WO2022203166A1 - 유전자 교정을 이용한 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성이 증가된 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 토마토 식물체 - Google Patents

유전자 교정을 이용한 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성이 증가된 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 토마토 식물체 Download PDF

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쉘케마하데브라훌
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경상국립대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a tomato plant having increased resistance to tomato yellow leaf curl virus using gene editing, and to a tomato plant produced by the production method.
  • Tomato Yellow Leaf Curl Virus is a deadly pathogen that causes significant economic loss every year in tomato cultivation. Leaf veins and leaf edges are discolored yellow. If the disease occurs immediately after planting the seedlings, it is almost impossible to harvest the tomatoes. Tomato yellow leaf curl virus disease is known to transmit the virus to healthy tomato seedlings while carrying the virus in the body while the tobacco powdery ( Bemisia tabaci ) sucks the juice of tomatoes and weeds infected with the tomato yellow leaf curl virus. . However, tobacco powdery mildew is a pest native to Korea, and it is very difficult to control, and it is very difficult to eradicate tomato yellow leaf curl virus disease because of its strong virus transmission ability.
  • the CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9) system has recently received attention.
  • the CRISPR/Cas9 system the third-generation gene editing technology, it is possible to specifically edit only the desired genes in cells.
  • the existing first-generation gene scissors technologies, Zinc Finger Nucleases (ZFNs) and second-generation Transcriptor Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) have a disadvantage in that they take a lot of time and money to design and manufacture.
  • the CRISPR/Cas9 system has very high target specificity, is simple in design and low in cost, so that the target trait can be easily introduced into various animals and plants. It has the advantage of being able to fix generations.
  • Korea Patent No. 1862008 discloses 'a multiplex PCR primer set for assaying tomato yellow leaf curl virus resistance'
  • Korean Patent No. 1406740 discloses "E. coli expression and recombination of tomato yellow leaf curl virus C2 gene.”
  • the present invention was derived from the above needs, and the present inventors developed a transgenic tomato by constructing a CRISPR/Cas9 vector targeting the SlPelo gene, a sensitivity gene, in order to increase resistance to tomato yellow leaf curl virus.
  • a CRISPR/Cas9 vector targeting the SlPelo gene a sensitivity gene
  • the SlPelo gene-corrected tomato showed increased resistance to the tomato yellow leaf curl virus compared to the wild-type tomato, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides a DNA encoding a guide RNA (guide RNA) specific to the target nucleotide sequence of the tomato-derived SlPelo ( Solanum lycopersicum Ty-5) gene and an endonuclease (endonuclease) encoding a protein.
  • a recombinant vector comprising a nucleic acid sequence; Or a complex of guide RNA and endonuclease protein specific to the target nucleotide sequence of the tomato-derived SlPelo gene (ribonucleoprotein);
  • ribonucleoprotein Provided is a composition for editing a genome for increasing resistance.
  • the present invention is composed of the base sequence of SEQ ID NO: 6, tomato-derived SlPelo ( Solanum lycopersicum Ty-5), the target base sequence and the nucleotide sequence consisting of the endonuclease binding sequence of the nucleotide sequence consisting of the guide RNA encoded by the RNA as an active ingredient It provides a composition for genome editing for increasing the resistance to tomato yellow leaf curl virus (Tomato Yellow Leaf Curl Virus) of tomato plants.
  • the present invention comprises the steps of (a) introducing a DNA and an endonuclease protein encoding a guide RNA specific to the target nucleotide sequence of the tomato-derived SlPelo gene into tomato plant cells to correct the genome; And (b) the step of redifferentiating the tomato plant from the tomato plant cells in which the genome has been corrected; provides a method for producing a genome-corrected tomato plant with increased resistance to tomato yellow leaf curl virus, comprising a.
  • the present invention provides a genome-corrected tomato plant with increased resistance to tomato yellow leaf curl virus produced by the above method, and a seed whose genome is corrected.
  • the method for producing a genome-corrected tomato plant according to the present invention can introduce resistance to tomato yellow leaf curl virus into an existing elite line through sophisticated gene editing.
  • the conventional method of introducing a resistance allele derived from a wild-type tomato plant causes linkage drag that deteriorates crop traits due to the accompanying gene, the SlPelo gene is knocked out.
  • the method of the present invention does not affect the characteristics of crops and can produce tomato plants with increased resistance to tomato yellow leaf curl virus, so it is expected to be useful for increasing tomato productivity and developing excellent varieties do.
  • FIG. 1 shows the position (A) of the target nucleotide sequence of the CRISPR/Cas9 gRNA in the SlPelo gene and the target nucleotide sequence of each gRNA (B).
  • GGA or GGT marked with gray boxes is a PAM sequence.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a CRISPR/Cas9 system-based construct for SlPelo gene correction.
  • A is the target nucleotide sequence and the amino acid sequence of the SlPelo gene of the wild-type (WT) tomato plant and the gene-corrected tomato plant
  • B is the wild-type (WT)
  • a chromatogram showing the results of ICE (Inference of CRISPR Edits) analysis on the target nucleotide sequence of the SlPelo gene of a tomato plant and a gene-corrected tomato plant.
  • GGA or CCT indicated by the gray box is the PAM sequence
  • the arrow is the position of the inserted base
  • the asterisk (*) is the stop codon.
  • TYLCV 4 is a result of analyzing the resistance of SlPelo gene-corrected tomato plants to tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), A shows the symptoms of disease of wild-type (WT) and SlPelo gene-corrected tomato plants 28 days after infection with TYLCV It is a photograph showing, B is the result of evaluating the severity of disease with the Disease Severity Index (DSI), and C is the result of measuring the titer of TYLCV in each plant. *** means that the TYLCV titer of the gene-modified tomato plants (G1-41-40, G1-41-42 and G1-41-44) was statistically significantly decreased compared to WT, and p ⁇ 0.001.
  • the present invention is a DNA encoding a guide RNA (guide RNA) specific to the target nucleotide sequence of the tomato-derived SlPelo ( Solanum lycopersicum Ty-5) gene and an endonuclease protein.
  • a recombinant vector comprising an encoding nucleic acid sequence; Or a complex of guide RNA and endonuclease protein specific to the target nucleotide sequence of the tomato-derived SlPelo gene (ribonucleoprotein);
  • ribonucleoprotein Provided is a composition for editing a genome for increasing resistance.
  • the present invention is composed of the base sequence of SEQ ID NO: 6, tomato-derived SlPelo ( Solanum lycopersicum Ty-5), the target base sequence and the nucleotide sequence consisting of the endonuclease binding sequence of the nucleotide sequence consisting of the guide RNA encoded by the RNA as an active ingredient It provides a composition for genome editing for increasing the resistance to tomato yellow leaf curl virus (Tomato Yellow Leaf Curl Virus) of tomato plants.
  • the target gene of genome editing for increasing the resistance of tomato plants to the tomato yellow leaf curl virus is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • the SlPelo gene consists of Pelo protein is known to play an important role in ribosome recycling during protein synthesis, and is known to induce a hypersensitive response (HR) in infection with tomato leaf curl virus.
  • the term “genome/gene editing” refers to a technology capable of introducing a target-directed mutation into the genome sequence of animal and plant cells, including human cells, and one or more nucleic acid molecules by DNA cleavage. Knock-out or knock-in a specific gene by deletion, insertion, substitution, etc. of coding) refers to a technology that can introduce mutations into DNA sequences.
  • the genome editing may be to introduce a mutation into a plant using an endonuclease, such as a Cas9 (CRISPR associated protein 9) protein and guide RNA.
  • the term 'gene editing' may be used interchangeably with 'gene editing'.
  • target gene refers to some DNA in the genome of a plant to be corrected through the present invention, is not limited to the type of the gene, and may include both a coding region and a non-coding region. A person skilled in the art can select the target gene according to the desired mutation for the genome-corrected plant to be prepared, depending on the purpose.
  • guide RNA is a short single-stranded RNA, including RNA specific to the target DNA among the nucleotide sequences encoding the target gene, and all or part of the target DNA nucleotide sequence is complementary Thus, it refers to a ribonucleic acid that leads the endonuclease protein to the corresponding target DNA sequence.
  • the guide RNA may include two RNAs, that is, a dual RNA including crRNA (CRISPR RNA) and tracrRNA (trans-activating crRNA) as components; or a single chain comprising a first site comprising a sequence that is all or partly complementary to a nucleotide sequence in a target gene and a second site comprising a sequence that interacts with an endonuclease (especially an RNA-guided nuclease)
  • CRISPR RNA crRNA
  • tracrRNA trans-activating crRNA
  • a single chain comprising a first site comprising a sequence that is all or partly complementary to a nucleotide sequence in a target gene and a second site comprising a sequence that interacts with an endonuclease (especially an RNA-guided nuclease)
  • sgRNA single guide RNA
  • the endonuclease can have activity in the target nucleotide sequence, it may be included in the scope of the present
  • the guide RNA may be transcribed from a plasmid template, transcribed in vitro (eg, oligonucleotide double-stranded), or synthesized guide RNA, but is not limited thereto.
  • the guide RNA is specifically designed for the target nucleotide sequence of the SlPelo gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, and is specifically designed for the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 is characterized by high editing efficiency compared to other guide RNAs for SlPelo gene editing specifically designed for the target nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 2 to 5 and SEQ ID NOs: 7 to 10.
  • the target nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 is specific
  • the SlPelo gene is corrected only by the guide RNA designed as
  • the endonuclease protein is Cas9, Cpf1 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1), TALEN (Transcription activator-like effector nuclease), ZFN (Zinc Finger Nuclease) or its It may be at least one selected from the group consisting of functional analogs, and preferably, a Cas9 protein, but is not limited thereto.
  • the Cas9 protein is Streptococcus pyogenes ( Streptococcus pyogenes )-derived Cas9 protein, Campylobacter jejuni ( Campylobacter jejuni )-derived Cas9 protein, Streptococcus thermophilus ) or Streptococcus aureus ( Streptocucus aureus ) Cas9 protein derived from Cas9, Neisseria meningitidis derived from Cas9 protein, Cas9 protein derived from Pasteurella multocida , Cas9 protein derived from Francisella novicida , etc. It may be one or more selected from the group, but is not limited thereto. Cas9 protein or genetic information thereof can be obtained from a known database such as GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • Cas9 protein is an RNA-guided DNA endonuclease enzyme that induces double-stranded DNA breaks.
  • PAM Protospacer Adjacent Motif
  • the guide RNA and the endonuclease protein form a ribonucleoprotein complex to operate as RNA-Guided Engineered Nuclease (RGEN).
  • RGEN RNA-Guided Engineered Nuclease
  • the guide RNA of the present invention may preferably be in the form of a single guide RNA (sgRNA), but is not limited thereto.
  • sgRNA single guide RNA
  • the present invention is (a) tomato-derived SlPelo ( Solanum lycopersicum Ty-5) DNA encoding a guide RNA (guide RNA) specific to the target nucleotide sequence of the gene and endonuclease (endonuclease) protein to tomato plant cells Introduced to correct the genome; And (b) re-differentiating tomato plants from tomato plant cells in which the genome has been corrected; to provide.
  • the guide RNA and endonuclease protein specific for the target nucleotide sequence of the SlPelo gene are the same as described above.
  • the CRISPR/Cas9 system used in the present invention introduces a double helix break at a specific position of a specific gene to be corrected, and NHEJ induces an insertion-deletion (InDel) mutation caused by incomplete repair induced in the DNA repair process. It is a gene editing method based on (non-homologous end joining) mechanism.
  • the introduction of the guide RNA and the endonuclease protein in step (a) into tomato plant cells includes DNA and endo a recombinant vector comprising a nucleic acid sequence encoding a nuclease protein;
  • a complex (ribonucleoprotein) of a guide RNA and an endonuclease protein specific for the target nucleotide sequence of the tomato-derived SlPelo gene may be used, but is not limited thereto.
  • the method for transducing the complex of the guide RNA and the endonuclease protein into plant cells is a calcium/polyethylene glycol method for protoplasts, electroporation of protoplasts, and micro-injection method with plant elements. , particle bombardment of various plant elements (DNA or RNA-coated), infection by bacteria in Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer (incomplete), and the like.
  • introducing a recombinant vector including a DNA encoding a guide RNA specific for the target nucleotide sequence and a nucleic acid sequence encoding an endonuclease protein into a plant cell means a transformation method. Transformation of plant species is now common for plant species including both monocots as well as dicots. In principle, any transformation method can be used to introduce the recombinant vector according to the invention into suitable progenitor cells.
  • the "plant cell” into which the guide RNA and endonuclease protein specific for the target nucleotide sequence are introduced may be any plant cell.
  • Plant cells are cultured cells, cultured tissues, cultured organs or whole plants.
  • Plant tissue refers to tissues of differentiated or undifferentiated plants, such as, but not limited to, cotyledons, hypocotyls, roots, stems, leaves, pollen, seeds, cancer tissues and various types of cells used in culture, i.e. Includes single cell, protoplast, shoot and callus tissue.
  • the plant tissue may be in planta or in an organ culture, tissue culture or cell culture state.
  • any method known in the art may be used as a method of redifferentiating a plant having a corrected genome from a plant cell having a corrected genome.
  • Plant cells whose genome has been corrected must be redifferentiated into whole plants.
  • Techniques for the redifferentiation of mature plants from callus or protoplast cultures are well known in the art for a number of different species.
  • the present invention provides a genome-corrected tomato plant with increased resistance to tomato yellow leaf curl virus produced by the above production method and seeds whose genome is corrected.
  • the genome-corrected tomato plant with increased resistance to tomato yellow leaf curl virus is a susceptibility gene related to tomato yellow leaf curl virus infection, SlPelo , corrected using the CRISPR/Cas9 system, and the tomato-derived SlPelo gene is green -Out, it is a genome-corrected tomato plant with a trait that increases resistance to tomato yellow leaf curl virus compared to tomato plants that have not edited the genome.
  • Tomato Solanum lycopersicum
  • Seeds of the BN-86 line were purchased from Bu-Nong Seedlings, an agricultural company, and used. After sterilization, the seeds were washed 5 times and placed in half-strength MS (Murashige and Skoog) medium supplemented with 20 g/L sucrose and 15 g/L plant agar for 16 hours light/8 hours dark. of the photoperiod, and incubated at a temperature of 25 ⁇ 2°C.
  • SlPelo a susceptibility gene related to tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV) infection
  • SlPelo Solyc04g009810 gene sequence was obtained from the Sol Genomics network database
  • sgRNA single guide RNA matching the criteria (snoRNA promoter: U6; Guide Sequence Length: 20, Target Genome: Solanum lycopersi-cum SL3.0) was designed.
  • the secondary structure of a single guide RNA was predicted using the Mfold web server.
  • plasmids were cloned using E. coli 10-beta cells following the Golden Gate protocol.
  • Level 0 and 1 modules were amplified by PCR using specific primers and high-fidelity DNA polymerase (Phusion Taq, Thermo Fisher Scientific, USA), and the PCR product was amplified by HiGene TM Gel & PCR Purification Kit (BioFact Co. Ltd., Korea) was used for analysis.
  • Expression of sgRNA was induced by the Arabidopsis U6 (AtU6) promoter (pICSL01009, Addgene #46968), and T-repeats (seven Ts) were expressed at the end.
  • the level 1 expression unit including the selection marker antibiotic kanamycin and humanized SpCas9 Streptococcus pyogenes Cas9, Addgene #49771 was expressed by the CaMV 35S promoter, and the sgRNA expression cassette was constructed by inserting it into the binary vector pAGM4723 (Fig. 2).
  • All binary vectors were transformed by inserting into the Agrobacterium tumefaciens GV3101 strain using electroporation, and Agrobacterium-mediated transformation to deliver the CRISPR/Cas9-sgRNA construct to tomato plants. was used.
  • As an explant for transformation 7-8-day-old tomato cotyledons were cut into 0.2-0.3 cm pieces and prepared in pre-culture medium (MS basal salts, Gamborg B5 vitamins, 2.0 mg/L of Zeatin trans isomer, 0.2 mg/L).
  • L of indolyl acetic acid, 1 mM of putrescine, and 30 g/L of glucose, pH 5.7) were cultured for 2 days.
  • Root-derived plants were acclimatized in vermiculite pots, and then transferred to a greenhouse and cultured.
  • Genotyping was performed to confirm that the mutation was induced at the target site by the CRISPR/Cas9 system in transgenic plants.
  • DNA was extracted from 100 mg of leaf tissue using CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) method, transformants and target site mutations were confirmed through PCR and Sanger sequencing.
  • CTAB Cetyl trimethylammonium bromide
  • PCR was performed using primers (Table 1) for amplifying the SpCas9 gene and the SlPelo gene, Sanger sequencing was performed using the services of Solgent Ltd. (Korea) or Cosmogentech Ltd. (Korea).
  • the PCR product was cloned using the CloneJET PCR cloning kit (Thermo Scien-tific, USA), and the proofreading efficiency in each sample was confirmed through analysis using SnapGene (GSL Biotech LLC) and ICE (Inference of CRISPR Edits) tool. .
  • Primer information used for mutation identification Primer name base sequence (5'-3') SEQ ID NO: purpose 138_F GACGAGTACAAGGTGCCGAGCA 11 For SpCas9 amplification 139_R GGTGGTGCTCATCATAGCGCT 12 149_F GGTAAGCTATTTGACACATTGTAT 13 For SlPelo amplification (Target A to D) 150_R CCATGAGATTCAAAAGTCGTTC 14 158_F GGGTCTTTGCTGATTGTTAAC 15 For SlPelo amplification (Target 1 to 5) 159_R CATATATCACCAGCTTGATAGC 16
  • TYLCV tomato yellow leaf curl virus
  • Tomato plants were infected with tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) and 28 days later, leaves were collected and titer of TYLCV was measured through real-time quantitative PCR (qRT-PCR) analysis.
  • qRT-PCR was performed using primers (Table 2) and KAPA SYBR FAST qPCR kit ( Kapa Bio-sys-tems, MA, USA). It was analyzed and shown.
  • Primer information used for RT-PCR analysis Primer name base sequence (5'-3') SEQ ID NO: purpose qTYLCV-C1_F GCTCGTAGAGGGTGACGAA 17 For TYLCV amplification qTYLCV-C1_R CACAAAGTACGGGAAGCCCA 18 EF-1_F GGAACTTGAGAAGGAGCCTAAG 19 For SlEF1 ⁇ amplification EF-1_R CAACACCAACAGCAACAGTCT 20
  • the off-target of sgRNA to the SlPelo gene was predicted using the Cas-OFFinder tool (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). Potential off-target sites predicted by setting the mismatch sequence to 3 or less were analyzed through PCR analysis and Sanger sequencing.
  • PELO protein consists of 387 amino acids and has three eukaryotic release factor 1 (eRF1) domains eRF1_1, eRF1_2 and eRF1_3. Inducing a mutation of a base insertion or deletion in the coding region of eRF1_1 induces premature stop codon generation or a frameshift, thereby preventing the PELO protein from functioning. Therefore, nine sgRNAs targeting the eRF1_1 domain region of the SlPelo gene were designed (Fig. 1, Table 3).
  • Candidate sgRNA target sequence information sgRNA name base sequence (5'-3') SEQ ID NO: Target site in SlPelo sgRNA_A TGATGGTTCTGGTAGTGTAA 2 Target A sgRNA_B GCTTATAATCTGATAGCTGA 3 Target B sgRNA_C CGTAGAGACTTTGTTCCTGA 4 Target C sgRNA_D CATAGATCATCAGCTTCTTC 5 Target D sgRNA_1 CTCCAGAAGCAGCTTCCCTC 6 Target 1 sgRNA_2 ATACTTCATCTCGACCACAT 7 Target 2 sgRNA_3 ATTCTTCCCGCGAATACGCA 8 Target 3 sgRNA_4 ATTCTTCAACTTAATCCTTT 9 Target 4 sgRNA_5 CTAATTATTTTATTGCAGAT 10 Target 5
  • Agrobacterium-mediated transformation was performed with four recombinant vectors (FIG. 2) using an SpCas9 expression cassette and multiple sgRNA expression cassettes in tomato cotyledons. . Then, after inducing and elongating shoots, they were transferred to a medium containing kanamycin and cultured while inducing root development to obtain a gene-corrected generation 0 plant (G0).
  • Genomic DNA was extracted from the leaves of redifferentiated G0 generation plants, and transformants were identified through PCR analysis using SpCas9 gene-specific primers (Table 1), and transformed through PCR analysis using SlPelo gene-specific primers (Table 1). The mutation pattern of the transformants was analyzed.
  • PCR was performed to detect the target sequence of the SlPelo gene in 24 plants, and as a result of analysis through Sanger sequencing, a total of 3 plants (G0) in which the mutation occurred in the third exon (Target 1, SEQ ID NO: 6) of the SlPelo gene -36, G0-37 and G0-41) were identified.
  • multiple sgRNAs consisting of sgRNA1, sgRNA2, and sgRNA3 were used, gene correction occurred only at the Target 1 site, and Mlo1 (Mildew resistance locus o 1) gene was not mutated. was found to induce
  • the wild-type (WT) tomato plants showed yellowing and curling of leaves, whereas the G1-41-40 and G1-41-42 tomato plants did not show any symptoms of tomato yellowing and curling, and G1-41- 44 Tomato plants did not have yellowing of leaves, but it was confirmed that mild leaf curling symptoms appeared (FIG. 4A).
  • the DSI index of the MOCK control group, G1-41-40, G1-41-42 and G1-41-44 tomato plants appeared as 0, whereas that of the wild-type (WT) tomato plant. It was confirmed that the DSI index appeared as 2.5 (FIG. 4B).
  • the sgRNA according to the present invention effectively induced SlPelo gene correction without inducing off-target mutation.

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Abstract

본 발명은 유전자 교정을 이용한 토마토황화잎말림바이러스(Tomato Yellow Leaf Curl Virus)에 대한 저항성이 증가된 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 토마토 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 토마토 유래 SlPelo (Solanum lycopersicum Ty-5) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 토마토 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 상기 유전체가 교정된 토마토 식물세포로부터 토마토 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는, 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법에 관한 것이다.

Description

유전자 교정을 이용한 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성이 증가된 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 토마토 식물체
본 발명은 유전자 교정을 이용한 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성이 증가된 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 토마토 식물체에 관한 것이다.
토마토황화잎말림바이러스(Tomato Yellow Leaf Curl Virus, TYLCV)는 토마토 재배에서 매년 상당한 경제적 손실을 초래하는 치명적인 병원균으로, 토마토 식물체가 토마토황화잎말림바이러스에 감염되면 잎의 크기가 작아지고 잎이 말리면서 잎맥과 잎 가장자리가 노랗게 변색된다. 모종 정식 직후 발병하게 되는 경우에는 토마토의 수확이 거의 불가능하며, 생육 도중 발병하게 되는 경우에는 토마토의 수확량이 감소하고 품질이 저하된다. 토마토황화잎말림바이러스병은 담배가루이(Bemisia tabaci)가 토마토황화잎말림바이러스에 감염된 토마토 및 잡초의 즙액을 빨아 먹는 과정에서 충체 내 바이러스를 보유하고 다니면서 건강한 토마토 육묘에 바이러스를 전염시키는 것으로 알려져 있다. 그러나, 담배가루이는 국내에 토착화된 해충이고, 방제가 매우 어려우며, 바이러스의 전파능력이 강해 토마토황화잎말림바이러스병의 근절이 매우 어렵다.
한편, 게놈을 교정하는 방법들 중 CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9) 시스템이 최근 주목을 받고 있다. 제 3세대 유전자가위 기술인 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하면 세포내 원하는 유전자만을 특이적으로 교정할 수 있다. 기존의 1세대 유전자가위 기술인 징크핑거 뉴클레이즈(Zinc Finger Nucleases, ZFNs)와 2세대 탈렌(Transcriptor Activator-Like Effector Nucleases, TALENs) 기술은 설계 및 제작에 많은 시간과 비용이 소요된다는 단점이 있다. 그러나, CRISPR/Cas9 시스템은 매우 높은 표적 특이성을 가지고 있고, 설계가 단순하고 비용이 저렴하여 다양한 동물 및 식물에 목표 형질을 쉽게 도입할 수 있으며, 멘델의 유전법칙에 따라 자손에게 전달되어 목표 형질의 세대고정이 가능하다는 장점이 있다.
한편, 한국등록특허 제1862008호에는 '토마토황화잎말림바이러스 저항성 검정용 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1406740호에는 '토마토황화잎말림바이러스 C2유전자의 대장균내 발현 및 재조합 C2단백질에 대한 다클론항체 생산법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '유전자 교정을 이용한 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성이 증가된 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 토마토 식물체'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성을 증가시키기 위해 감수성 유전자인 SlPelo 유전자를 표적으로 하는 CRISPR/Cas9 벡터를 구축하여 형질전환 토마토를 개발하였고 형질전환 토마토에서 표적 부위의 염기서열을 분석하여 토마토 SlPelo 유전자 서열에 편집이 일어난 것을 확인하였다. 또한, 토마토황화잎말림바이러스를 감염시킨 결과, 야생형 토마토에 비해 SlPelo 유전자 교정 토마토가 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성이 증가한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 토마토 유래 SlPelo (Solanum lycopersicum Ty-5) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 토마토 유래 SlPelo 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 유효성분으로 함유하는, 토마토 식물체의 토마토황화잎말림바이러스(Tomato Yellow Leaf Curl Virus)에 대한 저항성을 증가시키기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 6의 염기서열로 이루어진, 토마토 유래 SlPelo (Solanum lycopersicum Ty-5) 유전자의 표적 염기서열 및 엔도뉴클레아제 결합 서열로 이루어진 염기 서열에 의해 코딩되는 가이드 RNA를 유효성분으로 함유하는, 토마토 식물체의 토마토황화잎말림바이러스(Tomato Yellow Leaf Curl Virus)에 대한 저항성을 증가시키기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 토마토 유래 SlPelo 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 토마토 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (b) 상기 유전체가 교정된 토마토 식물세포로부터 토마토 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는, 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체 및 이의 유전체가 교정된 종자를 제공한다.
본 발명에 따른 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법은 정교한 유전자 교정을 통해 기존의 엘리트 라인에 토마토황화잎말림바이러스(Tomato Yellow Leaf Curl Virus)에 대한 저항성 형질을 도입할 수 있다. 또한, 야생형 토마토 식물체 유래의 저항성 대립 유전자를 도입하는 기존의 방식은 동반하는 유전자로 인해 작물의 형질을 나쁘게 하는 연관지체(linkage drag) 현상을 초래하는 반면, SlPelo 유전자를 녹-아웃(knock-out)시키는 본 발명의 방식은 작물의 형질에는 영향을 주지 않고, 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성이 증가된 토마토 식물체를 제조할 수 있으므로, 토마토 생산성 증대 및 우수 품종 개발에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 SlPelo 유전자에서 CRISPR/Cas9의 gRNA의 표적 염기서열의 위치(A) 및 각 gRNA의 표적 염기서열(B)을 보여준다. 회색 박스로 표시된 GGA 또는 GGT는 PAM 서열이다.
도 2는 SlPelo 유전자 교정을 위한 CRISPR/Cas9 시스템 기반 컨스트럭트의 모식도이다.
도 3은 SlPelo 유전자 교정 토마토 식물체의 표적 염기서열의 시퀀싱 분석 결과로, A는 야생형(WT) 토마토 식물체와 유전자 교정 토마토 식물체의 SlPelo 유전자의 표적 염기서열 및 아미노산 서열을 분석한 결과이고, B는 야생형(WT) 토마토 식물체와 유전자 교정 토마토 식물체의 SlPelo 유전자의 표적 염기서열에 대한 ICE (Inference of CRISPR Edits) 분석 결과를 보여주는 크로마토그램이다. 회색 박스로 표시된 GGA 또는 CCT는 PAM 서열이고, 화살표는 삽입된 염기의 위치이며, 별 표시(*)는 종결 코돈이다.
도 4는 SlPelo 유전자 교정 토마토 식물체의 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)에 대한 저항성을 분석한 결과로, A는 TYLCV를 감염시키고 28일 후의 야생형(WT) 및 SlPelo 유전자 교정 토마토 식물체의 병의 증상을 보여주는 사진이고, B는 발병지수(Disease Severity Index, DSI)로 발병 정도를 평가한 결과이고, C는 각 식물체내 TYLCV의 역가를 측정한 결과이다. ***은 WT에 비해 유전자 교정 토마토 식물체(G1-41-40, G1-41-42 및 G1-41-44)의 TYLCV 역가가 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 토마토 유래 SlPelo (Solanum lycopersicum Ty-5) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 토마토 유래 SlPelo 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 유효성분으로 함유하는, 토마토 식물체의 토마토황화잎말림바이러스(Tomato Yellow Leaf Curl Virus)에 대한 저항성을 증가시키기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 6의 염기서열로 이루어진, 토마토 유래 SlPelo (Solanum lycopersicum Ty-5) 유전자의 표적 염기서열 및 엔도뉴클레아제 결합 서열로 이루어진 염기 서열에 의해 코딩되는 가이드 RNA를 유효성분으로 함유하는, 토마토 식물체의 토마토황화잎말림바이러스(Tomato Yellow Leaf Curl Virus)에 대한 저항성을 증가시키기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 토마토 식물체의 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성을 증가시키기 위한 유전체 교정의 표적 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 SlPelo 유전자이다. Pelo 단백질은 단백질 합성 과정 동안 리보솜 재활용(ribosome recycling)에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 토마토황화잎말림바이러스의 감염에서 HR (hypersensitive response)을 유발하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 용어 "유전체/유전자 교정(genome/gene editing)"은, 인간 세포를 비롯한 동·식물세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실(deletion), 삽입(insertion), 치환(substitutions) 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩(non-coding) DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 발명의 목적상 상기 유전체 교정은 특히 엔도뉴클레아제(endonuclease) 예컨대, Cas9 (CRISPR associated protein 9) 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여 식물체에 변이를 도입하는 것일 수 있다. 또한, 용어 '유전자 교정'은 '유전자 편집'과 혼용되어 사용될 수 있다.
또한, 용어 "표적 유전자"는 본 발명을 통해 교정하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미하며, 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 비-코딩 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 교정 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있다.
또한, 용어 "가이드 RNA(guide RNA)"는 짧은 단일 가닥의 RNA로, 표적 유전자를 암호화하는 염기서열 중 표적 DNA에 특이적인 RNA를 포함하며, 표적 DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염기서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA (dual RNA); 또는 표적 유전자 내 염기서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 엔도뉴클레아제(특히, RNA-가이드 뉴클레아제)와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA) 형태를 말하나, 엔도뉴클레아제가 표적 염기서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있으며, 함께 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 엔도뉴클레아제의 유래 미생물 등을 고려하여 당업계의 공지된 기술에 따라 제조하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된(transcribed) 것, 생체외(in vitro)에서 전사된 것(예컨대, 올리고뉴클레오티드 이중가닥) 또는 합성한 가이드 RNA 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 SlPelo 유전자의 표적 염기서열에 특이적으로 고안된 것으로서, 상기 서열번호 6의 염기서열에 특이적으로 고안된 가이드 RNA는 서열번호 2 내지 5 및 서열번호 7 내지 10의 표적 염기서열에 특이적으로 고안된 다른 SlPelo 유전자 교정용 가이드 RNA에 비해 교정 효율이 높은 것이 특징이다. 본 발명에서 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열에 특이적으로 고안된 가이드 RNA로 이루어진 multiple 가이드 RNA를 이용하여 CRISPR/Cas9 시스템을 적용한 결과, 서열번호 6의 표적 염기서열에 특이적으로 고안된 가이드 RNA에 의해서만 SlPelo 유전자가 교정되어 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성이 증가된 것이 특징이다.
또한, 본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 Cas9, Cpf1 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1), TALEN (Transcription activator-like effector nuclease), ZFN (Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas9 단백질 또는 이의 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다.
Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 DNA의 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM (Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 DNA의 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.
본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 리보핵산-단백질(ribonucleoprotein) 복합체를 형성하여 RNA 유전자 가위(RNA-Guided Engineered Nuclease, RGEN)로 작동할 수 있다.
본 발명의 가이드 RNA는 바람직하게는 단일 사슬 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA) 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 (a) 토마토 유래 SlPelo (Solanum lycopersicum Ty-5) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 토마토 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (b) 상기 유전체가 교정된 토마토 식물세포로부터 토마토 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는, 토마토황화잎말림바이러스(Tomato Yellow Leaf Curl Virus)에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 SlPelo 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질은 전술한 것과 같다.
본 발명에서 사용된 CRISPR/Cas9 시스템은 교정하고자 하는 특정 유전자의 특정위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전 수선에 의한 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ (non-homologous end joining) 기작에 의한 유전자 교정 방법이다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 토마토 식물세포 도입하는 것은, 토마토 유래 SlPelo 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 토마토 유래 SlPelo 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체를 식물세포에 형질도입하는 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법, 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 박테리아에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.
또한, 상기 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 것은 형질전환 방법을 의미한다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질이 도입되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 떡잎, 하배축, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 유전체가 교정된 식물세포로부터 유전체가 교정된 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 유전체가 교정된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체 및 이의 유전체가 교정된 종자를 제공한다.
본 발명에 따른 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체는 토마토황화잎말림바이러스 감염과 관련된 감수성 유전자인 SlPelo를 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 교정한 것으로, 토마토 유래 SlPelo 유전자가 녹-아웃되어, 유전체를 교정하지 않은 토마토 식물체에 비해 토마토황화잎말림바이러스에 대한 저항성이 증가하는 형질을 가지는 유전체 교정 토마토 식물체이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물재료
토마토(Solanum lycopersicum) BN-86 라인의 종자를 농업회사법인 부농종묘에서 구입하여 사용하였다. 종자를 멸균한 후, 5회 세척하고 20 g/L 수크로스 및 15 g/L 플랜트 아가(plant agar)가 첨가된 half-strength MS(Murashige and Skoog) 배지에 치상하여 16시간 명/8시간 암의 광주기, 25±2℃의 온도 조건으로 배양하였다.
2. 단일 가이드 RNA(sgRNA) 설계
토마토황화잎말림바이러스(Tomato Yellow Leaf Curl Virus, TYLCV) 감염과 관련된 감수성 유전자인 SlPelo(Ty-5)를 표적으로 하는 유전자 교정을 실시하기 위해서 Sol Genomics network database로부터 SlPelo(Solyc04g009810) 유전자 서열을 얻었고, Plaza database(https://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/)로부터 SlPelo 단백질 서열을 얻어 NCBI-CDD tool(www.genome.jp/tools/motif/NCBI-CDD)을 이용하여 단백질 모티프 서열을 예측하였다. 이후, CRISPR-P 2.0 프로그램을 이용하여 기준(snoRNA promoter: U6; Guide Sequence Length: 20, Target Genome: Solanum lycopersi-cum SL3.0)에 부합하는 단일 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA)를 디자인하였고, Mfold 웹 서버를 이용하여 단일 가이드 RNA의 2차 구조를 예측하였다.
3. 플라스미드 구축
모든 플라스미드는 Golden Gate 프로토콜을 따라 E. coli 10-beta 세포를 이용하여 클로닝하였다. 레벨 0 및 1 모듈은 특이적인 프라이머와 high-fidelity DNA 폴리머라아제(Phusion Taq, Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용한 PCR을 수행하여 증폭하였고, PCR 산물은 HiGeneTM Gel & PCR 정제 키트(BioFact Co. Ltd., Korea)를 이용하여 분석하였다. sgRNA의 발현은 Arabidopsis U6(AtU6) 프로모터(pICSL01009, Addgene #46968)에 의해 유도되도록 하였고, 말단에 T-repeats(seven Ts)이 발현되도록 하였다. 선별 마커인 항생제 카나마이신(kanamycin) 및 humanized SpCas9(Streptococcus pyogenes Cas9, Addgene #49771)을 포함한 레벨 1 발현 유닛은 CaMV 35S 프로모터에 의해 발현되도록 하였으며, sgRNA 발현 카세트는 바이너리 벡터 pAGM4723에 삽입하여 구성하였다(도 2).
4. 형질전환
모든 바이너리 벡터는 전기천공법을 사용하여 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101 균주에 삽입하여 형질전환하였고, 토마토 식물체로 CRISPR/Cas9-sgRNA 구성체를 전달하기 위해 아그로박테리움-매개 형질전환법을 사용하였다. 형질전환을 위한 외식편으로 7~8일령의 토마토 떡잎을 0.2~0.3 cm 크기 단편으로 잘라 준비하였고, 전배양 배지(MS basal salts, Gamborg B5 vitamins, 2.0 mg/L of Zeatin trans isomer, 0.2 mg/L of indolyl acetic acid, 1 mM of putrescine 및 30 g/L of glucose, pH 5.7)에서 2일간 배양하였다. 상기 전배양한 외식편에 작은 구멍(8~10개/외식편)을 낸 후, CRISPR/Cas9-플라스미드를 가지고 있는 아그로박테리움과 25℃의 암조건에서 2일 동안 공동배양하였다. 이후, 300 μM 티멘틴(timentin)으로 세척하고 60 mg/L의 카나마이신을 포함하는 신초유도 배지(MS basal salts, Gamborg B5 vitamins, 2.0 mg/L of Zeatin trans isomer, 0.2 mg/L of indolyl acetic acid, 0.5 g/L of MES 및 30 g/L of glucose, pH 5.7)에서 14일 동안 배양하였다. 14일 마다 계대배양을 수행하여 신초(shoot) 신장을 유도한 후, 뿌리유도 배지(MS basal salts, Gamborg B5 vitamins, 30 g/L of glucose, 1.0 mg/L indole-3-butyric acid 및 30 mg/L kanamycin, pH 5.7)로 옮겨 배양하였다. 뿌리가 유도된 식물체는 버미큘라이트(vermiculite) 화분에서 적응시킨 후, 온실로 옮겨 배양하였다.
5. 유전형 분석 및 교정 효율 분석
형질전환 식물체에서 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 표적 부위에 돌연변이가 유도되었는지 확인하기 위해 유전형 분석을 수행하였다. CTAB(Cetyl trimethylammonium bromide) 방법을 이용하여 100 mg의 잎 조직으로부터 DNA를 추출한 후, PCR과 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)을 통하여 형질전환체 확인 및 표적 부위 돌연변이를 확인하였다. SpCas9 유전자 및 SlPelo 유전자를 증폭하기 위한 프라이머(표 1)를 사용하여 PCR을 수행한 후, Solgent Ltd.(Korea) 또는 Cosmogentech Ltd.(Korea)의 서비스를 이용하여 생거 시퀀싱을 수행하였다. PCR 산물은 CloneJET PCR 클로닝 키트(Thermo Scien-tific, USA)를 사용하여 클로닝하였고, SnapGene(GSL Biotech LLC) 및 ICE(Inference of CRISPR Edits) tool을 이용한 분석을 통해 각 샘플에서의 교정 효율을 확인하였다.
돌연변이 확인에 사용한 프라이머 정보
프라이머 명칭 염기서열 (5'-3') 서열번호 용도
138_F GACGAGTACAAGGTGCCGAGCA 11 SpCas9 증폭용
139_R GGTGGTGCTCATCATAGCGCT 12
149_F GGTAAGCTATTGACACATTGTAT 13 SlPelo 증폭용
(Target A to D)
150_R CCATGAGATTCAAAAGTCGTTC 14
158_F GGGTCTTTGCTGATTGTTAAC 15 SlPelo 증폭용
(Target 1 to 5)
159_R CATATATCACCAGCTTGATAGC 16
6. 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV) 감염 및 증상 평가
자가교배한 G1 homozygous SlPelo 돌연변이 식물체를 온실에서 배양한 후, 곁가지를 이용하여 미세번식(micropropagation)을 유도하였다. 미세번식된 신초는 바로 토양에 옮겨 심고 비닐봉지로 덮어 온실 조건의 습도를 유지하였다. 5~7일 후, virulent 플라스미드(pCAM-TYLCV-1.7mer)를 가지고 있는 아그로박테리움 배양액을 이용하여, 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV) 감염을 유도하였다. 아그로박테리움 배양액 한 방울을 신초 꼭대기에 떨어뜨리고 바늘을 이용하여 잎을 5~10번 찔러 배양액이 잎 안으로 잘 스며들도록 하였다. 항생제가 포함된 LB 배지를 동일한 방법으로 주입하여 대조군으로 이용하였다. TYLCV 감염 증상은 발병지수(Disease Severity Index, DSI)로 평가하였고, 0~4로 나타내었다.
7. 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV) 역가 측정
토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)를 토마토 식물체에 감염시키고 28일 후, 잎을 채취하여 real-time quantitative PCR(qRT-PCR) 분석을 통해 TYLCV의 역가를 측정하였다. 프라이머(표 2)와 KAPA SYBR FAST qPCR 키트(Kapa Bio-sys-tems, MA, USA)를 이용하여 qRT-PCR을 수행하였고, SlEF1α(internal control) 유전자에 대한 상대적 발현양을 2-ΔΔCt 방법으로 분석하여 나타내었다.
RT-PCR 분석에 사용한 프라이머 정보
프라이머 명칭 염기서열 (5'-3') 서열번호 용도
qTYLCV-C1_F GCTCGTAGAGGGTGACGAA 17 TYLCV 증폭용
qTYLCV-C1_R CACAAAGTACGGGAAGCCCA 18
EF-1_F GGAACTTGAGAAGGAGCCTAAG 19 SlEF1α 증폭용
EF-1_R CAACACCAACAGCAACAGTCT 20
8. 오프 타겟 분석
Cas-OFFinder tool(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)을 사용하여 SlPelo 유전자에 대한 sgRNA의 오프 타겟을 예측하였다. 불일치 서열을 3개 이하로 설정하여 예측한 잠재적 오프 타겟 부위를 PCR 분석 및 생거 시퀀싱을 통해 분석하였다.
실시예 1. 표적 부위 설정 및 sgRNA 디자인
PELO 단백질은 387개 아미노산으로 이루어져 있으며, 3개의 eRF1(eukaryotic release factor 1) 도메인 eRF1_1, eRF1_2 및 eRF1_3을 가지고 있다. eRF1_1의 코딩 부위에 염기 삽입 또는 결실의 돌연변이를 유도하면, 조기 종결 코돈 생성 또는 프레임쉬프트(frameshift)가 유도되어, PELO 단백질이 기능을 하지 못하게 된다. 따라서, SlPelo 유전자의 eRF1_1 도메인 부위를 표적으로 하는 9개의 sgRNA를 디자인하였다(도 1, 표 3).
후보 sgRNA 표적 염기서열 정보
sgRNA 명칭 염기서열 (5'-3') 서열번호 SlPelo 에서 표적부위
sgRNA_A TGATGGTTCTGGTAGTGTAA 2 Target A
sgRNA_B GCTTATAATCTGATAGCTGA 3 Target B
sgRNA_C CGTAGAGACTTTGTTCCTGA 4 Target C
sgRNA_D CATAGATCATCAGCTTCTTC 5 Target D
sgRNA_1 CTCCAGAAGCAGCTTCCCTC 6 Target 1
sgRNA_2 ATACTTCATCTCGACCACAT 7 Target 2
sgRNA_3 ATTCTTCCCGCGAATACGCA 8 Target 3
sgRNA_4 ATTCTTCAACTTAATCCTTT 9 Target 4
sgRNA_5 CTAATTATTTTATTGCAGAT 10 Target 5
실시예 2. 유전자 교정 토마토 식물체(G0) 제조
CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 유전자 교정 토마토(BN-86 라인)를 제조하기 위하여 토마토 떡잎에 SpCas9 발현 카세트와 multiple sgRNA 발현 카세트를 이용한 4개의 재조합 벡터(도 2)로 아그로박테리움 매개 형질전환을 수행하였다. 이후, 신초를 유도하고 신장시킨 후, 카나마이신이 포함된 배지로 옮겨 뿌리 발달을 유도하며 배양하여 유전자 교정 0 세대 식물체(G0)를 얻었다. 재분화된 G0 세대 식물체의 잎에서 게노믹 DNA를 추출하여 SpCas9 유전자 특이 프라이머(표 1)를 이용한 PCR 분석을 통해 형질전환체를 확인하였고, SlPelo 유전자 특이 프라이머(표 1)를 이용한 PCR 분석을 통해 형질전환체의 돌연변이 패턴을 분석하였다.
그 결과, SlPelo 유전자의 첫 번째 또는 두 번째 엑손을 표적으로 하는 sgRNA(sgRNA A, sgRNA B, sgRNA C 및 sgRNA D)를 이용한 재조합 벡터로 형질전환시킨 배치(batch) 1의 36개 식물체에서는 SlPelo 유전자 교정이 이루어지지 않은 것을 확인하였다. 반면, SlPelo 유전자의 세 번째, 네 번째 또는 다섯 번째 엑손을 표적으로 하는 sgRNA(sgRNA 1, sgRNA 2, sgRNA 3, sgRNA 4 및 sgRNA 5)를 이용한 재조합 벡터로 형질전환시킨 배치(batch) 2의 43개 식물체 중 24개 식물체는 SlPelo 유전자 교정이 이루어진 것을 확인하였다. 이후, 24개 식물체에서 SlPelo 유전자의 표적 서열 검출을 위한 PCR을 수행하였고 생거 시퀀싱을 통해 분석한 결과, SlPelo 유전자의 세 번째 엑손(Target 1, 서열번호 6)에서 돌연변이가 일어난 총 3개의 식물체(G0-36, G0-37 및 G0-41)를 확인하였다. sgRNA1, sgRNA2 및 sgRNA3으로 이루어진 multiple sgRNA를 이용하였지만, Target 1 부위에서만 유전자 교정이 일어났으며, Mlo1(Mildew resistance locus o 1) 유전자에는 돌연변이가 일어나지 않은 것을 확인함으로써, multiple sgRNA 중에서 sgRNA1만이 효과적으로 유전자 교정을 유도한 것을 알 수 있었다.
실시예 3. 유전자 교정 토마토 식물체(G1)의 유전형 분석
SlPelo 유전자가 교정된 G0 세대 식물체의 자가교배를 통해 얻은 G1 세대 식물체의 SlPelo 유전자의 세 번째 엑손(Target 1) 부위에 대한 PCR, 생거 시퀀싱 및 ICE(Inference of CRISPR Edits) tool을 이용한 유전형 분석을 수행하였다.
그 결과, 교정 효율이 높은 3개의 식물체(G1-41-40, G1-41-42 및 G1-41-44)를 선발하였다. 또한, 야생형(WT) 토마토 식물체의 염기서열과 비교한 결과, PAM 서열로부터 3번째와 4번째 염기 사이에 1개의 염기서열이 삽입되어, 아미노산 서열에 프레임쉬프트(frameshift)가 일어난 것을 확인하였다(도 3). 또한, SpCas9 유전자가 G0 세대에서 G1 세대로 안정적으로 전달되어 발현하는 것을 확인하였다.
실시예 4. 유전자 교정 토마토 식물체(G1)의 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)에 대한 저항성 분석
크리스퍼 시스템을 이용하여 SlPelo 유전자를 교정한 토마토 식물체(G1)에 TYLCV를 감염시키고 28일 후, 토마토황화잎말림병의 증상을 확인하였고, 발병지수(Disease Severity Index, DSI)로 발병 정도를 평가하였다.
그 결과, 야생형(WT) 토마토 식물체는 잎이 황화되고 말림 현상을 보이는 반면, G1-41-40 및 G1-41-42 토마토 식물체는 토마토황화잎말림 병의 증상이 전혀 나타나지 않았고, G1-41-44 토마토 식물체는 잎의 황화 현상은 없었지만 약한 잎말림 증상이 나타나는 것을 확인하였다(도 4A). 또한, DSI 지수로 발병 정도를 평가한 결과, MOCK 대조군, G1-41-40, G1-41-42 및 G1-41-44 토마토 식물체의 DSI 지수는 0으로 나타나는 반면, 야생형(WT) 토마토 식물체의 DSI 지수는 2.5로 나타나는 것을 확인하였다(도 4B).
또한, TYLCV를 토마토 식물체에 감염시키고 28일 후, 잎을 채취하여 qRT-PCR 분석을 통해 TYLCV의 역가를 측정한 결과, 야생형(WT) 토마토 식물체에 비해 G1-41-40, G1-41-42 및 G1-41-44 토마토 식물체에서 TYLCV의 역가가 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 4C).
따라서, 크리스퍼 시스템을 이용하여 SlPelo 유전자를 교정한 토마토 식물체는 TYLCV에 대한 저항성이 증가되어 발병 정도가 현저하게 감소하는 것을 알 수 있었다.
실시예 5. SlPelo 유전자에 대한 오프 타겟 검정
Cas-OFFinder tool(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)을 사용하여 예측한 잠재적 오프 타겟 부위를 PCR 분석 및 생거 시퀀싱을 통해 분석한 결과, 오프 타겟 부위에서 유도되지 않은 돌연변이는 검출되지 않은 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 sgRNA는 오프 타겟으로 하는 변이를 유도하지 않고, 효과적으로 SlPelo 유전자 교정을 유도하는 것을 알 수 있었다.

Claims (8)

  1. 토마토 유래 SlPelo (Solanum lycopersicum Ty-5) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 토마토 유래 SlPelo 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 유효성분으로 함유하는, 토마토 식물체의 토마토황화잎말림바이러스(Tomato Yellow Leaf Curl Virus)에 대한 저항성을 증가시키기 위한 유전체 교정용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 SlPelo 유전자의 표적 염기서열은 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 서열번호 6의 염기서열로 이루어진, 토마토 유래 SlPelo (Solanum lycopersicum Ty-5) 유전자의 표적 염기서열 및 엔도뉴클레아제 결합 서열로 이루어진 염기 서열에 의해 코딩되는 가이드 RNA를 유효성분으로 함유하는, 토마토 식물체의 토마토황화잎말림바이러스(Tomato Yellow Leaf Curl Virus)에 대한 저항성을 증가시키기 위한 유전체 교정용 조성물.
  4. (a) 토마토 유래 SlPelo (Solanum lycopersicum Ty-5) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 토마토 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및
    (b) 상기 유전체가 교정된 토마토 식물세포로부터 토마토 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는, 토마토황화잎말림바이러스(Tomato Yellow Leaf Curl Virus)에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 토마토 식물세포에 도입하는 것은, 토마토 유래 SlPelo 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 토마토 유래 SlPelo 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 이용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 SlPelo 유전자의 표적 염기서열은 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 토마토황화잎말림바이러스(Tomato Yellow Leaf Curl Virus)에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체.
  8. 제7항에 따른 토마토 식물체의 유전체가 교정된 종자.
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