KR101987663B1

KR101987663B1 - 식물체에서 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 LeMADS-RIN 유전자 편집에 의해 에틸렌 생산을 감소시키는 방법

Info

Publication number: KR101987663B1
Application number: KR1020170135857A
Authority: KR
Inventors: 강권규; 정유진
Original assignee: 한경대학교 산학협력단
Priority date: 2017-10-19
Filing date: 2017-10-19
Publication date: 2019-06-11
Also published as: KR20190043841A

Abstract

본 발명은 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 Cas9(CRISPR associated protein 9)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 1; 및 서열번호 3 내지 5의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 LeMADS-RIN 단백질을 코딩하는 유전자의 표적 서열을 포함하는 발현 카세트 2;를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 LeMADS-RIN 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해시키는 단계를 포함하는 식물체의 에틸렌(ethylene) 생산을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

Description

식물체에서 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 LeMADS-RIN 유전자 편집에 의해 에틸렌 생산을 감소시키는 방법{Method for reducing ethylene production by LeMADS-RIN gene editing using CRISPR/Cas9 system in plant}

본 발명은 식물체에서 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 LeMADS-RIN 유전자 편집에 의해 에틸렌 생산을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

과실은 착과(着果)되어 시간이 경과됨에 따라 성숙에 따른 다양한 생리적 변화를 초래한다. 따라서 수확 후 과실의 신선도 및 품질을 유지하기 위한 기술개발이 다양한 측면에서 시도되어 왔다. 특히 과실 성숙에 관한 분자기작, 세포벽 및 대사체 연구, 에틸렌 생합성 경로 및 응답반응 등에 대해 지난 20년간 많은 연구가 이루어져 왔다. 식물을 위해 대기에서 활동하는 유일한 호르몬인 에틸렌은 식물의 생장과 분화, 환경응답에 중요한 역할을 담당하고 있다. 토마토, 사과, 바나나 및 배 등과 같이 과실성숙을 위해 에틸렌이 반드시 필요한 과종을 호흡급등형 과실(climacteric fruit)이라고 말하며, 이들의 에틸렌 생성은 과실 성숙개시 직전에 시작되어 과실성숙을 제어하며, 잎 또는 꽃의 노화, 낙엽 및 낙과, 근모의 발생 등과 같은 생리적 요인에도 관여하는 것으로 보고되었다. 그 외, 에틸렌은 과실성숙에 관련된 유전자 및 병원균의 감염응답에 관여하는 유전자 등 다양한 유전자들의 발현을 제어하는 것으로 알려졌다. 과실성숙에 동반하여 생성된 에틸렌은 엽록소(chlorophyll) 분해관련 유전자, 카로테노이드 합성효소 등 색소합성에 관련된 유전자, 과육 연화를 일으키는 세포벽 분해 관련 유전자 등의 발현을 유도 및 활성화시키는 것으로 보고되었다.

과실은 성숙을 동반하여 호흡량의 변화를 지표로, 과실성숙 이전에 특이적으로 호흡이 상승되는 호흡급등형(climacteric)과 호흡 및 에틸렌 생성이 상승하지 않는 호흡비급등형(non climacteric)으로 대별된다. 에틸렌 생합성 및 에틸렌 억제제를 이용한 호흡급등형 과실의 분석, 에틸렌 생합성 관련 유전자의 발현을 억제한 형질전환 식물에서의 분석 또는 에틸렌 수용체와 관련된 토마토 돌연변이 Nr(Never-ripe) 등의 연구에서 과실성숙이 현저하게 억제되는 것이 관찰되어, 과실 성숙에 있어 에틸렌의 작용이 필수적인 것으로 확인되었다. 호흡급등형 과실은 일정한 발달 단계에 도달하면 미숙한 단계에서 수확해도 시간이 경과하면 인공적으로 에틸렌 처리를 하지 않아도 스스로 에틸렌을 생산하고 성숙한다. 이러한 수확 후 성숙 현상은 maturation과 구별하여 ripening이라고 한다. 호흡급등형 과실은 성숙과 함께 호흡 활성이 일시적으로 급증한다. 이 급증하여 생성하는 에너지는 세포벽에 의한 과육연화, 착색, 휘발성 방향족 성분의 생성, 전분의 당으로 분해 및 유기산 감소 등의 다양한 성분 변화로 이루어진 과실성숙 현상의 진행에 사용되는 것으로 유추되고 있다. 농산물의 숙성은 제품의 신선도와 품질에 큰 영향을 미친다. 숙성에 의한 변화는 과실의 품종에 따라 차이가 있지만 일반적으로 세포벽의 초미세 구조 및 조성이 변화하고 전분에서 당으로의 전환이 촉진되어 병원균에 대한 감수성이 높아져 질병에 감염되기 쉬운 상태가 된다. 또한 색소의 생합성 변화 및 축적 또는 맛에 관련된 물질과 휘발성 방향족 화합물의 증가 등 큰 변화가 일어난다.

호흡급등형 토마토는 과실 발육 및 성숙에 대한 연구와 교배 및 종자 채취가 용이하여 모델식물로 많이 사용되고 있다. 특히 토마토의 성숙에 관련된 자연 돌연변이 rin(성숙억제) 및 nor(미성숙) 토마토는 호흡급등형처럼 급격한 호흡 활성의 촉진이 일어나지 않고, 에틸렌 생합성도 일어나지 않는다. 이들 돌연변이체에 에틸렌을 처리하면, 에틸렌 관련 유전자의 발현이 유도되고, rin 및 nor 토마토에서 상해에 대한 반응으로 에틸렌 합성이 유도된다고 알려졌다. 최근 들어 rin 및 nor 토마토로부터 성숙되지 않는 원인 유전자가 분리되었다. nor 돌연변이는 nor 좌(locus) 내부에 하나의 전사 인자 구조의 특징을 가진 비 MADS-box 패밀리인 전사 인자가 존재하고 있는 것으로 알려졌다. 이와 같이 토마토의 돌연변이체를 이용한 연구는 성숙에 관련된 유전자의 발현이 제어되어 형질로서 나타난 것으로부터 형질관련 유전자를 동정하고 열매 성숙 생리 연구에 상당한 기여를 하고 있다. 또한 최근의 토마토 연구로는 전사체 분석, 프로테옴 분석 및 대사체 분석 등에 따라 토마토의 생리적 현상들의 포괄적인 분석이 이루어져 다량의 데이터가 축적되고 있으며, 유전자 재조합 기술에 의해 ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid) 합성 효소와 ACC 산화 효소의 발현을 억제함으로써 에틸렌 생산량이 저하된 형질전환체를 육성하기도 하였다. 그러나, 토마토의 성숙시작에 에틸렌이 필수적인 것은 분명하지만, 개별적인 성숙 관련 유전자의 발현이 에틸렌을 직접 통제하거나 간접적인 제어에 의한 것인지는 분명하지 않다. 토마토 성숙 관련 돌연변이 rin과 nor의 분석에서 NOR 등 에틸렌 합성 관련 유전자 이외에도 성숙 현상에 관여하는 다른 종류의 필수인자가 알려져 있다. 다수의 성숙 관련 유전자가 에틸렌과 RIN 및 NOR 신호 전달계에 의해 교묘하게 제어되는 것으로 간주되고 있지만, 그 자세한 기작은 아직까지 분명하지 않다.

한편, 한국등록특허 제0742219호에는 '멜론 유래의 익스펜신 유전자를 이용한 과실의 성숙조절방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0741255호에는 '식물 호르몬 자스몬산 및 에틸렌 생합성 저해 관련 애기장대 AtLEJ1 유전자 및 이를 이용한 웅성 불임 식물체 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 식물체에서 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 LeMADS-RIN 유전자 편집에 의해 에틸렌 생산을 감소시키는 방법에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 토마토 과실 성숙 관련 LeMADS-RIN 유전자를 CRISPR/Cas9(Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9) 시스템을 이용하여 인위적으로 편집한 형질전환체를 제작하고, 상기 형질전환된 토마토를 육성한 결과, LeMADS-RIN 유전자가 편집된 형질전환 토마토가 비형질전환체에 비해 다양한 과색 변이를 보여주었으며, 과실에서의 에틸렌 생성량이 현저히 감소되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 Cas9(CRISPR associated protein 9)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 1; 및 서열번호 3 내지 5의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 LeMADS-RIN 단백질을 코딩하는 유전자의 표적 서열을 포함하는 발현 카세트 2;를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 LeMADS-RIN 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해시키는 단계를 포함하는 식물체의 에틸렌(ethylene) 생산을 감소시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 Cas9(CRISPR associated protein 9)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 1; 및 서열번호 3 내지 5의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 LeMADS-RIN 단백질을 코딩하는 유전자의 표적 서열을 포함하는 발현 카세트 2;를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 에틸렌 생산이 감소된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 에틸렌 생산이 감소된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 Cas9(CRISPR associated protein 9)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 1; 및 서열번호 3 내지 5의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 LeMADS-RIN 단백질을 코딩하는 유전자의 표적 서열을 포함하는 발현 카세트 2;를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 식물체의 에틸렌 생산 감소용 조성물을 제공한다.

본 발명의 토마토 과실 성숙 관련 LeMADS-RIN 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 편집한 형질전환체는 에틸렌 생산량이 현저히 감소하는 결과를 보여 과실의 저장성이 매우 좋을 것으로 기대되었으며, 과실 성숙에 관한 분자기작, 세포벽 및 대사체 연구, 에틸렌 생합성 경로 및 응답반응 등에 대한 연구 재료로써 활용할 수 있다. 또한 정밀 유전자편집 기술인 CRISPR/Cas9 시스템은 생산성 및 기능 유전자가 편집된 개체의 육종에 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

도 1은 과실 성숙에 관여하는 에틸렌 생합성(A), LeMADS-RIN 유전자 편집을 위한 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 선별(B), 및 Ti-플라스미드 벡터(pBAtC)의 모식도(C)에 관한 것이다. Cas9hc: 인간 코돈 최적화된 Cas9, NLS: nuclear localization signal, 35S-P: CaMV 35S 프로모터, AtU6: 애기장대 U6-26 프로모터, sgRNA: single-guide RNA, Nos-P: Nos 프로모터, Bar: Basta 저항성 유전자, Ter: Nos 터미네이터.
도 2는 LeMADS-RIN 유전자가 편집된 형질전환 토마토의 생산 및 도입 유전자의 확인에 관한 것으로, (A)는 아그로박테리움을 이용한 pBAtC-RGEN 벡터가 도입된 토마토 식물체의 모습을 보여주는 사진이며, (B)는 LeMADS-RIN 유전자가 편집된 형질전환 토마토의 생산과정에 대한 도식이며, (C)는 형질전환 토마토 식물체를 대상으로 한 bar 및 nos 터미네이터 부위의 중합효소연쇄반응(PCR) 결과이고, (D)는 도입 유전자의 단일 카피를 포함하는 형질전환체의 선별을 위한 TaqMan PCR 분석 결과이다. TG1~10는 pBAtC-RGEN1 벡터로 형질전환된 식물체를; TG11~20는 pBAtC-RGEN2로 형질전환된 식물체를; TG21~27는 pBAtC-RGEN3로 형질전환된 식물체를 의미한다.
도 3은 형질전환된 토마토 식물체(TG4, TG12, TG26)의 LeMADS - RIN 유전자 염기서열을 분석한 결과이다.
도 4는 36 및 42dpa(day post-anthesis)에 형질전환된 토마토 과실에서 에틸렌 생산량을 분석한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 Cas9(CRISPR associated protein 9)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 1; 및 서열번호 3 내지 5의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 LeMADS-RIN 단백질을 코딩하는 유전자의 표적 서열을 포함하는 발현 카세트 2;를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 LeMADS-RIN 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해시키는 단계를 포함하는 식물체의 에틸렌(ethylene) 생산을 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 식물체의 에틸렌 생산을 감소시키는 방법은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 것으로, LeMADS-RIN 유전자의 편집을 통해 식물 세포에서 LeMADS-RIN 유전자의 발현을 저해시키는 방법이다.

본 발명의 에틸렌 생산을 감소시키는 방법에 있어서, 상기 LeMADS-RIN 단백질은 토마토 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 LeMADS-RIN 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명의 에틸렌 생산을 감소시키는 방법에 있어서, 상기 발현 카세트 1의 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 Cas9을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)의 Cas9 코딩 서열을 인간 코돈에 최적화한 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "코돈 최적화"는 코딩된 단백질이 유기체에서 보다 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈을 변화시키는 것을 의미한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는, 몇몇 코돈에 의해 표시된다는 점에서, 유전자 코드가 축퇴적이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 용법은 임의적이지 않고 특정 코돈 트리플렛에 편향적이다. 이러한 코돈 용법 편향성은 소정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현되는 단백질 대 낮은 복제수 단백질, 및 유기체 게놈의 집합적 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다.

본 발명의 에틸렌 생산을 감소시키는 방법에 있어서, 상기 발현 카세트 2는 서열번호 3 내지 5의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 LeMADS-RIN 단백질을 코딩하는 유전자의 표적 서열을 포함하며, 발현 카세트 2를 통해 LeMADS-RIN 단백질을 코딩하는 유전자의 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 표적 서열에 상보적으로 혼성화될 수 있는 단일 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA)가 만들어진다. 본 발명의 상기 서열번호 3 내지 5의 염기서열은 모두 LeMADS-RIN 단백질을 코딩하는 유전자의 서열 일부를 의미한다.

용어 "가이드 RNA(guide RNA)"는 편집하려는 DNA 위치를 찾아내는 역할을 수행하는 단일 가닥 RNA를 의미하며, 상기 가이드 RNA는 PAM(protospacer adjacent motif) 자리와 인접하며, 편집하려는 DNA의 10~20bp의 염기 서열과 상보적인 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 에틸렌 생산을 감소시키는 방법에 있어서, 상기 재조합 벡터가 식물 세포에 형질전환되면, DNA 결합 및 절단 활성이 있는 Cas9 단백질과 상기 Cas9 단백질에 결합되며 표적 서열로 Cas9 단백질을 이끄는 sgRNA가 함께 발현되게 된다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 비아포스(bialophos), 글리포세이트(glyphosate), 포스피노트리신(phosphinothricin) 및 글루포시네이트(glufosinate)와 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

"프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(nopaline synthase, NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway et al.,1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al.,1987, Nature 327: 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EPA 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 바이너리 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은

서열번호 12의 염기서열로 이루어진 Cas9(CRISPR associated protein 9)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 1; 및 서열번호 3 내지 5의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 LeMADS-RIN 단백질을 코딩하는 유전자의 표적 서열을 포함하는 발현 카세트 2;를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 에틸렌 생산이 감소된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 제조 방법은, 발현 카세트 1에 의해 발현되는 Cas9 단백질 및 발현 카세트 2에 의해 생성되는 sgRNA를 통해, LeMADS-RIN 유전자의 편집을 통해 식물 세포에서 LeMADS-RIN 유전자의 발현을 저해시켜, 비형질전환체에 비해 에틸렌 생성이 감소된 형질전환 식물체를 제조하는 것이다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 LeMADS-RIN 단백질은 토마토 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, LeMADS-RIN 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 에틸렌 생산이 감소된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

본 발명에 따른 제조 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 토마토, 애기장대, 가지, 담배, 고추, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물될 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 토마토 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 Cas9(CRISPR associated protein 9)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 1; 및 서열번호 3 내지 5의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 LeMADS-RIN 단백질을 코딩하는 유전자의 표적 서열을 포함하는 발현 카세트 2;를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 식물체의 에틸렌 생산 감소용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은, 유효성분으로 Cas9과 sgRNA를 코딩하는 재조합 벡터를 포함하며, 상기 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시킴으로써, 식물체의 에틸렌 생산을 감소시킬 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

식물재료

토마토(Solanum lycopersicum L.) 품종은 TYLCV(Tomato Yellow Leaf Curl Virus)계 '마미리오(Mamirio)'와 β-카로틴(carotene) 함량이 높은 '골든벨(Golden bell)' 품종을 사용하였다. 토마토 종자는 70% 에탄올과 2% 차염소산나트륨으로 소독한 후 멸균수로 3회 세척하여 MSR3 배지에 파종하고, 23±2℃ 배양실에서 10~14일간 무균배양 후 자엽을 잘라서 형질전환에 사용하였다. 재분화된 식물체는 포트로 이식하여 후대를 육성하였고, 토마토 잎은 잘라서 FavorPrep^TM Plant Genomic DNA Extraction Mini kit(Favorgen Biotech Corp. Taiwan)를 이용하여 게노믹(genomic) DNA를 추출하였다.

본 발명에 사용된 배지 종류 및 조성

배지명	성분
MSR3	4.4g l^-1 MS salts, 30g l^-1 sucrose, 1ml l^-1 R3 vitamins(1g l^-1thiamine, 0.5g l^-1 nicotinic acid, 0.5g l^-1 pyridoxine), 10g l^-1bacteriological ager, pH 5.9
MS 2.4-D	4.4g l^-1 MS salts, 30g l^-1 sucrose, 0.2g l^-1 KH₂PO₄, 1ml l^-1 R3 vitamins, 0.1 mg l^-1 kinetin, 0.2mg l^-1 2.4-D, pH 5.7
3C5ZR plates(M1)	MSR3 media with 10g l^-1bacteriological agar, 1.75mg l^-1 zeatin riboside, 0.87mg l^-1 IAA, pH 5.8
M13	MSR3 media with 1.75mg l^-1 of Zeatin and 0.87mg l^-1 of IAA, 4 ㎍ ml^-1 PPT and 400㎍ ml^-1 carbenicillin, pH 5.8
M4	MSR3 media with 1.75mg l^-1 of Zeatin and 0.87mg l^-1 of IAA with 3 ㎍ ml^-1 PPT and 400㎍ ml^-1 carbenicillin, pH 5.8
M16	MSR3 media with 3 ㎍ ml^-1 PPT and 400㎍ ml^-1 carbenicillin, no IAA and Zeatin, pH 5.8

RGEN (RNA-guided engineered nuclease)의 선정

토마토 과실 성숙 관련 LeMADS -RIN(accession no. AF448522) 유전자의 편집을 위하여 Gramene 데이터베이스 웹사이트(http://ensembl.gramene.org/Solanum_lycopersicum/Info/Index)로부터 토마토 유전자의 게놈 정보를 확인하고(Gene: Solyc05g012020.2), CRISPR RGEN tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)을 이용하여 sgRNA(single guide RNA)를 디자인하였다. RGEN은 CRISPR/Cas9효소가 인식하는 PAM(Proto-Spacer Adjacent Motif) 영역인 5'-NGG-3' 서열을 제외한 20bp 크기의 염기로 구성된다. 이렇게 얻어진 sgRNA들은 mismatch 1, 2에서 오프-타겟(off-target)이 제거된 목록 1-0-0으로 나온 것과, 30~70% 사이의 GC 함량으로 구성되고, out-of-frame 소스가 높은 순으로 RGEN 후보를 선정하였다(표 2).

RGEN 기구를 사용하여 토마토 게놈에서 LeMADS - RIN 유전자의 선별된 RGEN 표적 중에서 잠재적인 오프-타겟 자리 및 온-타겟에서 돌연변이 빈도

sgRNA	RGEN 표적서열(5'→3') (서열번호)	방향	GC 함량(%)	Out-of-frame Score^x	Mismatch
sgRNA	RGEN 표적서열(5'→3') (서열번호)	방향	GC 함량(%)	Out-of-frame Score^x	0bp	1bp	2bp
RGEN1	ACAATTGGGCACAAAAGACTTGG (3)	+	40	62.0	1	0	0
RGEN2	GTGTTACCTTTCAAACATCATGG (4)	+	35	62.5	1	0	0
RGEN3	AAAAATCCCTCATGATGAGAAGG (5)	-	35	39.6	1	0	0

(x : 되도록 많은 단백질 코딩 서열 내에서 원치 않는 in-frame 결실을 피하기 위해서, 높은 out-of-frame 스코어를 가진 표적 자리를 선택해야 한다.)

CRISPR / Cas9 이용 벡터 구축

토마토 형질전환을 위한 Ti-플라스미드 벡터, pBAtC는 CRISPR/Cas9 효소가 CaMV 35S 프로모터에 의해 제어되며, sgRNA는 AtU6 프로모터에 의하여 작동되도록 구축한 기본벡터를 이용하였다(Kim et al., (2016) J Integr Plant Biol 58(8):705-712). CRISPR RGEN tools로부터 선정된 3개의 RGEN은 유전자를 합성한 후 제한효소 AarI을 사용하여 pBAtC 벡터에 삽입하여 완성하였다. 구축된 pBAtC-RGEN 벡터는 각각 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 균주에 형질전환하여 이용하였다. 상기 형질전환된 아그로박테리움으로 토마토를 형질전환시켜 얻어진 식물체의 선발마커는 Bar 유전자를 이용하였다.

형질전환 토마토 육성 및 형질도입 확인

토마토 종자는 70% 에탄올과 2% 차염소산나트륨으로 소독한 후 멸균수로 3회 세척하여 MSR3 배지에 파종하고, 23±2℃ 배양실에서 10~14일간 무균배양 후, 양 끝 단면을 잘라버린 자엽을 MS 2,4-D 액체배지에 30~60분간 침적하였다. 그리고 M1 고체배지에 옮겨 24시간 배양하였다. pBAtC-RGEN 벡터가 도입된 아그로박테리움 균주는 OD₆₀₀=1.8~2.0으로 조정한 후, 24시간 M1 배지에서 배양된 자엽에 15분간 감염시킨 후 M1 배지에 옮겨 2일간 공동 배양하였다. 아그로박테리움에 의해 감염된 자엽은 M13 배지에 옮겨 캘러스가 형성할 때까지 배양한 후, M4 배지로 옮겨 신초를 형성시켜 M16 배지에서 뿌리 활착(rooting)시킨 후, 순화과정을 거쳐 포트에 이식하였다. pBAtC-RGEN 벡터의 도입을 확인하기 위하여 재분화된 개체의 잎으로부터 게노믹 DNA를 분리하여 nos-bar 유전자 특이 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 PCR 분석을 수행하였다. 이때 사용한 유전자 프라이머는 bar-정방향: 5'-CGTCAACCACTACATCGAGA-3'(서열번호 6) 및 nos-역방향: 5'-TTGCGCGCTATATTTTGTTT-3'(서열번호 7)이고, 증폭 반응은 95℃에서 5분간 전-변성시킨 후, 94℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30초간 결합, 72℃에서 1분간 신장 과정을 30회 반복으로 수행하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 신장 단계를 실시하였다.

단일 카피(single copy) 도입 개체의 선발 및 염기서열 분석을 통한 변이체 확인

PCR 분석을 통해 확인된 형질전환체(T₀)로부터 단일 카피로 pBAtC-RGEN가 도입된 개체를 선발하기 위해 TaqMan PCR 분석을 수행하였다. 대조군으로 단일 카피 도입이 확인된 형질전환체 T₂ 호모(homo) 개체와 T₂ 헤테로(hetero) 개체의 DNA를 이용하였으며, TaqMan probe PCR 반응 조건은 95℃에서 10분간 전변성시킨 후, 95℃에서 20초 변성, 56℃에서 1분 결합을 40회 반복 실시하였고, 결합 반응 중에 소광체(quencher)로부터 분리된 형광염료 FAM이 활성화될 때마다 형광을 탐지하고 처음 탐지된 사이클 수(ct)는 amplification plots로 표현하였다. TaqMan probe real-time PCR로 복제된 증폭산물은 nos 터미네이터에 특이적인 라벨링한 프로브를 이용하여 분석하였다. 선발된 단일 카피 개체들로부터 유전자 편집 여부의 확인은 유전자의 표적부위인 sgRNA 부분이 포함되며, 각각 362bp와 571bp의 PCR 산물을 얻을 수 있도록 각각의 표적부위마다 특이 증폭용 프라이머 세트를 작성하고, 잎으로부터 추출한 DNA를 이용하여 PCR 분석을 수행하였다. 사용된 프라이머 정보는 하기 표 3과 같다.

프라이머 서열 정보

표적		염기서열 (5'→3')
RGEN1	F	TTGAAGCTTAAAACAAGAGTGGAA (서열번호 8)
RGEN1	R	tgcctcaatgatgaatccaa (서열번호 9)
RGEN2 & RGEN3	F	ctgaaatgaacaaatctttgagaa (서열번호 10)
RGEN2 & RGEN3	R	ggccctacttgtgaggttacac (서열번호 11)

대조군과 각각의 형질전환 개체들의 PCR 산물은 ㈜바이오니아(한국)에 의뢰하여 염기서열 분석을 수행하였다.

에틸렌 생산량 측정

pBAtC-RGEN 형질전환 토마토 T₀세대 중에서 RIN 유전자가 편집된 TG4, TG12 및 TG26 개체의 에틸렌 생산량을 측정하기 위하여 토마토를 1L의 밀폐 유리병에 담고 25℃ 상온에서 3시간 동안 배양한 후, ALUMINA F-1 column(Alltech Associates, Deerfield, IL, USA)과 FID가 장착된 가스 크로마토그래피(Model 3800, Varian Inc, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 에틸렌 생산량을 측정하였다.

실시예 1. sgRNA 디자인 및 CRISPR - Cas9 벡터 구축

토마토 과실 성숙 관련 LeMADS -RIN 유전자는 5번 염색체에 위치하여 8개의 엑손을 가지며, ORF(open reading frame)은 729bp이고, 242개의 아미노산으로 구성되어 있다. 에틸렌 생합성은 LeMADS, LeACS 및 LeAOC 등 많은 유전자들의 발현 조절을 통해 과실 성숙에 관여한다고 알려져 있다(도 1A). 최근 들어 LeMADS -RIN 유전자의 엑손 부분이 결실되어 있는 돌연변이체(rin)가 발견되어 성숙에 관한 유전생리학적 연구가 많이 진행되었다. 따라서 LeMADS - RIN 유전자 부위의 CRISPR/Cas9효소가 인식할 수 있는 sgRNA을 선정하기 위해 각 엑손 영역을 CRISPR RGEN tools에 삽입하여 sgRNA(single guide RNA) 3개를 선발하였다(도 1B). 선발된 sgRNA는 Cas9 자체에 의해 인식되는 3bp의 트리뉴클레오티드(5'-NGG-3') 영역을 제외한 20bp의 염기로 구성되며, GC 함량은 35~40%를 보였다. RGEN1과 RGEN2의 out-of-frame score는 62.0이고, RGEN3는 39.6이었으며, 게놈상 미스매치 영역이 1-0-0이므로 오프 타겟 확률이 낮게 나타났다. sgRNA는 유전자를 합성한 후, AarI에 의해 자른 후, Cas9 효소가 포함된 식물발현 벡터인 pBAtC에 클로닝 하였다(도 1C). 이전의 연구들은 미스매치 영역이 0bp는 1, 1bp와 2bp는 0인 경우에 목적 유전자 편집 영역 외의 오프 타겟 영역의 변이가 발생할 확률이 낮다고 하였다. 또한 sgRNA 영역의 GC 함량이 30~70%이며, out-of-frame score가 높게 나온 것을 선정하는 것이 삽입결실(insertion/deletion; indel)이 일어났을 때 frame-shift가 일어날 가능성을 예측하여 유전자 편집의 효율을 증대시킬 수 있다고 보고하였다. 본 발명에서 선정한 3개의 sgRNA는 기존에 제시한 조건을 모두 만족하였다.

실시예 2. 형질전환체의 육성과 T-DNA 도입 확인 및 single copy 선발

식물발현 벡터에 sgRNA1~3을 각각 구축된 벡터(pBAtC-RGEN1~3)를 이용하여 '마미리오'와 '골든벨' 품종에 형질전환하였다. 토마토 종자를 발아시킨 후 14일된 유묘에서 얻어진 자엽 절편에 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404를 이용하여 형질전환시켰다(도 2A). 감염된 자엽은 M13 배지에서 캘러스를 형성시키고, 다시 M4배지로 옮겨 신초를 형성시킨 다음 M16 배지에서 뿌리 활착시킨 후에 최종적으로 순화과정을 거쳐 포트에 이식하였다(도 2B). 형질전환 실험에서 얻어진 재분화 식물체를 대상으로 유전자의 도입 여부를 확인하기 위해 nos-bar 유전자 특이 증폭용 프라이머를 이용하여 PCR 분석을 수행한 결과 총 85개의 형질전환 식물체를 얻었다(도 2, 표 4).

형질전환 식물체 특성

Target region	No. of embryogenic callus	No. of regenerated shoots	No. of transgenic	No. of single copy	No. of gene edited plants	Ratio of edited plants*
RGEN1	120	62	32	6	4	12.5
RGEN2	122	40	34	6	3	8.8
RGEN3	119	38	19	5	2	10.5
total	361	140	85	17	9	10.6

(*: number of gene edited plant/number of transgenic plant)

형질전환체에서 단일 카피 여부를 알기 위해 TaqMan PCR 분석을 실시한 결과 RGEN1 도입 형질전환체 32개체 중 6개체, RGEN2 도입 형질전환체 34개체 중 6개체 및 RGEN3 도입 형질전환체 19개체 중 5개체 등 총 17개 T₀ 식물체에서 단일 카피 도입이 확인되었고, 이들 식물체로부터 T₁ 종자를 채종하여 계통화하였다(도 2C, D).

실시예 3. 유전자 편집 확인 및 에틸렌 생산량 분석

도입유전자가 단일 카피로 삽입된 T₀ 개체들로부터 유전자 편집 여부의 확인은 LeMADS -RIN 유전자의 표적부분이 포함되도록 제작된 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하고, 증폭 산물의 염기서열을 분석하였다. 식물발현 벡터에 각각 도입된 3개의 sgRNA(RGEN1, RGEN2, RGEN3) 중 RGEN1이 도입된 6개의 형질전환체 중 2개체는 변이가 없었으며, TG2 변이체는 T/A로 치환되었고, TG4 변이체는 17bp가 결실되었고, TG8 변이체는 4bp가 결실되었으며, TG10 변이체는 1bp가 결실된 것으로 확인되었다. RGEN2가 도입된 6개의 형질전환체 중 3개체는 변이가 없었으며, TG12 변이체는 28bp가 결실되었고, TG16 변이체는 2bp가 결실되었으며, TG17 변이체는 1bp가 결실된 것으로 확인되었다. RGEN3가 도입된 5개의 형질전환체 중 3개체는 변이가 없었으며, TG23 변이체는 T/A로 치환되었고, TG26 변이체는 2bp가 결실된 것으로 확인되어, 최종적으로 총 9계통을 선발하였다(도 3A). 이들 변이체로부터 아미노산 합성여부를 조사한 결과는 도 3B와 같이 '마미리오' 품종으로부터 얻어진 TG4 및 '골든벨' 품종으로부터 얻어진 TG12와 TG26 개체에서 종결 코돈이 형성되어 단백질 발현 및 아미노산 생성이 불활성화된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 선발된 TG4, TG12와 TG26의 과실에서 에틸렌 생산량의 변화를 살펴본 결과 대조구에 비해 에틸렌 생산량이 현저히 감소된 것이 관찰되었다(도 4). 이러한 결과는 과실 숙성을 저해하는 LeMADS -RIN 유전자가 녹아웃(knockout)되어 RIN 단백질이 축적되지 않아 에틸렌 생산에 변화를 보인 것으로 유추되었다. 본 발명에서 사용한 '마미리오' 및 '골든벨' 품종은 세계적으로 유명한 레드계 품종으로 RIN 유전자 편집에 의해 다양한 과색 변이를 보여주었으며 아울러 에틸렌 생산량이 현저히 감소하는 결과를 보였다(도 4). 따라서 이들 유전자 편집 계통들은 과실의 저장성이 매우 좋을 것으로 기대되었다. 지금까지 보고된 에틸렌(ethylene) 생합성 과정은 메티오닌으로부터 SAM(S-adenosyl-L-Methionine)을 거쳐 ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid)로, ACC가 에틸렌으로 전환되는 두 단계에 의해 생합성된다고 알려져 있으며, LeMADS -RIN 유전자 발현을 통해 상기 첫 번째 단계에서는 ACC 생성효소(ACC synthase, ACS)에 의해, 두 번째 단계에서는 ACC 산화효소(ACC oxidase, ACO)에 의해 에틸렌 생합성이 이루어진다. 토마토에서 ACS와 ACO는 다중유전자 패밀리(multigene family)를 이루고 있으며, ACS에는 LE- ACSIA, LE-ACSIB와 LE- ACS2~7 등이 있으며, ACO에는 LE- ACO1~4가 존재한다. 에틸렌의 조절작용 시스템은 두 가지로 구분되는데, 이 중 과실 숙성과 노화에 관련된 시스템 작동 시 LE- ACS2와 LE- ACS4가 에틸렌 합성에 관여한 다음, LE- ACO3, Le- ACO4 유전자가 유도되면서 신호전달과 전사인자들의 작용으로 에틸렌 생합성이 조절되며 과실 숙성이 이루어진다고 알려져 있다. 본 발명에서 토마토 과실 성숙 관련 LeMADS -RIN 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 적용하여 편집한 후 선발된 형질전환체는 공지된 rin 토마토 돌연변이 계통과 유사한 결과를 보여주었다. 이에 본 발명의 형질전환체는 과실 성숙에 관한 분자기작, 세포벽 및 대사체 연구, 에틸렌 생합성 경로 및 응답반응 등에 대한 연구 재료로써 활용 가능성도 시사된다.

<110> Hankyong Industry Academic Cooperation Center <120> Method for reducing ethylene production by LeMADS-RIN gene editing using CRISPR/Cas9 system in plant <130> PN17425 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 729 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 1 atgggtagag ggaaagtaga attgaagaga attgagaaca aaataaatag acaagttacc 60 tttgcaaaga gaagaaatgg actcctaaag aaagcttatg aactttctat actttgtgat 120 gctgaaattg ctcttattat tttctctagt cgtggcaagc tttatgaatt ttgcagcaat 180 tcaagtatgt ccaagacatt ggagagatac cacagataca attatggtac acttgaagga 240 acccaaactt catcagattc acagaacaac taccaagagt atttgaagct taaaacaaga 300 gtggaaatgt tacaacagtc tcaaaggcat ttgctaggtg aggatttggg acaattgggc 360 acaaaagact tggaacagct tgaacgtcaa ttggattcat cattgaggca aattaggtca 420 acaaagacac aacacattct tgatcaactt gctgaacttc aacaaaagga acaatctctt 480 actgaaatga acaaatcttt gagaataaag ttggaagaac ttggtgttac ctttcaaaca 540 tcatggcatt gtggtgagca aagtgtacaa tatagacatg aacagccttc tcatcatgag 600 ggattttttc aacatgtaaa ttgcaataat acattgccta taagttacgg atacgataat 660 gtacaacccg aaaatgcagc accatcaaca catgatgcta ctggagttgt acctggatgg 720 atgctttga 729 <210> 2 <211> 242 <212> PRT <213> Solanum lycopersicum <400> 2 Met Gly Arg Gly Lys Val Glu Leu Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ala Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala 20 25 30 Tyr Glu Leu Ser Ile Leu Cys Asp Ala Glu Ile Ala Leu Ile Ile Phe 35 40 45 Ser Ser Arg Gly Lys Leu Tyr Glu Phe Cys Ser Asn Ser Ser Met Ser 50 55 60 Lys Thr Leu Glu Arg Tyr His Arg Tyr Asn Tyr Gly Thr Leu Glu Gly 65 70 75 80 Thr Gln Thr Ser Ser Asp Ser Gln Asn Asn Tyr Gln Glu Tyr Leu Lys 85 90 95 Leu Lys Thr Arg Val Glu Met Leu Gln Gln Ser Gln Arg His Leu Leu 100 105 110 Gly Glu Asp Leu Gly Gln Leu Gly Thr Lys Asp Leu Glu Gln Leu Glu 115 120 125 Arg Gln Leu Asp Ser Ser Leu Arg Gln Ile Arg Ser Thr Lys Thr Gln 130 135 140 His Ile Leu Asp Gln Leu Ala Glu Leu Gln Gln Lys Glu Gln Ser Leu 145 150 155 160 Thr Glu Met Asn Lys Ser Leu Arg Ile Lys Leu Glu Glu Leu Gly Val 165 170 175 Thr Phe Gln Thr Ser Trp His Cys Gly Glu Gln Ser Val Gln Tyr Arg 180 185 190 His Glu Gln Pro Ser His His Glu Gly Phe Phe Gln His Val Asn Cys 195 200 205 Asn Asn Thr Leu Pro Ile Ser Tyr Gly Tyr Asp Asn Val Gln Pro Glu 210 215 220 Asn Ala Ala Pro Ser Thr His Asp Ala Thr Gly Val Val Pro Gly Trp 225 230 235 240 Met Leu <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGEN target sequence 1 <400> 3 acaattgggc acaaaagact tgg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGEN target sequence 2 <400> 4 gtgttacctt tcaaacatca tgg 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGEN target sequence 3 <400> 5 aaaaatccct catgatgaga agg 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgtcaaccac tacatcgaga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ttgcgcgcta tattttgttt 20 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ttgaagctta aaacaagagt ggaa 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tgcctcaatg atgaatccaa 20 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ctgaaatgaa caaatctttg agaa 24 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggccctactt gtgaggttac ac 22 <210> 12 <211> 4104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human codon optimized Cas9 <400> 12 gtcgccgccc agctggctca ggtcgatgcg ggtctcgtac agaccggtga tgctctggtg 60 gatcagggtg gcgtccagca cctccttggt gctggtgtag cgcttgcggt cgatggtggt 120 gtcgaagtac ttgaaggcgg cgggggcgcc caggttggtc agggtgaaca ggtggatgat 180 gttctcggcc tgctcgcgga tgggcttgtc gcggtgcttg ttgtaggcgc tcagcacctt 240 gtccaggttg gcgtcggcca ggatcacgcg cttgctgaac tcgctgatct gctcgatgat 300 ctcgtccagg tagtgcttgt gctgctccac gaacagctgc ttctgctcgt tgtcctcggg 360 gctgcccttc agcttctcgt agtggctggc caggtacagg aagttcacgt acttgctggg 420 cagggccagc tcgttgccct tctgcagctc gccggcgctg gccagcatgc gcttgcggcc 480 gttctccagc tcgaacaggc tgtacttggg cagcttgatg atcaggtcct tcttcacctc 540 cttgtagccc ttggcctcca ggaagtcgat ggggttcttc tcgaagctgc tgcgctccat 600 gatggtgatg cccagcagct ccttcacgct cttcagcttc ttgctcttgc ccttctccac 660 cttggccacc accagcacgc tgtaggccac ggtggggctg tcgaagccgc cgtacttctt 720 ggggtcccag tccttcttgc gggcgatcag cttgtcgctg ttgcgcttgg gcaggatgct 780 ctccttgctg aagccgccgg tctgcacctc ggtcttcttc acgatgttca cctggggcat 840 gctcagcacc ttgcgcacgg tggcgaagtc gcggcccttg tcccacacga tctcgccggt 900 ctcgccgttg gtctcgatca gggggcgctt gcggatctcg ccgttggcca gggtgatctc 960 ggtcttgaag aagttcatga tgttgctgta gaagaagtac ttggcggtgg ccttgccgat 1020 ctcctgctcg ctcttggcga tcatcttgcg cacgtcgtac accttgtagt cgccgtacac 1080 gaactcgctc tccagcttgg ggtacttctt gatcagggcg gtgcccacca cggcgttcag 1140 gtaggcgtcg tgggcgtggt ggtagttgtt gatctcgcgc accttgtaga actggaagtc 1200 cttgcggaag tcgctcacca gcttgctctt cagggtgatc accttcacct cgcggatcag 1260 cttgtcgttc tcgtcgtact tggtgttcat gcggctgtcc aggatctggg ccacgtgctt 1320 ggtgatctgg cgggtctcca ccagctggcg cttgatgaag ccggccttgt ccagctcgct 1380 caggccgccg cgctcggcct tggtcaggtt gtcgaacttg cgctgggtga tcagcttggc 1440 gttcagcagc tggcgccagt agttcttcat cttcttcacc acctcctcgc tgggcacgtt 1500 gtcgctcttg ccgcggttct tgtcgctgcg ggtcagcacc ttgttgtcga tgctgtcgtc 1560 cttcaggaag ctctggggca cgatgtggtc cacgtcgtag tcgctcaggc ggttgatgtc 1620 cagctcctgg tccacgtaca tgtcgcggcc gttctgcagg tagtacaggt acagcttctc 1680 gttctgcagc tgggtgttct ccacggggtg ctccttcagg atctggctgc ccagctcctt 1740 gatgccctcc tcgatgcgct tcatgcgctc gcggctgttc ttctggccct tctgggtggt 1800 ctggttctcg cgggccatct cgatcacgat gttctcgggc ttgtggcggc ccatcacctt 1860 caccagctcg tccaccacct tcacggtctg caggatgccc ttcttgatgg cggggctgcc 1920 ggccaggttg gcgatgtgct cgtgcaggct gtcgccctgg ccgctcacct gggccttctg 1980 gatgtcctcc ttgaaggtca ggctgtcgtc gtggatcagc tgcatgaagt tgcggttggc 2040 gaagccgtcg ctcttcagga agtccaggat ggtcttgccg ctctgcttgt cgcggatgcc 2100 gttgataagc ttgcggctca ggcggcccca gccggtgtag cggcggcgct tcagctgctt 2160 catcaccttg tcgtcgaaca ggtgggcgta ggtcttcagg cgctcctcga tcatctcgcg 2220 gtcctcgaac agggtcaggg tcagcacgat gtcctccagg atgtcctcgt tctcctcgtt 2280 gtccaggaag tccttgtcct tgatgatctt cagcaggtcg tggtaggtgc ccaggctggc 2340 gttgaagcgg tcctccacgc cgctgatctc cacgctgtcg aagcactcga tcttcttgaa 2400 gtagtcctcc ttcagctgct tcacggtcac cttgcggttg gtcttgaaca gcaggtccac 2460 gatggccttc ttctgctcgc cgctcaggaa ggcgggcttg cgcatgccct cggtcacgta 2520 cttcaccttg gtcagctcgt tgtacacggt gaagtactcg tacagcaggc tgtgcttggg 2580 cagcaccttc tcgttgggca ggttcttgtc gaagttggtc atgcgctcga tgaagctctg 2640 ggcgctggcg cccttgtcca ccacctcctc gaagttccag ggggtgatgg tctcctcgct 2700 cttgcgggtc atccaggcga agcggctgtt gccgcgggcc agggggccca cgtagtaggg 2760 gatgcggaag gtcaggatct tctcgatctt ctcgcggttg tccttcagga aggggtagaa 2820 gtcctcctgg cggcgcagga tggcgtgcag ctcgcccagg tggatctggt gggggatgct 2880 gccgttgtcg aaggtgcgct gcttgcgcag caggtcctcg cggttcagct tcaccagcag 2940 ctcctcggtg ccgtccatct tctccaggat gggcttgatg aacttgtaga actcctcctg 3000 gctggcgccg ccgtcgatgt agccggcgta gccgttcttg ctctggtcga agaagatctc 3060 cttgtacttc tcgggcagct gctggcgcac cagggccttc agcagggtca ggtcctggtg 3120 gtgctcgtcg tagcgcttga tcatgctggc gctcaggggg gccttggtga tctcggtgtt 3180 cacgcgcagg atgtcgctca gcaggatggc gtcgctcagg ttcttggcgg ccaggaacag 3240 gtcggcgtac tggtcgccga tctgggccag caggttgtcc aggtcgtcgt cgtaggtgtc 3300 cttgctcagc tgcagcttgg cgtcctcggc caggtcgaag ttgctcttga agttgggggt 3360 caggcccagg ctcagggcga tcaggttgcc gaacaggccg ttcttcttct cgccgggcag 3420 ctgggcgatc aggttctcca ggcggcggct cttgctcagg cgggcgctca ggatggcctt 3480 ggcgtccacg ccgctggcgt tgatggggtt ctcctcgaac agctggttgt aggtctgcac 3540 cagctggatg aacagcttgt ccacgtcgct gttgtcgggg ttcaggtcgc cctcgatcag 3600 gaagtggccg cggaacttga tcatgtgggc cagggccagg tagatcaggc gcaggtcggc 3660 cttgtcggtg ctgtccacca gcttcttgcg cagatggtag atggtggggt acttctcgtg 3720 gtaggccacc tcgtccacga tgttgccgaa gatggggtgg cgctcgtgct tcttgtcctc 3780 ctccaccagg aagctctcct ccaggcggtg gaagaagctg tcgtccacct tggccatctc 3840 gttgctgaag atctcctgca ggtagcagat gcggttcttg cggcgggtgt agcggcggcg 3900 ggcggtgcgc ttcaggcggg tggcctcggc ggtctcgccg ctgtcgaaca gcagggcgcc 3960 gatcaggttc ttcttgatgc tgtggcggtc ggtgttgccc agcaccttga acttcttgct 4020 gggcaccttg tactcgtcgg tgatcacggc ccagcccacg ctgttggtac cgatgtccag 4080 gccgatgctg tacttcttgt ccat 4104

Claims

서열번호 12의 염기서열로 이루어진, 인간 코돈에 최적화된 Cas9(CRISPR associated protein 9)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 1; 및 서열번호 3 내지 5의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 LeMADS-RIN 단백질을 코딩하는 유전자의 표적 서열을 포함하는 발현 카세트 2;를 포함하는 재조합 벡터로 토마토 식물 세포를 형질전환하여 LeMADS-RIN 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해시키는 단계를 포함하는 토마토 식물체의 에틸렌(ethylene) 생산을 감소시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 LeMADS-RIN 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 토마토 식물체의 에틸렌 생산을 감소시키는 방법.
삭제
서열번호 12의 염기서열로 이루어진, 인간 코돈에 최적화된 Cas9(CRISPR associated protein 9)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 1; 및 서열번호 3 내지 5의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 LeMADS-RIN 단백질을 코딩하는 유전자의 표적 서열을 포함하는 발현 카세트 2;를 포함하는 재조합 벡터로 토마토 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 토마토 식물세포로부터 토마토 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 에틸렌 생산이 감소된 형질전환 토마토 식물체의 제조 방법.
제4항의 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 에틸렌 생산이 감소된 형질전환 토마토 식물체.
제5항에 따른 토마토 식물체의 형질전환된 종자.
서열번호 12의 염기서열로 이루어진, 인간 코돈에 최적화된 Cas9(CRISPR associated protein 9)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 1; 및 서열번호 3 내지 5의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 LeMADS-RIN 단백질을 코딩하는 유전자의 표적 서열을 포함하는 발현 카세트 2;를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 토마토 식물체의 에틸렌 생산 감소용 조성물.