CN110699354A - 一种利用转录激活因子样效应物核酸酶技术提高稻米抗性淀粉的方法 - Google Patents

一种利用转录激活因子样效应物核酸酶技术提高稻米抗性淀粉的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110699354A
CN110699354A CN201910704836.2A CN201910704836A CN110699354A CN 110699354 A CN110699354 A CN 110699354A CN 201910704836 A CN201910704836 A CN 201910704836A CN 110699354 A CN110699354 A CN 110699354A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
artificial sequence
rice
represented
tn11a
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910704836.2A
Other languages
English (en)
Inventor
彭日荷
姚泉洪
田永生
高建杰
许晶
付晓燕
李振军
韩红娟
王波
王丽娟
张福建
黄悠楠
张文慧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Academy of Agricultural Sciences filed Critical Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201910704836.2A priority Critical patent/CN110699354A/zh
Publication of CN110699354A publication Critical patent/CN110699354A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12N9/107—1,4-Alpha-glucan branching enzyme (2.4.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01018—1,4-Alpha-glucan branching enzyme (2.4.1.18), i.e. glucan branching enzyme

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用转录激活因子样效应物核酸酶技术提高稻米中抗性淀粉含量的方法。具体过程是：通过基因序列分析，从水稻淀粉分支酶SBE3基因组DNA中筛选两段专一核苷酸序列，分别构建两段靶位点序列的转录激活因子效应子识别模块，并与FokI II核酸酶表达单元串联。获得靶向SBE3基因TALEN的植物表达载体SFokIAB[TN11ab]，然后将表达载体通过农杆菌介导转化到水稻中。利用本发明，可以显著提高稻米中抗性淀粉的含量。

Description

一种利用转录激活因子样效应物核酸酶技术提高稻米抗性淀 粉的方法
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体地说利用转录激活因子样效应物核酸酶技术，定向剪切水稻淀粉分支酶Sbe3基因，培育出高抗性淀粉含量的稻米。
背景技术
抗性淀粉（resistant starch, RS）即抗酶解性淀粉，最早由Englyst提出。其定义为不能被健康人体小肠所吸收，但能在大肠中发酵的淀粉及其淀粉降解物的总称。RS具有非常重要的生理功能，可降低糖尿病患者饭后血糖值、控制体重、有效防止肠道疾病及降血脂等功效，且对饮食中维生素、矿物质等微量营养素的吸收无干扰作用，故还可作为食品添加剂来改良食品品质和加工工艺，因此开发大米抗性淀粉产品，具有广阔的市场前景。
Eerlingen等认为抗性淀粉主要由直链淀粉构成，也含有一部分支链淀粉、少量脂类和少量蛋白质(Cereal Chemistry，1993，70(3)：345-350)。研究表明，直链淀粉参与了抗性淀粉结晶区和无定形区的形成。有些直链淀粉分子只是一部分链段与相邻直链淀粉分子相互靠近、形成氢键参与了抗性淀粉的形成。直链淀粉结晶区，阻止淀粉酶靠近淀粉结晶区域的a-1，4葡萄糖苷键，并阻止淀粉酶活性中心的结合部位与淀粉分子结合，因此直链淀粉结晶极具抗淀粉酶消化的能力。
由于直链淀粉近似线形的盘管状分子间的排列聚集比较容易，而支链淀粉是分支状大分子，由于空间位阻作用而难以发生聚集，因此直链淀粉在RS形成过程中起着重要作用。支链淀粉在RS形成中同样非常重要。支链淀粉的分支部分可以形成双螺旋并进一步形成有序的三维结构，支链淀粉聚合度(Degree of polymerization，DP)小于100时，RS含量随着DP的增加而上升。
Yano等人(1985年)从水稻中成功地筛选出了一种高直链淀粉突变体ae(Theoretical and Applied Genetics，1985，69：253-257．)。ae突变体中淀粉分支酶的活性只有野生型的60-90％，缺少的一部分活性是由于淀粉分支酶Sbe3的异常而引起的（Kouichi, Journal of Biological Chemistry，1993，268：19084-19091）。Sbe3负责催化短分支的形成，Sbe3突变体,支链淀粉长链聚合度>35(B2和B3链)和中长链(聚合度为15-30,A链和B1链)显著增加,短链(聚合度为6-12)显著减少(Aiko,Plant Physiology，2001，127:459-472)。朱利佳等通过在籼稻品种特青中利用反义RNA技术同时抑制Sbe1和Sbe3的活性，获得了直链淀粉含量接近50%，抗性淀粉含量接近13%左右的转基因系，且支链淀粉的精细结构亦发生改变，表现为支链淀粉的短链合成减少而中长链増加(扬州大学位论文，2009)。满建民等通过比较同时下调Sbe1和Sbe3表达的转基因水稻，发现在表观直链淀粉含量大幅度增加，淀粉的螺旋结构和结晶方式也发生相应的变化(扬州大学位论文，2015)。
传统的植物育种方法通过诱变、筛选及自交来实现,时间长,随机性大,再加上突变不专一，为育种工作带来很多不利因素。基因编辑技术能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除和加入，能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。为育种工作带来了很多方便。其中转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs，transcription activator-like effector nucleases)技术以其能够高效率地进行定点基因组编辑，在基因研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力(Miller,Nature Biotechnology. 2011,29(2):143-8)。TALENs借助于TAL效应子识别特异性DNA碱基对。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。由于TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列，TALENs技术广泛用于基因敲除、敲入或转录激活等靶向基因组编辑(Sakuma , Genes Cells. 2013 ,18(4):315-26)。
本发明利用TALENs剪切水稻淀粉分支酶Sbe3基因，大幅提高了稻米中抗性淀粉的含量。
发明内容
本发明为了提高稻米中抗性淀粉的含量，利用TALENs技术，定向剪切水稻淀粉分支酶Sbe3基因。
本发明通过水稻基因组的Blast分析，以保证靶位点在水稻基因组中的唯一性为原则。选择水稻淀粉分支酶Sbe3基因15bp的左侧靶位点CCAGATGGACTCTAT和ACCGATATTCAAGAT。
本发明利用基因合成方法（xiong 2004，核酸研究），按照NG识别碱基T，HD识别碱基C，NI识别碱基A，NN识别碱基G和A原则，构建由15个模块组成的DNA结合域TN11a和TN11b，每模块由34个氨基酸组成。
分别对淀粉分支酶Sbe3基因左右两侧靶位点识别模块TN11a和TN11b进行双酶切，与FokIA基因表达单元连接，构建SFokIA【TN11a】和SFokIA【TN11b】靶向序列，插入双酶切的植物双元载体pcamBIA-1301，最终获得靶向淀粉分支酶Sbe3基因TALEN的植物表达载体SFokIAB[TN11ab]1301。
本发明利用电击法将质粒导入根癌农杆菌中。农杆菌介导方法将SFokIAB[TN11ab]1301表达载体转化水稻中（Clough 1998，植物学杂志），通过检测，水稻中直链淀粉的含量为6-10%。
附图说明
图1 OsSbe3基因TALEN的植物表达载体SFokIAB[TN11ab]1301构建图谱。
图2 OsSbe3基因剪切后稻米外观形态变化。
图3 OsSbe3基因基因剪切后淀粉粒的变化
本发明有益效果
该发明能够定向剪切水稻淀粉分支酶Sbe3基因，使水稻中抗性淀粉含量大幅提高。
具体实施方式
实施例1：识别水稻淀粉分支酶Sbe3基因左侧靶位点功能模块TN12a合成
以基因合成方法（Nucleic Acids Research, 2004, 32, e98）合成TN11a模块。设计的引物为：
TN11a-1 GGATCCCTCACTCCAGCACAGGTGGTTGCGATCGCAT CCAATATCGGAGGTAAGCAGGCG（SEQ ID NO.3所示）
TN11a-2 CCTGACAAAGGACCGGCAACAGACGCTGCACAGTCT C CAACGCCTGCTTACCTCCGATAT（SEQ ID NO.4所示）
TN11a-3 GTTGCCGGTCCTTTGTCAGGATCATGGCCTGACGC CA G ATCAGGTAGTCGCAATCGCAAG（SEQ ID NO.5所示）
TN11a-4 GCGCTGGACTGTCTCAAGGGCCTGCTTGCCTCCATTG TTGCTTGCGATTGCGACTACCTG（SEQID NO.6所示）
TN11a-5CCCTTGAGACAGTCCAGCGCTTGTTGCCTGTTCTATGC
CAGGATCACGGCCTGACTCCTG（SEQ ID NO.7所示）
TN11a-6 TGTTTACCACCATCGTGAGACGCAATGGCGACCACTT GGTCAGGAGTCAGGCCGTGATCC（SEQID NO.8所示）
TN11a-7 TCTCACGATGGTGGTAAACAAGCACTGGAAACGGTTC AAAGACTCCTCCCAGTGCTGTGT（SEQID NO.9所示）
TN11a-8 CTATAGCTACGACTTGTTCAGGTGTCAAACCATGATC TTGACACAGCACTGGGAGGAGTC（SEQID NO.10所示）
TN11a-9 TGAACAAGTCGTAGCTATAGCCTCTAACGGTGGTGG GAAGCAAGCGCTGGAAACCGTTCA（SEQID NO.11所示）
TN11a-10GGTTAGCCCATGATCCTGACATAGTACTGGCAAG
AGTCTCTGAACGGTTTCCAGCGCTTG（SEQ ID NO.12所示）
TN11a-11 GTCAGGATCATGGGCTAACCCCTGCCCAAGTTGTGG CCATTGCGTCGAACGGTGGTGGAA（SEQ ID NO.13所示）
TN11a-12 AAGACGGGAAGGAGACGTTGTACCGTTTCGAG A GCTTGTTTTCCACCACCGTTCGACGCA（SEQ ID NO.14所示）
TN11a-13 CAACGTCTCCTTCCCGTCTTGTGTCAAGATCACGG
TTTGACTCCAGCGCAGGTTGTCGCA（SEQ ID NO.15所示）
TN11a-14 CAGTCTCAAGCGCCTGCTTGCCACCATCGTG GC TGGCGATTGCGACAACCTGCGCTGGAG（SEQ ID NO.16所示）
TN11a-15CAAGCAGGCGCTTGAGACTGTTCAGCGCTTGCT C CCGGTGCTCTGTCAGGATCACGGGCT（SEQ ID NO.17所示）
TN11a-16 ACCGTCATGGGAAGCGATTGCCACCACTTGATCAGG
TGTGAGCCCGTGATCCTGACAGAG（SEQ ID NO.18所示）
TN11a-17 CAATCGCTTCCCATGACGGTGGAAAGCAAGCA CT CGAAACTGTTCAGCGGCTTTTGCCTG（SEQ ID NO.19所示）
TN11a-18ACGACTTGTGCTGGAGTCAGGCCATGGTCCTG GCAAAGTACAGGCAAAAGCCGCTGAACA（SEQID NO.20所示）
TN11a-19CTGACTCCAGCACAAGTCGTCGCAATCGCATCAA ACATTGGTGGCAAGCAAGCGTTGGAA（SEQ ID NO.21所示）
TN11a-20 CATGGTCTTGACATAGGACGGGAAGGAGCCGTTGCA
CCGTTTCCAACGCTTGCTTGCCAC（SEQ ID NO.22所示）
TN11a-21 CGTCCTATGTCAAGACCATGGTCTGACACCAGCGCAA
GTTGTCGCTATCGCAAGCCACGA （SEQ ID NO.23所示）
TN11a-22CAGAAGTCTCTGCACAGTCTCAAGTGCTTGCTTCCC GCCATCGTGGCTTGCGATAGCGAC（SEQID NO.24所示）
TN11a-23 AGACTGTGCAGAGACTTCTGCCGGTTCTGTGTCAG GACCATGGACTGACTCCGGATCAGG（SEQ ID NO.25所示）
TN11a-24 AGTGCCTGCTTACCACCGCCATTCGAAGCGATGGC CACGACCTGATCCGGAGTCAGTCCA（SEQ ID NO.26所示）
TN11a-25GGCGGTGGTAAGCAGGCACTGGAGACAGTTCAGCGT
CTGCTGCCAGTTCTGTGTCAAGAC （SEQ ID NO.27所示）
TN11a-26TGCTGGCTATTGCAACAACCTGCGCCGGGGTCAGCCCATGGTCTTGACACAGAACTGGCA（SEQID NO.28所示）
TN11a-27GGTTGTTGCAATAGCCAGCAACAATGGCGGTAAACAGGCGTTGGAAACGGTTCAGCGTCT （SEQID NO.29所示）
TN11a-28AGCAGGCGTAAGTCCGTGGTCTTGACACAGGACTGGCAAGAGACGCTGAACCGTTTCCAA（SEQID NO.30所示）
TN11a-29ACCACGGACTTACGCCTGCTCAGGTTGTGGCAATTGCGAGTAACAATGGTGGGAAGCAGG （SEQID NO.31所示）
TN11a-30TGACAGAGTACTGGCAGGAGCCGCTGGACCGTCTCAAGAGCCTGCTTCCCACCATTGTTA（SEQID NO.32所示）
TN11a-31CTCCTGCCAGTACTCTGTCAGGACCATGGCCTAACTCCAGATCAGGTCGTCGCCATTGCT（SEQID NO.33所示）
TN11a-32GCTGCACTGTCTCCAGCGCCTGCTTCCCTCCACCGTTCGAAGCAATGGCGACGACCTGAT（SEQID NO.34所示）
TN11a-33GGCGCTGGAGACAGTGCAGCGTCTTCTGCCTGTGCTGTGCCAGGATCATGGCTTAACACC （SEQID NO.35所示）
TN11a-34TTTACCTCCATTGTTGCTGGCGATAGCCACAACCTGTTCCGGTGTTAAGCCATGATCCTG（SEQID NO.36所示）
TN11a-35CCAGCAACAATGGAGGTAAACAGGCATTGGAAACAGTTCAGCGCCTGTTGCCAGTGCTAT （SEQID NO.37所示）
TN11a-36ATGGCGACAACCTGTTCTGGTGTAAGCCCGTGGTCCTGACATAGCACTGGCAACAGGCGC（SEQID NO.38所示）
TN11a-37CCAGAACAGGTTGTCGCCATCGCGAGTAACATTGGTGGCAAACAGGCACTTGAAGAGCTC（SEQID NO.39所示）
TN11a-38 GAGCTCTTCAAGTGCCTGTTTGCCACCAATGTTACT CGCGATGGCGACAACCTGTTCTGG（SEQ ID NO.40所示）
利用PCR 合成识别水稻OsSbe3基因左侧靶位点功能模块TN11a，在100µl反应体系中，TN11a-2—TN11a-37共36个引物的添加量为2ng，外侧引物TN11a-1和TN11a-38添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1 min；94℃, 30 s, 50℃, 30 s, 72℃, 2 min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶（Toyobo公司，日本），共25个循环。PCR产物进行1% 琼脂糖胶回收，取10 µl 直接与平端克隆载体相连（大连宝生物公司）。4℃连接过夜，高效转化 DH5α感受态中，获得阳性克隆。
实施例2：识别水稻淀粉分支酶Sbe3基因右侧靶位点功能模块TN11b的合成
以基因合成方法（Nucleic Acids Research, 2004, 32, e98）TN11b。设计的引物为：
TN11b-1GGATCCCTCACTCCAGCACAGGTGGTTGCGATCGCATCCAATATCGGAGGTAAGCAGGCG （SEQID NO.41所示）
TN11b-2CCTGACAAAGGACCGGCAACAGACGCTGCACAGTCTCCAACGCCTGCTTACCTCCGATAT（SEQID NO.42所示）
TN11b-3GTTGCCGGTCCTTTGTCAGGATCATGGCCTGACGCCAGATCAGGTAGTCGCAATCGCAAG （SEQID NO.43所示）
TN11b-4GCGCTGGACTGTCTCAAGGGCCTGCTTGCCTCCATTATTGCTTGCGATTGCGACTACCTG（SEQID NO.44所示）
TN11b-5CCCTTGAGACAGTCCAGCGCTTGTTGCCTGTTCTATGCCAGGATCACGGCCTGACTCCTG （SEQID NO.45所示）
TN11b-6TGTTTACCACCGATGTTAGACGCAATGGCGACCACTTGGTCAGGAGTCAGGCCGTGATCC（SEQID NO.46所示）
TN11b-7TCTAACATCGGTGGTAAACAAGCACTGGAAACGGTTCAAAGACTCCTCCCAGTGCTGTGT （SEQID NO.47所示）
TN11b-8CTATAGCTACGACTTGTTCAGGTGTCAAACCATGATCTTGACACAGCACTGGGAGGAGTC（SEQID NO.48所示）
TN11b-9TGAACAAGTCGTAGCTATAGCCTCCAACGGTGGTGGGAAGCAAGCGCTGGAAACCGTTCA （SEQID NO.49所示）
TN11b-10GGTTAGCCCATGATCCTGACATAGTACTGGCAAGAGTCTCTGAACGGTTTCCAGCGCTTG（SEQID NO.50所示）
TN11b-11GTCAGGATCATGGGCTAACCCCTGCCCAAGTTGTGGCCATTGCGTCGCACGATGGTGGAA （SEQID NO.51所示）
TN11b-12AAGACGGGAAGGAGACGTTGTACCGTTTCGAGAGCTTGTTTTCCACCATCGTGCGACGCA（SEQID NO.52所示）
TN11b-13CAACGTCTCCTTCCCGTCTTGTGTCAAGATCACGGTTTGACTCCAGCGCAGGTTGTCGCA （SEQID NO.53所示）
TN11b-14CAGTCTCAAGCGCCTGCTTGCCACCACCGTTGCTGGCGATTGCGACAACCTGCGCTGGAG（SEQID NO.54所示）
TN11b-15CAAGCAGGCGCTTGAGACTGTTCAGCGCTTGCTCCCGGTGCTCTGTCAGGATCACGGGCT （SEQID NO.55所示）
TN11b-16ACCACCGTTGGAAGCGATTGCCACCACTTGATCAGGTGTGAGCCCGTGATCCTGACAGAG（SEQID NO.56所示）
TN11b-17CAATCGCTTCCAACGGTGGTGGAAAGCAAGCACTCGAAACTGTTCAGCGGCTTTTGCCTG （SEQID NO.57所示）
TN11b-18ACGACTTGTGCTGGAGTCAGGCCATGGTCCTGGCAAAGTACAGGCAAAAGCCGCTGAACA（SEQID NO.58所示）
TN11b-19CTGACTCCAGCACAAGTCGTCGCAATCGCATCACACGATGGTGGCAAGCAAGCGTTGGAA （SEQID NO.59所示）
TN11b-20CATGGTCTTGACATAGGACGGGAAGGAGCCGTTGCACCGTTTCCAACGCTTGCTTGCCAC（SEQID NO.60所示）
TN11b-21CGTCCTATGTCAAGACCATGGTCTGACACCAGCGCAAGTTGTCGCTATCGCAAGCAACGG （SEQID NO.61所示）
TN11b-22CAGAAGTCTCTGCACAGTCTCAAGTGCTTGCTTCCCGCCACCGTTGCTTGCGATAGCGAC（SEQID NO.62所示）
TN11b-23AGACTGTGCAGAGACTTCTGCCGGTTCTGTGTCAGGACCATGGACTGACTCCGGATCAGG （SEQID NO.63所示）
TN11b-24AGTGCCTGCTTACCACCGTCGTGGGATGCGATGGCCACGACCTGATCCGGAGTCAGTCCA（SEQID NO.64所示）
TN11b-25GACGGTGGTAAGCAGGCACTGGAGACAGTTCAGCGTCTGCTGCCAGTTCTGTGTCAAGAC （SEQID NO.65所示）
TN11b-26TGCTGGCTATTGCAACAACCTGCGCCGGGGTCAGCCCATGGTCTTGACACAGAACTGGCA（SEQID NO.66所示）
TN11b-27GGTTGTTGCAATAGCCAGCAACATTGGCGGTAAACAGGCGTTGGAAACGGTTCAGCGTCT （SEQID NO.67所示）
TN11b-28AGCAGGCGTAAGTCCGTGGTCTTGACACAGGACTGGCAAGAGACGCTGAACCGTTTCCAA（SEQID NO.68所示）
TN11b-29ACCACGGACTTACGCCTGCTCAGGTTGTGGCAATTGCGAGTCACGATGGTGGGAAGCAGG （SEQID NO.69所示）
TN11b-30TGACAGAGTACTGGCAGGAGCCGCTGGACCGTCTCAAGAGCCTGCTTCCCACCATCGTGA（SEQID NO.70所示）
TN11b-31CTCCTGCCAGTACTCTGTCAGGACCATGGCCTAACTCCAGATCAGGTCGTCGCCATTGCT （SEQID NO.71所示）
TN11b-32GCTGCACTGTCTCCAGCGCCTGCTTCCCTCCATCGTGCGAAGCAATGGCGACGACCTGAT（SEQID NO.72所示）
TN11b-33GGCGCTGGAGACAGTGCAGCGTCTTCTGCCTGTGCTGTGCCAGGATCATGGCTTAACACC （SEQID NO.73所示）
TN11b-34TTTACCTCCGTTGTTGCTGGCGATAGCCACAACCTGTTCCGGTGTTAAGCCATGATCCTG（SEQID NO.74所示）
TN11b-35CCAGCAACAACGGAGGTAAACAGGCATTGGAAACAGTTCAGCGCCTGTTGCCAGTGCTAT （SEQID NO.75所示）
TN11b-36ATGGCGACAACCTGTTCTGGTGTAAGCCCGTGGTCCTGACATAGCACTGGCAACAGGCGC（SEQID NO.76所示）
TN11b-37CCAGAACAGGTTGTCGCCATCGCGAGTAACAATGGTGGCAAACAGGCACTTGAAGAGCTC（SEQID NO.77所示）
TN11b-38GAGCTCTTCAAGTGCCTGTTTGCCACCATTGTTACTCGCGATGGCGACAACCTGTTCTGG（SEQID NO.78所示）
利用PCR合成TN11b模块，在100µl反应体系中，TN11b-2- TN11b-37共36个引物的添加量为2ng，外侧引物TN11b-1和TN11b-38添加量为30 ng，扩增条件为：94℃预热1 min；94℃,30 s, 50℃, 30 s, 72℃, 2 min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶（Toyobo公司，日本），共25个循环。PCR产物进行1% 琼脂糖胶回收，取10 µl 直接与平端克隆载体相连（大连宝生物公司）。4℃连接过夜，高效转化 DH5α感受态中，获得阳性克隆。
实施例3：靶向OsSbe3基因的TALEN植物表达载体构建
用BamHI和SacI分别对OsSbe3基因左侧靶位点识别模块pUC19(TN11a)和右侧靶位点识别模块pUC19(TN11b)进行双酶切，酶切产物经1% Agarose电泳分离并割胶回收1500bp的片段。将SFokIA（pUC19）载体和1500bp左右的TN11a片段进行T4 DNA连接酶连接； SFokIB（pUC19）载体和1500bp左右的TN11b片段进行T4 DNA连接酶连接。以上连接物分别转化大肠杆菌DH5α,挑取大肠杆菌转化子的单菌落进行液体培养，分别抽提质粒并进行酶切鉴定，最终对阳性质粒中的插入片段进行全序列分析测定，获得靶向GBSSI基因的两个TALEN质粒,定名为SFokIA【TN11a】pUC19和SFokIB【TN11b】pUC19。
对SFokIA【TN11a】pUC19质粒进行EcoRI和HindIII双酶切，1% agarose电泳后，割胶并回收3510bp的SFokIA【TN11a】片段，与植物双元载体pcamBIA-1301进行T4 DNA ligase连接，连接物转化大肠杆菌DH5α,挑取大肠杆菌单菌落进行试管液体培养，抽提质粒进行EcoRI和HindIII双酶切鉴定，获得酶切鉴定正确的阳性克隆，将3个阳性质粒测序，最终获得靶向OsSbe3基因左侧靶位点TALEN的植物表达载体SFokIA[TN11a]1301。
对SFokIB【TN11b】pUC19质粒进行KpnI和HindIII双酶切，回收3487bp的SFokIB【TN11b】片段，与植物双元载体SFokIA【TN11a】1301进行T4 DNA ligase连接，连接物转化大肠杆菌DH5α,挑取大肠杆菌单菌落进行试管液体培养，抽提质粒进行KpnI和HindIII双酶切鉴定，获得酶切鉴定正确的阳性克隆，将3个阳性质粒测序，最终获得靶向OsSbe3基因TALEN的植物表达载体SFokIAB[TN11ab]。
实施例3：农杆菌培养和水稻转化
所用菌株为根癌农杆菌。质粒经电击法导人农杆菌中。挑取单菌到25 ml YEB培养基（50mg/l 利福平）培养过夜，取5 ml菌液转接到100 ml YEB培养基（50mg/l 利福平），培养至OD600 = 0.7-0.8，菌液冰上放置10分钟，5000 rpm离心10 min ，4℃，收集菌体，加入100ml 无菌双蒸水清洗两次。加入4 ml 10%甘油悬浮菌体，转到50 ml离心管。5500 rpm离心10min ，4℃。收集菌体，加入500 µl 10%甘油悬浮菌体，转到1.5 ml离心管。取70µl感受态细胞，加入1µl重组质粒SFokIAB[TN11ab]。用去头的黄枪头混匀，转到0.1cm 电击杯中。电击参数：200Ω，1.7 KV， 2.5F，电击后立即加入800µl SOC 培养液。培养1小时后，取100µl 涂抗性板筛选转化子，28℃培养。
N6培养基为基本培养基，去壳的种子，授粉后12-15天的幼胚，经表面消毒后接种到N6D2培养基中诱导愈伤组织（N6培养基，水解乳蛋白500mg/L，蔗糖30g/L,2,4-D 2mg/L,植物凝胶2.5g/L,pH5.8）；培养4-7天后取愈伤组织进行转化。农杆菌培养OD0.8-1.0后离心5000 g离心 8分钟，ddH2O清洗一次，等体积MS培养液悬浮侵染8分钟后，吸干放置在MS+NAA1 mg/L +BA 2 mg/L的培养基中，22度共培养3天。然后转入筛选培养基（加入头孢Cb(500ug/ml) 和潮霉素HAT(50ug/ml)，转化后的愈伤在含有和的抗性培养基上培养3-4代，转入分化培养基中（2 mg/L KT）；幼芽长至2 mm转移到生根培养基（1/2MS+0．5mg/L IBA）。以上培养基中分别加入500 mg/L酶水解乳蛋白(CH)，0-700 mg/L谷氨酰胺或精氨酸，蔗糖30-80 g/L，琼脂6 g，pH 5．8。继代周期为25 d。将淡黄色的胚性愈伤组织转入分化培养基中，30 d左右分化出芽。光照强度1 500-2 000lx，12-14 h/d。
将转基因水稻种植到田间，收取种子，种子用含潮霉素HAT（50ug/ml）的MS培养基筛选，筛选抗性水稻苗进行分子检测，提取叶片总DNA，参照《分子克隆》的方法，以潮霉素抗性基因HPT设计专有引物对转基因植株进行PCR检测，扩增条件为：94℃预热1 min；94℃,30 s, 60℃, 30 s, 72℃, 4 min。共25个循环。从分子水平上证明目的基因是否导入。
实施例4：稻米中抗性淀粉含量检测
抗性淀粉含量是参照Ｍegazyme公司（Wicklow,Ireland）提供的试剂盒略作改动进行测定。该方法测定的原理是在10mg米粉或淀粉中加入工作浓度1 mg/ml胰ａ-淀粉酶溶液２ml含淀粉葡萄糖苷酶（Amyloglucosidase，AMG）37℃震荡16小时，充分酶解可被酶解的淀粉。上清为可溶解淀粉，根据显色反应吸光值的测定将可溶解淀粉进行定量。并对16 h后不被酶解的白色沉淀抗性淀粉中加入2 M的KOH溶液，磁力搅拌20 min充分溶解，后加１.2M乙酸钠缓冲液（pH3.8），混匀后立即加入10µl AMG（3000u/ml），混匀后50℃水浴30 min酶解抗性淀粉；10000rpm离心10 min，吸取上清至新的２ml离心管中，按比例加入葡萄糖氧化酶／过氧化物酶（GOPOD）根据合成的玫红色化合物，在510 nm波长下测定其吸光值（其颜色深浅与糖的含量成正比，且在510 nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定）。
以不同的粳稻品种试验，淀粉中抗性淀粉含量均有大幅度的提高。亲本中的表观直链淀粉含量分别约为14-17%，不同转基因纯合系的表观直链淀粉含量均有一定提高；亲本米粉和淀粉中抗性淀粉含量分别约为化0.25-0.46,而转基因系的抗性淀粉含量都达到10.2-13.5%, 比亲本的高十几倍不等。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种利用转录激活因子样效应物核酸酶技术提高稻米抗性淀粉的方法
<130> 2019
<160> 78
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1500
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ggatccctca ctccagcaca ggtggttgcg atcgcatcca atatcggagg taagcaggcg 60
ttggagactg tgcagcgtct gttgccggtc ctttgtcagg atcatggcct gacgccagat 120
caggtagtcg caatcgcaag caacaatgga ggcaagcagg cccttgagac agtccagcgc 180
ttgttgcctg ttctatgcca ggatcacggc ctgactcctg accaagtggt cgccattgcg 240
tctcacgatg gtggtaaaca agcactggaa acggttcaaa gactcctccc agtgctgtgt 300
caagatcatg gtttgacacc tgaacaagtc gtagctatag cctctaacgg tggtgggaag 360
caagcgctgg aaaccgttca gagactcttg ccagtactat gtcaggatca tgggctaacc 420
cctgcccaag ttgtggccat tgcgtcgaac ggtggtggaa aacaagctct cgaaacggta 480
caacgtctcc ttcccgtctt gtgtcaagat cacggtttga ctccagcgca ggttgtcgca 540
atcgccagcc acgatggtgg caagcaggcg cttgagactg ttcagcgctt gctcccggtg 600
ctctgtcagg atcacgggct cacacctgat caagtggtgg caatcgcttc ccatgacggt 660
ggaaagcaag cactcgaaac tgttcagcgg cttttgcctg tactttgcca ggaccatggc 720
ctgactccag cacaagtcgt cgcaatcgca tcaaacattg gtggcaagca agcgttggaa 780
acggtgcaac ggctccttcc cgtcctatgt caagaccatg gtctgacacc agcgcaagtt 840
gtcgctatcg caagccacga tggcgggaag caagcacttg agactgtgca gagacttctg 900
ccggttctgt gtcaggacca tggactgact ccggatcagg tcgtggccat cgcttcgaat 960
ggcggtggta agcaggcact ggagacagtt cagcgtctgc tgccagttct gtgtcaagac 1020
catgggctga ccccggcgca ggttgttgca atagccagca acaatggcgg taaacaggcg 1080
ttggaaacgg ttcagcgtct cttgccagtc ctgtgtcaag accacggact tacgcctgct 1140
caggttgtgg caattgcgag taacaatggt gggaagcagg ctcttgagac ggtccagcgg 1200
ctcctgccag tactctgtca ggaccatggc ctaactccag atcaggtcgt cgccattgct 1260
tcgaacggtg gagggaagca ggcgctggag acagtgcagc gtcttctgcc tgtgctgtgc 1320
caggatcatg gcttaacacc ggaacaggtt gtggctatcg ccagcaacaa tggaggtaaa 1380
caggcattgg aaacagttca gcgcctgttg ccagtgctat gtcaggacca cgggcttaca 1440
ccagaacagg ttgtcgccat cgcgagtaac attggtggca aacaggcact tgaagagctc 1500
<210> 2
<211> 1500
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
ggatccctca ctccagcaca ggtggttgcg atcgcatcca atatcggagg taagcaggcg 60
ttggagactg tgcagcgtct gttgccggtc ctttgtcagg atcatggcct gacgccagat 120
caggtagtcg caatcgcaag caataatgga ggcaagcagg cccttgagac agtccagcgc 180
ttgttgcctg ttctatgcca ggatcacggc ctgactcctg accaagtggt cgccattgcg 240
tctaacatcg gtggtaaaca agcactggaa acggttcaaa gactcctccc agtgctgtgt 300
caagatcatg gtttgacacc tgaacaagtc gtagctatag cctccaacgg tggtgggaag 360
caagcgctgg aaaccgttca gagactcttg ccagtactat gtcaggatca tgggctaacc 420
cctgcccaag ttgtggccat tgcgtcgcac gatggtggaa aacaagctct cgaaacggta 480
caacgtctcc ttcccgtctt gtgtcaagat cacggtttga ctccagcgca ggttgtcgca 540
atcgccagca acggtggtgg caagcaggcg cttgagactg ttcagcgctt gctcccggtg 600
ctctgtcagg atcacgggct cacacctgat caagtggtgg caatcgcttc caacggtggt 660
ggaaagcaag cactcgaaac tgttcagcgg cttttgcctg tactttgcca ggaccatggc 720
ctgactccag cacaagtcgt cgcaatcgca tcacacgatg gtggcaagca agcgttggaa 780
acggtgcaac ggctccttcc cgtcctatgt caagaccatg gtctgacacc agcgcaagtt 840
gtcgctatcg caagcaacgg tggcgggaag caagcacttg agactgtgca gagacttctg 900
ccggttctgt gtcaggacca tggactgact ccggatcagg tcgtggccat cgcatcccac 960
gacggtggta agcaggcact ggagacagtt cagcgtctgc tgccagttct gtgtcaagac 1020
catgggctga ccccggcgca ggttgttgca atagccagca acattggcgg taaacaggcg 1080
ttggaaacgg ttcagcgtct cttgccagtc ctgtgtcaag accacggact tacgcctgct 1140
caggttgtgg caattgcgag tcacgatggt gggaagcagg ctcttgagac ggtccagcgg 1200
ctcctgccag tactctgtca ggaccatggc ctaactccag atcaggtcgt cgccattgct 1260
tcgcacgatg gagggaagca ggcgctggag acagtgcagc gtcttctgcc tgtgctgtgc 1320
caggatcatg gcttaacacc ggaacaggtt gtggctatcg ccagcaacaa cggaggtaaa 1380
caggcattgg aaacagttca gcgcctgttg ccagtgctat gtcaggacca cgggcttaca 1440
ccagaacagg ttgtcgccat cgcgagtaac aatggtggca aacaggcact tgaagagctc 1500
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
ggatccctca ctccagcaca ggtggttgcg atcgcatcca atatcggagg taagcaggcg 60
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
cctgacaaag gaccggcaac agacgctgca cagtctccaa cgcctgctta cctccgatat 60
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
gttgccggtc ctttgtcagg atcatggcct gacgccagat caggtagtcg caatcgcaag 60
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
gcgctggact gtctcaaggg cctgcttgcc tccattgttg cttgcgattg cgactacctg 60
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
cccttgagac agtccagcgc ttgttgcctg ttctatgcca ggatcacggc ctgactcctg 60
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
tgtttaccac catcgtgaga cgcaatggcg accacttggt caggagtcag gccgtgatcc 60
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
tctcacgatg gtggtaaaca agcactggaa acggttcaaa gactcctccc agtgctgtgt 60
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
ctatagctac gacttgttca ggtgtcaaac catgatcttg acacagcact gggaggagtc 60
<210> 11
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
tgaacaagtc gtagctatag cctctaacgg tggtgggaag caagcgctgg aaaccgttca 60
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
ggttagccca tgatcctgac atagtactgg caagagtctc tgaacggttt ccagcgcttg 60
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
gtcaggatca tgggctaacc cctgcccaag ttgtggccat tgcgtcgaac ggtggtggaa 60
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
aagacgggaa ggagacgttg taccgtttcg agagcttgtt ttccaccacc gttcgacgca 60
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
caacgtctcc ttcccgtctt gtgtcaagat cacggtttga ctccagcgca ggttgtcgca 60
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 16
cagtctcaag cgcctgcttg ccaccatcgt ggctggcgat tgcgacaacc tgcgctggag 60
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 17
caagcaggcg cttgagactg ttcagcgctt gctcccggtg ctctgtcagg atcacgggct 60
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 18
accgtcatgg gaagcgattg ccaccacttg atcaggtgtg agcccgtgat cctgacagag 60
<210> 19
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 19
caatcgcttc ccatgacggt ggaaagcaag cactcgaaac tgttcagcgg cttttgcctg 60
<210> 20
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 20
acgacttgtg ctggagtcag gccatggtcc tggcaaagta caggcaaaag ccgctgaaca 60
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 21
ctgactccag cacaagtcgt cgcaatcgca tcaaacattg gtggcaagca agcgttggaa 60
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 22
catggtcttg acataggacg ggaaggagcc gttgcaccgt ttccaacgct tgcttgccac 60
<210> 23
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 23
cgtcctatgt caagaccatg gtctgacacc agcgcaagtt gtcgctatcg caagccacga 60
<210> 24
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 24
cagaagtctc tgcacagtct caagtgcttg cttcccgcca tcgtggcttg cgatagcgac 60
<210> 25
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 25
agactgtgca gagacttctg ccggttctgt gtcaggacca tggactgact ccggatcagg 60
<210> 26
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 26
agtgcctgct taccaccgcc attcgaagcg atggccacga cctgatccgg agtcagtcca 60
<210> 27
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 27
ggcggtggta agcaggcact ggagacagtt cagcgtctgc tgccagttct gtgtcaagac 60
<210> 28
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 28
tgctggctat tgcaacaacc tgcgccgggg tcagcccatg gtcttgacac agaactggca 60
<210> 29
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 29
ggttgttgca atagccagca acaatggcgg taaacaggcg ttggaaacgg ttcagcgtct 60
<210> 30
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 30
agcaggcgta agtccgtggt cttgacacag gactggcaag agacgctgaa ccgtttccaa 60
<210> 31
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 31
accacggact tacgcctgct caggttgtgg caattgcgag taacaatggt gggaagcagg 60
<210> 32
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 32
tgacagagta ctggcaggag ccgctggacc gtctcaagag cctgcttccc accattgtta 60
<210> 33
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 33
ctcctgccag tactctgtca ggaccatggc ctaactccag atcaggtcgt cgccattgct 60
<210> 34
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 34
gctgcactgt ctccagcgcc tgcttccctc caccgttcga agcaatggcg acgacctgat 60
<210> 35
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 35
ggcgctggag acagtgcagc gtcttctgcc tgtgctgtgc caggatcatg gcttaacacc 60
<210> 36
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 36
tttacctcca ttgttgctgg cgatagccac aacctgttcc ggtgttaagc catgatcctg 60
<210> 37
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 37
ccagcaacaa tggaggtaaa caggcattgg aaacagttca gcgcctgttg ccagtgctat 60
<210> 38
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 38
atggcgacaa cctgttctgg tgtaagcccg tggtcctgac atagcactgg caacaggcgc 60
<210> 39
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 39
ccagaacagg ttgtcgccat cgcgagtaac attggtggca aacaggcact tgaagagctc 60
<210> 40
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 40
gagctcttca agtgcctgtt tgccaccaat gttactcgcg atggcgacaa cctgttctgg 60
<210> 41
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 41
ggatccctca ctccagcaca ggtggttgcg atcgcatcca atatcggagg taagcaggcg 60
<210> 42
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 42
cctgacaaag gaccggcaac agacgctgca cagtctccaa cgcctgctta cctccgatat 60
<210> 43
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 43
gttgccggtc ctttgtcagg atcatggcct gacgccagat caggtagtcg caatcgcaag 60
<210> 44
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 44
gcgctggact gtctcaaggg cctgcttgcc tccattattg cttgcgattg cgactacctg 60
<210> 45
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 45
cccttgagac agtccagcgc ttgttgcctg ttctatgcca ggatcacggc ctgactcctg 60
<210> 46
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 46
tgtttaccac cgatgttaga cgcaatggcg accacttggt caggagtcag gccgtgatcc 60
<210> 47
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 47
tctaacatcg gtggtaaaca agcactggaa acggttcaaa gactcctccc agtgctgtgt 60
<210> 48
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 48
ctatagctac gacttgttca ggtgtcaaac catgatcttg acacagcact gggaggagtc 60
<210> 49
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 49
tgaacaagtc gtagctatag cctccaacgg tggtgggaag caagcgctgg aaaccgttca 60
<210> 50
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 50
ggttagccca tgatcctgac atagtactgg caagagtctc tgaacggttt ccagcgcttg 60
<210> 51
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 51
gtcaggatca tgggctaacc cctgcccaag ttgtggccat tgcgtcgcac gatggtggaa 60
<210> 52
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 52
aagacgggaa ggagacgttg taccgtttcg agagcttgtt ttccaccatc gtgcgacgca 60
<210> 53
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 53
caacgtctcc ttcccgtctt gtgtcaagat cacggtttga ctccagcgca ggttgtcgca 60
<210> 54
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 54
cagtctcaag cgcctgcttg ccaccaccgt tgctggcgat tgcgacaacc tgcgctggag 60
<210> 55
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 55
caagcaggcg cttgagactg ttcagcgctt gctcccggtg ctctgtcagg atcacgggct 60
<210> 56
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 56
accaccgttg gaagcgattg ccaccacttg atcaggtgtg agcccgtgat cctgacagag 60
<210> 57
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 57
caatcgcttc caacggtggt ggaaagcaag cactcgaaac tgttcagcgg cttttgcctg 60
<210> 58
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 58
acgacttgtg ctggagtcag gccatggtcc tggcaaagta caggcaaaag ccgctgaaca 60
<210> 59
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 59
ctgactccag cacaagtcgt cgcaatcgca tcacacgatg gtggcaagca agcgttggaa 60
<210> 60
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 60
catggtcttg acataggacg ggaaggagcc gttgcaccgt ttccaacgct tgcttgccac 60
<210> 61
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 61
cgtcctatgt caagaccatg gtctgacacc agcgcaagtt gtcgctatcg caagcaacgg 60
<210> 62
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 62
cagaagtctc tgcacagtct caagtgcttg cttcccgcca ccgttgcttg cgatagcgac 60
<210> 63
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 63
agactgtgca gagacttctg ccggttctgt gtcaggacca tggactgact ccggatcagg 60
<210> 64
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 64
agtgcctgct taccaccgtc gtgggatgcg atggccacga cctgatccgg agtcagtcca 60
<210> 65
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 65
gacggtggta agcaggcact ggagacagtt cagcgtctgc tgccagttct gtgtcaagac 60
<210> 66
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 66
tgctggctat tgcaacaacc tgcgccgggg tcagcccatg gtcttgacac agaactggca 60
<210> 67
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 67
ggttgttgca atagccagca acattggcgg taaacaggcg ttggaaacgg ttcagcgtct 60
<210> 68
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 68
agcaggcgta agtccgtggt cttgacacag gactggcaag agacgctgaa ccgtttccaa 60
<210> 69
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 69
accacggact tacgcctgct caggttgtgg caattgcgag tcacgatggt gggaagcagg 60
<210> 70
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 70
tgacagagta ctggcaggag ccgctggacc gtctcaagag cctgcttccc accatcgtga 60
<210> 71
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 71
ctcctgccag tactctgtca ggaccatggc ctaactccag atcaggtcgt cgccattgct 60
<210> 72
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 72
gctgcactgt ctccagcgcc tgcttccctc catcgtgcga agcaatggcg acgacctgat 60
<210> 73
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 73
ggcgctggag acagtgcagc gtcttctgcc tgtgctgtgc caggatcatg gcttaacacc 60
<210> 74
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 74
tttacctccg ttgttgctgg cgatagccac aacctgttcc ggtgttaagc catgatcctg 60
<210> 75
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 75
ccagcaacaa cggaggtaaa caggcattgg aaacagttca gcgcctgttg ccagtgctat 60
<210> 76
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 76
atggcgacaa cctgttctgg tgtaagcccg tggtcctgac atagcactgg caacaggcgc 60
<210> 77
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 77
ccagaacagg ttgtcgccat cgcgagtaac aatggtggca aacaggcact tgaagagctc 60
<210> 78
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 78
gagctcttca agtgcctgtt tgccaccatt gttactcgcg atggcgacaa cctgttctgg 60

Claims (4)

1.用于定向剪切水稻淀粉分支酶Sbe3基因的两段核苷酸序列CCAGATGGACTCTAT和ACCGATATTCAAGAT。
2.根据权利要求1所示的核苷酸序列，合成的转录激活因子效应子识别模块编码基因（SEQ ID NO.1；SEQ ID NO.2所示）。
3.根据权利要求2所示的编码基因，构建的靶向水稻淀粉分支酶Sbe3基因的TALEN植物表达载体SFokIAB[TN11ab]。
4.根据权利要求3所示，构建的植物表达载体可以用于改变不同水稻品种的淀粉结构。
CN201910704836.2A 2019-08-01 2019-08-01 一种利用转录激活因子样效应物核酸酶技术提高稻米抗性淀粉的方法 Pending CN110699354A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910704836.2A CN110699354A (zh) 2019-08-01 2019-08-01 一种利用转录激活因子样效应物核酸酶技术提高稻米抗性淀粉的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910704836.2A CN110699354A (zh) 2019-08-01 2019-08-01 一种利用转录激活因子样效应物核酸酶技术提高稻米抗性淀粉的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110699354A true CN110699354A (zh) 2020-01-17

Family

ID=69193259

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910704836.2A Pending CN110699354A (zh) 2019-08-01 2019-08-01 一种利用转录激活因子样效应物核酸酶技术提高稻米抗性淀粉的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110699354A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103013954A (zh) * 2012-12-17 2013-04-03 中国科学院遗传与发育生物学研究所 水稻基因badh2的定点敲除系统及其应用
US20140087426A1 (en) * 2012-09-24 2014-03-27 The Chinese University Of Hong Kong Transcription activator-like effector nucleases (talens)
CN105367628A (zh) * 2014-08-19 2016-03-02 深圳华大基因科技有限公司 一对高效编辑水稻waxy基因的talen其识别打靶位点及其应用
CN106086028A (zh) * 2016-08-23 2016-11-09 中国农业科学院作物科学研究所 一种通过基因组编辑提高水稻抗性淀粉含量的方法及其专用sgRNA
CN107384946A (zh) * 2017-07-21 2017-11-24 上海市农业科学院 水稻淀粉分支酶sbe3基因的人工定点突变体及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140087426A1 (en) * 2012-09-24 2014-03-27 The Chinese University Of Hong Kong Transcription activator-like effector nucleases (talens)
CN103013954A (zh) * 2012-12-17 2013-04-03 中国科学院遗传与发育生物学研究所 水稻基因badh2的定点敲除系统及其应用
CN105367628A (zh) * 2014-08-19 2016-03-02 深圳华大基因科技有限公司 一对高效编辑水稻waxy基因的talen其识别打靶位点及其应用
CN106086028A (zh) * 2016-08-23 2016-11-09 中国农业科学院作物科学研究所 一种通过基因组编辑提高水稻抗性淀粉含量的方法及其专用sgRNA
CN107384946A (zh) * 2017-07-21 2017-11-24 上海市农业科学院 水稻淀粉分支酶sbe3基因的人工定点突变体及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11447785B2 (en) Method for base editing in plants
DE69836267T2 (de) Nukleinsäuren aus der artischocke (cynara scolymus), welche für ein enzym mit fruktosylpolymerase-aktivität kodieren
CN105985943B (zh) 一种利用非遗传物质对植物基因组进行定点改造的方法
CN108495932A (zh) 用于特异性转换靶向dna序列的核酸碱基的单子叶植物的基因组序列的转换方法、及其使用的分子复合体
JP4644777B2 (ja) 種子中のタンパク質含量が低減した植物ならびにその作出法および利用法
CN107746859B (zh) 靶向血红蛋白hbb突变基因的造血干细胞基因修饰方法
CN113621630B (zh) 3-酮脂酰-CoA硫解酶基因RkACAA1-1及其应用
JP3431177B2 (ja) 習性及び収量において変更されたトランスジェニック植物を作製するプラスミド
CN106164275A (zh) 蜈蚣草植酸酶核苷酸和氨基酸序列及使用方法
CN115315516A (zh) 一种提高植物遗传转化和基因编辑效率的方法
CN111363020A (zh) 茶树myc2转录因子及其应用
CN110066824B (zh) 一套用于水稻的碱基编辑人工系统
CN115011616A (zh) 一种乙醛脱氢酶基因rkaldh及其应用
CN116218896A (zh) 利用Cas12i在大豆中进行基因编辑的方法
AU2011273569B2 (en) Gene involved in the development of the seed
CN109456969B (zh) 水稻褐飞虱为害诱导型启动子及其应用
CN110699354A (zh) 一种利用转录激活因子样效应物核酸酶技术提高稻米抗性淀粉的方法
CN112824526A (zh) 一种水稻ACCase突变型蛋白及相应基因
CN110387371A (zh) 利用转录激活因子样效应物核酸酶技术培育软米的方法
CN103261419A (zh) 一种调控植物花粉育性的构建体及其使用方法
JP3513192B2 (ja) 新規なイネ澱粉枝つけ酵素遺伝子
CN113897372B (zh) OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用
CN114350685B (zh) 烟草NtTAC1基因在叶片夹角调控中的应用
CN110904067B (zh) 烟草绿原酸合成基因NtHQT及其应用
US20230227835A1 (en) Method for base editing in plants

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200117