WO2022114692A1 - CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 갈변 억제 감자 식물체의 제조방법 - Google Patents

CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 갈변 억제 감자 식물체의 제조방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention is (a) Potato-derived StPPO2 ( Solanum tuberosum Polyphenol Oxidases 2) gene specific guide RNA (guide RNA) and endonuclease (endonuclease) protein is introduced into the potato plant cell to generate the genome. correcting; and (b) re-differentiating the potato plant cells from the potato plant cells in which the genome has been corrected. It provides a method for producing a genome-edited potato plant with suppressed browning, comprising a.
  • the CRISPR/Cas9 system used in the present invention introduces a double helix break at a specific position of a specific gene to be corrected, and NHEJ induces an insertion-deletion (InDel) mutation due to incomplete repair induced in the DNA repair process. (non-homologous end joining) It is a gene editing method based on the mechanism.
  • a CRISPR/Cas9 RNP complex was prepared as follows. First, 15 ⁇ g of StPPO2-4 sgRNA (using 3 ⁇ l of sgRNA at a concentration of 5 ⁇ g/ ⁇ l) and 30 ⁇ g of Cas9 (using 6 ⁇ l of 5 ⁇ g/ ⁇ l of Cas9 protein) were put in a 2 ml tube, and NEB buffer (#3) ) was mixed with 1 ⁇ l and reacted at room temperature for 10 minutes. Thereafter, the CRISPR/Cas9 RNP complex was introduced into the prepared protoplasts by a PEG-mediated transfection method.
  • PEG solution composition for transduction 40% PEG Solution When making 2.5 ml PEG 4000 1 g 1M Mannitol 0.5 ml 1M CaCl 2 0.25 ml ddH 2 0 To be 2.5 ml (about 1 ml) Put in a 14 ml round tube, adjust 2.5 ml with the naked eye, microwave for 20 seconds, mix well to dissolve completely, cool at room temperature, and filter before use. PEG solution is prepared and used fresh after each experiment.
  • the protein concentration was measured through a Bradford assay, and the unit of PPO2 was calculated based on the measured protein concentration and absorbance at 410 nm.

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Abstract

본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 갈변 억제 감자 식물체의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 감자 유래 StPPO2 (Solanum tuberosum Polyphenol Oxidases 2) 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 포함하는 RNP(ribonucleoprotein) 복합체를 감자 원형질체에 형질도입하여 갈변이 억제된 유전체 교정 감자 식물체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 외래 유전자의 삽입이 없고, 자연적 변이와 구별할 수 없는 작은 변이만 가지고 있으므로, 안전성과 환경 유해성 여부를 평가하기 위해 막대한 비용과 시간이 소모되는 GMO(Genetically Modified Organism) 작물과 달리 비용과 시간을 절약할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

CRISPR/Cａｓ9 시스템을 이용한 갈변 억제 감자 식물체의 제조방법
본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 갈변 억제 감자 식물체의 제조방법에 한 것이다.
최근 소비자들의 식품구매 형태가 천연물 선호 및 건강 지향적으로 변화함과 동시에, 1인 및 핵가족 가구의 증가로 신선도와 편의성을 갖춘 최소가공 작물(minimally processed crops)의 수요가 증가하고 있다. 이러한 최소가공 작물은 생산 단계에서 세척, 박피 및 절단 등의 과정을 거치기 때문에 소비자는 이러한 제품을 구입한 후에는 전처리 과정을 거치지 않고 바로 사용할 수 있는 장점이 있다.
감자는 최소가공 작물 중 하나로 가공 공정에서 박피와 절단으로 인한 표면의 공기 노출과 세포벽 파괴로 효소적 갈변현상(enzymatic browning)이 쉽게 발생한다.
감자를 포함한 식물체에서 이러한 효소적 갈변현상의 주원인은 PPO (polyphenol oxidase) 단백질이며, PPO 단백질은 Cu2+를 함유한 효소로서 세포 내에 존재하는 폴리페놀 화합물을 산화시켜 L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine)로 전환되고, L-DOPA는 DOPA 퀴논으로 전환된 후 산화적 중합 반응을 거쳐 흑갈색의 멜라닌 색소를 형성하는 갈변 현상을 일으키게 된다.
이러한 갈변 반응은 최소가공 작물에 바람직하지 못한 색깔, 냄새를 지니게 할 뿐만 아니라 영양가를 저하시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 이와 같이 최소가공 작물을 저장 및 유통하는 도중에 갈변이 일어난 제품은 상품성이 저하되어 경제적 손실을 야기하므로 갈변을 억제할 필요가 있다.
최근의 게놈 편집 기술은 다양한 유형의 부위 특정 뉴클레아제(nuclease)를 사용하여 원하는 게놈 DNA 위치에서 유전자 돌연변이를 유도할 수 있는 가능성을 보여주었다. 그 중에서 CRISPR/Cas9 시스템은 식물 및 기타 많은 유기체와 관련하여 강력한 게놈 편집 도구로 알려졌다. 이 시스템의 장점은 표적 부위에 정확하고 효율적인 돌연변이의 도입이다. 또한, 유전자 편집 작물은 종래 전통 육종 기술을 통해 개발된 작물과 비교할 때 차이가 없는 것으로 보여지고 있다.
한편, 일본공개특허 제2019-507595호에는 '감소된 손상 유발성 표면 변색을 나타내는 식물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2016-0087651호에는 '갈변이 방지된 유색감자 및 유색감자의 갈변을 방지하는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 'CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 갈변 억제 감자 식물체의 제조방법'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 일반 교배육성이나 유전자 변형방법 대신 CRISPR 시스템을 이용하여 StPPO2 유전자를 교정하여 갈변을 억제하기 위해, 기내 배양시킨 무균 감자 유식물로부터 원형질체를 분리한 후 PEG 매개 형질주입(transfection) 방법으로 RNP 복합체(StPPO2 sgRNA+Cas9)을 도입한 후, 도입된 원형질체들의 세포 재생 및 분화를 통하여 궁극적으로 StPPO2 유전자가 교정된 개체들을 선발하였으며 선발된 유전자 교정 식물체들 중에서 PPO2 단백질의 활성과 갈변 현상이 억제된 감자 계통들을 선발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 감자 유래 StPPO2 (Solanum tuberosum Polyphenol Oxidases 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 감자 유래 StPPO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 를 유효성분으로 함유하는, 감자 식물체의 갈변을 억제하기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 StPPO2 (Solanum tuberosum Polyphenol Oxidases 2) 유전자를 구성하는 뉴클레오티드 서열 중 표적 영역에 특이적인 RNA 서열이며, 상기 표적 영역은 서열번호 5의 염기서열인 가이드 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 감자 유래 StPPO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 감자 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (b) 상기 유전체가 교정된 감자 식물세포로부터 감자 식물체를 재분화하는 단계; 를 포함하는, 갈변이 억제된 유전체 교정 감자 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 갈변이 억제된 유전체 교정 감자 식물체 및 이의 유전체가 교정된 씨감자를 제공한다.
본 발명의 방법을 통해 제조된 갈변이 억제된 유전체 교정 감자 식물체는 미리 깎거나 갈아 놓아도 갈변이 늦게 일어나 가공이나 조리작업이 편리하고, 갈변 억제를 위한 가열과 인공첨가제 등의 추가 공정을 줄일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 외래 유전자의 삽입이 없고, 자연적 변이와 구별할 수 없는 작은 변이만 가지고 있으므로, 안전성과 환경 유해성 여부를 평가하기 위해 막대한 비용과 시간이 소모되는 GMO(Genetically Modified Organism) 작물과 달리 비용과 시간을 절약할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1 내지 도 4는 후보 sgRNA의 검증을 위해 수행한 In vivo assay의 Target deep-sequencing 결과이다.
도 5는 감자 유식물체의 잎으로부터 원형질체를 분리하는 것을 보여주는 것으로, (A)는 감자 유식물체의 잎을 VCP 처리하는 모습이고, (B)는 VCP 처리한 원형질체를 수크로스 농도 구배로 분리하여 확인된 intact한 원형질체(빨간 화살표 표시 부분)를 보여주는 모습이며, (C)는 최종적으로 분리된 원형질체의 현미경 관찰 사진이다.
도 6은 CRISPR/Cas9 RNP 복합체 도입 감자 원형질체로부터 재분화된 식물체의 모습이다.
도 7 내지 도 10은 CRISPR/Cas RNP 복합체가 도입된 원형질체로부터 재분화된 식물체 중 일부 개체들에 대한 deep-seq. 분석 결과이다.
도 11은 본 발명의 방법에 따른 감자 원형질체의 StPPO2 교정 효율(좌) 및 감자 원형질체 유래 StPPO2 교정체의 InDel 패턴(우)을 보여주는 결과이다.
도 12는 감자 괴경을 이용하여 PPO2 단백질의 활성을 측정한 결과이다.
도 13은 감자 괴경을 이용한 갈변 현상 관찰 결과로, (A)는 감자의 괴경을 슬라이스한 후 대조구(WT)와 유전자 교정체(GE#14, #25)를 비교한 모습이며, (B)는 감자 괴경을 껍질만 제거한 후 대조구(WT)와 유전자 교정체(GE#14, #25)를 비교한 모습이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감자 유래 StPPO2 (Solanum tuberosum Polyphenol Oxidases 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 감자 유래 StPPO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 를 유효성분으로 함유하는, 감자 식물체의 갈변을 억제하기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 감자 식물체의 갈변을 억제하기 위한 유전체 교정의 표적 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 StPPO2 유전자이다.
본 명세서에서 용어 "유전체/유전자 교정(genome/gene editing)"은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실(deletion), 삽입(insertion), 치환(substitutions) 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩(non-coding) DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 발명의 목적상 상기 유전체 교정은 특히 엔도뉴클레아제(endonuclease) 예컨대, Cas9 (CRISPR associated protein 9) 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여 식물체에 변이를 도입하는 것일 수 있다. 또한, 용어 '유전자 교정'은 '유전자 편집'과 혼용되어 사용될 수 있다.
또한, 용어 "표적 유전자"는 본 발명을 통해 교정하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미하며, 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 비-코딩 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 교정 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있다.
또한, 용어 "가이드 RNA(guide RNA)"는 짧은 단일 가닥의 RNA로, 표적 유전자를 암호화하는 염기서열 중 표적 DNA에 특이적인 RNA를 포함하며, 표적 DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염기서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA (dual RNA); 또는 표적 유전자 내 염기서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 엔도뉴클레아제(특히, RNA-가이드 뉴클레아제)와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA) 형태를 말하나, 엔도뉴클레아제가 표적 염기서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있으며, 함께 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 엔도뉴클레아제의 유래 미생물 등을 고려하여 당업계의 공지된 기술에 따라 제조하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것, 생체 외(in vitro)에서 전사된(transcribed) 것(예컨대, 올리고뉴클레오티드 이중가닥) 또는 합성한 가이드 RNA 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 StPPO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적으로 고안된 것으로서, 상기 서열번호 5의 염기서열에 특이적으로 고안된 가이드 RNA는 서열번호 2 내지 서열번호 4의 표적 염기서열에 특이적으로 고안된 다른 StPPO2 유전자 교정용 가이드 RNA에 비해 InDel 돌연변이 유도 효율이 높은 것이 특징이다. 특히, 감자는 4배체 작물이기 때문에 InDel 효율이 높은 가이드 RNA를 이용하여 CRISPR/Cas 시스템을 적용하면, 4개의 대립유전자가 모두 교정된 개체들을 확보할 수 있는 효율이 높아진다.
또한, 본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 Cas9, Cpf1 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1), TALEN (Transcription activator-like effector nuclease), ZFN (Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas9 단백질 또는 이의 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다.
Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM (Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.
본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 리보핵산-단백질(ribonucleoprotein) 복합체를 형성하여 RNA 유전자 가위(RNA-Guided Engineered Nuclease, RGEN)로 작동할 수 있다.
본 발명은 또한, StPPO2 (Solanum tuberosum Polyphenol Oxidases 2) 유전자를 구성하는 뉴클레오티드 서열 중 표적 영역에 특이적인 RNA 서열이며, 상기 표적 영역은 서열번호 5의 염기서열인 가이드 핵산을 제공한다.
본 발명에 따른 '가이드 핵산'은 전술한 '가이드 RNA'를 의미하며, 표적 영역에 특이적인 RNA 서열 외에, 엔도뉴클레아제 결합 부위를 포함한다. 상기 엔도뉴클레아제는 바람직하게는 RNA-가이드 뉴클레아제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 가이드 핵산은 바람직하게는 단일 사슬 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA) 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 가이드 핵산에 있어서, 상기 표적 영역에 특이적인 RNA 서열은 합성 시, PAM 염기로부터 20번째에 해당하는 표적 서열의 염기가 아데닌(adenine, A), 티민(thymine, T) 또는 시토신(cytosine, C)일 경우 구아닌(guanine, G)으로 대체하여 합성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 가이드 핵산은 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 StPPO2 유전자의 표적 서열에서 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 돌연변이를 유도할 때, 수 bp 크기(1~10 bp)의 결실 돌연변이를 일으켜, 수백 bp 크기의 염기 삽입 또는 결실 변이체를 유발할 수 있는 가이드 RNA에 비해 유전체 변이 측면에서 안전성이 상대적으로 높은 것이 특징이다.
또한, 본 발명은 (a) 감자 유래 StPPO2 (Solanum tuberosum Polyphenol Oxidases 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 감자 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (b) 상기 유전체가 교정된 감자 식물세포로부터 감자 식물체를 재분화하는 단계; 를 포함하는, 갈변이 억제된 유전체 교정 감자 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 StPPO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질은 전술한 것과 같다.
본 발명에서 사용된 CRISPR/Cas9 시스템은 교정하고자 하는 특정 유전자의 특정위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전 수선에 의한 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ(non-homologous end joining) 기작에 의한 유전자 교정 방법이다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 감자 식물세포에 도입하는 것은, 감자 유래 StPPO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 감자 유래 StPPO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체를 식물세포에 형질도입하는 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296:72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8:363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3:1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202:179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al., 1987, Nature 327:70), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 박테리아에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.
또한, 상기 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 것은 형질전환 방법을 의미한다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질이 도입되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 소포자, 난세포, 종자 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 식물세포는 원형질체이다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 유전체가 교정된 감자 식물세포는 StPPO2 유전자의 표적 염기서열에 1~10 bp 크기의 결실(deletion) 변이가 유도된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 유전체가 교정된 식물세포로부터 유전체가 교정된 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 유전체가 교정된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 갈변이 억제된 유전체 교정 감자 식물체 및 이의 유전체가 교정된 씨감자를 제공한다.
본 발명에 따른 갈변이 억제된 유전체 교정 감자 식물체는 갈변 현상에 관여하는 StPPO2 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 교정한 것으로, 감자 유래 StSPPO2 유전자가 녹-아웃되어, 유전체를 교정하지 않은 감자 식물체에 비해 갈변이 억제된 형질을 가지는 유전체 교정 감자 식물체이다.
특히, 본 발명에 따른 유전체 교정 감자 식물체는 StPPO2 유전자의 표적 염기서열에 1~10 bp 크기의 결실(deletion) 변이가 유도된 것일 수 있고, 이는 수백 bp 크기의 염기 삽입 또는 결실 변이체가 유발된 유전체 교정 식물체에 비해 유전체 변이 측면에서 안전성이 상대적으로 높은 것이 특징이다.
본 명세서에서 용어 'StPPO2'는 'StuPPO2'와 혼용되어 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. StPPO2 유전자 sgRNA 선발
CRISPR RGEN Tools 웹사이트(www.rgenome.net/Cas-designer)에서 감자 StPPO2 유전자 서열을 이용하여 4개의 서로 다른 sgRNA를 선발하였다(표 1). 하기 표 1에 개시된 sgRNA는 여러가지 조건들(GC contents, out of frame score, 및 게놈 서열내 mismatch number 등)을 반영하여 선발된 것들이다. 본 발명에 있어서, 서열번호 2 내지 5의 염기서열은 하기 표 1의 RGEN target 서열에서 PAM 염기(밑줄 표시)를 제외한 서열을 지칭한다.
감자 StPPO2 유전자 편집을 위한 sgRNA 표적 서열
sgRNA RGEN target* (5'→3')
(서열번호)		 방향 GC content
(%, w/o PAM)		 Out-of frame score Mismatchs
0 1 2
StPPO2-1 TCCATGGATGAAAAGTTGAGAGG (서열번호 2) - 40 91.2 0 2 1
StPPO2-2 TGCATGAAACTTTGAACATTTGG (서열번호 3) - 30 75.0 2 0 0
StPPO2-3 ATACTACAAGACGAGAGATCAGG (서열번호 4) - 40 79.1 0 0 2
StPPO2-4 TTAGGCGCGCAACAACTGTACGG (서열번호 5) - 50 72.5 1 0 0
* 밑줄 : PAM 염기.
선발된 4개의 표적 서열에 대한 sgRNA를 각각 합성한 후 검증을 위해 In vitro cleavage assay와 In vivo assay를 수행하였다. In vitro cleavage assay는 표적 DNA PCR 단편을 포함하는 시험 튜브에 Cas9 및 sgRNA 미포함(시료 1), 1 : 1 비율의 Cas9 및 sgRNA 첨가(시료 2), 1 : 3 비율의 Cas9 및 sgRNA 첨가(시료 3) 후 반응시켜 이들 반응산물을 전기영동 분석하여 해당 sgRNA의 표적 DNA에 대한 작동 여부를 조사하는 방법이다. 이 때, 분석에 사용한 sgRNA가 표적 DNA에 작동하게 되면 표적 DNA가 절단되어 2개 이상의 밴드가 확인되고, sgRNA가 표적 DNA에 작동하지 않으면 절단된 산물이 확인되지 않게 된다.
또한, In vivo assay는 선발된 각각의 sgRNA를 원형질체 세포(5 x 105)에 Cas9과 같이 PEG 매개 형질도입 방법으로 도입시키고 3일 정도 (핵 안에서 RNP [Cas9+sgRNA] 복합체가 표적 유전자에 반응하는 시간) 경과 후, 원형질체로부터 게노믹 DNA를 분리하여 PCR 방법을 통한 Target deep-sequencing 분석을 진행하여 InDel 효율을 분석하는 방법이다.
In vivo assay를 통한 4개의 선발된 sgRNA의 InDel 효율은 StPPO2-1 내지 StPPO2-3은 0%, StPPO2-4는 1.9%로 확인되었다(도 1 내지 도 4). 상기 검정 실험 결과에 기초하여 본 발명자는 최종적으로 StPPO2 유전자의 교정을 위한 sgRNA의 표적 서열로 StPPO2-4(서열번호 5)를 선발하였다.
실시예 2. 감자 원형질체 분리 및 배양 방법
페트리 디쉬에 10 ㎖의 VCP (Viscozyme, Celluclast, PectinEX) 효소 용액을 넣고 기내 배양한 Desiree 품종(Solanum tuberosum L. cv. Desiree) 유식물체의 잎(약 5~7 장)을 잘라 잎 뒷면이 위로 오도록 하여 상기 페트리 디쉬에 넣어준 후 25℃, 암 조건에서 45 rpm의 교반속도로 5시간 정도 반응시켰다. 그 후, 효소분해 정도를 관찰한 후 잎 조직이 투명하게 변하는 게 관찰되면 원형질체 분리를 진행하였다. VCP 효소 반응이 완료되면 disposable mesh (Falcon사 40 ㎛)을 사용하여 걸러낸 후, 14 ㎖ 라운드 튜브로 옮겨 800 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 버리고 W5 용액 (Menczel L. et al. (1981) Theor. Appl. Genet. 59;191-195)을 1 ㎖ 넣어준 후, 원형질체를 조심스럽게 풀어준 다음, 천천히 W5 용액 9 ㎖을 첨가한 후 800 rpm으로 5분간 원심분리하여 1차 세척을 진행하였다. 동일한 과정을 반복하여 2차 세척을 진행하고, 2차 세척 후 상층액을 버린 다음, W5 용액 5 ㎖을 천천히 넣고 20% 수크로스 5 ㎖이 들어있는 15 ㎖ 라운드 튜브에 조심스럽게 옮긴 다음 800 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 튜브의 중간부분에서 원형질체층(초록색 띠)이 확인 가능하며, 깨진 원형질체나 조직의 일부는 튜브 바닥에 가라앉는 것을 확인할 수 있었다. 끝이 뭉뚝한 파이펫 팁으로 원형질체층을 조심스럽게 추출하여 W5 용액 10 ㎖이 들어있는 새로운 15 ㎖ 라운드 튜브로 옮기고 800 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 제거한 후 1 ㎖의 W5 용액을 넣어 잘 풀어준 뒤 원형질체 상태를 현미경으로 관찰하였다(도 5).
분리한 원형질체의 상태가 양호하면 6 웰 플레이트에 3 ㎖의 PIM (Protoplast Inducing Media)를 넣은 후 요일별로 원형질체 및 세포분열 양상을 관찰하였다. 일반적으로 5일 정도 경과 후 세포분열이 관찰되며 2주 정도 후에는 세포들이 축적되기 시작하여 약 3주 정도 후에는 microcalli (육안 식별 가능하며 1 mm 미만)가 관찰되고, 4주 정도 지나면 1.2% low melting agar에서 배양 시 육안으로 하얀 스팟이 관찰 가능하다.
Figure PCTKR2021017138-appb-img-000001
실시예 3. CRISPR/Cas9 RNP 복합체를 이용한 감자 원형질체의 유전자 교정
실시예 2에서 기술한 방법을 통해 분리한 원형질체를 현미경하에서 혈구계(hemocytometer)를 이용하여 계수하여 약 10만개 정도의 원형질체를 CRISPR/Cas9 유전자 교정 실험에 사용하였다.
원형질체 분리가 완료되면 CRISPR/Cas9 RNP 복합체를 다음과 같이 제조하였다. 먼저, 2 ㎖ 튜브에 StPPO2-4 sgRNA 15 ㎍ (5 ㎍/㎕ 농도의 sgRNA를 3 ㎕ 사용)과 Cas9 30 ㎍ (5 ㎍/㎕의 Cas9 단백질을 6 ㎕ 사용)을 넣고, NEB buffer(#3) 1 ㎕를 섞어 상온에서 10분간 반응시켰다. 그 후 준비한 원형질체에 PEG 매개 형질주입(transfection) 방법으로 CRISPR/Cas9 RNP 복합체를 도입시켰다. 즉, 원형질체 (1 x 105) 200 ㎕와 CRISPR/Cas9 RNP 복합체 10 ㎕를 섞고, 40% PEG 용액을 동량(210 ㎕) 넣어 혼합한 후 상온에서 10분간 반응시켰다. 10분 경과 후 반응이 종료되면, 동량의(420 ㎕) W5 용액을 첨가한 후 1차 세척한 후, 600 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 잔존한 PEG를 제거하기 위해 다시 1 ㎖의 W5 용액을 첨가한 후 2차 세척 후 동일 조건으로 원심분리하였다. 세척 중에 미리 6 웰 플레이트에 PIM를 각 3 ㎖씩 분주하여 두었다. 원심분리 후 상층액을 제거한 원형질체에 1 ㎖의 PIM 용액을 넣어 잘 섞어준 후, 500 ㎕씩 상기 6 웰 플레이트의 각 웰에 분주한 후 밀봉한 후 25℃ 암 조건에서 배양하면서 원형질체 상태를 관찰하였다.
약 2주 후 원형질체가 어느 정도 안정되게 분열하면 최종 농도 1.2%의 low melting agar을 넣고 굳힌 다음 동조건에서 배양하며 관찰하였다. CRISPR/Cas9 RNP 복합체 도입 후, 약 3주가 경과하면 microcalli가 관찰되기 시작하고, low melting agar/PIM에서 배양 중인 microcalli를 CFM (Callus Forming Media)로 옮겨서 배양시켰다. CFM에서 배양중인 캘러스(직경 약 0.5 cm)를 SIM (Shoot Inducing Media)로 옮겨서 배양하고, 신초(shoot)가 유도된 개체로부터 뿌리를 유도하기 위하여 RIM (Root Inducing Media)으로 옮겨 배양하였다. CRISPR/Cas9 RNP 복합체 도입 원형질체로부터 약 16주 내외가 경과하면 완전한 하나의 식물체로 자라게 된다(도 6). 상기 원형질체 배양에 사용된 PIM, CFM, SIM, RIM 배지의 조성은 Ehsanpour 및 Jones (J. Sci. I. R. Iran. (2001), 12(2):103-110)의 보고를 참고하였다.
형질도입을 위한 PEG 용액 조성
40% PEG Solution 2.5 ㎖ 제작 시
PEG 4000 1g
1M Mannitol 0.5 ㎖
1M CaCl2 0.25 ㎖
ddH20 To be 2.5 ㎖ (약 1 ㎖ 정도)
14 ㎖ 라운드 튜브에 넣고 육안으로 2.5 ㎖을 맞춘 다음 전자레인지에 20초 돌린 후, 잘 섞어서 완전하게 용해하여 실온에서 식힌 후에 여과하여 사용함.
PEG 용액은 실험할 때마다 만들어서 신선하게 사용함
실시예 4. 감자 원형질체 유래 StPPO2 교정체 선발
실시예 3을 통해 확보한 총 640개의 개체 중 590 개체들에 대하여 StPPO2 유전자의 교정 여부를 deep-seq. 분석으로 확인하였으며, 최종적으로 110개의 개체에서 최소한 1개 이상의 대립유전자(allele)에서 유전자 교정이 유도되었음을 확인하였고, 3 개체는 4개의 대립유전자가 모두 상이한 InDel 양상으로 교정됨을 확인하였다. 도 7 내지 도 10은 이 중 일부 개체들에 대한 deep-seq. 분석 결과들을 보여준다. 최종적으로 StPPO2 유전자가 교정이 확인된 총 110개 개체들의 deep-seq. 분석 결과는 표 4와 같다.
Figure PCTKR2021017138-appb-img-000002
특히 상기 110개 개체들의 deep-seq. 분석 결과, 본 발명의 방법으로 제조된 StPPO2 유전자 교정 식물체는 4개의 대립유전자(alleles) 모두에서 -2 bp 또는 -4 bp의 결실 패턴이 확인되는 돌연변이가 전체 110개 교정체의 InDel 패턴에서 57% (63/110)에 해당하는 것을 확인할 수 있었다(표 5 및 도 11).
StPPO2 유전자 교정 110개 식물체의 InDel 변이 패턴
Indel
Pattern #		 Deletion
size(bp)		 개체 수 Deletion sites
(PAM 서열로부터의 염기 위치)		 비고
1 -2 25 5th, 6th 4개의 alleles 모두가 -2 bp 결실 패턴으로 확인됨
2 -4 24 4th, 5th, 6th, 7th 4개의 alleles 모두가 -4 bp 결실 패턴으로 확인됨
3 -2/-4 14 pattern 1 & 2 4개의 alleles 중 2개 alleles씩 1번, 2번 결실 패턴이 나타남
4 -1 47 4th 4개의 alleles 중 1번, 2번 결실 패턴과 함께 -1 bp 결실 패턴을 가지는 allele가 확인됨
-5 4th, 5th, 6th, 7th, 8th 4개의 alleles 중 1번, 2번 결실 패턴과 함께 -5 bp 결실 패턴을 가지는 allele가 확인됨
-10 5th ~ 14th #205 라인의 1개 allele에서만 -10 bp 결실 패턴이 확인됨
계 110
최종적으로 StPPO2 유전자가 교정된 라인들에 대해 괴경(tuber: 덩이줄기)을 확보하기 위하여 유전자 교정이 확인된 감자 유식물체들을 씨감자 재배 온실로 옮겨서 배양을 진행하였으며, 약 3개월 후에 일부 라인들에서 괴경을 확보하였으며, 이들의 PPO2 단백질 활성 및 갈변현상 억제 현상을 관찰하였다.
실시예 5. StPPO2 교정 식물체의 PPO2 단백질 활성 측정
StPPO2 유전자 교정이 확인된 감자 식물체(#14, 16, 25 및 30)와 비-교정 대조구(WT) 감자의 조직으로부터 PPO2 활성 측정은 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 먼저, 1.5 ㎖ 튜브에 0.5 g의 감자 괴경을 잘게 잘라서 넣는다. 차가운 인산나트륨 용액(pH 6.5) 1 ㎖을 넣고 파이펫 팁을 이용하여 조직을 으깼다. 그 후, 13,000 rpm, 4℃ 조건으로 20분간 원심분리하고, 원심분리가 진행되는 동안, 96 웰 플레이트에서 인산나트륨 용액(pH 5.5)과 0.2M 피로카테콜(pyrocatechol)을 섞어 10분간 전배양하였다. 상기 원심분리후, 상층액을 10분간 전배양하였던 인산나트륨과 피로카테콜의 혼합용액이 들어있는 96 웰 플레이트에 넣고 즉시 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정은 0초부터 30초마다 측정하여 최대 2분까지 측정하였다.
남은 상층액을 이용하여 브래드포드 어세이(Bradford assay)를 통해 단백질 농도를 측정하였고, 측정된 단백질 농도와 410 nm 흡광도 측정값을 통해 PPO2의 Unit을 계산하였다.
실험상의 편향을 방지하기 위한 맹검 실험(blind test)을 위해 유전자 교정 식물체의 샘플들에 번호를 붙인 뒤 상기에서 기술한 바와 같이 실험을 수행하였으며, PPO2 단백질 활성 측정 결과는 도 12에서 보는 봐와 같이 비-교정 대조구(WT) 대비 최소 28.6%에서 최대 57.8%까지 유전자 교정 식물체 계통에서 PPO2 활성이 억제됨을 확인할 수 있었다.
실시예 6. StPPO2 교정 식물체의 갈변현상 조사
감자 갈변현상 관찰은 2가지 방법으로 진행하였다.
먼저, 감자 괴경을 이전 보고(Gonzalez MN et al., Front Plant Sci. (2020) 10:1649)에서 진행한 방법과 동일하게 슬라이스하여 실험을 진행하였으며, 결과는 도 13(A)와 같다. 감자 괴경을 슬라이스해서 갈변 억제 현상을 관찰한 결과, 대조구(WT)에 비해서는 갈변현상이 억제된 모습이 관찰되었다. 그러나, 수분이 증발되어 갈변현상 억제 여부가 크게 진전이 없어서, 동일한 크기의 감자 괴경을 껍질만 제거한 후 갈변현상을 관찰하였다. 그 결과, StPPO2 교정 감자 식물체(GE#14, #25)의 괴경은 비-교정 대조구(WT)에 비해 갈변현상이 현저히 억제되는 것이 관찰되었다(도 13B). 결과적으로 감자 StPPO2 유전자 교정 식물체 계통들의 갈변 현상은 PPO2 단백질 활성과 연관성이 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (10)

  1. 감자 유래 StPPO2 (Solanum tuberosum Polyphenol Oxidases 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 감자 유래 StPPO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 를 유효성분으로 함유하는, 감자 식물체의 갈변을 억제하기 위한 유전체 교정용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 StPPO2 유전자의 표적 염기서열은 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. StPPO2 (Solanum tuberosum Polyphenol Oxidases 2) 유전자를 구성하는 뉴클레오티드 서열 중 표적 영역에 특이적인 RNA 서열이며,
    상기 표적 영역은 서열번호 5의 염기서열인 가이드 핵산.
  4. (a) 감자 유래 StPPO2 (Solanum tuberosum Polyphenol Oxidases 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 감자 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및
    (b) 상기 유전체가 교정된 감자 식물세포로부터 감자 식물체를 재분화하는 단계; 를 포함하는, 갈변이 억제된 유전체 교정 감자 식물체의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 감자 식물세포에 도입하는 것은, 감자 유래 StPPO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 감자 유래 StPPO2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 를 이용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 StPPO2 유전자의 표적 염기서열은 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 (b) 단계의 유전체가 교정된 감자 식물세포는 StPPO2 유전자의 표적 염기서열에 1~10 bp 크기의 결실(deletion) 변이가 유도된 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 갈변이 억제된 유전체 교정 감자 식물체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 갈변이 억제된 유전체 교정 감자 식물체는 StPPO2 유전자의 표적 염기서열에 1~10 bp 크기의 결실(deletion) 변이가 유도된 것을 특징으로 하는 유전체 교정 감자 식물체.
  10. 제8항에 따른 감자 식물체의 유전체가 교정된 씨감자.
PCT/KR2021/017138 2020-11-25 2021-11-22 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 갈변 억제 감자 식물체의 제조방법 WO2022114692A1 (ko)

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