CN107384946B

CN107384946B - 水稻淀粉分支酶sbe3基因的人工定点突变体及其应用

Info

Publication number: CN107384946B
Application number: CN201710599347.6A
Authority: CN
Inventors: 杨瑞芳; 朴钟泽; 白建江; 方军
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-07-21
Filing date: 2017-07-21
Publication date: 2020-07-14
Anticipated expiration: 2037-07-21
Also published as: CN107384946A

Abstract

本发明公开了一种水稻淀粉分支酶SBE3基因人工定点突变体及其应用。所述水稻淀粉分支酶基因人工突变体通过采用CRISPR/Cas9基因靶向基因编辑技术对SBE3基因第8外显子修饰，使得第8外显子的碱基发生缺失而得到。本发明采用CRISPR/Cas9对SBE3基因的第8外显子进行人工突变，并筛选出抗性淀粉含量显著提高且通过后代分离去除筛选标记的的突变体水稻植株，抗性淀粉含量达到10％以上。

Description

水稻淀粉分支酶SBE3基因的人工定点突变体及其应用

技术领域

本发明涉及水稻基因组编辑育种领域，具体地，本发明涉及水稻淀粉分支酶SBE3基因的人工定点突变体及其应用。

背景技术

抗性淀粉(Resistant Starch，简称RS)是指“在健康个体的小肠中不能被吸收的淀粉或淀粉降解产物”(欧洲RS协会EURESTA定义)。已有研究表明，抗性淀粉不能在小肠中被消化吸收和提供葡萄糖，在大肠中则可以被生理性细菌发酵，产生短链脂肪酸(Shortchain fatty acids，SCFA)和气体。抗性淀粉有着重要的生理功能，包括降低餐后血糖和胰岛素应答，提高机体对胰岛素的敏感性，预防便秘和结肠癌的发生，降低血清中胆固醇和甘油三酯含量，降低和控制体重，促进矿物质吸收。与低抗性淀粉饮食者相比，高抗性淀粉饮食者具有较少的胰岛素反应，这对糖尿病患者控制餐后血糖值有很大影响，尤其对于非胰岛素依赖型病人，摄食高RS食物，可延缓餐后血糖上升，有效控制糖尿病病情。

通过筛选和鉴定高RS含量的水稻遗传资源来改善人们的饮食结构，是治疗和预防糖尿病等文明病发病的最经济有效的手段之一。上海市农业科学院作物栽培育种研究所利用化学诱变和小孢子培养技术并结合常规育种技术，培育了高RS粳稻新品种“降糖稻1号”，并与相关企业合作进行了产业化开发，缓解了糖尿病人吃饭难、吃不饱饭的难题，该产品商品名为“优糖米”。课题组还首次以降糖稻1号及籼稻密阳23杂交后代为定位群体，定位分离克隆了控制水稻高抗性淀粉性状形成的主效基因sbe3-rs，并对其进行了功能互补验证，证明sbe3-rs是水稻淀粉分支酶SBE3基因的突变基因。而高抗性淀粉含量水稻品种降糖稻1号具有水稻淀粉分支酶SBE3基因的突变基因，具体为SBE3基因第16个外显子的第105位发生碱基T-C的突变，此突变是化学诱变结合小孢子培养技术产生的，该突变是随机发生的。

近年来，基因组编辑技术蓬勃发展，其可以实现对靶位点的定点突变、缺失、插入或替换，已经广泛用于各自植物或作物的基因组修饰中。但是，对于水稻高抗性淀粉性状、特别是针对水稻高抗性淀粉性状形成的主效基因SBE3，目前尚未有这方面的相关研究或成果。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的发明人考虑可以使用新的基因组编辑技术CRISPR/Cas9体系对水稻野生型基因SBE3进行人工突变，由此定向快速获得新型突变体材料，以便筛选出包含人工定点突变从而抗性淀粉含量得到显著提高的新型水稻品种。

因此，本发明的一个目的是通过采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术，提供野生型水稻淀粉分支酶SBE3的人工定点突变体及其相关序列与载体。

本发明的另一个目的是提供所述人工定点突变体及其相关序列与载体在含高抗性淀粉水稻品种的育种中的用途。

本发明的技术方案如下。

一方面，本发明提供一种水稻淀粉分支酶SBE3基因的第8外显子的突变序列，所述突变序列相对于野生型SBE3基因的第8外显子缺失一个或多个碱基。

本发明提供的突变序列通过采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术对野生型SBE3基因的第8外显子进行修饰使得所述第8外显子的碱基发生缺失而得到。

其中，野生型水稻淀粉分支酶SBE3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其第8外显子如SEQ ID NO.3所示。

优选地，通过采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术对野生型SBE3基因的第8外显子进行修饰的靶向序列位于所述第8外显子中的第70-89位碱基，为20个碱基，核苷酸序列如下以下划线标出的加粗斜体部分所示：

SEQ ID NO.3：

5’-GTGCGAATGGAAACTCCATCTGGTATAAAGGATTCTATTCCTGCCTGGATCAAGTACTCTGTGCAGGCC

TGGAATATATTATGATCCTCCTGAAGAG-3’

优选地，本发明提供的第8外显子的突变序列包含如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；优选地，所述突变序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

关于缺失的碱基，具体而言，SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列相对于野生型SBE3基因的第8外显子，是在所述第8外显子中的第87-93位缺失7个碱基，所示的核苷酸序列在本文中还命名为“SBE3-m1”；SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列相对于野生型SBE3基因的第8外显子，是在所述第8外显子中的第86位缺失1个碱基，所示的核苷酸序列在本文中还命名为“SBE3-m2”。

相对于野生型SBE3基因的第8外显子，SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2分别如下所示，其中“-”表示单个的缺失碱基：

SEQ ID NO.1(SBE3-m1)：

5’-GTGCGAATGGAAACTCCATCTGGTATAAAGGATTCTATTCCTGCCTGGATCAAGTACTCTGTGCAGGCCGCAGGAGAAATCCCATA-------ATATATTATGATCCTCCTGAAGAG-3’

SEQ ID NO.2(SBE3-m2)：

5’-GTGCGAATGGAAACTCCATCTGGTATAAAGGATTCTATTCCTGCCTGGATCAAGTACTCTGTGCAGGCCGCAGGAGAAATCCCAT-CAATGGAATATATTATGATCCTCCTGAAGAG-3’

另一方面，本发明还提供一种水稻淀粉分支酶SBE3基因的突变基因，相对于野生型SBE3基因，所述突变基因的第8外显子为本文提供的上述突变序列。

优选地，所述突变基因在第8外显子与野生型SBE3基因相区别；具体而言，相对于野生型SBE3基因，所述突变基因中第8外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

还一方面，本发明提供一种载体，其包含本发明提供的上述突变序列或者突变基因中的任一种或多种。

并且，本发明还提供一种水稻细胞，其包含本发明提供的上述突变序列、突变基因或者载体中的任一种或多种。

又一方面，本发明提供所述的突变序列、突变基因、载体或者水稻细胞在含高抗性淀粉水稻品种的育种中的用途。

再一方面，本发明提供表达载体pCAMBIA1300::SBEIIbsgRNA::Cas9。

表达载体pCAMBIA1300::SBEIIbsgRNA::Cas9是本发明构建的用于水稻转化的基因编辑表达载体，构建过程见下文的实施例1。

还一方面，本发明提供所述表达载体pCAMBIA1300::SBEIIbsgRNA::Cas9在水稻品种的育种中的用途。该载体可以用于针对水稻淀粉分支酶SBE3基因的第8外显子进行人工定点突变，可选地结合对水稻其他性状的筛选，可用于水稻新型突变体品种的筛选。

优选地，所述水稻品种为高抗性淀粉水稻品种。

本发明的发明人对水稻淀粉分支酶SBE3的全序列进行靶向序列筛选，锁定第8外显子中的第70～89位碱基作为靶点，采用CRISPR/Cas9靶向基因编辑技术构建了表达载体pCAMBIA1300::SBEIIbsgRNA::Cas9，用于对SBE3基因第8外显子进行修饰，以使得第8外显子的碱基发生突变。

通过筛选发生突变的T0代植株、检测到的双突变植株的T1代种植，将T1代中没有潮霉素的纯合突变体植株进行收种，进行T2代种植，验证得到了存在3种突变类型的纯合突变体，且已经检测不到筛选标记基因潮霉素。由此得到了第8外显子的突变序列以及包含该突变序列的水稻淀粉分支酶SBE3基因的突变基因。

经过对分别存在3种突变类型的纯合突变体植株进行抗性淀粉含量的检测，发现2种植株的抗性淀粉含量都达到10％以上，与降糖稻1号的抗性淀粉含量相当，由此证明本发明提供的SBE3基因人工定点突变体能够将水稻抗性淀粉含量提高到10％以上。

此外，本发明还为快速定向获得水稻新型突变体品种提供了新的方法与思路，特别是构建的表达载体pCAMBIA1300::SBEIIbsgRNA::Cas9，可以用于针对水稻淀粉分支酶SBE3基因的第8外显子进行人工定点突变，可选地结合对水稻其他性状的筛选，可用于水稻新型突变体品种的筛选。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示了基因编辑表达载体pCAMBIA1300::SBEIIbsgRNA::Cas9的T-DNA区结构。

图2显示了基因编辑表达载体pCAMBIA1300::SBEIIbsgRNA::Cas9的整个图谱。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1CRISPR/Cas9修饰靶点的选择

针对SBE3全基因组序列进行扫描，SBE3基因共有22个外显子，以靶向序列在外显子上且尽量靠近上游作为选择标准，将靶向序列选择限制在前10个外显子区域中，同时要求靶向序列存在酶切位点从而方便后续通过酶切进行初步检测突变效率。

最终经排除确定预选择了3个靶向序列，分别为：

位于SBE3基因第5外显子的GTATCGAGAATGGGCTCCCG(包含SmaI酶切位点)；

位于SBE3基因第8外显子的GCAGGAGAAATCCCATACAA(包含Van91I/BseLI酶切位点)；以及

位于SBE3基因第10外显子的TTCCAAGAATCAAAAAGCT(包含HinIII酶切位点)。

由于第10外显子除了靶向序列含有HindIII，在附近区域也含有该酶切位点，造成后续通过酶切电泳不容易检测到，因此舍弃该靶向序列。

实施例2CISPR/Cas9载体构建及转基因

(一)针对SBE3基因第8外显子中的靶向序列

野生型水稻淀粉分支酶SBE3基因序列中第8外显子的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。其中CRISPR/Cas9修饰靶点长度为20bp，位于第8外显子中的第70-89位碱基，修饰靶向序列为GCAGGAGAAATCCCATACAA。针对该靶向序列合成以下寡核苷酸：

SEQ ID NO.5(SBE3-F3)：

5’-GTGT GCAGGAGAAATCCCATACAA-3’

SEQ ID NO.6(SBE3-R3)：

5’-AAACTTGTATGGGATTTCTCCTGC-3’

用BbsI酶切sgRNA载体OsU6-SK质粒载体(参见Zhengyan Feng等人,Efficientgenome editing in plants using a CRISPR/Cas system，Cell Research(2013)23:1229–1232；来自朱健康实验室)后，进行胶回收。将合成好的上下游引物F3和R3引物分别加入ddH2O中，稀释成10μmol母液，分别吸取10μl放到同一个管中，放入PCR仪，退火获得一小段带接头的双链DNA片段。将该双链DNA片段与载体的胶回收产物连接过夜。连接产物转化DH5α大肠杆菌，鉴定阳性克隆并验证构建得到正确的OsU6-SbeIIbsgRNA-SK载体。

用KpnI和SalI同时双酶切构建好的OsU6-SbeIIbsgRNA-SK载体和35S-Cas9-SK质粒载体，胶回收OsU6-SbeIIbsgRNA-SK片段，将回收后的OsU6-SbeIIbsgRNA-SK片段与回收后的线状35S-Cas9-SK质粒载体过夜连接。连接产物转化DH5α大肠杆菌，鉴定阳性克隆并验证构建得到正确的OsU6-SbeIIbsgRNA-35S-Cas9-SK载体。

用KpnI和EcoRI双酶切OsU6-SbeIIbsgRNA-35S-Cas9-SK载体，回收OsU6-SbeIIbsgRNA-35S-Cas9片段；同时用这两种酶双酶切pCAMBIA1300质粒表达载体，然后胶回收。将分别胶回收的片段与pCAMBIA1300载体过夜连接。连接产物转化大肠杆菌，鉴定阳性克隆并验证构建得到正确的表达载体pCAMBIA1300::SBEIIbsgRNA::Cas9，其T-DNA区结构与图谱参见图1和图2。

将该正确的表达载体转化到农杆菌EHA105当中。以水稻LPR18为受体进行农杆菌转化，经过筛选、分化、再生过程获得T0代转基因植株。

(二)针对SBE3基因第5外显子中的靶向序列

参照第(一)部分所述，针对第5外显子中的靶向序列进行CRISPR/Cas9载体构建。

针对该靶向序列合成以下寡核苷酸：

SEQ ID NO.7(SBE3-CCF1)：

5-GTGTGTATCGAGAATGGGCTCCCG-3

SEQ ID NO.8(SBE3-CCR1)：

5-AAACCGGGAGCCCATTCTCGATAC-3

实施例3CRISPR/Cas9T0突变体的获得

杨瑞芳等以降糖稻1号作为高RS基因供体材料，分别与产量较高的密阳23、秀水123和沪稻55进行杂交，并利用三个杂交群体早世代籽粒垩白特性、直链淀粉含量(Amylasecontent，AC)及功能标记(CAPS/SpeI)进行高RS水稻辅助选择育种。研究结果表明，籽粒的垩白特性与RS含量有很高的关联性(杨瑞芳等，分子标记辅助选择选育高抗性淀粉水稻新品种，核农学报，2015，29(12)：2259-2267)。

因此，对实施例1获得的T0代植株分单株种植，单株取叶片保存备用抽提DNA，种子对应收获，通过对T1种子垩白度观察，垩白粒率>50％的单株保留。针对第5外显子靶向序列修饰的转基因T0代收获T1代籽粒垩白粒率均<50％，同时对应单株测序分析突变类型没有纯合突变，因此舍弃。而针对第8外显子靶向序列修饰的转基因T0代收获到T1代籽粒垩白粒率均>50％的两个转化体，作为重点研究对象，对应单株叶片抽提DNA，在SBE3第8外显子的靶位点附近设计引物并进行PCR检测，检测引物为：

SEQ ID NO.9(Crisper3F)：

GCTTGGCCAGTGTTTTAGCT

SEQ ID NO.10(Crisper3R)：

CCGTGCTACTCATTCCAACA

将PCR产物进行测序，确定有2个T0代植株发生SBE3第8外显子的纯合突变。

实施例4去除筛选标记的稳定突变体植株的获得

将实施例3中T0代检测到双突变的植株进行T1代种植。采集T1代植株叶片进行提取DNA，检测选择标记潮霉素是否存在。

设计潮霉素PCR检测引物，引物序列为：

SEQ ID NO.11(HYGF)：

CTATTTCTTTGCCCTCGGAC；

SEQ ID NO.12(HYGR)：

CCTGACCTATTGCATCTCCC。

通过检测潮霉素片段的存在，筛选出突变类型为纯合突变且潮霉素检测为阴性的植株。对T1代检测没有潮霉素的纯合突变体植株进行收种，进行T2代种植，每种突变体种植60株，随机筛选部分植株进行基因型检测验证。

证明T2代植株中存在3种突变类型的纯合突变体，且已经检测不到筛选标记基因潮霉素。2种SBE3基因突变体如下：

SEQ ID NO.1：SBE3基因突变体SBE3-m1第8外显子碱基序列

SEQ ID NO.2：SBE3基因突变体SBE3-m2第8外显子碱基序列

将具有SEQ ID NO.1的突变体植株的种子于2017年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为稻种粳亚种(拉丁名为：Oryza sativasubsp.japonica)，保藏号为CGMCC No.13796。

实施例5抗性淀粉含量检测

对获得的没有潮霉素的双突变体植株，测定其种子的抗性淀粉含量。

抗性淀粉含量测定方法：应用Megazyme公司提供的RS含量测定试剂盒(Megazyme,Co.Wicklow,Ireland)对RS含量进行测定，方法略有改进。具体步骤为：准确称取100mg米粉样品，小心放入带螺旋盖的塑料试管中，依次加入α-胰淀粉酶反应液和淀粉葡萄糖苷酶(AGM)，37℃震荡孵育16小时，非RS被溶解，水解成D-葡萄糖；孵育结束后加入99％乙醇终止反应；离心上述溶液，弃上清，底部残留絮状团即为样品中的RS，再用50％乙醇洗涤沉淀；倒置离心管，沉淀干燥后用2mol L-1氢氧化钾溶解沉淀，并加入AGM，置于60℃水浴中孵育1h，最后用D-葡萄糖用葡糖氧化酶/过氧化物酶试剂(GOPOD)试剂测定葡萄糖含量，并计算RS含量。

结果见下表1。

表1不同植株的RS含量

编号	RS含量(％)
		水稻LPR18(对照)	0.48
降糖稻1号(对照)	12.6
		含有SBE3-m1的植株	11.4
含有SBE3-m2的植株	10.2

发现2种植株的抗性淀粉含量都达到10％以上，与降糖稻1号的抗性淀粉含量相当，由此证明本发明提供的SBE3基因人工定点突变体能够将水稻抗性淀粉含量提高到10％以上。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 水稻淀粉分支酶SBE3基因的人工定点突变体及其应用

<130> LC17110035

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 110

<212> DNA

<213> SBE3基因第8外显子的突变序列1

<400> 1

gtgcgaatgg aaactccatc tggtataaag gattctattc ctgcctggat caagtactct 60

gtgcaggccg caggagaaat cccataatat attatgatcc tcctgaagag 110

<210> 2

<211> 116

<212> DNA

<213> SBE3基因第8外显子的突变序列2

<400> 2

gtgcgaatgg aaactccatc tggtataaag gattctattc ctgcctggat caagtactct 60

gtgcaggccg caggagaaat cccatcaatg gaatatatta tgatcctcct gaagag 116

<210> 3

<211> 117

<212> DNA

<213> 野生型SBE3基因第8外显子

<400> 3

gtgcgaatgg aaactccatc tggtataaag gattctattc ctgcctggat caagtactct 60

gtgcaggccg caggagaaat cccatacaat ggaatatatt atgatcctcc tgaagag 117

<210> 4

<211> 11025

<212> DNA

<213> 野生型SBE3基因

<400> 4

gcgcacaccc acacaccgac caccaggcag cgcctcctcg ctttggctct cgcgtgagga 60

gggtttaggt ggaagcagag cgcgggggtt gccgggggat ccgatccggc tgcggtgcgg 120

gcgagatggc ggcgccggcg tctgcggttc ccgggagcgc ggcggggcta cgggcggggg 180

ccgtgcggtt ccccgtgcca gccggggccc ggagctggcg tgcggcggcg gagctcccga 240

cgtcgcggtc gctgctctcc ggccggagat tccccggtaa tgatcccgcg ccaccttgtt 300

gttctcgtcc gccgcgacgc gccacgcgtg cgcctcggct cgaccaggtg gcgtgccgtg 360

tcgcgtcgcg ccgcgggtgc ggtaaatcgt cgtgatcttc attttggttt tgcctgcgtc 420

tcgtgtccag gtgccgttcg cgtggggggt tccggggggc gcgtggccgt gcgcgcggcg 480

ggcgcgtcag gggaggtgat gatccccgag ggcgagagcg acgggatgcc ggtttcagca 540

ggttcagacg atctgcaggt gcgtgatcat gattcatcct gccttgacaa tactattgct 600

acatatctaa cagcattttg catgtcatgt ttgaaaatgg agacatgttc ttgtgcagtg 660

ctaccttacg agatcatata catttcacgc agtccacgtc ttgagacgtg ttgatttctg 720

tttgtgacgg gattatgata tattcagtga ttcagtcctt ttttatgtac ttagtccata 780

ctagttgtct gcgtgcataa tgataatatg atctaggtct agagcaccct atatgaggcc 840

tcaaagggca caccatatgc gtaggattga tctagagtct tgcttgttgt cgctcattcc 900

gttcagttgt cattatgttt tacttctgaa cattttatct cttgtacatt gttgtagttg 960

ccagccttag atgatgaatt aagcacggag gttggagctg aagttgagat tgagtcatct 1020

ggagcaagtg acgttgaagg cgtgaagaga gtggttgaag aattagctgc tgagcagaaa 1080

ccacgagttg tcccaccaac aggagatggg caaaaaatat tccagatgga ctctatgctt 1140

aatggctata agtaccatct tgaatatcgg tatggctttc cgcccttctt tatagatcac 1200

atagtttcat taggttatgt ttttattatt ctccatctgt tcagtctttc acaagatgta 1260

tgcaaataac tacttacgtg tcacagctga tgagactctt gaagttttat ctttagtcct 1320

gcatatatac tctgatctgt tctcaaatgg aagttgtttt agaaatcatt cagtcatgct 1380

ttaaaattta acaagagtcc taaactacta atgtgcgaaa aaaaaataga tttaccatta 1440

taagaatttt taagtcaaca tatagttaga aaaaaaaagt taatggtcaa atgagtatat 1500

tggacataca tagtaaatag tactaataat acatagatag tactcttcac agtggttctg 1560

ggttggggcg gtactgcaaa ccaaacaaaa gagtgatagg atggcgtcag aactaagaaa 1620

tgcaatatta attttgcaaa tatttaatct gaaagttatc tatgatgtaa aatacataat 1680

gggttttaga ccttgctgac gtctgtcaac tggacaacaa ctttatttcc tttcttttat 1740

atcattgtta tactccctct gtcctagaaa aaacaacttt cgtacgtgaa cttggaaagt 1800

tgatttattt tatgatggag ggagcataga tgaagtcaat atgcccatgc taactctact 1860

agaaacctga ttatgcttta attgattgaa tacagatata gcctatatag gagactgcgt 1920

tcagacattg atcagtatga aggaggactg gaaacatttt ctcgcggtta tgagaagttt 1980

ggatttaatc acaggtatag tttcttttac attgtaaccg cacatcactt ctctgggtgt 2040

aacaaaataa ctcagtgata ttcatccttc ttcccatgta gtgctgaagg tgtcacttat 2100

cgagaatggg ctcccggggc acatgtatgt tcttttgata gtctcaccat ttacctaaaa 2160

tgctacatta ttagttccat atttctagta catgtagata taattaccat gccatatatt 2220

ctgagatatt ccagattgta tggaatttat aattctcaga tgaacaactt gtcaatgtac 2280

ttgactagac gttgttaaga actaattttt gcttccaatt gcagtctgca gcattagtag 2340

gtgacttcaa caattggaat ccaaatgcag accgcatgag caaagtaagc ccacaggctc 2400

acaaatatgc ccttcctttc ttcaaaaata ttttgtttac atttctttaa ctaatttatt 2460

tggttatagc attggtttca tctatactct agagttgagc tagtgatata tcatgcgaac 2520

gcatgtatag cgcagtggta aacctgactc gaacctggat tttcgcacaa aaaaaattaa 2580

atccctcctt gcaaatgctg gcagaagcgt gctccccatg tgaggttgag caatcccggt 2640

tgtgcgatgc gttcaggggt ggggttctca acttagcttc atgctgcggg ccatcttaac 2700

ccgccgattg agtttttata tatatatatc atgcacactc ttatatgtta ttgactgttg 2760

ccatgagtta actgttagtt atcggttttg atgctactgt agtggtagta cattaatgtt 2820

gtgtatgtta catgtacatt ctttagtacc tagatgtatt ttgcagtttt tgtggacttg 2880

ataggagaag atgagtagct tgaggttgta actaataatg catggaccta gtgttgtaat 2940

tccatatgat tggtaagttg gtagttaccg atgctcatat ctaatgcaac tgtttccaga 3000

atgagtttgg tgtttgggag atttttctgc ctaacaatgc tgatggctca tctcctattc 3060

cacatggctc acgtgtaaag gtaattcctt atcctgcttg gccagtgttt tagctctggg 3120

cctgtgagca tctccctgta tcaagcatgc cttttgtcat ctaggtgcga atggaaactc 3180

catctggtat aaaggattct attcctgcct ggatcaagta ctctgtgcag gccgcaggag 3240

aaatcccata caatggaata tattatgatc ctcctgaaga ggtacctccc cccccccccc 3300

ccaacacgtg cacacgccat ttgaatatgt tcttgttcct tgaaaaaagt gcttcatttg 3360

tacttgtgaa tacttctgta atgtccttgg actcttggaa atttctcttt ttgttggcat 3420

ctttagattg ttctttttat ctagttatta aaatgtttta tatgactatg caggagaagt 3480

acatattcaa gcatcctcaa cctaaaagac caaagtcatt gcggatatac gaaactcatg 3540

ttggaatgag tagcacggta atgcatcttt tcttttaatt actagccata tacagttcaa 3600

gttaacttac attctagaat tatattaaag tgctgttagc cttaattttt ataactgtct 3660

acttctaagc agtgataagt tgttacaagt ttcctctgta ataatatatt aatacaatca 3720

gcacattttt tgcacattcg tcaacaatta gccgtttata taacctttgc tggatggttg 3780

attcaaatat gatgttttga aacaaattac tgatatttac actgatataa tttttgattt 3840

atgttttctg ctaacatagg gtatatttaa ttaatctatg tttgtatttc ttacaaacgg 3900

gtacggttat tattacataa taaaaaatag cgaataacac catgcctacc atttgtatac 3960

attttttttt gggcgtctgt tggtaattta tgattttcct gtactatgct ggctggtatt 4020

aattttaata ttgcaatcag gagccaaaga tcaacacgta tgcaaacttt agggatgagg 4080

tgcttccaag aatcaaaaag cttggataca atgcagtgca aataatggca attcaagagc 4140

atgcatatta tggaagcttt gggtgatcaa attacatatt gctggattta tttcttgtct 4200

ttgcagttta catatatatg cttttagact ttatctttca tcttccttgt tccctttgta 4260

taatgtgata aactgcttca tctttcttat catctttatc ttccttttat actcatgaaa 4320

caatgctgtt actgacccct tttgtttccc cttttgtttt ggtacaattg aactgtaaca 4380

aatgacattc gccacctttt gaatgaatgg ctattgagat aattttcaat tgtcaattaa 4440

gacttttatt atgggtgagc aatgcagatt ttttactttt gtttcaggta ccatgtcacc 4500

aatttctttg caccaagtag tcgtttcggg accccagaag atttaaagtc attgattgat 4560

aaagctcatg agcttggttt agttgtgctc atggatgttg ttcacaggta attaattact 4620

ccctctgctc atttttataa ggcatatttt aattttagaa agtatttatg actgaaattt 4680

gacaattaat ttctcataaa atatatttat catagctata aaaccaatat aatgtgaaaa 4740

tactttgagg tatgaatcta gtggtatatg ttttatactc taaatatact tgtatatcaa 4800

ctaattattg gtcaaaatct ttcgagtttg actttctgaa atcaaaatat gcgttataaa 4860

agtgaacaga atgagtattt gttaactggt ctttcatatc taagttagta aggcgtggcc 4920

acagagataa aagaaagtcc ttataatata gaagaaggct gtggtggtaa gtctgccatt 4980

ataccaccac ctcttgagtt tgtgggatct tctgtggata aatagatcat ttatgcatgt 5040

ggctaggctg tttgtggatt aatgtttggt tccaaattgc ttacaaatta caattttttt 5100

cctgagaagt tcatgcatag ttcatttcat ttttatgata ttttttaaaa aaaatccact 5160

tctactcatg ggtatttagc taacggtatg attctctgtt ctataaaaaa aaagtacatc 5220

tagccctcat gttggtgaac cctaattatg actaatctac aaccgtagat cttctctctt 5280

ttatgcaaca tgtttaactt gaattattgc agtataagag ttttcacaat ttaaattggc 5340

tagcattcga gtttatctta ggatgggaag aaaatgaatt aaacagtttc attcatattt 5400

tctattcaat tattgaattt gagaattcaa attaatattt tattcgtgac atcttttgtt 5460

ggctttctgg tggacaacaa ctagaactaa tttacatgcc aaaatttgtc aatcaccatg 5520

gcccaaagtt tagctcattg gcctctgggt tctaagccct tttggtttca aatattaacc 5580

tttgtgttga tttactaagt ccccttttag ctgcatacct aatagcttta cctttgcccc 5640

ttttttttcc ttttgcagcc atgcgtcaaa taatacccta gatgggttga acggttttga 5700

tggtacagat acgcattact ttcatagtgg ttcacgcggc catcattgga tgtgggattc 5760

tcgccttttc aactatggga attgggaagt aaggaacacg ttaatcgcta cttcccttta 5820

caaagtatca ttattcatat gcattaatct ctattgtgtt tgccaacatt tttatcctta 5880

tacaggttct aagatttcta ctatccaatg caagatggtg gctcgaggag tataagtttg 5940

atggtttcag atttgacggt gtaacctcaa tgatgtacac tcatcatgga ttacaagtat 6000

attgcttcgt tttcattact ttatcttcac taccttctta attatgatgg ggtcaaacct 6060

agcagttgct atctgttaca atttcatatt tatttgcgtc ataaccttta tcttatgatt 6120

ccaccctcta ttttaggtag catttacggg gaactacagt gaatactttg gatttgccac 6180

tgatgctgat gcagtagttt acttgatgct ggtaaatgat ttaattcatg gactttatcc 6240

tgaggccata accatcggtg aagatgtaag tgctgactat atttgtcttt atgtactcat 6300

ttctttagca tgcatttata gcaatatttt ggcatctaga catgcttaag taagaagttg 6360

aaagcttgca ctgcatatta cgctaatgtc agttttgcct tctctagttc ataatgttgt 6420

atacccaaag cttagctttc caatcttagt gttacatatt tactattaac cccatcttga 6480

tagttgatca aattatgtcg ctggttcaag aaattgtttt ccttgggctt agaaaacagc 6540

aaggagtaat gatagttacc aaagattagt gaccacctgg tctctagtac agaagttgac 6600

catcaatgtt atacgagtat gttagtaaag aattatacaa atgtattgtt atgaaaaaaa 6660

ttcgtgacga atataatggc accatttgca tgtgaataac ctgattgttt ttatatatta 6720

ttctgagtta gagaagtttg aaatatgaac gcgtgcattc taaaaattta catatttctg 6780

aacaaaaaga gtacattttt tctgtaaaaa aagagagtat aattgtgtcc tcaaaaacag 6840

ctgtgcatgt tccatggtgc catactgtca taaccttttc ttctcttggg aaatccagcc 6900

tccctggaag tttgtgaagt acaaaaagca agttatacag tagctctgta tggtctacat 6960

ttttttttgg gaatacgcaa aatgcgtatc ttttgtatta agatcgggaa aagttgttag 7020

aacaggcaca gcaactatgt acagggagaa aggaagaaaa atgggtgtgg gaaacatata 7080

gtaatatctc gcggaacaat ttgatgacca aatgctccac ctagatgcgc gctcctgcct 7140

ccctccaggg cgcggcctcc gatgccacta gctccgctat ctcctgcatg gtcttgcatt 7200

gaccattgaa aacccggttt ttccactcct tttgtatcgt ccaggccacc aggatatgat 7260

gatggtgtca aaccctcatc tttgggccgc tatgattttg tctcggctgt cgcaccacca 7320

tacgaggaag ggctgctcat ttgatgggaa gcaatgggat tggccaatgc cgcatagaac 7380

tgtccaccat agctgtagtg tttctggaca ttggattaga aggtggtcaa ttgactccac 7440

actttgatca cagaagacac acttctgcag accacttgct cagcctgtcg cctgtatggt 7500

ctagagttgc aatagtagta acaatactct aaatcccata cgtaaaccta actctattgc 7560

aaaagataac ttaatttcaa ctgttctgtg gttaaatggc atataactac ttcaggtcag 7620

tggaatgcct acatttgccc ttcctgttca agatggtggg gttggttttg attatcgcct 7680

tcatatggct gttcctgaca aatggattga actcctcaag taagtgtttc aaattttggt 7740

taatagaaat actaattaca tatctaatga acataaactg ttttcttgtg ttaaattctt 7800

ttttgtatac attggtttcc ttgaccatga tatctctatt tctcttctga agttaattgg 7860

cataactcct gcccttgatt tttttttaaa aaaaaaaaag atcactcata tatagggtta 7920

taggcattta ccaatgtgat gtgctggatt tggtcatatg aacagtggtc gtgtgagttc 7980

cattattagt ataaaataag atgcaactac caacttatag agtttgactt ggcaacgtta 8040

catttttaat gctcctttat tatgtggtat aaaaatgccc atgctcatcg tatctcactt 8100

ttttgtcagc tgtttagctt ttatttagaa actgggaaag attgttattt tgtatccttt 8160

aattgaaaga tgtggtgcca gagtttcaat ttttatttta cacaggcaaa gtgatgaatc 8220

ttggaagatg ggtgatattg tgcacacact gactaacaga aggtggtcag agaagtgtgt 8280

tacttatgct gaaagtcatg atcaagcact agttggtgac aaaactattg cattctggtt 8340

gatggacaag gttaccacac atcaatctct aggttttagt gttttactga ttaggactgt 8400

aactaatggc tctttaatat atccttgata attatttgta ctgattttac tcaaatatac 8460

tcaatgcatt cattgtggat agtaagaacg gtatgaaaac cacagctaga tcagtgtttt 8520

aagttggata gctttaggct ttctgcagtc tacacccagt ttttcttgta ttagttgcaa 8580

catgtattta tgaattttct attctttact agttctttgg aaaatgttat ttccttgttt 8640

taatacttaa aacatatttg tgtatcagtg tatcaccgta ctattcttga gataatagag 8700

ttgttctttg agttttaatt gttgagaaaa tgcatataca tgcaggatat gtatgaattt 8760

taatgaatac tggcatgaga acctcacata ctgtacttat gcaggatatg tatgatttta 8820

tggctctgga cagaccggca acacctagca ttgatcgtgg aatagcattg cataaaatga 8880

ttagacttat cacaatgggg ttaggaggag aaggctatct taactttatg ggaaatgagt 8940

tcggacatcc tggtgagatt taataacaat cacacaccat gtttgtttct tattttatat 9000

caacttctca tttgatgaca atggttcttg tcacctagta ttttctggga aacaattggc 9060

ttaaaggcca ttgatctacc ttttattttg cagaatggat tgattttcca agagctccac 9120

aagtacttcc aaatggtaaa ttcatcccag ggaataacaa cagttatgat aaatgccgtc 9180

gaagatttga cctggtaact ttctttgctc tgtcacctga ttattgatga aaataagttc 9240

tgcattccct ggattcaatt tagatatctt tttaccccct tctgcagtgt tttaatcatg 9300

aaggtcccat tatgacaatt catctaattc atcaattcct ttttattcac attaacattt 9360

gtgcgaggcc agcaacattg aaccatgatt ttgttatgga tcagtaagtt ttttcattgc 9420

tttgtcaggg tgatgcggac tatcttaggt atcgtggcat gctagagttt gaccgcgcga 9480

tgcagtctct cgaggaaaaa tatggggtat gttgtattta tcacttatct ttttctgggg 9540

gttgcacaaa tatgagccat tatgcttatg tcctgttact gatacttgct atgtcaacta 9600

tttatccaaa accacttgaa atatatggtg aaatgacgag ctgcacttgt gcattatgca 9660

attatgtcca atactcttag gaatagctcc cattgtcatt atctaggtgc atcattatgt 9720

tttctcatgt cttccaatca ttgcaatagt aatcaatact gttaaataat ggacagcttt 9780

gttcgatgcc aattaaatta ttttgtcttg tttgcatggg ctatgtggac agtaatttta 9840

tatttttatt gatgaataaa tgcattatca ataatataat gcatatattt cccttcatag 9900

aatttctttt ttgtatttat aggaaaaact ttgcaagtaa aatgatggtt ttgttttaac 9960

attgctctga cactgatggg ggttttctta tggctatgtt atttcagttc atgacatcag 10020

accaccagta catatctcga aagcatgaag aggataagat gattatattt gagaagggag 10080

atctggtatt tgtgttcaac ttccattgga gtaacagcta ttttgactac cgtgttggtt 10140

gtttaaagcc agggaaatat aaggtatgca gctatttgtg cattgcccgt gatcaattat 10200

agtttttgtt cactaggtaa ggctttaccg accttactgt taaccaagta gaaaatggca 10260

aaatgccaaa aaaatcggat ttgtatgatt tctgcccaag aataaaatag attgacaact 10320

atgcttgcat atgcaccccg gtggtcaagg agttgccttt gttagcgata gtcctaggtc 10380

tggatcctca aattgcaacc attcattttt ttttcctatt cagattaaaa aatattgaat 10440

gtggactaaa aaaatttcat gttatgtacg tctccaattg tactgtaact aatatttctc 10500

cctgggtctc tgggatatgt caagtgccat tatttattga ttggtgttaa atcaggaatt 10560

acgagcaaag aagttcttgg taatcatcaa cacttcatat ttacctacac tagtcgtgcc 10620

cattatgttg accctgccat agtttactcc ttccatatat ttgaaaataa ccagtaaaaa 10680

ttactcaaaa gtcctctagt cagttttgca gcgcgttcat gcttcttaca gacgaactgg 10740

atgtgttggt tgctgaactg caaaataatt tatgttgctt tctatcaggt ggtcttggac 10800

tcagatgctg gactctttgg tggatttggc aggatccatc acactgcaga gcacttcact 10860

gccgtaagtc ttgctcagat gaaattgcgt accgtatatt gtgtgctctt tattaacctc 10920

tgttgtgctc attccttgca ggattgttca catgacaaca ggccctactc gttctcagtt 10980

tattctccta gcagaacctg cgttgtctat gctccagcgg aatga 11025

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SBE3基因第8外显子-F3

<400> 5

gtgtgcagga gaaatcccat acaa 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SBE3基因第8外显子-R3

<400> 6

aaacttgtat gggatttctc ctgc 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SBE3基因第5外显子-CCF1

<400> 7

gtgtgtatcg agaatgggct cccg 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SBE3基因第5外显子-CCR1

<400> 8

aaaccgggag cccattctcg atac 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SBE3基因第8外显子的PCR检测上游引物

<400> 9

gcttggccag tgttttagct 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SBE3基因第8外显子的PCR检测下游引物

<400> 10

ccgtgctact cattccaaca 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 潮霉素的PCR检测上游引物

<400> 11

ctatttcttt gccctcggac 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 潮霉素的PCR检测下游引物

<400> 12

cctgacctat tgcatctccc 20

Claims

1.水稻淀粉分支酶SBE3基因的第8外显子的突变序列，其特征在于，所述突变序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示。

2.根据权利要求1所述的突变序列，其特征在于，所述突变序列通过采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术对野生型SBE3基因的第8外显子进行修饰使得所述第8外显子的碱基发生缺失而得到，其中对野生型SBE3基因的第8外显子进行修饰的靶向序列位于所述第8外显子中的第70-89位碱基。

3.一种水稻淀粉分支酶SBE3基因的突变基因，其特征在于，相对于野生型SBE3基因，所述突变基因的第8外显子为权利要求1或2所述的突变序列。

4.一种载体，其包含权利要求1或2所述的突变序列或者权利要求3所述的突变基因。

5.权利要求1或2所述的突变序列、权利要求3所述的突变基因或者权利要求4所述的载体在含高抗性淀粉水稻品种的育种中的用途。

6.表达载体pCAMBIA1300::SBEIIbsgRNA::Cas9，所述表达载体如下构建得到：

以如SEQ ID NO. 3所示的野生型水稻淀粉分支酶SBE3基因序列中第8外显子中的第70-89位碱基为靶向序列，合成如SEQ ID NO. 5所示的寡核苷酸作为上游引物，合成如SEQID NO. 6所示的寡核苷酸作为下游引物；

用BbsI酶切sgRNA载体OsU6-SK质粒载体后，胶回收；将所述上游引物和下游引物分别加入ddH2O中，稀释成10μmol母液，分别吸取10μl放到同一个管中，放入PCR仪，退火获得带接头的双链DNA片段；将所述双链DNA片段与载体的胶回收产物连接过夜，连接产物转化DH5α大肠杆菌，鉴定阳性克隆并验证构建得到正确的OsU6-SbeIIbsgRNA-SK载体；

用KpnI和SalI同时双酶切构建好的OsU6-SbeIIbsgRNA-SK载体和35S-Cas9-SK质粒载体，胶回收OsU6-SbeIIbsgRNA-SK片段，将回收后的OsU6-SbeIIbsgRNA-SK片段与回收后的线状35S-Cas9-SK质粒载体过夜连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌，鉴定阳性克隆并验证构建得到正确的OsU6-SbeIIbsgRNA-35S-Cas9-SK载体；

用KpnI和EcoRI双酶切OsU6-SbeIIbsgRNA-35S-Cas9-SK载体，回收OsU6-SbeIIbsgRNA-35S-Cas9片段；同时用这两种酶双酶切pCAMBIA1300质粒表达载体，然后胶回收；将分别胶回收的片段与pCAMBIA1300载体过夜连接，连接产物转化大肠杆菌，鉴定阳性克隆并验证构建得到正确的表达载体pCAMBIA1300::SBEIIbsgRNA::Cas9。

7.权利要求6所述的表达载体pCAMBIA1300::SBEIIbsgRNA::Cas9在水稻品种的育种中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述水稻品种为高抗性淀粉水稻品种。