菌)上扩繁，黑光灯照射5d后，无菌水洗下孢子镜检(图8)，接种到离体水稻叶片(水稻CO39(抗性品种)，广东省农科院水稻所)片上，侵染96h后进行拍照观察，致病性分析。与野生型菌株WT相比，ΔMohxt2在抗性品种CO39致病性明显降低(图9)。

为了进一步验证ΔMohxt2的致病性，将ΔMohxt2突变体在CM培养基上扩繁，待长满全皿后，挑起菌丝放入玉米粒培养基(将玉米粒高压灭菌即可)上生长十天，25℃，12h光/暗交替三天完成产孢。无菌水洗下孢子，收集分生孢子，通过滤膜过滤得到后定量到5×10⁵(孢子数/毫升)的孢子悬浮液。将5mL孢子悬浮液喷洒在14d左右、生长健康且长势一致的水稻品种CO39苗(14天左右)上。将接种的植物放置在暗箱内24h(维持28℃及90％湿度)，随后在每12小时光暗交替和同样温湿度的环境继续培养，7天后观察病斑，实验重复三次。拍照观察，致病性分析。结果如图10所示：野生型WT能导致水稻叶片正常发病形成典型的病斑，而ΔMohxt2无致病性病斑的形成。综上可知，MoHXT2基因对水稻致病性的形成十分重要。

实施例4酵母突变体互补试验

根据MoHXT2基因全长设计引物pDR195-MoHXT2F/R，这两个引物分别带有Xho I和BamH I酶切位点。通过同源重组连接反应将MoHXT2基因(SEQ ID NO.1)克隆至酵母异源表达载体pDR195中，构建出pDR195::MoHXT2载体。引物如下：

pDR195-MoHXT2F：

5’-accccagcctcgagcatgcttggcggcaagtccatca-3’(SEQ ID NO.37)；

pDR195-MoHXT2R：

5’-gaagtccaaagctggatcttacgcgttccggagcacagcc-3’(SEQ ID NO.38)。

参照新型快速酵母转化试剂盒(Coolaber)使用方法，通过酵母转化法将构建的pDR195::MoHXT2载体与空载体pDR195分别转入酵母己糖转运蛋白缺失突变体EBY.VW4000中。pDR195::MoHXT2转运底物筛选通过提取酵母质粒(酵母阳性克隆快速检测试剂盒，Coolaber)进行PCR检测，筛选出阳性克隆菌株。将阳性转化菌株接种至以2％(w/v)麦芽糖为碳源的筛选培养基(SD-Ura培养基)中30℃，220rpm震荡培养至菌液OD600值在0.5～0.7之间。收集2mL菌液在室温下8000rpm离心5min。用无菌水将含pDR195::MoHXT2载体与pDR195空载体的阳性转化菌体悬浮液稀释到相同OD浓度0.1，并进一步梯度稀释到OD为0.05，0.01，0.005等不同浓度菌体悬浮液。将这些菌体悬浮液依次分别吸取1μL接种至含有不同糖类作为碳源(麦芽糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖)的筛选培养基上，糖浓度皆为2％(w/v)，30℃倒置培养60h后对菌落生长情况进行拍照记录。结果如图11所示：观察到pDR195::MoHXT2的表达可以恢复EBY.VW4000在葡萄糖，甘露糖和果糖上的生长，表明编码的转运蛋白接受多种糖作为底物。同时，这些结果表明MoHXT2是典型的单糖转运蛋白。

实施例5MoHXT2参与调节生长节律

由前面的表型实验的结果可以得知，ΔMohxt2导致黑色素缺乏并降低了致病性。为了研究作用机理，我们推测MoHXT2会影响昼夜节律的调节。为了确定MoHXT2是否参与了稻瘟菌生长节律的调节，我们观察在黑暗/明亮(12h/12h)循环下，野生型以和ΔMohxt2-9菌丝带模式，这能表明在稻瘟菌中存在功能性昼夜节律反应。具体为：将野生型菌株WT和ΔMohxt2菌株接种在CM培养基上，28℃黑暗/明亮(12h/12h)循环5d后，ΔMohxt2中未观察到明显的条带(菌丝带)，表明ΔMohxt2的昼夜节律受到干扰，MoHXT2基因参与调节昼夜节律(图12)。

实施例6MoHXT2的同源建模及与己糖分子对接

同源性建模：将模板晶体结构通过BLAST鉴定，并从RCSB蛋白质数据库(PGG ID：MoHXT2的4LDS)下载。在MOE1中进行了同源性建模。在pH＝7和300K的温度下，通过LigX优化了蛋白质的质子化状态和氢的取向。首先，将靶序列与模板序列比对，并建立十个独立的中间模型。这些不同的同源性模型是对不同的候选环和侧链旋转异构体进行置换选择的结果。然后，选择根据GB/VI评分功能评分最高的中间模型作为最终模型，使用AMBER12/EHT力场进一步降低能量。

己糖分子对接：MOE Dock用于单糖与MoHXT2的分子对接，并预测结合亲和力。将单糖定义为配体，将MoHXT2定义为目标。通过能量最小化，在MOE中将4个分子的2D结构转换为3D。然后通过LigX在7的PH和300K的温度下优化目标的质子化状态和氢的取向。在对接之前，AMBER10：EHT的力场和反应场的隐式溶剂化模型(R-字段)。这两个模板结构没有天然配体，在不知道特定结合位点的情况下，我们使用MOE中的Site Finder模块来预测MoHXT2的口袋。我们找到了MoHXT2的口袋，包括残基Met145，Lys421，Ala89，Gln164等。对接工作流程遵循“诱导拟合”方案，其中受体口袋的侧链根据配体构象移动，但有一个限制在他们的位置上。用于将侧链原子束缚到其原始位置的权重为10。首先通过伦敦dG得分对所有停靠的分子姿势进行排名，然后对前15个姿势进行力场细化，然后对GBVI/WSA dG进行评分。最终排名最高的被选为结合模式。

本发明中的同源建模及分子对接均委托中大唯信科技有限公司完成。

MoHXT2的建模结果如图13所示：PepT1的Ramachandran图显示，在允许的区域中有99％的残基，表明该模型的3D结构是合理的。MoHXT2的结构与模板结构基本一致。三维结构重叠的平均RMSD值为

并且都具有相同的alpha螺旋区域。氨基酸序列的整体同一性为31.1％。

为了研究己糖与MoHXT2的结合亲和力，进行了对接模拟研究。己糖的结构如表1所示，2个分子的对接分数如表2所示。

表1己糖结构

表2 2个分子的对接分数

受体	配体	对接分数(Kcal/mol)
			MoHXT2	D(+)-葡萄糖-50-99-7	-4.46
MoHXT2	D-(-)-果糖-57-48-7	-5.11
			MoHXT2	D-半乳糖-59-23-4	-4.37
MoHXT2	D-甘露糖-3458-28-4	-5.10
			MoHXT2	根皮苷-7061-54-3	-7.02

MoHXT2和D(+)-葡萄糖-50-99-7之间的结合模型结果如图14所示。D(+)-葡萄糖-50-99-7中羟基的两个氧原子被视为氢键供体在MoHXT2中与Met145(这里三字母符号“Met”表示氨基酸为蛋氨酸，数字“145”表示氨基酸所在位置，即“Met145”表示第145位蛋氨酸；下同)的侧链的硫原子形成两个氢键。D(+)-葡萄糖-50-99-7中羟基的氧原子被认为是氢键受体，与MoHXT2中Lys421侧链的氮原子形成氢键。D(+)-葡萄糖-50-99-7中羟基的氧原子被认为是氢键供体，与MoHXT2中Ala89骨架的氧原子形成氢键。

MoHXT2和D-(-)-果糖-57-48-7之间的结合模型结果如图15所示。D-(-)-果糖-57-48-7中的羟基的氧原子被视为氢键供体，与MoHXT2中Met145的侧链的硫原子形成氢键。D-(-)-果糖-57-48-7中羟基的氧原子被视为氢键受体，与MoHXT2中Lys421侧链的氮原子形成氢键。D-(-)-果糖-57-48-7中羟基的氧原子被认为是氢键供体，与MoHXT2中的Ala420的主链的氧原子形成氢键。

MoHXT2与D-半乳糖-59-23-4(D-Galactose-59-23-4)之间的结合模型结果如图16所示。D-半乳糖-59-23-4中的羟基的氧原子被视为氢键供体，与氧原子形成氢键。MoHXT2中Glu149的侧链D-半乳糖-59-23-4中羟基的氧原子被视为氢键受体，在MoHXT2中与Arg97侧链的氮原子形成氢键。D-半乳糖-59-23-4中羟基的氧原子被视为氢键供体，与MoHXT2中Ser148侧链的氧原子形成氢键。

MoHXT2和D-甘露糖-3458-28-4之间的结合模型结果如图17所示。D-甘露糖-3458-28-4中的羟基氧的原子被视为氢键受体，与氮原子形成氢键。D-甘露糖-3458-28-4中羟基的相同氧原子被视为氢键受体，与MoHXT2中Gln300侧链的氮原子形成氢键。D-甘露糖-3458-28-4中的羟基的氧原子被认为是氢键受体，与MoHXT2中Gln164的侧链的氮原子形成氢键。

综上所述，MoHXT2的同源模型均可与葡萄糖，果糖，半乳糖，甘露糖均能进行结合，具有一定的亲和能力。MoHXT2基因能转运这四种己糖转运蛋白，且敲除后会降低致病性，则可根据同源建模与分子对接的结合靶点，进行杀菌剂的设计与合成。

实施例7根皮苷的竞争性抑制

根皮苷是一种己糖竞争性抑制剂。为了确定根皮苷的竞争抑制作用，我们在含有10mM根皮苷以及不同碳源(2％(w/v)葡萄糖，2％(w/v)半乳糖，2％(w/v)甘露糖和2％(w/v)果糖)的CM培养基上接种了野生型菌株WT(使用0.5cm的打孔器打出菌块进行接种)。结果如图18所示：我们发现根皮苷对野生型菌株WT产生竞争性抑制作用，并且根皮苷抑制了WT中的己糖转运。WT在葡萄糖，半乳糖，甘露糖和果糖中的抑制率分别为34％，34％，27％和26％。

同时，也将根皮苷与MoHXT2进行了分子对接(根皮苷的结构如表1所示，对接数如表2所示)(委托中大唯信科技有限公司完成)。根皮苷-7061-54-3之间的结合模型如图19所示。根皮苷-7061-54-3中羟基的氧原子被视为氢键供体，与MoHXT2中Glu149侧链的氧原子形成氢键。根皮苷-7061-54-3中羰基的氧原子被视为氢键受体，与MoHXT2中的Arg156侧链的氮原子形成氢键。根皮苷与MoHXT2的分子模型能进行结合，且亲和力强，表明MoHXT2是重要的己糖转运蛋白，根皮苷能对MoHXT2转运己糖产生一定的抑制，从而抑制稻瘟菌的生长。因此也为合成靶向杀菌剂提供了更可靠的方向。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<223> MoHXT2基因

atgcttggcg gcaagtccat cagggtcaat ggcgccgagt gcggcgtcga gtctctcttc 60

ctcggcgctg tcaccagcct gggtggcttt cttttcggtt acgacacggg tcagatctcg 120

ggcatgctca tcttcgagga ctttcagcgc cgcttcgcca cgggccccgt tggggagaat 180

ggcatccggg aatgggttcc catcattcag tccaccatgg tgtccctgat gagcatcgga 240

acgctcatcg gtgctctttc tggtgcctac actgccgact ggtggggacg tcggaggagt 300

ttggcgttcg gtgtcatctt gttcatcatc ggcaacatca tccagattac tgccatggag 360

tcttggattc acatgatgat gggtcgcctg attgctggtt ttggtattgg taacctgtct 420

gtcggtgtgc ccatgttcca gtcggagtgt gctccccgtg agattagggg tgccgttgtg 480

gccagctacc aactgctcat cactttcgga atcctcatct caaacatcat caactacggt 540

gtcaggaaca tccagggctc cgacgcctcg tggagaatcg tgattggcct gggcatcttc 600

ttcagcgtgc ctctcggtat cggcatcctg ctcgtccccg agtctccccg ttggctcgcc 660

ggacgtcagg actgggatgg tgctcgcatg tccatcgctc gtctccgcgg catgaagcac 720

gaccccaaca acgtcctcgt cgagaccgac atcagcgaga tgtacaagat catcaaggag 780

gagtccagcg tcggagtcgg cagctgggcc gaatgcttca ccggcaaggg cggttccgaa 840

ggcattccca aggttgtgta ccgcaccatc ctgggcatgt tcctgcactt tacgcagcag 900

tggaccggtg taaactactt cttctactac ggtgccacga ttttccagtc tgctggtgtc 960

gacgacccta tcgtcacgca attgatcctg ggcgccgtca acgtcgccat gaccttcttg1020

ggtctgtaca ttgtcgagaa gtttggacgt cgtggtcccc tctttattgg tggcgcgtgg1080

caggcggtct ggctggctgt ttttgctgcc attggaaccg ctctgccgcc cacagagaac1140

cgcgtctctg gcatcgtcat gattgtgtcc gcctgcatgt ttattgcttc gttcgccagc1200

acctggggtc ccatctgctg ggtcgtcatc ggcgagacct tcccgctccg cacgcgtgcc1260

aagcaggcct cgctgtccac agccggcaac tggctgggca actttatgat ttcgttcctc1320

acgcccatcg ccaccgacgg catctcgttc tcctacggct tcgtgtttgc cgccgtcaac1380

ttgtgcggtg ccctgggcgt gtacttcttc ctctacgagt cccgcatgct gtcgctcgag1440

aacgtcgacc gcatgtacgg cgacccgtcc atcaagccct ggaactcgcg caagtggact1500

ccccccggat acatcaaccg ccgcaccaag gacgagaagt acgtgcccga gggcgagcac1560

gtccagggcg gagtcagggg ctcggtcggc agcgacaaca ccgccgtccc cggcgaggcc1620

gacgtcaacc acgaccacgc caagcaaagg cctggtagcg acggcgttcc cacgacggag1680

cagcacgagc aggctgtgct ccggaacgcg taa 1713

<210> 2

<223> PCR产物1

tgaccagcga tcttggggct attttttcca tttgggacgt agagcaaaat tcgaggatgg 60

atgccaatgg ttcccccgca ctttgtggct gccccttggc aagggaagtt tttttctgat 120

ctgatgcagc cttctccaac aaagggagaa aataaattag gcgataaaaa aagaaaagag 180

tttccaacgg ccagccggac acaaaaagca aataaaaaaa aatgcaactt tccagtacct 240

ggcccccttg tgtgccgtgt tccgaaacgg acttttttcc cacaacgcga accgaatttc 300

tcccttcttg ttactcggca cccagggact ttaccttgat tacctagcaa agccaaacgt 360

catggagacc tgctccaccc agtcggcgct ttctcgtgca aacaagacga ccacaccgca 420

gacgtgggcc caggcgacgg gctccgtcat cccgttattt tgtggtctct tttgttttcc 480

aatttttttt ttaattcctt ttttttttcg tgaggctttt gctgctttgc tgcaatttcg 540

cggcacgtgg tcctttcatt ttttgctccc cctttgcgga tcgtgaatga gtcgtgggtg 600

gctacagttt tacaaaggaa accgtgcaac gacgtcatct tggacggcct cttggcgtct 660

tggtgatgct tgaaagaaaa aaaacccacc acggatcctc gacgcgcgcc gtggttcaaa 720

aacgcactcg tctgccgcat ttcttctggt tccggaatgt atttcttgta cagtgatctg 780

ctcgtctgtt tcctcaatcc gacttttttt ttttttcaat ggacctcgag tgagcccgat 840

ctactgacac aaccgtaaag tggtccccca agccaccaag acaccacctg ttggccaaaa 900

tcccccaggg cccggccgaa cttttctttt cgattttgat cccttttcgt ctgttttatt 960

ttgtcaacct gtgataccct cttgcgtata cttctttttt caacagcaat c 1011

<210> 3

<223> PCR产物2

tgttggcggg tggcttaatg tcttgaaaca tcgatggttt tgagagattt tgtcttgtag 60

gatactacta ggttttcttt gttgcagaaa actgactggt ttagctgcca gtgagagcat 120

atatatacaa acataaatat aaccgaaacc tttgggtaac cccttggtca aatgcatgcg 180

agaaagtgat gagcttttga cgggataatt gataataggt tcacatttcg aacctcgcag 240

gcgatgatgg gccgtcaaac tccatcctta cttggacccc gtgtacacaa gcaggcctag 300

cccgccattg tacggcaaaa ctgtcatatt gaacccactg tccggctgat cgacataatc 360

caggagatcg cgatagcccg acttggcatc ctcgatattg tccacaatga ccatggcacc 420

ctttttcatc attggctgta ccagcttgag agtcggaagg gccagcggtg tccagactat 480

tgccaagtcg cggtcagcct gtcattggca gtatgaaaaa aaaagagccc cgggagcaac 540

ttactgtcga gaagcaaaag atccacccgt ggcagaccct gcttgagcgt ctccaagatg 600

tcaccctccc tcagctcaat ccacctcgcc acatcctcac cagcagcggc ccaattctcc 660

ctcgccctcg ccgccttttc cggctcgttc tccgtggcaa tcaccctcgc aacccccgcg 720

tcgtcgccgg cgttctgccc gaccgccagc gcgagccaga tggtcgagac gccaaagctg 780

gtccccgcct ccaccacgca acgcgccccc gaaccccgca ccagcaggta cgccagcgcc 840

gccttgtccg ggtccagcgc gacgaacagc tcccgcgtgt gtcgccgcag cgcctcctcg 900

cgcgtctccg tctcggaggc gcgcgcgtcc gtgctgacaa agggcggctc cgccagcgct 960

tgttcgtgca ggcgcgcgag ggtttcgagt gcgcggttgc tgcccgtgat ggaggaga 1018

<210> 4

<223> Flank1 F

accgaatttc tcccttcttg tt 22

<210> 5

<223> Flank1 R

cattgaccct gatggacctg ta 22

<210> 6

<223> Flank2 F

acgccaagca aaggcctggt agc 23

<210> 7

<223> Flank2 R

tctcctccat cacgggcagc aac 23

<210> 8

<223> Flank3F

ggtaccagag aagggcaatt ccaccgaatt tctcccttct tgtt 44

<210> 9

<223> Flank3R

ccttcaatat cagttaacgt cgcattgacc ctgatggacc tgta 44

<210> 10

<223> Flank4F

tcaccagccc tgggttctcg agacgccaag caaaggcctg gtagc 45

<210> 11

<223> Flank4R

ccctctagat gcatgctcga gtctcctcca tcacgggcag caac 44

<210> 12

<211> 20

<223> ΔMohxt2 sgRNA

ggcgtcgagt ctctcttcct 20

<210> 13

<223> ΔMohxt2 F1

gctagccaat ggaagccagc t 21

<210> 14

<223> Hpt R

ataaagggag gaagggcgaa c 21

<210> 15

<223> ΔMohxt2 R2

aggttcgcag tcacgtacgt t 21

<210> 16

<223> Hpt F

tcttagccag acgagcgggt tc 22

<210> 17

<223> ΔMohxt2 CDS F

tcggaatcct catctcaaac atc 23

<210> 18

<223> ΔMohxt2 CDS R

cctggcgaac gaagcaataa ac 22

<210> 19

<223> MoHXT1基因

atgcccggct ccgtcatcgg gacggccgac gtctcgcgcg tcgaggctcc catcaccgtc 60

aaggcctacc tcgtttgtgc ctttgccgcc tttggtggta tcttcttcgg ttatgacaca 120

ggatggatgg gtggtgtcca gggcatgccc tacttcatca gcatgtacac tggcatgcaa 180

tacgactacg aggccgggca gcctatcggt gttgacaagg acaagttcat tcttcccgac 240

caacagaaat ctctcatgac ctctatcctg tctgccggta ccttctttgg cgctcttatt 300

gctggtgata ttgccgacta cattggccgc cgtcccacca ttatcgctgg ctgtggtatc 360

ttctccatcg gtgccgtcct ccaagccgct tccaccaacc aggaggccct catggtcctc 420

ggccgtctga ttgctggtct cggtgtcggt ttcatctcgg ccatcatcat tctctacatg 480

tccgagatcg cccccaagaa ggtccgtggt gccatggtct cgggatacca gttttgcatc 540

accattggta ttctgctggc caactgcgtc gtctacgcca cccagaacag aaacgacacc 600

ggatcatacc gtatccccgt ggccatccag ttcctatggg ccatcatcct tgccgttggt 660

ctgttcctgc tgcccgagtc tccccgttac cacgtcaaga agggcatgct cgagcaggcc 720

gccaaggacc tctctgtcat ccgtggccag cccgtcgact cggactacat caaggacgag 780

cttgccgaga ttgtcgccaa caacgagtac gagatggccc acatccccca gaccagctac 840

atcggctcgt ggactgccct cttcaagggt tccctgtcca agggcaacag caacatccgc 900

cgtaccattc tcggcgttgg tatgcagatg atgcaacagc tcactggtat caactttatc 960

ttctactttg gtgttccctc ttccagcagc tgggcacaat ttcagacccc ttcctgatgg1020

gtctggtcac caccctggtc aacgtttgct ccactcccgt atcgttctgg tctattgaga1080

agttcggtcg tcgtttcctc ctcatctacg gagccatggg tatgatcgtc tgtcagttca1140

tcgtcgccat tctcggtgtg actgagggtc gcaaggaggc cggcaacgac aacgccgtca1200

aggccatgat tgccttcatc tgcatcaaca tcagcttctt cgccatcacc tggggtccca1260

ctgcctgggt cattgtcggc gagaccttct ccctgcccat ccgctcgcgc ggtgtcggta1320

tctcgaccgc ctccaactgg ttctggaact gcatcatcgg catcatcacc ccctacatgg1380

tcggtgagag tgacggctca gccggcctgg gctctaaggt gttcttcatc tggggcagtc1440

tgtgctgcgc atcgctcgcc ttcgcctact tcctggtccc cgagatgaag ggtctctccc1500

tggagcaggt cgacaagatg ctcgaggaga ccaccccccg caagtccaag agctggatcc1560

cgacctccac ctacgccgcc gacatgggcc acacccacgg cgagaagagc ggcattatcg1620

ccaccgagtc tgccaaggag gagaccgtct aa 1652

<210> 20

<223> PCR产物3

ccactaccag gcaaacaaag taaagtaaaa aaaaaaaaaa acccctgcat catcatcaaa 60

gacatggaat catatgtttg tgattggacc attccatacc gccacgccgt tttctccttt 120

caaaagtaac cgatttggat ctcgcccgtt gtgatcacct ggtgggccat attcccggag 180

gattggagag atggagaaga gacagagaga aaagcccagt cggcctccat tcggcgattc 240

acgcgtatga tccacatgtt tttgatccct gagcttgttg gagacgagct gcatcgcaag 300

gagggcgtat gtgggaagta cctacttgct gctgtatgta agtactgtac ctaggtaggt 360

atgtatgtac ggggtaggtg tgtgtggcgt tgcagatgca ttcgcacata cctttttttt 420

cccctttcgt agctctccca ttgactttcc tagctggagt ttcttctctc tatttcgtca 480

acatgcggtt gtttaaacgg ctagcatttt gttcttggtg ctgaattact tttttcctct 540

ggcgaggctt tgtctgggcc ggattatcgc taaactcttt ccaggcggat gccggatgtg 600

accgcctgtg gatgtttgtg ccgtagtaat taatttacca cgagggcaca cgacaaccac 660

accccccagt ctcttccttt tctcgtttta ttgcacgtcg tcgttttttg tcaggctcct 720

cctctccgcc gcccacaccg caaccccggc ctggccctcc tcgcccatcc acaaccaatt 780

ttcaatttgc ggagtcccac gcatgcaaca catttcccca accggcccta ccttgccatc 840

cattaccaag acccttgcaa ctaaacaaca agcccacccc tagagttcgg tacggctcac 900

gccccccccc cccccccccc cccctgcagc tcactttgtg tacctaccgt acctacttcg 960

taggttgctt tagctcgagt ttcgtacaat ttctgttcct cgggtgtggg ctatatattg1020

ccctgcccat ccccttccat tcacctctgc ctcaccttcc ctcctgtt 1068

<210> 21

<223> PCR产物4

gccaaggagg agaccgtcta aaatgtcttg tttattggcg aatccccgta atctccagcc 60

atttggactc gtcggccagg acatggtccg ctgggtatca tttggtttgg aattgcaaaa 120

gaaaagaggg atacaattgg ctttttactg ttggtctcct acgtccgcta tcgcggtagg 180

atgacgctag gaactctaaa tgataccatc tcttatatta taatacaaat ccaactcgat 240

ttaatcaacg ttactccgtg aaaagtgatc ctcatattga tttttctctt cttaactgtg 300

tcgttttcgg tatgctcgtc tctgtgtttc actgctaatg ttgtttgcat gacttgtcta 360

actaggtggt tatatttcga acaggaaaaa aaggtaaatt tgtacccagc atgaaatagt 420

cgagttgtga caagatgcat accagtccaa cgtctactta ctcgaaaagg tataatccgc 480

tcactccatt attccatctc ttgtaagcca acaacacatc tctttaggtc ttcaacaaga 540

cccaatggcc acgtggtaat tagacctcgt ccgaacattt tggctgaagt ttcaagctta 600

aggtcttttg ttcaatggga tcaggaacac agaaacccaa gatgaaaaag gagcacaagc 660

tggaaaagaa aagcaagtac cccacactga agccgagccg gggccaggcc aattggcaaa 720

gcgcggcccg aatccgctag tccaaacggt cttgtcggag aataaaaggg gcaagaagag 780

acgatcaagc aaagaaagga aactgccccc aagtgaatca aaatgattca ttctggctgt 840

gcgcccagcg cgcccagctg gttctttttg tgtcgcccag acctgaaaaa cccgccctag 900

tatgcaattt caaaggcagt tacgtatatc tacagaaaga gttggcaaat gggaacagtt 960

acaaactggt atttgtatcg gcctgttttt tttttctttt cttttttttt gtcatcataa1020

gccctccaaa aagagacagg tacagacgga cgaaattga 1059

<210> 22

<223> Flank5 F

ccactaccag gcaaacaaag 20

<210> 23

<223> Flank5 R

aacaggaggg aaggtgaggc 20

<210> 24

<223> Flank6 F

atcgccaccg agtctgccaa ggagg 25

<210> 25

<223> Flank6 R

tcaatttcgt ccgtctgtac ctg 23

<210> 26

<223> Flank7 F

ggtaccagag aagggcaatt ccccactacc aggcaaacaa ag 42

<210> 27

<223> Flank7 R

ccttcaatat cagttaacgt cgaacaggag ggaaggtgag gc 42

<210> 28

<223> Flank8 F

tcaccagccc tgggttctcg agatcgccac cgagtctgcc aaggagg 47

<210> 29

<223> Flank8 R

ccctctagat gcatgctcga gtcaatttcg tccgtctgta cctg 44

<210> 30

<223> ΔMohxt1 F3

ctggacttgg aatgaccaaa 20

<210> 31

<223> Hpt R

ataaagggag gaagggcgaa c 21

<210> 32

<223> ΔMohxt1R4

gcgacggact ctgaggcaat c 21

<210> 33

<223> Hpt F

tcttagccag acgagcgggt tc 22

<210> 34

<212> DNA

<223> ΔMohxt1 CDS F

atgcccggct ccgtcatcgg g 21

<210> 35

<223> ΔMohxt1 CDS R

ttagacggtc tcctccttgg c 21

<210> 36

<223> ΔMohxt1 sgRNA

gataccacca aaggcggcaa 20

<210> 37

<223> pDR195-MoHXT2 F

accccagcct cgagcatgct tggcggcaag tccatca 37

<210> 38

<223> pDR195-MoHXT2 R

gaagtccaaa gctggatctt acgcgttccg gagcacagcc 40

<210> 39

<223> M13F

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 40

<223> M13R

cacacaggaa acagctatga c 21

Claims

1.一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌黑色素沉积中的应用，其特征在于：

所述的稻瘟病菌基因MoHXT2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的调控稻瘟病菌黑色素沉积通过基因敲除来减少黑色素沉积，或通过转入稻瘟病菌基因MoHXT2来恢复或提高黑色素含量。

2.根据权利要求1所述的稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌黑色素沉积中的应用，其特征在于：

所述的基因敲除通过如下步骤实现：

（1）利用Kpn I酶切pHPT1质粒，得到酶切产物；然后将酶切产物进行脱磷反应后纯化回收，得到pHPT1线性化产物；

（2）将稻瘟病菌基因MoHXT2上游片段连接到pEASY-T1 载体上，得到pTA-MGGFlank1；然后使用接头引物Flank3 F和Flank3 R扩增pTA-MGGFlank1，得到扩增产物I；再用Infusion连接酶连接扩增产物I和步骤（1）中得到的pHPT1线性化产物，转化大肠杆菌，提取质粒，得到质粒pTA-MGG Flank 1-hpt；其中，稻瘟病菌基因MoHXT2上游片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；接头引物Flank3 F和Flank3 R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8～9所示；

（3）利用XhoI酶切步骤（2）中得到的质粒pTA-MGG Flank 1-hpt，得到线性化载体pTA-MGG Flank 1-hpt；

（4）将稻瘟病菌基因MoHXT2下游片段连接到pEASY-T1 载体上，得到pTA-MGGFlank2；然后使用接头引物Flank4 F和Flank4 R扩增pTA-MGGFlank2，得到扩增产物II；再用Infusion连接酶连接扩增产物II和步骤（3）中得到的线性化载体pTA-MGG Flank 1-hpt，转化大肠杆菌，提取质粒，得到质粒pMoHXT2 Flank1-hpt-Flank2；其中，稻瘟病菌基因MoHXT2下游片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；接头引物Flank4 F和Flank4 R的核苷酸序列如SEQ IDNO.10～11所示；

（5）将Guide-it Recombinant Cas9与sgRNA混合后孵育，得到复合物；然后利用CRISPRCas9系统，将复合物和步骤（4）中得到的质粒pMoHXT2 Flank1-hpt-Flank2转入稻瘟菌原生质体，再转化真菌，筛选得到基因敲除后的突变体Mohxt2；其中，sgRNA的核苷酸序列如SEQID NO.12所示；

步骤（2）所述的扩增产物I和pHPT1线性化产物的摩尔比为1：4～6；

步骤（4）所述的扩增产物II和线性化载体pTA-MGG Flank 1-hpt的摩尔比为1：4～6；

所述的转入稻瘟病菌基因MoHXT2为通过如下步骤实现：将MoHXT2基因克隆至酵母异源表达载体pDR195 中，构建pDR195::MoHXT2载体；然后将pDR195::MoHXT2载体转入酵母菌株中，以恢复或提高糖转运能力。

3.根据权利要求2所述的稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌黑色素沉积中的应用，其特征在于，在步骤（5）之后还包括进行验证的步骤，具体为：

利用使用如SEQ ID NO.13～14所示的引物ΔMohxt2 F1和Hpt R进行扩增，鉴定上游同源臂是否插入以及是否含有标记基因Hpt片段；使用如SEQ ID NO.15～16所示的引物ΔMohxt2 F2和Hpt F进行扩增，鉴定下游同源臂是否插入以及是否含有标记基因Hpt片段；使用如SEQ ID NO.17～18所示的引物ΔMohxt2 CDS F和ΔMohxt2 CDS R进行扩增，鉴定是否含有CDS区域。

4.一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌致病力中的应用，其特征在于：

所述的稻瘟病菌基因MoHXT2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的调控稻瘟病菌致病力通过敲除稻瘟病菌基因MoHXT2来降低稻瘟病菌致病力，或通过转入稻瘟病菌基因MoHXT2来恢复或提高稻瘟病菌致病力。

5.一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌昼夜节律中的应用，其特征在于：

所述的稻瘟病菌基因MoHXT2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的调控稻瘟病菌昼夜节律通过敲除稻瘟病菌基因MoHXT2，稻瘟病菌的昼夜节律受到干扰，进而抑制稻瘟病菌菌丝的生长发育；或通过转入稻瘟病菌基因MoHXT2来促进稻瘟病菌菌丝的生长发育。

6.一种稻瘟病菌基因MoHXT2在农药基因靶标中的应用，其特征在于：所述的稻瘟病菌基因MoHXT2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。