CN110387371A

CN110387371A - 利用转录激活因子样效应物核酸酶技术培育软米的方法

Info

Publication number: CN110387371A
Application number: CN201910702339.9A
Authority: CN
Inventors: 彭日荷; 姚泉洪; 田永生; 高建杰; 许晶; 付晓燕; 李振军; 韩红娟; 王波; 王丽娟; 张福建; 黄悠楠; 张文慧
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-07-31
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2019-10-29

Abstract

本发明公开了一种利用转录激活因子样效应物核酸酶技术培育软米的方法。具体过程是：通过基因序列分析，从水稻淀粉合成酶GBSSI基因组DNA中筛选两段专一核苷酸序列，分别构建两段靶位点序列的转录激活因子效应子识别模块，并与FokI II核酸酶表达单元串联。获得靶向GBSSI基因TALEN的植物表达载体SFokIAB[TN12ab]，然后将表达载体通过农杆菌介导转化到水稻中。利用本发明，可以显著降低稻米中直链淀粉的含量，从而获得优质的软米。

Description

利用转录激活因子样效应物核酸酶技术培育软米的方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体地说利用转录激活因子样效应物核酸酶技术，定向剪切水稻淀粉合成酶GBSSI基因，培育出低直链淀粉含量的软米。

背景技术

淀粉最稻米中主要成分，由支链淀粉(70%-80%)和直链淀粉( 20%-30%) 组成。淀粉分子以淀粉颗粒的形式存在于大米中，其形状大多是不规则的多边形，稻米的淀粉粒直径在3-10μm 之间。高等植物淀粉的合成是在质体中进行的，淀粉的形成是通过高分子量的聚合体结晶而完成的，高分子量的聚合体包括无定形淀粉分子、蛋白质以及脂类物质。淀粉合成的整个过程主要由四大酶类协同完成，包括ADP(二磷酸腺苷)-葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶和淀粉去分支酶。

淀粉合成酶是以ADPG为葡萄糖供体，对葡萄糖聚合体通过糖基转移而催化α-1，4糖苷键延长作用的酶。根据水溶性的不同，淀粉合成酶分为淀粉粒结合淀粉合成酶(GBSS)和可溶性淀粉合成酶(SSS)，前者的功能是合成直链淀粉，而后者的功能则是合成支链淀粉。

颗粒结合淀粉合成酶由蜡质基因(Waxy，Wx) 编码，包裹于淀粉粒中。水稻GBSS由两个基因编码GBSSⅠ和GBSSⅡ(Denye, Plant Cell Environ,1995,18(9):1019-1026)。其中GBSS I只在储藏组织中表达，控制胚乳等贮藏器官中直链淀粉的合成；而GBSSⅡ在根、茎、叶等营养器官中表达，负责瞬时淀粉的合成 (Dial,Planta,2003, 218(2):261-268)。在水稻中,GBSSI由蜡质基因Wx编码,Wx位于第6染色体上,蛋白质大小为60kD 左右。Wx基因是影响稻米蒸煮与食味品质的最重要基因，通过编码淀粉粒结合淀粉合成酶(GBSSI)控制着稻米中直链淀粉的合成，直接影响水稻胚乳和花粉中直链淀粉的含量(AC)。非糯性基因(Wx)对糯性基因(wx) 表现为不完全显性，存在较为明显的剂量效应，Wx基因等位变异的挖掘和利用是解析水稻质量变异一个重要的方法，也是稻米品质改良的一个重要方面。大量研究表明,Wx 外显子和内含子的结构发生改变,都将影响其表达量和蛋白质功能，目前在栽培稻中已鉴定了7个Wx基因的复等位变异，包括Wxb、wx、Wxop、Wxin、Wxmq、Wxmp、Wxhp。Wxa、Wxb等位基因的第1内含子5’端剪切位点G/T突变，降低了Wx 基因转录后mRNA 的剪接效率(Blight, Plant Mol Biol,1998,38(3):407-415)，其中IR63、特青的基因型为Wxa，明恢63 的腊质基因型为Wxb；wx等位基因的第2外显子23bp碱基重复插入，导致终止密码子提前出现(Inukai, Genome,2000,43(4):589-596)；Wxop 和Wxhp 等位基因的第4外显子A/G突变，云南软米低直链淀粉含量由Wxhp 基因的遗传控制；Wxmq 等位基因的第4外显子G/A突变导致氨基酸由Asp 变为Gly(Mikami, Euphytica,1999,105(2):91-97; Liu, PlantMol Biol,2009,71(6)609-626)，第5外显子T/C突变，来自日本的软米含Wxmq，如品种关东大194 的直链淀粉含量较低(Sato, Breeding Sci,2002,52(2):131-135)，显示软米的特点；Wxin 等位基因的第6外显子A/C突变，其编码的氨基酸由Tyr 变为Ser(Larkin, MolBreeding,2003,12(4):335-339)，第10外显子的C/T 突变(Bergman．Cereal Chem ,2001,78(3):257-260)。这7个功能位点已被证实与稻米直链淀粉含量变化显著相关。这些等位变异是造成稻米品质差异的主要原因。

传统的植物育种方法通过诱变、筛选及自交来实现,时间长,随机性大,再加上突变不专一，为育种工作带来很多不利因素。基因编辑技术能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除和加入，能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。为育种工作带来了很多方便。其中转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs，transcription activator-like effector nucleases)技术以其能够高效率地进行定点基因组编辑，在基因研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力（Moscou，Science, 2009，326(5959): 1501）。TALENs借助于TAL效应子识别特异性DNA碱基对。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。由于TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列，TALENs技术广泛用于基因敲除、敲入或转录激活等靶向基因组编辑（Boch andBonas, Annu Rev Phytopathol, 2010,48: 419-436）。

本发明利用TALENs剪切水稻淀粉合成酶GBSSI基因，大幅降低了稻米中直链淀粉的含量，从而显示软米特性，具有软而不烂、甜润爽口、膨化性好、富有弹性、冷后不易变硬等优点。

发明内容

本发明为了降低稻米中直链淀粉的含量，利用TALENs技术，定向剪切水稻的淀粉合成酶GBSS1基因。

本发明通过水稻基因组的Blast分析，以保证靶位点在水稻基因组中的唯一性为原则。选择水稻GBSS1基因15bp的左侧靶位点AGCTTCCACTGGTGA和15bp的右侧靶位点AGATCTTCTCACCGG。

本发明利用基因合成方法（xiong 2004，核酸研究），按照NG识别碱基T，HD识别碱基C，NI识别碱基A，NN识别碱基G和A原则，构建由15个模块组成的DNA结合域TN12a和TN12b，每模块由34个氨基酸组成。

分别对GBSS1左右两侧靶位点识别模块TN12a和TN12b进行双酶切，与FokIA基因表达单元连接，构建SFokIA【TN12a】和SFokIA【TN12b】靶向序列，插入双酶切的植物双元载体pcamBIA-1301，最终获得靶向GBSSI基因TALEN的植物表达载体SFokIAB[TN12ab]1301。

本发明利用电击法将质粒导入根癌农杆菌中。农杆菌介导方法将SFokIAB[TN12ab]1301表达载体转化水稻中（Clough 1998，植物学杂志），通过检测，水稻中直链淀粉的含量为6-10%。

附图说明

图1水稻GBSSI基因TALEN的植物表达载体SFokIAB[TN12ab]1301构建图谱。

图2 水稻GBSSI基因剪切后淀粉粒的变化

图3 水稻GBSSI基因剪切后直链淀粉含量变化。

本发明有益效果

该发明能够定向剪切水稻淀粉合成酶GBSS1基因，使水稻中直链淀粉含量大幅降低，培育出软米。

具体实施方式

实施例1：识别水稻OsGBSSI基因左侧靶位点功能模块TN12a合成

以基因合成方法（Nucleic Acids Research, 2004, 32, e98）合成TN12a模块。设计的引物为：

TN12a -1 GGATCCCTCACTCCAGCACAGGTGGTTGCGATCGCA TCCA ATATCGGAGG TAAGCAGGCG（SEQ ID NO.3所示）

TN12a -2 CCTGACAAAGGACCGGCAACAGACGCTGCACAGTC T CCAA CGCCTGCTTA CCTCCGATAT（SEQ ID NO.4所示）

TN12a -3 GTTGCCGGTCCTTTGTCAGGATCATGGCCTGACGC CAGAT CAGGTAGTCG CAATCGCAAG（SEQ ID NO.5所示）

TN12a -4 GCGCTGGACTGTCTCAAGGGCCTGCTTGCCTCCAT TGTTG CTTGCGATTG CGACTACCTG（SEQ ID NO.6所示）

TN12a -5 CCCTTGAGACAGTCCAGCGCTTGTTGCCTGTTCTAT GCCA GGATCACGGC CTGACTCCTG（SEQ ID NO.7所示）

TN12a -6 TGTTTACCACCATCGTGAGACGCAATGGCGACCACT TGGTCAGGAGTCAG GCCGTGATCC（SEQ ID NO.8所示）

TN12a -7 TCTCACGATGGTGGTAAACAAGCACTGGAAACGGT TCAAA GACTCCTCCC AGTGCTGTGT（SEQ ID NO.9所示）

TN12a -8 CTATAGCTACGACTTGTTCAGGTGTCAAACCATGA TCTTG ACACAGCACT GGGAGGAGTC（SEQ ID NO.10所示）

TN12a -9 TGAACAAGTCGTAGCTATAGCCTCTAACGGTGGTG GGAAG CAAGCGCTGG AAACCGTTCA（SEQ ID NO.11所示）

TN12a -10 GGTTAGCCCATGATCCTGACATAGTACTGGCAAGAG TCTC TGAACGGTTT CCAGCGCTTG（SEQ ID NO.12所示）

TN12a -11 GTCAGGATCATGGGCTAACCCCTGCCCAAGTTGTGG CCAT TGCGTCGAACGGTGGTGGAA（SEQ ID NO.13所示）

TN12a -12 AAGACGGGAAGGAGACGTTGTACCGTTTCGAGAGCT TGTT TTCCACCACC GTTCGACGCA（SEQ ID NO.14所示）

TN12a -13 CAACGTCTCCTTCCCGTCTTGTGTCAAGATCACGGT TTGA CTCCAGCGCA GGTTGTCGCA（SEQ ID NO.15所示）

TN12a -14 CAGTCTCAAGCGCCTGCTTGCCACCATCGTGGCTGG CGATTGCGACAACC TGCGCTGGAG（SEQ ID NO.16所示）

TN12a -15 CAAGCAGGCGCTTGAGACTGTTCAGCGCTTGCTCCC GGTG CTCTGTCAGG ATCACGGGCT（SEQ ID NO.17所示）

TN12a -16 ACCGTCATGGGAAGCGATTGCCACCACTTGATCAGG TGTG AGCCCGTGAT CCTGACAGAG（SEQ ID NO.18所示）

TN12a -17 CAATCGCTTCCCATGACGGTGGAAAGCAAGCACTCG AAACTGTTCAGCGG CTTTTGCCTG（SEQ ID NO.19所示）

TN12a -18 ACGACTTGTGCTGGAGTCAGGCCATGGTCCTGGCAA AGTA CAGGCAAAAG CCGCTGAACA（SEQ ID NO.20所示）

TN12a -19 CTGACTCCAGCACAAGTCGTCGCAATCGCATCAAAC ATTG GTGGCAAGCA AGCGTTGGAA（SEQ ID NO.21所示）

TN12a -20CATGGTCTTGACATAGGACGGGAAGGAGCCGTTGCA CCGT TTCCAACGCT TGCTTGCCAC（SEQ ID NO.22所示）

TN12a -21 CGTCCTATGTCAAGACCATGGTCTGACACCAGCGCA AGTT GTCGCTATCG CAAGCCACGA（SEQ ID NO.23所示）

TN12a -22 CAGAAGTCTCTGCACAGTCTCAAGTGCTTGCTTCC CG CCATCGTGGCTTG CGATAGCGAC（SEQ ID NO.24所示）

TN12a -23 AGACTGTGCAGAGACTTCTGCCGGTTCTGTGTCAGG ACCA TGGACTGACT CCGGATCAGG（SEQ ID NO.25所示）

TN12a -24 AGTGCCTGCTTACCACCGCCATTCGAAGCGATGGC CACGA CCTGATCCGG AGTCAGTCCA（SEQ ID NO.26所示）

TN12a -25 GGCGGTGGTAAGCAGGCACTGGAGACAGTTCAGCG TCTGC TGCCAGTTCT GTGTCAAGAC（SEQ ID NO.27所示）

TN12a -26 TGCTGGCTATTGCAACAACCTGCGCCGGGGTCAGCC CATG GTCTTGACAC AGAACTGGCA（SEQ ID NO.28所示）

TN12a -27 GGTTGTTGCAATAGCCAGCAACAATGGCGGTAAACA GGCG TTGGAAACGG TTCAGCGTCT（SEQ ID NO.29所示）

TN12a -28 AGCAGGCGTAAGTCCGTGGTCTTGACACAGGACTGG CAAG AGACGCTGAA CCGTTTCCAA（SEQ ID NO.30所示）

TN12a -29 ACCACGGACTTACGCCTGCTCAGGTTGTGGCAATTG CGAG TAACAATGGT GGGAAGCAGG（SEQ ID NO.31所示）

TN12a -30 TGACAGAGTACTGGCAGGAGCCGCTGGACCGTCTCA AGAG CCTGCTTCCC ACCATTGTTA（SEQ ID NO.32所示）

TN12a -31 CTCCTGCCAGTACTCTGTCAGGACCATGGCCTAACT CCAG ATCAGGTCGT CGCCATTGCT（SEQ ID NO.33所示）

TN12a -32 GCTGCACTGTCTCCAGCGCCTGCTTCCCTCCACCGTT CGA AGCAATGGCGACGACCTGAT（SEQ ID NO.34所示）

TN12a -33 GGCGCTGGAGACAGTGCAGCGTCTTCTGCCTGTGCT GTGCCAGGATCATG GCTTAACACC（SEQ ID NO.35所示）

TN12a -34 TTTACCTCCATTGTTGCTGGCGATAGCCACAACCTG TTCC GGTGTTAAGC CATGATCCTG（SEQ ID NO.36所示）

TN12a -35 CCAGCAACAATGGAGGTAAACAGGCA TTGGAAACA G TTCA GCGCCTGTTGCCAGTGCTAT（SEQ ID NO.37所示）

TN12a -36 ATGGCGACAACCTGTTCTGGTGTAAGCCCGTGGTC CTGACATAGCACTGG CAACAGGCGC（SEQ ID NO.38所示）

TN12a -37 CCAGAACAGGTTGTCGCCATCGCGAGTAACATTGGT GGCA AACAGGCACT TGAAGAGCTC（SEQ ID NO.39所示）

TN12a -38 GAGCTCTTCAAGTGCCTGTTTGCCACCAATGTTACTC GCG ATGGCGACAA CCTGTTCTGG（SEQ ID NO.40所示）

利用PCR 合成识别水稻OsGBSSI基因左侧靶位点功能模块TN12a，在100µl反应体系中，TN12a-2- TN12a-37共36个引物的添加量为2ng，外侧引物TN12a-1和TN12a-38添加量为30ng，扩增条件为：94℃ 预热1 min；94℃, 30 s, 50℃, 30 s, 72℃, 2 min，使用的TaqDNA聚合酶为KOD FX taq酶（Toyobo公司，日本），共25个循环。PCR产物进行1% 琼脂糖胶回收，取10 µl 直接与平端克隆载体相连（大连宝生物公司）。4℃连接过夜，高效转化 DH5α感受态中，获得阳性克隆。

实施例2：识别水稻OsGBSSI基因右侧靶位点功能模块TN12b的合成

以基因合成方法（Nucleic Acids Research, 2004, 32, e98）TN12b。设计的引物为：

TN12b-1 GGATCCCTCACTCCAGCACAGGTGGTTGCGATCGCA TC CAATATCGGAGGTAAGCAGGCG（SEQ ID NO.41所示）

TN12b -2CCTGACAAAGGACCGGCAACAGACGCTGCACAGTCTC CAACGCCTGCTTACCTCCGATAT（SEQID NO.42所示）

TN12b-3 GTTGCCGGTCCTTTGTCAGGATCATGGCCTGACGCCA G ATCAGGTAGTCGCAATCGCAAG（SEQ ID NO.43所示）

TN12b-4 GCGCTGGACTGTCTCAAGGGCCTGCTTGCCTCCATTA TTGCTTGCGATTGCGACTACCTG（SEQ ID NO.44所示）

TN12b-5 CCCTTGAGACAGTCCAGCGCTTGTTGCCTGTTCTATGC CAGGATCACGGCCTGACTCCTG（SEQ ID NO.45所示）

TN12b-6 TGTTTACCACCGATGTTAGACGCAATGGCGACCACTT GGTCAGGAGTCAGGCCGTGATCC（SEQID NO.46所示）

TN12b-7TCTAACATCGGTGGTAAACAAGCACTGGAAACGGTTCAAAGACTCCTCCCAGTGCTGTGT（SEQID NO.47所示）

TN12b-8 CTATAGCTACGACTTGTTCAGGTGTCAAACCATGATC TTGACACAGCACTGGGAGGAGTC（SEQID NO.48所示）

TN12b-9 TGAACAAGTCGTAGCTATAGCCTCCAACGGTGGTGGG AAGCAAGCGCTGGAAACCGTTCA（SEQID NO.49所示）

TN12b-10 GGTTAGCCCATGATCCTGACATAGTACTGGCAAGAG TCTCTGAACGGTTTCCAGCGCTTG（SEQ ID NO.50所示）

TN12b-11 GTCAGGATCATGGGCTAACCCCTGCCCAAGTTGTGGC CATTGCGTCGCACGATGGTGGAA（SEQ ID NO.51所示）

TN12b-12 AAGACGGGAAGGAGACGTTGTACCGTTTCGAGAGCT TGTTTTCCACCATCGTGCGACGCA（SEQ ID NO.52所示）

TN12b-13 CAACGTCTCCTTCCCGTCTTGTGTCAAGATCACGGTT TGACTCCAGCGCAGGTTGTCGCA（SEQ ID NO.53所示）

TN12b-14 CAGTCTCAAGCGCCTGCTTGCCACCACCGTTGCTGGC GATTGCGACAACCTGCGCTGGAG（SEQ ID NO.54所示）

TN12b-15 CAAGCAGGCGCTTGAGACTGTTCAGCGCTTGCTCCC GGTGCTCTGTCAGGATCACGGGCT（SEQ ID NO.55所示）

TN12b-16 ACCACCGTTGGAAGCGATTGCCACCACTTGATCAG GTGTGAGCCCGTGATCCTGACAGAG（SEQ ID NO.56所示）

TN12b-17 CAATCGCTTCCAACGGTGGTGGAAAGCAAGCACTCG AAACTGTTCAGCGGCTTTTGCCTG（SEQ ID NO.57所示）

TN12b-18 ACGACTTGTGCTGGAGTCAGGCCATGGTCCTGGCAA AGTACAGGCAAAAGCCGCTGAACA（SEQ ID NO.58所示）

TN12b-19 CTGACTCCAGCACAAGTCGTCGCAATCGCATCACAC GATGGTGGCAAGCAAGCGTTGGAA（SEQ ID NO.59所示）

TN12b-20 CATGGTCTTGACATAGGACGGGAAGGAGCCGTTGC ACCGTTTCCAACGCTTGCTTGCCAC（SEQ ID NO.60所示）

TN12b-21 CGTCCTATGTCAAGACCATGGTCTGACACCAGCGCA AGTTGTCGCTATCGCAAGCAACGG（SEQ ID NO.61所示）

TN12b-22 CAGAAGTCTCTGCACAGTCTCAAGTGCTTGCTTCCC GCCACCGTTGCTTGCGATAGCGAC（SEQ ID NO.62所示）

TN12b-23 AGACTGTGCAGAGACTTCTGCCGGTTCTGTGTCAG GACCATGGACTGACTCCGGATCAGG（SEQ ID NO.63所示）

TN12b-24 AGTGCCTGCTTACCACCGTCGTGGGATGCGATGGCC ACGACCTGATCCGGAGTCAGTCCA（SEQ ID NO.64所示）

TN12b-25 GACGGTGGTAAGCAGGCACTGGAGACAGTTCAGCGT CTGCTGCCAGTTCTGTGTCAAGAC（SEQ ID NO.65所示）

TN12b-26 TGCTGGCTATTGCAACAACCTGCGCCGGGGTCAGC CCATGGTCTTGACACAGAACTGGCA（SEQ ID NO.66所示）

TN12b-27 GGTTGTTGCAATAGCCAGCAACATTGGCGGTAAACA GGCGTTGGAAACGGTTCAGCGTCT（SEQ ID NO.67所示）

TN12b-28 AGCAGGCGTAAGTCCGTGGTCTTGACACAGGACTGG CAAGAGACGCTGAACCGTTTCCAA（SEQ ID NO.68所示）

TN12b-29 ACCACGGACTTACGCCTGCTCAGGTTGTGGCAATTGC GAGTCACGATGGTGGGAAGCAGG（SEQ ID NO.69所示）

TN12b-30 TGACAGAGTACTGGCAGGAGCCGCTGGACCGTCTCA AGAGCCTGCTTCCCACCATCGTGA（SEQ ID NO.70所示）

TN12b-31 CTCCTGCCAGTACTCTGTCAGGACCATGGCCTAACT CCAGATCAGGTCGTCGCCATTGCT（SEQ ID NO.71所示）

TN12b-32 GCTGCACTGTCTCCAGCGCCTGCTTCCCTCCATCGTG CGAAGCAATGGCGACGACCTGAT（SEQ ID NO.72所示）

TN12b-33 GGCGCTGGAGACAGTGCAGCGTCTTCTGCCTGTGCT GTGCCAGGATCATGGCTTAACACC（SEQ ID NO.73所示）

TN12b-34 TTTACCTCCGTTGTTGCTGGCGATAGCCACAACCTGT TCCGGTGTTAAGCCATGATCCTG（SEQ ID NO.74所示）

TN12b-35 CCAGCAACAACGGAGGTAAACAGGCATTGGAAACA G TTCAGCGCCTGTTGCCAGTGCTAT（SEQ ID NO.75所示）

TN12b-36 ATGGCGACAACCTGTTCTGGTGTAAGCCCGTGGTCC TGACATAGCACTGGCAACAGGCGC（SEQ ID NO.76所示）

TN12b-37 CCAGAACAGGTTGTCGCCATCGCGAGTAACAATGG TGGCAAACAGGCACTTGAAGAGCTC（SEQ ID NO.77所示）

TN12b-38 GAGCTCTTCAAGTGCCTGTTTGCCACCATTGTTACTC GCGATGGCGACAACCTGTTCTGG（SEQ ID NO.78所示）

利用PCR合成TN12b模块，在100µl反应体系中，TN12b-2- TN12b-37共36个引物的添加量为2ng，外侧引物TN12b-1和TN12b-38添加量为30 ng，扩增条件为：94℃ 预热1 min；94℃, 30 s, 50℃, 30 s, 72℃, 2 min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶（Toyobo公司，日本），共25个循环。PCR产物进行1% 琼脂糖胶回收，取10 µl 直接与平端克隆载体相连（大连宝生物公司）。4℃连接过夜，高效转化 DH5α感受态中，获得阳性克隆。

实施例3：靶向GBSSI基因的TALEN植物表达载体构建

用BamHI和SacI分别对GBSSI基因左侧靶位点识别模块pUC19(TN12a)和右侧靶位点识别模块pUC19(TN12b)进行双酶切，酶切产物经Agarose电泳分离并割胶回收1500bp的片段。将SFokIA（pUC19）载体和TN12a片段进行T4 DNA连接酶连接； SFokIB（pUC19）载体和TN12b片段进行T4 DNA连接酶连接。以上连接物分别转化大肠杆菌DH5α,挑取大肠杆菌转化子的单菌落进行液体培养，分别抽提质粒并进行酶切鉴定，最终对阳性质粒中的插入片段进行全序列分析测定，获得靶向GBSSI基因的两个TALEN质粒,定名为SFokIA【TN12a】pUC19和SFokIB【TN12b】pUC19。

对SFokIA【TN12a】pUC19质粒进行EcoRI和HindIII双酶切，1% agarose电泳后，割胶并回收3510bp的SFokIA【TN12a】片段，与植物双元载体pcamBIA-1301进行T4 DNA ligase连接，连接物转化大肠杆菌DH5α,挑取大肠杆菌单菌落进行试管液体培养，抽提质粒进行EcoRI和HindIII双酶切鉴定，获得酶切鉴定正确的阳性克隆，将3个阳性质粒测序，最终获得靶向GBSSI基因左侧靶位点TALEN的植物表达载体SFokIA[TN12a]1301。

对SFokIB【TN12b】pUC19质粒进行KpnI和HindIII双酶切，回收3487bp的SFokIB【TN12b】片段，与植物双元载体SFokIA【TN12a】1301进行T4 DNA ligase连接，连接物转化大肠杆菌DH5α,挑取大肠杆菌单菌落进行试管液体培养，抽提质粒进行KpnI和HindIII双酶切鉴定，获得酶切鉴定正确的阳性克隆，将3个阳性质粒测序，最终获得靶向GBSSI基因TALEN的植物表达载体SFokIAB[TN12ab]。

实施例3：农杆菌培养和水稻转化

所用菌株为根癌农杆菌。质粒经电击法导人农杆菌中。挑取单菌到25 ml YEB培养基（50mg/l 利福平）培养过夜，取5 ml菌液转接到100 ml YEB培养基（50mg/l 利福平），培养至OD600 = 0.7-0.8，菌液冰上放置10分钟，5000 rpm离心10 min ，4℃，收集菌体，加入100ml 无菌双蒸水清洗两次。加入4 ml 10%甘油悬浮菌体，转到50 ml离心管。5500 rpm离心10min ，4℃。收集菌体，加入500 µl 10%甘油悬浮菌体，转到1.5 ml离心管。取70µl感受态细胞，加入1µl重组质粒SFokIAB[TN12ab]。用去头的黄枪头混匀，转到0.1cm 电击杯中。电击参数：200Ω，1.7 KV， 2.5F，电击后立即加入800µl SOC 培养液。培养1小时后，取100µl 涂抗性板筛选转化子，28℃培养。

N6培养基为基本培养基，去壳的种子，授粉后12-15天的幼胚，经表面消毒后接种到N6D2培养基中诱导愈伤组织（N6培养基，水解乳蛋白500mg/L，蔗糖30g/L,2,4-D 2mg/L,植物凝胶2.5g/L,pH5.8）；培养4-7天后取愈伤组织进行转化。农杆菌培养OD0.8-1.0后离心5000 g离心 8分钟，ddH2O清洗一次，等体积MS培养液悬浮侵染8分钟后，吸干放置在MS+NAA1 mg/L +BA 2 mg/L的培养基中，22度共培养3天。然后转入筛选培养基（加入头孢Cb(500ug/ml) 和潮霉素HAT(50ug/ml)，转化后的愈伤在含有和的抗性培养基上培养3-4代，转入分化培养基中（2 mg/L KT）；幼芽长至2 mm转移到生根培养基（1/2MS+0．5mg/L IBA）。以上培养基中分别加入500 mg/L酶水解乳蛋白(CH)，0-700 mg/L谷氨酰胺或精氨酸，蔗糖30-80 g/L，琼脂6 g，pH 5．8。继代周期为25 d。将淡黄色的胚性愈伤组织转入分化培养基中，30 d左右分化出芽。光照强度1 500-2 000lx，12-14 h/d。

将转基因水稻种植到田间，收取种子，种子用含潮霉素HAT（50ug/ml）的MS培养基筛选，筛选抗性水稻苗进行分子检测，提取叶片总DNA，参照《分子克隆》的方法，以潮霉素抗性基因HPT设计专有引物对转基因植株进行PCR检测，扩增条件为：94℃ 预热1 min；94℃,30 s, 60℃, 30 s, 72℃, 4 min。共25个循环。从分子水平上证明目的基因是否导入。

实施例4：稻米中直链淀粉含量检测

样品前处理: 取干净的EP管，准确称取10mg样品；加入100ul酒精，900ul NaOH溶液，涡旋混匀；沸水煮10min，待冷却后定容至10ml。待测。取干净的15ml离心管，加入0.5ml上清，0.1ml乙酸，加入0.2ml碘化钾溶液，定容至10ml，室温放置10min。720nm处测定吸光值。

标曲制作：准确称取5mg直链淀粉和支链淀粉标样，加入0.05ml酒精和0.45mlNaOH，沸水煮10min，冷却后定容至5ml。按如下比例混匀，取混样0.5ml加入离心管，按测定方法同样品一起测定。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 利用转录激活因子样效应物核酸酶技术培育软米的方法

<130> 2019

<160> 78

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1500

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ggatccctca ctccagcaca ggtggttgcg atcgcatcca atatcggagg taagcaggcg 60

ttggagactg tgcagcgtct gttgccggtc ctttgtcagg atcatggcct gacgccagat 120

caggtagtcg caatcgcaag caacaatgga ggcaagcagg cccttgagac agtccagcgc 180

ttgttgcctg ttctatgcca ggatcacggc ctgactcctg accaagtggt cgccattgcg 240

tctcacgatg gtggtaaaca agcactggaa acggttcaaa gactcctccc agtgctgtgt 300

caagatcatg gtttgacacc tgaacaagtc gtagctatag cctctaacgg tggtgggaag 360

caagcgctgg aaaccgttca gagactcttg ccagtactat gtcaggatca tgggctaacc 420

cctgcccaag ttgtggccat tgcgtcgaac ggtggtggaa aacaagctct cgaaacggta 480

caacgtctcc ttcccgtctt gtgtcaagat cacggtttga ctccagcgca ggttgtcgca 540

atcgccagcc acgatggtgg caagcaggcg cttgagactg ttcagcgctt gctcccggtg 600

ctctgtcagg atcacgggct cacacctgat caagtggtgg caatcgcttc ccatgacggt 660

ggaaagcaag cactcgaaac tgttcagcgg cttttgcctg tactttgcca ggaccatggc 720

ctgactccag cacaagtcgt cgcaatcgca tcaaacattg gtggcaagca agcgttggaa 780

acggtgcaac ggctccttcc cgtcctatgt caagaccatg gtctgacacc agcgcaagtt 840

gtcgctatcg caagccacga tggcgggaag caagcacttg agactgtgca gagacttctg 900

ccggttctgt gtcaggacca tggactgact ccggatcagg tcgtggccat cgcttcgaat 960

ggcggtggta agcaggcact ggagacagtt cagcgtctgc tgccagttct gtgtcaagac 1020

catgggctga ccccggcgca ggttgttgca atagccagca acaatggcgg taaacaggcg 1080

ttggaaacgg ttcagcgtct cttgccagtc ctgtgtcaag accacggact tacgcctgct 1140

caggttgtgg caattgcgag taacaatggt gggaagcagg ctcttgagac ggtccagcgg 1200

ctcctgccag tactctgtca ggaccatggc ctaactccag atcaggtcgt cgccattgct 1260

tcgaacggtg gagggaagca ggcgctggag acagtgcagc gtcttctgcc tgtgctgtgc 1320

caggatcatg gcttaacacc ggaacaggtt gtggctatcg ccagcaacaa tggaggtaaa 1380

caggcattgg aaacagttca gcgcctgttg ccagtgctat gtcaggacca cgggcttaca 1440

ccagaacagg ttgtcgccat cgcgagtaac attggtggca aacaggcact tgaagagctc 1500

<210> 2

<211> 1500

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

ggatccctca ctccagcaca ggtggttgcg atcgcatcca atatcggagg taagcaggcg 60

ttggagactg tgcagcgtct gttgccggtc ctttgtcagg atcatggcct gacgccagat 120

caggtagtcg caatcgcaag caataatgga ggcaagcagg cccttgagac agtccagcgc 180

ttgttgcctg ttctatgcca ggatcacggc ctgactcctg accaagtggt cgccattgcg 240

tctaacatcg gtggtaaaca agcactggaa acggttcaaa gactcctccc agtgctgtgt 300

caagatcatg gtttgacacc tgaacaagtc gtagctatag cctccaacgg tggtgggaag 360

caagcgctgg aaaccgttca gagactcttg ccagtactat gtcaggatca tgggctaacc 420

cctgcccaag ttgtggccat tgcgtcgcac gatggtggaa aacaagctct cgaaacggta 480

caacgtctcc ttcccgtctt gtgtcaagat cacggtttga ctccagcgca ggttgtcgca 540

atcgccagca acggtggtgg caagcaggcg cttgagactg ttcagcgctt gctcccggtg 600

ctctgtcagg atcacgggct cacacctgat caagtggtgg caatcgcttc caacggtggt 660

ggaaagcaag cactcgaaac tgttcagcgg cttttgcctg tactttgcca ggaccatggc 720

ctgactccag cacaagtcgt cgcaatcgca tcacacgatg gtggcaagca agcgttggaa 780

acggtgcaac ggctccttcc cgtcctatgt caagaccatg gtctgacacc agcgcaagtt 840

gtcgctatcg caagcaacgg tggcgggaag caagcacttg agactgtgca gagacttctg 900

ccggttctgt gtcaggacca tggactgact ccggatcagg tcgtggccat cgcatcccac 960

gacggtggta agcaggcact ggagacagtt cagcgtctgc tgccagttct gtgtcaagac 1020

catgggctga ccccggcgca ggttgttgca atagccagca acattggcgg taaacaggcg 1080

ttggaaacgg ttcagcgtct cttgccagtc ctgtgtcaag accacggact tacgcctgct 1140

caggttgtgg caattgcgag tcacgatggt gggaagcagg ctcttgagac ggtccagcgg 1200

ctcctgccag tactctgtca ggaccatggc ctaactccag atcaggtcgt cgccattgct 1260

tcgcacgatg gagggaagca ggcgctggag acagtgcagc gtcttctgcc tgtgctgtgc 1320

caggatcatg gcttaacacc ggaacaggtt gtggctatcg ccagcaacaa cggaggtaaa 1380

caggcattgg aaacagttca gcgcctgttg ccagtgctat gtcaggacca cgggcttaca 1440

ccagaacagg ttgtcgccat cgcgagtaac aatggtggca aacaggcact tgaagagctc 1500

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

ggatccctca ctccagcaca ggtggttgcg atcgcatcca atatcggagg taagcaggcg 60

<210> 4

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

cctgacaaag gaccggcaac agacgctgca cagtctccaa cgcctgctta cctccgatat 60

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

gttgccggtc ctttgtcagg atcatggcct gacgccagat caggtagtcg caatcgcaag 60

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

gcgctggact gtctcaaggg cctgcttgcc tccattgttg cttgcgattg cgactacctg 60

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

cccttgagac agtccagcgc ttgttgcctg ttctatgcca ggatcacggc ctgactcctg 60

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

tgtttaccac catcgtgaga cgcaatggcg accacttggt caggagtcag gccgtgatcc 60

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

tctcacgatg gtggtaaaca agcactggaa acggttcaaa gactcctccc agtgctgtgt 60

<210> 10

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

ctatagctac gacttgttca ggtgtcaaac catgatcttg acacagcact gggaggagtc 60

<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

tgaacaagtc gtagctatag cctctaacgg tggtgggaag caagcgctgg aaaccgttca 60

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

ggttagccca tgatcctgac atagtactgg caagagtctc tgaacggttt ccagcgcttg 60

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

gtcaggatca tgggctaacc cctgcccaag ttgtggccat tgcgtcgaac ggtggtggaa 60

<210> 14

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

aagacgggaa ggagacgttg taccgtttcg agagcttgtt ttccaccacc gttcgacgca 60

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

caacgtctcc ttcccgtctt gtgtcaagat cacggtttga ctccagcgca ggttgtcgca 60

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

cagtctcaag cgcctgcttg ccaccatcgt ggctggcgat tgcgacaacc tgcgctggag 60

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

caagcaggcg cttgagactg ttcagcgctt gctcccggtg ctctgtcagg atcacgggct 60

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

accgtcatgg gaagcgattg ccaccacttg atcaggtgtg agcccgtgat cctgacagag 60

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

caatcgcttc ccatgacggt ggaaagcaag cactcgaaac tgttcagcgg cttttgcctg 60

<210> 20

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 20

acgacttgtg ctggagtcag gccatggtcc tggcaaagta caggcaaaag ccgctgaaca 60

<210> 21

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 21

ctgactccag cacaagtcgt cgcaatcgca tcaaacattg gtggcaagca agcgttggaa 60

<210> 22

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 22

catggtcttg acataggacg ggaaggagcc gttgcaccgt ttccaacgct tgcttgccac 60

<210> 23

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

cgtcctatgt caagaccatg gtctgacacc agcgcaagtt gtcgctatcg caagccacga 60

<210> 24

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 24

cagaagtctc tgcacagtct caagtgcttg cttcccgcca tcgtggcttg cgatagcgac 60

<210> 25

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 25

agactgtgca gagacttctg ccggttctgt gtcaggacca tggactgact ccggatcagg 60

<210> 26

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 26

agtgcctgct taccaccgcc attcgaagcg atggccacga cctgatccgg agtcagtcca 60

<210> 27

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 27

ggcggtggta agcaggcact ggagacagtt cagcgtctgc tgccagttct gtgtcaagac 60

<210> 28

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 28

tgctggctat tgcaacaacc tgcgccgggg tcagcccatg gtcttgacac agaactggca 60

<210> 29

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 29

ggttgttgca atagccagca acaatggcgg taaacaggcg ttggaaacgg ttcagcgtct 60

<210> 30

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 30

agcaggcgta agtccgtggt cttgacacag gactggcaag agacgctgaa ccgtttccaa 60

<210> 31

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 31

accacggact tacgcctgct caggttgtgg caattgcgag taacaatggt gggaagcagg 60

<210> 32

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 32

tgacagagta ctggcaggag ccgctggacc gtctcaagag cctgcttccc accattgtta 60

<210> 33

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 33

ctcctgccag tactctgtca ggaccatggc ctaactccag atcaggtcgt cgccattgct 60

<210> 34

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 34

gctgcactgt ctccagcgcc tgcttccctc caccgttcga agcaatggcg acgacctgat 60

<210> 35

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 35

ggcgctggag acagtgcagc gtcttctgcc tgtgctgtgc caggatcatg gcttaacacc 60

<210> 36

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 36

tttacctcca ttgttgctgg cgatagccac aacctgttcc ggtgttaagc catgatcctg 60

<210> 37

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 37

ccagcaacaa tggaggtaaa caggcattgg aaacagttca gcgcctgttg ccagtgctat 60

<210> 38

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 38

atggcgacaa cctgttctgg tgtaagcccg tggtcctgac atagcactgg caacaggcgc 60

<210> 39

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 39

ccagaacagg ttgtcgccat cgcgagtaac attggtggca aacaggcact tgaagagctc 60

<210> 40

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 40

gagctcttca agtgcctgtt tgccaccaat gttactcgcg atggcgacaa cctgttctgg 60

<210> 41

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 41

ggatccctca ctccagcaca ggtggttgcg atcgcatcca atatcggagg taagcaggcg 60

<210> 42

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 42

cctgacaaag gaccggcaac agacgctgca cagtctccaa cgcctgctta cctccgatat 60

<210> 43

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 43

gttgccggtc ctttgtcagg atcatggcct gacgccagat caggtagtcg caatcgcaag 60

<210> 44

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 44

gcgctggact gtctcaaggg cctgcttgcc tccattattg cttgcgattg cgactacctg 60

<210> 45

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 45

cccttgagac agtccagcgc ttgttgcctg ttctatgcca ggatcacggc ctgactcctg 60

<210> 46

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 46

tgtttaccac cgatgttaga cgcaatggcg accacttggt caggagtcag gccgtgatcc 60

<210> 47

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 47

tctaacatcg gtggtaaaca agcactggaa acggttcaaa gactcctccc agtgctgtgt 60

<210> 48

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 48

ctatagctac gacttgttca ggtgtcaaac catgatcttg acacagcact gggaggagtc 60

<210> 49

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 49

tgaacaagtc gtagctatag cctccaacgg tggtgggaag caagcgctgg aaaccgttca 60

<210> 50

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 50

ggttagccca tgatcctgac atagtactgg caagagtctc tgaacggttt ccagcgcttg 60

<210> 51

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 51

gtcaggatca tgggctaacc cctgcccaag ttgtggccat tgcgtcgcac gatggtggaa 60

<210> 52

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 52

aagacgggaa ggagacgttg taccgtttcg agagcttgtt ttccaccatc gtgcgacgca 60

<210> 53

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 53

caacgtctcc ttcccgtctt gtgtcaagat cacggtttga ctccagcgca ggttgtcgca 60

<210> 54

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 54

cagtctcaag cgcctgcttg ccaccaccgt tgctggcgat tgcgacaacc tgcgctggag 60

<210> 55

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 55

caagcaggcg cttgagactg ttcagcgctt gctcccggtg ctctgtcagg atcacgggct 60

<210> 56

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 56

accaccgttg gaagcgattg ccaccacttg atcaggtgtg agcccgtgat cctgacagag 60

<210> 57

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 57

caatcgcttc caacggtggt ggaaagcaag cactcgaaac tgttcagcgg cttttgcctg 60

<210> 58

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 58

acgacttgtg ctggagtcag gccatggtcc tggcaaagta caggcaaaag ccgctgaaca 60

<210> 59

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 59

ctgactccag cacaagtcgt cgcaatcgca tcacacgatg gtggcaagca agcgttggaa 60

<210> 60

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 60

catggtcttg acataggacg ggaaggagcc gttgcaccgt ttccaacgct tgcttgccac 60

<210> 61

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 61

cgtcctatgt caagaccatg gtctgacacc agcgcaagtt gtcgctatcg caagcaacgg 60

<210> 62

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 62

cagaagtctc tgcacagtct caagtgcttg cttcccgcca ccgttgcttg cgatagcgac 60

<210> 63

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 63

agactgtgca gagacttctg ccggttctgt gtcaggacca tggactgact ccggatcagg 60

<210> 64

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 64

agtgcctgct taccaccgtc gtgggatgcg atggccacga cctgatccgg agtcagtcca 60

<210> 65

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 65

gacggtggta agcaggcact ggagacagtt cagcgtctgc tgccagttct gtgtcaagac 60

<210> 66

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 66

tgctggctat tgcaacaacc tgcgccgggg tcagcccatg gtcttgacac agaactggca 60

<210> 67

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 67

ggttgttgca atagccagca acattggcgg taaacaggcg ttggaaacgg ttcagcgtct 60

<210> 68

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 68

agcaggcgta agtccgtggt cttgacacag gactggcaag agacgctgaa ccgtttccaa 60

<210> 69

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 69

accacggact tacgcctgct caggttgtgg caattgcgag tcacgatggt gggaagcagg 60

<210> 70

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 70

tgacagagta ctggcaggag ccgctggacc gtctcaagag cctgcttccc accatcgtga 60

<210> 71

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 71

ctcctgccag tactctgtca ggaccatggc ctaactccag atcaggtcgt cgccattgct 60

<210> 72

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 72

gctgcactgt ctccagcgcc tgcttccctc catcgtgcga agcaatggcg acgacctgat 60

<210> 73

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 73

ggcgctggag acagtgcagc gtcttctgcc tgtgctgtgc caggatcatg gcttaacacc 60

<210> 74

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 74

tttacctccg ttgttgctgg cgatagccac aacctgttcc ggtgttaagc catgatcctg 60

<210> 75

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 75

ccagcaacaa cggaggtaaa caggcattgg aaacagttca gcgcctgttg ccagtgctat 60

<210> 76

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 76

atggcgacaa cctgttctgg tgtaagcccg tggtcctgac atagcactgg caacaggcgc 60

<210> 77

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 77

ccagaacagg ttgtcgccat cgcgagtaac aatggtggca aacaggcact tgaagagctc 60

<210> 78

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 78

gagctcttca agtgcctgtt tgccaccatt gttactcgcg atggcgacaa cctgttctgg 60

Claims

1.用于定向剪切水稻淀粉合成酶GBSSI基因的两段核苷酸序列AGCTTCCACTGGTGA和AGATCTTCTCACCGG。

2.根据权利要求1所示的核苷酸序列，合成的转录激活因子效应子识别模块编码基因（SEQ ID NO.1；SEQ ID NO.2所示）。

3.根据权利要求2所示的编码基因，构建的靶向GBSSI基因TALEN的植物表达载体SFokIAB[TN12ab]。

4.根据权利要求3所示的植物表达载体，可以转化所有水稻品种，用于降低稻米中直链淀粉的含量。