KR102110870B1 - 고구마 유래의 IbOr-R96H 변이체 및 이의 용도 - Google Patents

고구마 유래의 IbOr-R96H 변이체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 유래 Orange 단백질의 96번째 아미노산이 아르기닌에서 히스티딘으로 치환된 IbOr-R96H 변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 IbOr-R96H 변이체는 식물체의 카로티노이드 함량을 현저히 증진시킬 수 있으며, 고온 스트레스 저항성을 부여할 수 있다.

Description

고구마 유래의 IbOr-R96H 변이체 및 이의 용도{IbOr-R96H mutant from Ipomoea batatas and uses thereof}
본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 유래 Orange 단백질의 96번째 아미노산이 아르기닌(arginine)에서 히스티딘(histidine)으로 치환된 IbOr-R96H 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다.
고구마(Ipomoea batatas L. Lam)는 비교적 척박한 땅에서도 재배가 가능할 뿐만 아니라 헥타르당 생산량이 약 30톤으로 우수하여, 식량과 가축 사료로 이용되는 대표적인 뿌리작물이다. 자색, 황색 등의 유색 고구마들은 다양한 항산화 물질을 포함하고 있는데, 특히 황색을 띄는 황색 고구마는 베타카로틴을 14.7~20mg/100g 함유하며, 자색 고구마는 안토시아닌을 2.28g/100g 내외로 함유하고 있어, 세포의 노화를 촉진시키고 각종 성인병의 원인이 되는 활성산소를 제거하는 항산화 활성이 매우 탁월하다. 또한 고구마는 1990년대 이후 아그로박테리움(Agrobacterium) 공동배양을 통한 형질전환이 시도되었고, 정단 및 측아 분열조직으로부터 배발생 배양세포 유도 및 체세포 배발생을 통한 식물체 재분화 형질전환시스템을 발전시켜왔다.
카로티노이드(carotenoid)는 광합성계의 필수성분이면서 과일과 꽃의 휘발성 성분이고, 식물호르몬인 ABA의 전구물질이며, 프로비타민(provitamin) A의 전구체로서 식물 자체뿐만 아니라 인간을 비롯한 동물에게도 매우 유용한 물질로, 강력한 항산화 효능으로 영양소뿐 아니라 암, 심장질환, 눈 질환과 같은 의료산업적으로 널리 이용되는 중요한 물질이다.
한편, 한국등록특허 제1281071호에는 '고구마 유래의 IbOr-Ins 유전자 변이체 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1359308호에는 '카로티노이드 및 안토시아닌 고축적 형질전환 고구마 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체'가 개시되어 있으나, 본 발명의 고구마 유래의 IbOr-R96H 변이체 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 고구마 유래 Orange 단백질의 96번째 아미노산이 아르기닌에서 히스티딘으로 치환된 IbOr-R96H 변이체를 제조하고, 상기 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 고구마 세포를 형질전환시킨 결과, 비형질전환 고구마 배양세포, 야생형 IbOrange 유전자 및 IbOr-Ins 변이체 유전자로 형질전환된 고구마 배양세포보다 IbOr-R96H 변이체 유전자로 형질전환된 고구마 배양세포에서 총 카로티노이드의 함량, 특히 베타카로틴의 함량이 현저히 증가된 것을 확인하였으며, IbOr-R96H 변이체 유전자로 형질전환된 고구마 식물체가 비형질전환 고구마 식물체 및 야생형 IbOrange 유전자로 형질전환된 고구마 식물체에 비해 고온 스트레스에 대한 저항성이 우수함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 유래 Orange 단백질의 96번째 아미노산이 아르기닌(arginine, R)에서 히스티딘(histidine, H)으로 치환된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 IbOr-R96H 변이체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜, IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 카로티노이드 함량이 증가되고 고온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 카로티노이드 함량이 증가되고 고온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜, IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 카로티노이드 함량 및 고온 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 카로티노이드 함량 및 고온 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 IbOr-R96H 변이체로 형질전환된 식물체는 기능성 물질인 카로티노이드가 고축적될 수 있으므로, 기능성 식품, 화장품, 사료 등의 소재로 다양하게 활용될 수 있을 것이며, IbOr-R96H 변이체를 활용하여 카로티노이드가 증진된 고품질의 식물체를 개발할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명에 따른 IbOr-R96H 변이체로 형질전환된 식물체는 일반 식물체가 성장하기 어려운 고온 지역에서도 재배가 가능할 것이다.
도 1은 IbOrange 단백질의 96번째 아미노산이 아르기닌(R)에서 히스티딘(H)으로 변형된 IbOr-R96H 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터의 모식도이다.
도 2는 비형질전환 고구마 배양세포(YM)와 야생형 IbOrange 유전자(IbOr-wt) 및 IbOrange 유전자 변이체(IbOr-Ins 및 IbOr-R96H)로 각각 형질전환된 고구마 배양세포의 표현형을 확인한 사진이다.
도 3은 IbOrWT 또는 IbOrR96H 과발현 형질전환 고구마 식물체 제작과정을 보여주는 것으로, (a)는 벡터 맵, (b)는 형질전환 식물체에서 추출한 게노믹 DNA를 이용한 PCR 결과, (c)는 각 형질전환 식물체에서 정량적(quantitative) real-time PCR을 이용한 유전자 발현 수준을 분석한 결과이다.
도 4는 IbOrWT 또는 IbOrR96H 과발현 형질전환 고구마 식물체의 leaf disc를 이용한 고온 스트레스(47℃) 내성실험 결과로, (a)는 DAB 염색 표현형이고, (b)는 각각의 leaf disc에서 이온 누출(ion leakage)을 측정한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 유래 Orange 단백질의 96번째 아미노산이 아르기닌(arginine, R)에서 히스티딘(histidine, H)으로 치환된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 IbOr-R96H 변이체를 제공한다.
본 발명에 따른 IbOr-R96H 변이체는 형질전환된 식물체에서 과발현될 때, 식물체의 총 카로티노이드 함량 및 고온 스트레스 저항성을 현저히 증가시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명에 따른 IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자의 범위는 야생형 IbOr 단백질의 96번째 아미노산이 히스티딘으로 치환될 수 있도록, 아르기닌의 코딩 염기가 히스티딘의 코딩 염기(CAT 또는 CAC)로 치환된 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-DNA 영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0116718 B1 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0120516 B1 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 포스피노트리신(phosphinothricin) 및 글루포시네이트(glufosinate)와 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
"프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 식물 발현 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜, IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 카로티노이드 함량이 증가되고 고온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 IbOr-R96H 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 "유전자 과발현"이란 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 상기 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다. 식물체 내로 상기 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 상기 유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 방법이 있다. 상기에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법 (Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8:363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3:1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway et al.,1986, Mol. Gen. Genet. 202:179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법 (Klein et al.,1987, Nature 327:70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0301316 B1) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EPA 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 바이너리 벡터 기술을 이용하는 것이다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 카로티노이드 함량이 증가되고 고온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
본 발명의 형질전환 식물체는 비형질전환 식물체 대비 총 카로티노이드 함량이 약 34배 증가되었으며, 특히 베타카로틴의 함량은 약 300배 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 형질전환 식물체는 비형질전환 식물체 및 야생형 IbOr를 코딩하는 유전자로 형질전환된 식물체에 비해 고온 스트레스에서 저항성이 우수한 것일 수 있다. 상기 고온은 40~55℃일 수 있고, 바람직하게는 45~49℃일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 47℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 상기 카로티노이드 함량이 증가되고 고온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체는 메꽃과(Convolvulaceae), 콩과(Leguminosae), 두릅나무과(Araliaceae) 등의 쌍자엽 식물체 또는 벼과(Gramineae) 등의 단자엽 식물체일 수 있고, 바람직하게는 메꽃과의 쌍자엽 식물체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 고구마일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜, IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 카로티노이드 함량 및 고온 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 IbOr-R96H 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, IbOr-R96H 변이체가 식물체에서 과발현되면 베타카로틴 등을 포함하는 식물체의 총 카로티노이드 함량이 증진되고, 식물체의 고온 스트레스 저항성이 증진된다.
본 발명은 또한, 상기 IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 카로티노이드 함량 및 고온 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 고구마 유래 Orange 단백질의 96번째 아미노산이 아르기닌(R)에서 히스티딘(H)으로 치환된 IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 변이체를 코딩하는 유전자를 식물세포에 형질전환함으로써 식물체의 카로티노이드 함량 및 고온 스트레스 저항성을 증진시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. IbOr-R96H 변이체 유전자의 클로닝 및 염기서열 분석
IbOr-R96H 변이체 유전자의 클로닝은 PCR-매개된 자리지정 돌연변이 유발 방법을 기초로 하여 QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis 키트(Agilent, 미국)를 사용하여 수행하였으며, pDONR207 벡터에 클로닝된 IbOr 야생형(WT) cDNA를 주형으로 정방향 프라이머(5'-GAAATTCAAGACAATATTCGGAGTCACCGGAATAAAATATTTTTGCA-3', 서열번호 3) 및 역방향 프라이머(5'-TGCAAAAATATTTTATTCCGGTGACTCCGAATATTGTCTTGAATTTC-3', 서열번호 4)를 사용하였다. PCR 산물의 서열분석을 통해 IbOr 야생형의 96번째 아미노산인 아르기닌이 히스티딘으로 치환되어 있는 것을 확인하였고, 이를 IbOr-R96H 변이체로 명명하였다.
실시예 2. IbOr-R96H 변이체 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제조 및 상기 벡터를 이용하여 IbOr-R96H 변이체를 과발현하는 형질전환체의 개발
IbOr-R96H 변이체 유전자를 과발현하는 형질전환체를 제조하기 위하여 Invitrogen의 gateway 발현 시스템을 이용하여 pDONR207와 식물발현 벡터인 pGWB5 벡터와 LR 반응으로 클로닝한 IbOr-R96H 변이체 유전자의 재조합 벡터를 제작하였다. 재조합 벡터는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 균주를 이용해 흰색(미색) 과육의 고구마인 율미(Yulmi) 배양세포에 형질전환하였다. 형질전환된 배양세포는 하이그로마이신이 포함된 MS(Murashige and Skoog) 배지에서 선별되었다. 형질전환한 배양세포를 대상으로 바이오펙트사의 HiGeneTM Genomic DNA 추출 키트(식물용)를 이용하여 게노믹 DNA를 추출한 후 형질전환체 선발마커인 하이그로마이신 유전자 HPT(hygromycin phosphotransferase)의 발현을 PCR로 분석하였다.
실시예 3. IbOr-R96H 재조합 벡터로 형질전환된 고구마 배양세포에서의 카로티노이드 함량 분석
IbOr-R96H 변이체 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 고구마 배양세포의 표현형을 관찰한 결과, 비형질전환 고구마 배양세포의 경우 미색을 띄는데 반해, 야생형 IbOr 유전자로 형질전환된 고구마 배양세포는 노란색을 띄었으며, 기존에 발표(한국등록특허 제1281071호)된 IbOr-Ins 변이체로 형질전환된 고구마 배양세포의 경우 진한 노란색을 나타내었고, 본 발명의 IbOr-R96H 변이체로 형질전환된 고구마 배양세포는 주황색에 가까운 색깔을 가지고 있음이 육안으로 확인되었다(도 2).
또한, 각각의 형질전환 고구마 배양세포의 카로티노이드 함량을 HPLC(High-performance liquid chromatography) 분석을 통해 정량하였다(표 1). 그 결과 IbOr-R96H 변이체로 형질전환된 고구마 배양세포는 비형질전환 고구마 배양세포보다 총 카로티노이드 함량이 약 24배 이상 증가하였다. 특히, 베타카로틴의 경우 IbOr-R96H 변이체로 형질전환된 고구마 배양세포에서 비형질전환 고구마 배양세포보다 약 88배 이상 그 함량이 증가된 것이 확인되었다. 또한, 야생형 IbOr(IbOr-WT)로 형질전환된 고구마 배양세포에 비해 IbOr-R96H 변이체로 형질전환된 고구마 배양세포는 총 카로티노이드 함량이 13배 이상 증가되었고, 베타카로틴의 경우도 39배 이상 증가된 것으로 확인되어, 본 발명의 IbOr-R96H 변이체가 식물체의 카로티노이드 함량 증진 효과가 매우 우수함을 알 수 있었다.
Figure 112018126396718-pat00001
실시예 4. IbOr-R96H 과발현 형질전환 고구마 식물체의 제작
고구마의 품종 중 Xushu 29 (중국의 북쪽지방에서 많이 재배되는 품종 중 하나)를 이용하여 야생형 IbOr 유전자(IbOrWT) 또는 IbOr-R96H 변이체 유전자(IbOrR96H)를 과발현하는 형질전환 고구마 식물체를 제작하였다. 상기 IbOrWT 또는 IbOrR96H 각각을 35S 프로모터와 C-말단 FLAG 태그를 가지고 있는 pGWB11 벡터에 클로닝하여 벡터를 제작하였다(도 3a). 고구마 형질전환 실험은 재조합 벡터를 함유하는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumerfaciens) EHA105 균주를 고구마 배발생 캘러스와 3일간 공동배양한 후, MS 기본배지로 세척하여 선발배지에서 배양하고 3주 간격으로 계대배양 한 후 살아남은 배발생 캘러스에서 지상부와 뿌리를 유도하여 소식물체로 재분화 시킴으로서 형질전환 고구마 식물체를 제조하였다. 하루 16시간 광조건의 25℃ 생장실에서 3주간 키운 형질전환 고구마 식물체의 3번째 또는 4번째 잎을 샘플링하여 게노믹 DNA를 추출하였고, 정방향 (5'-CGCACAATCCCACTATCCTT-3', 서열번호 5) 및 역방향 (5'-TTCCCAAGCTCAGCATTCTT-3', 서열번호 6) 프라이머 세트를 제작하여 게노믹 DNA PCR을 수행하였다. PCR 조건은 초기 변성 94℃ 5분에 이어서, 변성, 어닐링, 신장 과정을 30회 반복 하였고, 변성은 94℃ 30초, 어닐링은 58℃ 30초, 신장은 72℃ 60초로 하였다. 그리고 최종 신장은 72℃ 5분으로 수행하였다. 상기 결과를 통해 게노믹 DNA에서 IbOrWT 또는 IbOrR96H가 확인된 형질전환 식물체를 10라인씩 확보하였다(도 3b).
앞서 동일하게 샘플링한 잎에서 RibospinTM Plant 키트 (GeneAll, Korea)를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. RNase-free DNase I (GeneAll)을 처리하여 게노믹 DNA 오염을 제거하였고, 1,000 ㎍의 총 RNA로 TOPscriptTM RT DryMIX (dT18) (Enzynomics, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. PCR 조건은 최초 42℃ 5분, 이어서 50℃ 60분, 95℃ 5분으로 수행하였다. 유전자 발현 비교를 위한 정량적 실시간(quantitative real-time) PCR의 프라이머는 정방향 (5'-GCACTGGATCACTAGTCCTT-3', 서열번호 7) 및 역방향 (5'-GTCAATTCGTGGGTCATGCT-3', 서열번호 8)로 제작하였다. 정량적 실시간 PCR은 96-웰 플레이트를 이용하여 CFX real-time PCR system (Bio-Rad, USA)으로 수행하였다. 각 반응 (최종 20 ㎕)은 2 ㎕의 희석된 cDNA와 10 ㎕의 EvaGreen PCR Master Mix (Solgent, Korea), 그리고 프라이머들을 각 1 ㎕씩 첨가하여 수행하였다. PCR 조건은 최초 95℃ 15분, 이어서 95℃ 20초, 60℃ 40초, 72℃ 20초로 하여 40회 반복하였다. 분석 결과, IbOr WT 또는 IbOr R96H 의 유전자발현이 높은 3 라인을 선발하였다(도 3c).
실시예 5. IbOr-R96H 과발현 형질전환 고구마 식물체의 환경 스트레스 내성 평가
이전의 연구에서 IbOr 과발현 형질전환 고구마 식물체 (cv. Sinzami)는 비형질전환 고구마 식물체에 비해 고온 스트레스 조건에서 저항성이 있다는 것을 확인하였었다. 본 발명자는 이전 연구 결과를 바탕으로 IbOr R96H 과발현 형질전환 고구마 식물체와 IbOr WT 과발현 형질전환 고구마 식물체의 고온 스트레스에 대한 저항성을 비교·분석하였다. IbOr WT 또는 IbOr R96H 과발현 형질전환 고구마 식물체를 흙에서 증식하여 25℃, 하루 16시간 광조건의 생장실에서 4주간 생장시킨 후 식물체의(위로부터 3, 4번째) 잎을 잘라 leaf disc를 제작하였다. 5개의 leaf discs를 1반복으로 하여 총 3반복 진행하였다. 먼저, leaf discs를 고온 (47℃)에서 12시간 놓아둔 뒤 DAB (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride) 염색과 이온 누출(ion leakage) 측정을 실시하였다. 스트레스를 받아 세포사멸이 유도될 때 나오는 활성산소 발생 정도를 관찰하기 위해 DAB 염색을 진행하였고, 스트레스에 의한 세포의 이온소실은 이온 전도율계(ion conductivity meter)를 이용하여 0~12시간 동안 6시간 단위로 측정하였고, 각 측정값들은 12시간 이후 시료를 80℃에서 2시간 동안 처리하여 세포를 완전 파괴시켜 측정한 이온의 소실 값을 100%로 하여 계산하였다. 그 결과, 비형질전환 고구마 식물체(NT)보다 IbOr 과발현 형질전환 식물체들의 leaf discs가 손상을 덜 받는 것으로 확인되어 고온에 저항성이 있음을 알 수 있었고, 특히, IbOr WT 과발현 형질전환 고구마보다 IbOr R96H 과발현 형질전환 고구마 식물체가 더 강한 고온 저항성을 보이는 것을 알 수 있었다(도 4).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> IbOr-R96H mutant from Ipomoea batatas and uses thereof <130> PN18529 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 313 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IbOr-R96H <400> 1 Met Val Tyr Ser Gly Arg Ile Leu Ser Leu Ser Ser Ser Thr Thr Pro 1 5 10 15 Phe His Leu Ser Thr Ser Pro Phe His Ser Ser Arg Tyr His Leu His 20 25 30 Gly Arg Leu Lys Ser Arg Val Arg Leu Arg Pro Met Ala Ala Asp Ala 35 40 45 Asp Ser Ser Ser Phe Ser Ser Ser Val Asp Thr Glu Ala Pro Asp Lys 50 55 60 Asn Ala Ala Gly Phe Cys Ile Ile Glu Gly Pro Glu Thr Val Gln Asp 65 70 75 80 Phe Ala Gln Met Glu Leu Lys Glu Ile Gln Asp Asn Ile Arg Ser His 85 90 95 Arg Asn Lys Ile Phe Leu His Met Glu Glu Val Arg Arg Leu Arg Ile 100 105 110 Gln Gln Arg Ile Lys Asn Ala Glu Leu Gly Asn Leu Asn Glu Lys Gln 115 120 125 Glu Asn Lys Leu Pro Asn Phe Pro Ser Phe Ile Pro Phe Leu Pro Pro 130 135 140 Leu Thr Ser Ala Asn Leu Lys Gln Tyr Tyr Ala Thr Cys Phe Ser Leu 145 150 155 160 Ile Ala Gly Val Met Leu Phe Gly Gly Leu Leu Ala Pro Thr Leu Glu 165 170 175 Leu Lys Leu Gly Leu Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Phe Ile Arg Ser 180 185 190 Met His Leu Pro Met Gln Leu Ser Asp Val Asp Pro Ile Val Ala Ser 195 200 205 Phe Ser Gly Gly Ala Val Gly Val Ile Ser Ala Leu Met Val Val Glu 210 215 220 Ile Asn Asn Val Lys Gln Gln Glu His Lys Arg Cys Lys Tyr Cys Leu 225 230 235 240 Gly Thr Gly Tyr Leu Ala Cys Ala Arg Cys Ser Ser Thr Gly Ser Leu 245 250 255 Val Leu Ile Glu Pro Val Ser Thr Val Asn Arg Gly Asp Gln Pro Leu 260 265 270 Ser Pro Pro Lys Thr Glu Arg Cys Thr Asn Cys Ser Gly Ser Gly Lys 275 280 285 Val Met Cys Pro Thr Cys Leu Cys Thr Gly Met Ala Met Ala Ser Glu 290 295 300 His Asp Pro Arg Ile Asp Pro Phe Asp 305 310 <210> 2 <211> 942 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IbOr-R96H <400> 2 atggtatatt caggtagaat cttgtcgctc tcgtcctcca cgacgccgtt tcatctctcc 60 acttcgccgt tccacagttc ccggtatcat ctccatggaa ggctcaaatc cagagtcaga 120 ttgcgtccta tggccgccga tgccgattcc tcctcctttt cttcatccgt cgacaccgaa 180 gcacccgata aaaacgcagc cgggttttgt attatagaag ggcctgagac agtgcaggac 240 tttgctcaaa tggaattgaa agaaattcaa gacaatattc ggagtcaccg gaataaaata 300 tttttgcata tggaagaggt tcgtaggctg agaatacagc aacgaattaa gaatgctgag 360 cttgggaatc ttaatgaaaa gcaagaaaat aaacttccga attttccttc gttcattcct 420 tttttgcctc ctctgacatc cgcaaatctt aaacaatatt atgccacttg tttctctctc 480 atagccggag ttatgctttt tggcggactg ctagcaccta ctttggaact aaaattgggc 540 ttaggaggta catcgtacgc tgatttcatt cgcagcatgc accttccgat gcaattaagt 600 gatgtggacc ccattgtggc gtccttctcc ggtggagcag tcggggtaat ctctgccttg 660 atggtagttg aaataaacaa tgtgaaacag caggagcata agaggtgcaa gtactgttta 720 ggaacagggt atcttgcatg tgctcgctgt tcaagcactg gatcactagt ccttatcgaa 780 cctgtctcca cagttaatcg tggagatcag ccactatcac cacctaaaac agaaagatgc 840 acaaactgct cgggttcagg gaaggtcatg tgccctacat gtctttgtac tgggatggct 900 atggcaagcg agcatgaccc acgaattgac ccatttgatt aa 942 <210> 3 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gaaattcaag acaatattcg gagtcaccgg aataaaatat ttttgca 47 <210> 4 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgcaaaaata ttttattccg gtgactccga atattgtctt gaatttc 47 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgcacaatcc cactatcctt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ttcccaagct cagcattctt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gcactggatc actagtcctt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gtcaattcgt gggtcatgct 20

Claims (8)

  1. 고구마(Ipomoea batatas) 유래 Orange 단백질의 96번째 아미노산이 아르기닌(arginine, R)에서 히스티딘(histidine, H)으로 치환된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 IbOr-R96H 변이체.
  2. 제1항의 IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자.
  3. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  4. 제3항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜, IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 카로티노이드 함량이 증가되고 고온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법.
  5. 제4항의 방법에 의해 제조된 카로티노이드 함량이 증가되고 고온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.
  6. 제5항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
  7. 제3항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜, IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 카로티노이드 함량 및 고온 스트레스 저항성 증진 방법.
  8. 제2항의 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 카로티노이드 함량 및 고온 스트레스 저항성 증진용 조성물.
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