WO2019124899A1 - 고구마 유래의 ＩｂＯｒ-Ｒ96Ｈ 변이체 및 이의 용도 - Google Patents

고구마 유래의 ＩｂＯｒ-Ｒ96Ｈ 변이체 및 이의 용도 Download PDF

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WO2019124899A1
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plant
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mutant
sweet potato
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곽상수
김호수
김소은
이찬주
지창윤
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한국생명공학연구원
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    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis

Definitions

  • the present invention relates to an IbOr-R96H mutant in which the 96th amino acid of orange protein derived from sweet potato ( Ipomoea batatas ) is replaced by histidine in arginine and its use.
  • Sweet potatoes ( Ipomoea batatas L. Lam) are not only cultivated on relatively unfavorable grounds but also produce about 30 tons per hectare, which is a representative root crop for food and livestock feed.
  • Purple sweet potatoes contain various antioxidants. Yellow sweet potatoes contain beta carotene in an amount of 14.7 to 20 mg / 100 g. Purple sweet potatoes contain anthocyanin in an amount of 2.28 g / 100 g or so, And the antioxidant activity of removing active oxygen which causes various adult diseases is very excellent.
  • Sweet potatoes also have developed since the 1990s Agrobacterium (Agrobacterium) co-culturing the regenerated transgenic plants transformed this system was attempting conversion, through the embryo and cultured cells derived from somatic embryogenesis and cheukah apical meristem through.
  • Agrobacterium Agrobacterium
  • Carotenoids are essential components of photosynthetic systems and are volatile components of fruits and flowers. They are precursors of ABA, the plant hormone. They are precursors of provitamin A and are very useful for humans as well as plants. It is an important antioxidant effective ingredient, and it is widely used in medical industry such as cancer, heart disease and eye disease as well as nutrients.
  • Korean Patent No. 1281071 discloses " IbOr-Ins gene mutant derived from sweet potato and its use ", and Korean Patent No. 1359308 discloses a method for producing a carotenoid and anthocyanin-rich transgenic sweet potato plant, Plant, "but the Ibor-R96H variant derived from the sweet potato of the present invention and its use have not been described.
  • the present invention has been made in view of the above-described needs.
  • the present invention provides a recombinant vector containing IbOr-R96H mutant in which the 96th amino acid of the orange protein derived from sweet potato is substituted with histidine in arginine,
  • the content of total carotenoids in the cultured sweet potato cells transformed with the IbOr-R96H mutant gene was higher than that of the non-transformed sweet potato cultured cells, the wild type IbOrange gene and the IbOr-Ins mutant gene transformed with sweet potato cells ,
  • beta carotene, and the potato plants transformed with the IbOr-R96H mutant gene were more resistant to high temperature stress than untransformed sweet potato plants and sweet potato plants transformed with the wild type IbOrange gene
  • the present invention is completed. The.
  • the present invention provides a method for producing Ibol-R96H, which comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in which the 96th amino acid of orange protein derived from sweet potato ( Ipomoea batatas ) is substituted with histidine (H) in arginine Provide variants.
  • the present invention also provides a gene encoding the IbOr-R96H variant.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising the gene.
  • the present invention provides a method for producing a transgenic plant having increased carotenoid content and enhanced high-temperature stress resistance, comprising transforming plant cells with the recombinant vector and overexpressing a gene encoding the IbOr-R96H mutant do.
  • the present invention also provides transgenic plants and transgenic seeds thereof, wherein the carotenoid content produced by the method is increased and the high temperature stress resistance is enhanced.
  • the present invention also provides a method for promoting carotenoid content and high-temperature stress resistance of a plant, comprising the step of transforming a plant cell with the recombinant vector and overexpressing a gene encoding the IbOr-R96H mutant.
  • the present invention also provides a composition for promoting carotenoid content and high-temperature stress resistance of a plant, which comprises the gene encoding the IbOr-R96H variant as an active ingredient.
  • the plant transformed with the IbOr-R96H variant according to the present invention can accumulate a carotenoid as a functional substance, it can be utilized as a variety of functional foods, cosmetics, feeds and the like. Utilizing the IbOr-R96H variant It will be possible to develop high-quality plants with enhanced carotenoids. In addition, the plant transformed with the IbOr-R96H variant according to the present invention will be able to be cultivated even in a high temperature region where general plants are difficult to grow.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a recombinant vector comprising the IbOr-R96H gene mutant in which the 96th amino acid of the IbOrange protein is modified from arginine (R) to histidine (H).
  • FIG. 2 is a photograph showing the phenotype of cultured sweet potato cells transformed with unmodified sweet potato cultured cells (YM), wild type IbOrange gene (IbOr-wt) and IbOrange gene mutants (IbOr-Ins and IbOr-R96H), respectively.
  • Fig. 3 shows the process of producing IbOr WT or IbOr R96H overexpressed transgenic sweet potato plants.
  • Fig. 3 (a) shows a vector map
  • Fig. 3 (b) shows PCR results using genomic DNA extracted from a transgenic plant, This is the result of analyzing the level of gene expression using quantitative real-time PCR in plants.
  • FIG. 4 shows the result of the high temperature stress (47 ° C.) resistance test using leaf discs of IbOr WT or IbOr R96H overexpressed transgenic sweet potato plants, in which (a) is DAB staining phenotype, (b) ion leakage).
  • the present invention provides a sweet potato ( Ipomoea R96H variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in which the 96th amino acid of the batatas- derived Orange protein is replaced with histidine (H) in arginine (R).
  • a sweet potato Ipomoea R96H variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in which the 96th amino acid of the batatas- derived Orange protein is replaced with histidine (H) in arginine (R).
  • the IbOr-R96H variants according to the present invention can significantly increase the total carotenoid content and high temperature stress resistance of the plant when overexpressed in the transformed plant.
  • the present invention also provides a gene encoding the IbOr-R96H variant.
  • the range of the gene encoding the IbOr-R96H variant according to the present invention may be that the coding base of arginine is substituted with the coding base of histidine (CAT or CAC) so that the 96th amino acid of the wild type IbOr protein can be replaced by histidine ,
  • CAT or CAC histidine
  • a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is not limited thereto.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising a gene encoding an IbOr-R96H variant.
  • recombinant refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, heterologous peptide or heterologous nucleic acid.
  • the recombinant cell can express a gene or a gene fragment that is not found in the natural form of the cell in one of the sense or antisense form.
  • the recombinant cell can express a gene found in a cell in its natural state, but the gene has been modified and reintroduced intracellularly by an artificial means.
  • vector is used to refer to a DNA fragment (s), nucleic acid molecule, which is transferred into a cell.
  • the vector replicates the DNA and can be independently regenerated in the host cell.
  • carrier is often used interchangeably with “vector “.
  • expression vector means a recombinant DNA molecule comprising a desired coding sequence and a suitable nucleic acid sequence necessary for expressing a coding sequence operably linked in a particular host organism. Promoters, enhancers, termination signals and polyadenylation signals available in eukaryotic cells are known.
  • a preferred example of a plant expression vector is a Ti-plasmid vector that is capable of transferring a so-called T-DNA region into plant cells when present in a suitable host such as Agrobacterium tumefaciens .
  • a suitable host such as Agrobacterium tumefaciens .
  • Other types of Ti-plasmid vectors are currently being used to transfer hybrid DNA sequences to plant cells, or to protoplasts in which new plants capable of properly inserting hybrid DNA into the plant's genome can be produced.
  • a particularly preferred form of the Ti-plasmid vector is a so-called binary vector as claimed in EP 0120516 B1 and US 4,940,838.
  • Suitable vectors that can be used to introduce the DNA according to the invention into the plant host include viral vectors such as those that can be derived from double-stranded plant viruses (e. G., CaMV) and single- For example, from non -complete plant virus vectors. The use of such vectors may be particularly advantageous when it is difficult to transform the plant host properly.
  • viral vectors such as those that can be derived from double-stranded plant viruses (e. G., CaMV) and single- For example, from non -complete plant virus vectors.
  • CaMV double-stranded plant viruses
  • the use of such vectors may be particularly advantageous when it is difficult to transform the plant host properly.
  • the expression vector will preferably comprise one or more selectable markers.
  • the marker is typically a nucleic acid sequence having a property that can be selected by a chemical method, and includes all genes capable of distinguishing a transformed cell from a non-transformed cell. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate, phosphinothricin and glufosinate, kanamycin, G418, Bleomycin, hygromycin, Antibiotic resistance genes such as chloramphenicol, but are not limited thereto.
  • the promoter may be CaMV 35S, actin, ubiquitin, pEMU, MAS or histone promoter, but is not limited thereto.
  • promoter refers to the region of DNA upstream from the structural gene and refers to a DNA molecule to which an RNA polymerase binds to initiate transcription.
  • a "plant promoter” is a promoter capable of initiating transcription in plant cells.
  • a “constitutive promoter” is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental conditions or cell differentiation. Constructive promoters may be preferred in the present invention because the choice of transformants can be made by various tissues at various stages. Thus, constitutive promoters do not limit selectivity.
  • conventional terminators can be used. Examples thereof include nopaline synthase (NOS), rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, Agrobacterium and the terminator of the Octopine gene of Tumefaciens, but the present invention is not limited thereto. Regarding the need for terminators, it is generally known that such regions increase the certainty and efficiency of transcription in plant cells. Therefore, the use of a terminator is highly desirable in the context of the present invention.
  • the present invention also provides a method for producing a transgenic plant having increased carotenoid content and enhanced high-temperature stress resistance, which comprises transforming plant cells with the recombinant vector and overexpressing a gene encoding the IbOr-R96H mutant do.
  • the IbOr-R96H variant may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • gene overexpression is meant that the gene is expressed at a level that is expressed in a wild-type plant.
  • a method of introducing the gene into a plant there is a method of transforming a plant using an expression vector containing the gene under the control of a promoter.
  • the above promoter is not particularly limited as long as it can overexpress an insertion gene in a plant.
  • Transformation of a plant means any method of transferring DNA to a plant. Such transformation methods do not necessarily have a regeneration and / or tissue culture period. Transformation of plant species is now common for plant species, including both terminal plants as well as dicotyledonous plants. In principle, any transformation method can be used to introduce the hybrid DNA according to the present invention into suitable progenitor cells. The method is based on the calcium / polyethylene glycol method for protoplasts (Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), electroporation of protoplasts (Shillito et al., 1985, Bio / Technol. (DNA or RNA-coated) particle impact method of various plant elements (Klein et al., J.
  • Biol. ≪ RTI ID 0.0 & (EP 0301316 B1) from Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer by transformation of plant infestation or mature pollen or micropore (EP 0301316 B1) and the like . ≪ / RTI >
  • a preferred method according to the present invention comprises Agrobacterium mediated DNA delivery. Particularly preferred is the use of so-called binary vector techniques as described in EPA 120 516 and U.S. Pat. No. 4,940,838.
  • Plant cell used for transformation of a plant may be any plant cell.
  • Plant cells are cultured cells, cultured tissues, cultivated or whole plants.
  • Plant tissue refers to a tissue of differentiated or undifferentiated plant, including but not limited to roots, stems, leaves, pollen, seeds, cancer tissues, and various types of cells used for culture, protoplasts, shoots and callus tissue.
  • the plant tissue may be in planta or may be in an organ culture, tissue culture or cell culture.
  • the present invention also provides transgenic plants and transgenic seeds thereof, wherein the carotenoid content produced by the method is increased and the high temperature stress resistance is enhanced.
  • the transgenic plants of the present invention have increased total carotenoid contents by about 34 times, especially beta carotene contents by about 300 times, but not limited thereto.
  • transgenic plants of the present invention may be more resistant to stress at high temperatures than plants transformed with non-transgenic plants and genes encoding wild type IbOr.
  • the high temperature may be 40 to 55 ° C, preferably 45 to 49 ° C, and more preferably 47 ° C, but is not limited thereto.
  • the transgenic plants in which the carotenoid content of the present invention is increased and the high-temperature stress resistance is promoted can be obtained by cultivating a dicotyledonous plant such as Convolvulaceae, Leguminosae, Araliaceae or the like such as Gramineae May be a plant, preferably a dicotyledonous plant with a filamentous flower, more preferably a sweet potato, but is not limited thereto.
  • a dicotyledonous plant such as Convolvulaceae, Leguminosae, Araliaceae or the like
  • Gramineae May be a plant, preferably a dicotyledonous plant with a filamentous flower, more preferably a sweet potato, but is not limited thereto.
  • the present invention also relates to a method for transforming a plant cell with a recombinant vector comprising a gene encoding the IbOr-R96H variant, and overexpressing a gene encoding the IbOr-R96H mutant, wherein the carotenoid content and the high temperature stress resistance Provides an enhancement method.
  • the IbOr-R96H mutant of the present invention may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and when the IbOr-R96H mutant is overexpressed in the plant, the total carotenoid content of the plant including beta carotene is increased and the high temperature stress resistance .
  • the present invention also provides a composition for enhancing the carotenoid content and high-temperature stress resistance of a plant, which comprises a gene encoding the IbOr-R96H variant as an active ingredient.
  • the composition of the present invention comprises a gene coding for an IbOr-R96H mutant in which the 96th amino acid of an orange protein derived from sweet potato comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine (H) in arginine (R) Transformation of a gene encoding a mutant into a plant cell can enhance the carotenoid content and high temperature stress resistance of the plant.
  • IbOr-R96H mutant gene PCR- based on a parameter-digit directed mutagenesis kit ways QuickChange TM Site-Directed Mutagenesis (Agilent, USA) were performed using, the IbOr wild-type (WT) cDNA cloned into vector pDONR207 (5'-GAAATTCAAGACAATATTCGGAGTCACCGGAATAAAATATTTTTGCA-3 ', SEQ ID NO: 3) and a reverse primer (5'-TGCAAAAATATTTTATTCCGGTGACTCCGAATATTGTCTTGAATTTC-3', SEQ ID NO: 4) were used as a template. Sequence analysis of the PCR product confirmed that arginine, the 96th amino acid of the IbOr wild type, was substituted by histidine and was named IbOr-R96H variant.
  • Example 2 Preparation of a recombinant vector containing the IbOr-R96H mutant gene and development of a transformant over-expressing the IbOr-R96H variant using the vector
  • a recombinant vector of IbOr-R96H mutant gene cloned by pDONR207 and a plant expression vector pGWB5 vector and LR reaction was constructed using Invitrogen's gateway expression system.
  • the recombinant vector was transformed into Yulmi cultured cells, which were sweet potatoes of white (off-white) flesh, using Agrobacterium tumefaciens strain EHA105. Transformed cultured cells were selected on MS (Murashige and Skoog) medium containing hygromycin.
  • Genomic DNA was extracted from the transformed cultured cells using the HiGene TM Genomic DNA Extraction Kit (for plants) of Biopect Company, and the expression of hygromycin phosphotransferase ( HPT ), a transformant selection marker, Respectively.
  • the carotenoid content of each transgenic sweet potato cultured cell was quantified by HPLC (High-performance liquid chromatography) analysis (Table 1).
  • HPLC High-performance liquid chromatography
  • the total carotenoid content of the sweet potato cultured cells transformed with the IbOr-R96H mutant was 24 times higher than that of the non-transformed sweet potato cultured cells.
  • beta-carotene it was confirmed that the content of the IbOr-R96H mutant increased by 88 times or more than that of the non-transformed sweet potato culture cells in the sweet potato culture cells.
  • the total carotenoid content of the cultured sweet potato cells transformed with the IbOr-R96H mutant was 13 times higher than that of the wild-type IbOr (IbOr-WT) transformed sweet potato cultured cells, and the beta carotene was also increased 39 times , It was found that the IbOr-R96H mutant of the present invention has an excellent effect of enhancing the carotenoid content of the plant.
  • Transgenic sweet potato plants overexpressing the wild type IbOr gene (IbOr WT ) or the IbOr-R96H mutant gene (IbOr R96H ) were constructed using Xushu 29 (one of the cultivars cultivated in the north of China) among the sweet potato varieties.
  • IbOr WT or IbOr R96H was cloned into a pGWB11 vector having a 35S promoter and a C-terminal FLAG tag to construct a vector (Fig. 3A).
  • Agrobacterium tumerfaciens strain EHA105 containing a recombinant vector was co-cultured with embryogenic callus for 3 days, washed with MS base medium and cultured in a selection medium at intervals of 3 weeks Transgenic sweet potato plants were prepared by subculturing the submerged callus of the surviving embryo and subculturing the root and root.
  • Genomic DNA was extracted by sampling the third or fourth leaf of the transgenic sweet potato plant which was cultivated for 16 hours in a light condition at 25 ⁇ in a growth chamber for 3 weeks, and the genomic DNA was extracted in the forward (5'-CGCACAATCCCACTATCCTT-3 ', SEQ ID NO: 5) (5'-TTCCCAAGCTCAGCATTCTT-3 ', SEQ ID NO: 6) primer sets were prepared and genomic DNA PCR was performed. The denaturation, annealing, and elongation were repeated 30 times at 94 ° C for 5 min, denaturation at 94 ° C for 30 sec, annealing at 58 ° C for 30 sec, elongation at 72 ° C for 60 sec. The final elongation was performed at 72 ° C for 5 minutes. 10 lines of transgenic plants in which IbOr WT or IbOr R96H was identified in genomic DNA were obtained from the above results (Fig. 3B).
  • Primers for quantitative real-time PCR for gene expression comparison were prepared in the forward (5'-GCACTGGATCACTAGTCCTT-3 ', SEQ ID NO: 7) and reverse (5'-GTCAATTCGTGGGTCATGCT-3', SEQ ID NO: 8).
  • Quantitative real-time PCR was performed with a CFX real-time PCR system (Bio-Rad, USA) using a 96-well plate. Each reaction (final 20 ⁇ l) was performed by adding 2 ⁇ l of diluted cDNA, 10 ⁇ l of EvaGreen PCR Master Mix (Solgent, Korea) and 1 ⁇ l of each primer.
  • IbOr overexpressed transgenic sweet potato plants are resistant to high temperature stress conditions compared to untransformed sweet potato plants. Based on the results of previous studies, the present inventors have found that IbOr R96H overexpressed transgenic sweet potato plants and Ibor WT The resistance of overexpressed transgenic sweet potato plants to high temperature stress was compared and analyzed. IbOr WT Or IbOr R96H overgrown transgenic sweet potato plants were grown in soil and cultivated for 16 hours at 25 ° C for 16 hours in a light growth chamber for 4 weeks. Leaf discs were prepared by cutting the leaves (3rd and 4th from the top) of the plants. Five leaf discs were repeated for 3 repetitions.
  • leaf discs were allowed to stand at high temperature (47 ° C) for 12 hours and then stained with DAB (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride) and measured for ion leakage. DAB staining was performed to observe the level of reactive oxygen species generated when the cells were exposed to stress. The ionic conductivity of the cells was measured using an ion conductivity meter for 0 to 12 hours for 6 hours , And each of the measured values was calculated by taking 100% of the disappearance of ions measured by completely destroying the cells after 12 hours at 80 ° C for 2 hours.
  • DAB 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride
  • non-transformed potato plants are found to be less subject to leaf discs are damaged by IbOr transgenic plants than (NT) were found that are resistant to high temperatures, in particular, IbOr WT-overexpressing transgenic IbOr R96H overexpression than switching potatoes Transgenic sweet potato plants were found to exhibit stronger high temperature resistance (FIG. 4).

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Abstract

본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 유래 Orange 단백질의 96번째 아미노산이 아르기닌에서 히스티딘으로 치환된 IbOr-R96H 변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 IbOr-R96H 변이체는 식물체의 카로티노이드 함량을 현저히 증진시킬 수 있으며, 고온 스트레스 저항성을 부여할 수 있다.

Description

고구마 유래의 ＩｂＯｒ-Ｒ96Ｈ 변이체 및 이의 용도
본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 유래 Orange 단백질의 96번째 아미노산이 아르기닌(arginine)에서 히스티딘(histidine)으로 치환된 IbOr-R96H 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다.
고구마(Ipomoea batatas L. Lam)는 비교적 척박한 땅에서도 재배가 가능할 뿐만 아니라 헥타르당 생산량이 약 30톤으로 우수하여, 식량과 가축 사료로 이용되는 대표적인 뿌리작물이다. 자색, 황색 등의 유색 고구마들은 다양한 항산화 물질을 포함하고 있는데, 특히 황색을 띄는 황색 고구마는 베타카로틴을 14.7~20mg/100g 함유하며, 자색 고구마는 안토시아닌을 2.28g/100g 내외로 함유하고 있어, 세포의 노화를 촉진시키고 각종 성인병의 원인이 되는 활성산소를 제거하는 항산화 활성이 매우 탁월하다. 또한 고구마는 1990년대 이후 아그로박테리움(Agrobacterium) 공동배양을 통한 형질전환이 시도되었고, 정단 및 측아 분열조직으로부터 배발생 배양세포 유도 및 체세포 배발생을 통한 식물체 재분화 형질전환시스템을 발전시켜왔다.
카로티노이드(carotenoid)는 광합성계의 필수성분이면서 과일과 꽃의 휘발성 성분이고, 식물호르몬인 ABA의 전구물질이며, 프로비타민(provitamin) A의 전구체로서 식물 자체뿐만 아니라 인간을 비롯한 동물에게도 매우 유용한 물질로, 강력한 항산화 효능으로 영양소뿐 아니라 암, 심장질환, 눈 질환과 같은 의료산업적으로 널리 이용되는 중요한 물질이다.
한편, 한국등록특허 제1281071호에는 '고구마 유래의 IbOr-Ins 유전자 변이체 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1359308호에는 '카로티노이드 및 안토시아닌 고축적 형질전환 고구마 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체'가 개시되어 있으나, 본 발명의 고구마 유래의 IbOr-R96H 변이체 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 고구마 유래 Orange 단백질의 96번째 아미노산이 아르기닌에서 히스티딘으로 치환된 IbOr-R96H 변이체를 제조하고, 상기 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 고구마 세포를 형질전환시킨 결과, 비형질전환 고구마 배양세포, 야생형 IbOrange 유전자 및 IbOr-Ins 변이체 유전자로 형질전환된 고구마 배양세포보다 IbOr-R96H 변이체 유전자로 형질전환된 고구마 배양세포에서 총 카로티노이드의 함량, 특히 베타카로틴의 함량이 현저히 증가된 것을 확인하였으며, IbOr-R96H 변이체 유전자로 형질전환된 고구마 식물체가 비형질전환 고구마 식물체 및 야생형 IbOrange 유전자로 형질전환된 고구마 식물체에 비해 고온 스트레스에 대한 저항성이 우수함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 유래 Orange 단백질의 96번째 아미노산이 아르기닌(arginine, R)에서 히스티딘(histidine, H)으로 치환된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 IbOr-R96H 변이체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜, IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 카로티노이드 함량이 증가되고 고온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 카로티노이드 함량이 증가되고 고온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜, IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 카로티노이드 함량 및 고온 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 카로티노이드 함량 및 고온 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 IbOr-R96H 변이체로 형질전환된 식물체는 기능성 물질인 카로티노이드가 고축적될 수 있으므로, 기능성 식품, 화장품, 사료 등의 소재로 다양하게 활용될 수 있을 것이며, IbOr-R96H 변이체를 활용하여 카로티노이드가 증진된 고품질의 식물체를 개발할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명에 따른 IbOr-R96H 변이체로 형질전환된 식물체는 일반 식물체가 성장하기 어려운 고온 지역에서도 재배가 가능할 것이다.
도 1은 IbOrange 단백질의 96번째 아미노산이 아르기닌(R)에서 히스티딘(H)으로 변형된 IbOr-R96H 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터의 모식도이다.
도 2는 비형질전환 고구마 배양세포(YM)와 야생형 IbOrange 유전자(IbOr-wt) 및 IbOrange 유전자 변이체(IbOr-Ins 및 IbOr-R96H)로 각각 형질전환된 고구마 배양세포의 표현형을 확인한 사진이다.
도 3은 IbOrWT 또는 IbOrR96H 과발현 형질전환 고구마 식물체 제작과정을 보여주는 것으로, (a)는 벡터 맵, (b)는 형질전환 식물체에서 추출한 게노믹 DNA를 이용한 PCR 결과, (c)는 각 형질전환 식물체에서 정량적(quantitative) real-time PCR을 이용한 유전자 발현 수준을 분석한 결과이다.
도 4는 IbOrWT 또는 IbOrR96H 과발현 형질전환 고구마 식물체의 leaf disc를 이용한 고온 스트레스(47℃) 내성실험 결과로, (a)는 DAB 염색 표현형이고, (b)는 각각의 leaf disc에서 이온 누출(ion leakage)을 측정한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 유래 Orange 단백질의 96번째 아미노산이 아르기닌(arginine, R)에서 히스티딘(histidine, H)으로 치환된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 IbOr-R96H 변이체를 제공한다.
본 발명에 따른 IbOr-R96H 변이체는 형질전환된 식물체에서 과발현될 때, 식물체의 총 카로티노이드 함량 및 고온 스트레스 저항성을 현저히 증가시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명에 따른 IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자의 범위는 야생형 IbOr 단백질의 96번째 아미노산이 히스티딘으로 치환될 수 있도록, 아르기닌의 코딩 염기가 히스티딘의 코딩 염기(CAT 또는 CAC)로 치환된 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-DNA 영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0116718 B1 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0120516 B1 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 포스피노트리신(phosphinothricin) 및 글루포시네이트(glufosinate)와 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
"프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 식물 발현 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜, IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 카로티노이드 함량이 증가되고 고온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 IbOr-R96H 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 "유전자 과발현"이란 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 상기 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다. 식물체 내로 상기 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 상기 유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 방법이 있다. 상기에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법 (Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8:363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3:1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway et al.,1986, Mol. Gen. Genet. 202:179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법 (Klein et al.,1987, Nature 327:70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0301316 B1) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EPA 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 바이너리 벡터 기술을 이용하는 것이다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 카로티노이드 함량이 증가되고 고온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
본 발명의 형질전환 식물체는 비형질전환 식물체 대비 총 카로티노이드 함량이 약 34배 증가되었으며, 특히 베타카로틴의 함량은 약 300배 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 형질전환 식물체는 비형질전환 식물체 및 야생형 IbOr를 코딩하는 유전자로 형질전환된 식물체에 비해 고온 스트레스에서 저항성이 우수한 것일 수 있다. 상기 고온은 40~55℃일 수 있고, 바람직하게는 45~49℃일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 47℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 상기 카로티노이드 함량이 증가되고 고온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체는 메꽃과(Convolvulaceae), 콩과(Leguminosae), 두릅나무과(Araliaceae) 등의 쌍자엽 식물체 또는 벼과(Gramineae) 등의 단자엽 식물체일 수 있고, 바람직하게는 메꽃과의 쌍자엽 식물체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 고구마일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜, IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 카로티노이드 함량 및 고온 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 IbOr-R96H 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, IbOr-R96H 변이체가 식물체에서 과발현되면 베타카로틴 등을 포함하는 식물체의 총 카로티노이드 함량이 증진되고, 식물체의 고온 스트레스 저항성이 증진된다.
본 발명은 또한, 상기 IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 카로티노이드 함량 및 고온 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 고구마 유래 Orange 단백질의 96번째 아미노산이 아르기닌(R)에서 히스티딘(H)으로 치환된 IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 변이체를 코딩하는 유전자를 식물세포에 형질전환함으로써 식물체의 카로티노이드 함량 및 고온 스트레스 저항성을 증진시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. IbOr-R96H 변이체 유전자의 클로닝 및 염기서열 분석
IbOr-R96H 변이체 유전자의 클로닝은 PCR-매개된 자리지정 돌연변이 유발 방법을 기초로 하여 QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis 키트(Agilent, 미국)를 사용하여 수행하였으며, pDONR207 벡터에 클로닝된 IbOr 야생형(WT) cDNA를 주형으로 정방향 프라이머(5'-GAAATTCAAGACAATATTCGGAGTCACCGGAATAAAATATTTTTGCA-3', 서열번호 3) 및 역방향 프라이머(5'-TGCAAAAATATTTTATTCCGGTGACTCCGAATATTGTCTTGAATTTC-3', 서열번호 4)를 사용하였다. PCR 산물의 서열분석을 통해 IbOr 야생형의 96번째 아미노산인 아르기닌이 히스티딘으로 치환되어 있는 것을 확인하였고, 이를 IbOr-R96H 변이체로 명명하였다.
실시예 2. IbOr-R96H 변이체 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제조 및 상기 벡터를 이용하여 IbOr-R96H 변이체를 과발현하는 형질전환체의 개발
IbOr-R96H 변이체 유전자를 과발현하는 형질전환체를 제조하기 위하여 Invitrogen의 gateway 발현 시스템을 이용하여 pDONR207와 식물발현 벡터인 pGWB5 벡터와 LR 반응으로 클로닝한 IbOr-R96H 변이체 유전자의 재조합 벡터를 제작하였다. 재조합 벡터는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 균주를 이용해 흰색(미색) 과육의 고구마인 율미(Yulmi) 배양세포에 형질전환하였다. 형질전환된 배양세포는 하이그로마이신이 포함된 MS(Murashige and Skoog) 배지에서 선별되었다. 형질전환한 배양세포를 대상으로 바이오펙트사의 HiGeneTM Genomic DNA 추출 키트(식물용)를 이용하여 게노믹 DNA를 추출한 후 형질전환체 선발마커인 하이그로마이신 유전자 HPT(hygromycin phosphotransferase)의 발현을 PCR로 분석하였다.
실시예 3. IbOr-R96H 재조합 벡터로 형질전환된 고구마 배양세포에서의 카로티노이드 함량 분석
IbOr-R96H 변이체 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 고구마 배양세포의 표현형을 관찰한 결과, 비형질전환 고구마 배양세포의 경우 미색을 띄는데 반해, 야생형 IbOr 유전자로 형질전환된 고구마 배양세포는 노란색을 띄었으며, 기존에 발표(한국등록특허 제1281071호)된 IbOr-Ins 변이체로 형질전환된 고구마 배양세포의 경우 진한 노란색을 나타내었고, 본 발명의 IbOr-R96H 변이체로 형질전환된 고구마 배양세포는 주황색에 가까운 색깔을 가지고 있음이 육안으로 확인되었다(도 2).
또한, 각각의 형질전환 고구마 배양세포의 카로티노이드 함량을 HPLC(High-performance liquid chromatography) 분석을 통해 정량하였다(표 1). 그 결과 IbOr-R96H 변이체로 형질전환된 고구마 배양세포는 비형질전환 고구마 배양세포보다 총 카로티노이드 함량이 약 24배 이상 증가하였다. 특히, 베타카로틴의 경우 IbOr-R96H 변이체로 형질전환된 고구마 배양세포에서 비형질전환 고구마 배양세포보다 약 88배 이상 그 함량이 증가된 것이 확인되었다. 또한, 야생형 IbOr(IbOr-WT)로 형질전환된 고구마 배양세포에 비해 IbOr-R96H 변이체로 형질전환된 고구마 배양세포는 총 카로티노이드 함량이 13배 이상 증가되었고, 베타카로틴의 경우도 39배 이상 증가된 것으로 확인되어, 본 발명의 IbOr-R96H 변이체가 식물체의 카로티노이드 함량 증진 효과가 매우 우수함을 알 수 있었다.
[표 1]
Figure PCTKR2018015992-appb-I000001
실시예 4. IbOr-R96H 과발현 형질전환 고구마 식물체의 제작
고구마의 품종 중 Xushu 29 (중국의 북쪽지방에서 많이 재배되는 품종 중 하나)를 이용하여 야생형 IbOr 유전자(IbOrWT) 또는 IbOr-R96H 변이체 유전자(IbOrR96H)를 과발현하는 형질전환 고구마 식물체를 제작하였다. 상기 IbOrWT 또는 IbOrR96H 각각을 35S 프로모터와 C-말단 FLAG 태그를 가지고 있는 pGWB11 벡터에 클로닝하여 벡터를 제작하였다(도 3a). 고구마 형질전환 실험은 재조합 벡터를 함유하는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumerfaciens) EHA105 균주를 고구마 배발생 캘러스와 3일간 공동배양한 후, MS 기본배지로 세척하여 선발배지에서 배양하고 3주 간격으로 계대배양 한 후 살아남은 배발생 캘러스에서 지상부와 뿌리를 유도하여 소식물체로 재분화 시킴으로서 형질전환 고구마 식물체를 제조하였다. 하루 16시간 광조건의 25℃ 생장실에서 3주간 키운 형질전환 고구마 식물체의 3번째 또는 4번째 잎을 샘플링하여 게노믹 DNA를 추출하였고, 정방향 (5'-CGCACAATCCCACTATCCTT-3', 서열번호 5) 및 역방향 (5'-TTCCCAAGCTCAGCATTCTT-3', 서열번호 6) 프라이머 세트를 제작하여 게노믹 DNA PCR을 수행하였다. PCR 조건은 초기 변성 94℃ 5분에 이어서, 변성, 어닐링, 신장 과정을 30회 반복 하였고, 변성은 94℃ 30초, 어닐링은 58℃ 30초, 신장은 72℃ 60초로 하였다. 그리고 최종 신장은 72℃ 5분으로 수행하였다. 상기 결과를 통해 게노믹 DNA에서 IbOrWT 또는 IbOrR96H가 확인된 형질전환 식물체를 10라인씩 확보하였다(도 3b).
앞서 동일하게 샘플링한 잎에서 RibospinTM Plant 키트 (GeneAll, Korea)를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. RNase-free DNase I (GeneAll)을 처리하여 게노믹 DNA 오염을 제거하였고, 1,000 ㎍의 총 RNA로 TOPscriptTM RT DryMIX (dT18) (Enzynomics, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. PCR 조건은 최초 42℃ 5분, 이어서 50℃ 60분, 95℃ 5분으로 수행하였다. 유전자 발현 비교를 위한 정량적 실시간(quantitative real-time) PCR의 프라이머는 정방향 (5'-GCACTGGATCACTAGTCCTT-3', 서열번호 7) 및 역방향 (5'-GTCAATTCGTGGGTCATGCT-3', 서열번호 8)로 제작하였다. 정량적 실시간 PCR은 96-웰 플레이트를 이용하여 CFX real-time PCR system (Bio-Rad, USA)으로 수행하였다. 각 반응 (최종 20 ㎕)은 2 ㎕의 희석된 cDNA와 10 ㎕의 EvaGreen PCR Master Mix (Solgent, Korea), 그리고 프라이머들을 각 1 ㎕씩 첨가하여 수행하였다. PCR 조건은 최초 95℃ 15분, 이어서 95℃ 20초, 60℃ 40초, 72℃ 20초로 하여 40회 반복하였다. 분석 결과, IbOrWT 또는 IbOrR96H의 유전자발현이 높은 3 라인을 선발하였다(도 3c).
실시예 5. IbOr-R96H 과발현 형질전환 고구마 식물체의 환경 스트레스 내성 평가
이전의 연구에서 IbOr 과발현 형질전환 고구마 식물체 (cv. Sinzami)는 비형질전환 고구마 식물체에 비해 고온 스트레스 조건에서 저항성이 있다는 것을 확인하였었다. 본 발명자는 이전 연구 결과를 바탕으로 IbOrR96H 과발현 형질전환 고구마 식물체와 IbOrWT 과발현 형질전환 고구마 식물체의 고온 스트레스에 대한 저항성을 비교·분석하였다. IbOrWT 또는 IbOrR96H 과발현 형질전환 고구마 식물체를 흙에서 증식하여 25℃, 하루 16시간 광조건의 생장실에서 4주간 생장시킨 후 식물체의(위로부터 3, 4번째) 잎을 잘라 leaf disc를 제작하였다. 5개의 leaf discs를 1반복으로 하여 총 3반복 진행하였다. 먼저, leaf discs를 고온 (47℃)에서 12시간 놓아둔 뒤 DAB (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride) 염색과 이온 누출(ion leakage) 측정을 실시하였다. 스트레스를 받아 세포사멸이 유도될 때 나오는 활성산소 발생 정도를 관찰하기 위해 DAB 염색을 진행하였고, 스트레스에 의한 세포의 이온소실은 이온 전도율계(ion conductivity meter)를 이용하여 0~12시간 동안 6시간 단위로 측정하였고, 각 측정값들은 12시간 이후 시료를 80℃에서 2시간 동안 처리하여 세포를 완전 파괴시켜 측정한 이온의 소실 값을 100%로 하여 계산하였다. 그 결과, 비형질전환 고구마 식물체(NT)보다 IbOr 과발현 형질전환 식물체들의 leaf discs가 손상을 덜 받는 것으로 확인되어 고온에 저항성이 있음을 알 수 있었고, 특히, IbOrWT 과발현 형질전환 고구마보다 IbOrR96H 과발현 형질전환 고구마 식물체가 더 강한 고온 저항성을 보이는 것을 알 수 있었다(도 4).

Claims (8)

  1. 고구마(Ipomoea batatas) 유래 Orange 단백질의 96번째 아미노산이 아르기닌(arginine, R)에서 히스티딘(histidine, H)으로 치환된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 IbOr-R96H 변이체.
  2. 제1항의 IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자.
  3. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  4. 제3항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜, IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 카로티노이드 함량이 증가되고 고온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법.
  5. 제4항의 방법에 의해 제조된 카로티노이드 함량이 증가되고 고온 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.
  6. 제5항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
  7. 제3항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜, IbOr-R96H 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 카로티노이드 함량 및 고온 스트레스 저항성 증진 방법.
  8. 제2항의 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 카로티노이드 함량 및 고온 스트레스 저항성 증진용 조성물.
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