CN111118061A - 基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体及其构建方法和应用 - Google Patents

基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)的载体及其构建方法和应用，包括针对中国番茄黄化曲叶病毒TYLCCNV的复制核心区(Iteron区)构建的pCambia 1300‑BKG‑g4、pCambia 1300‑BKG‑g5和pCambia 1300‑BKG‑g6；还包括针对中国番茄黄化曲叶病毒beta(TYLCCNB)的Iteron区构建的pCambia 1300‑BKG‑g1、pCambia 1300‑BKG‑g2和pCambia 1300‑BKG‑g3。此套载体依靠CRISPR/Cas9系统，可以实现对TYLCCNV/TYLCCNB序列的定点编辑，并且编辑效率高。

Description

基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体及 其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种基于CRISPR/Cas9系统靶标并编辑中国番茄黄化曲叶病毒复制核心区来抑制双生病毒侵染的载体构建方法。
背景技术
中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)属于双生病毒科，菜豆金色花叶病毒属病毒。该病毒在田间常伴随有卫星分子中国番茄黄化曲叶病毒卫星beta(Tomato yellow leaf curl China betasatellite,TYLCCNB)，TYLCCNV与TYLCCNB复合侵染后形成的病害复合物对我国田间番茄等蔬菜作物造成毁灭性的危害。该病毒主要通过烟粉虱传播，感病的番茄植株生长缓慢或停滞，矮化严重，新叶褪绿发黄、变小、边缘上卷。目前该病害在田间主要治理手段仍以预防为主，切断其传播媒介是主要的防治方法。然而，由于治理困难，该病毒已经在多种作物上造成了严重的危害，对我国农业生产安全造成了巨大破坏，寻找更为有效的防治措施尤为关键。
鉴于目前生产中无有效的抗TYLCCNV/TYLCCNB的植物品种。先前通过利用Cas9技术靶标其他双生病毒的IR区，获得的植物的抗病效果并不理想。当前条件下，在田间防治双生病毒还有很多掣肘：(1)植物病毒素有“植物癌症”之说，田间防治困难，由于生物，物理以及化学防治效果均不理想，目前田间抗病毒工程多以预防为主，防治结合；(2)双生病毒多依靠昆虫媒介进行传播，因此控制田间农作物取食昆虫是切断其传播途径最有效的方法，这样就避免不了化学试剂的大规模使用，农药残留问题以及对非靶标生物安全问题摆在了人们面前，并在短时间内难以解决；(3)育种方面，抗双生病毒农作物品种培育缓慢，田间效果不理想，存在潜在的极大不确定因素。(4)目前利用CRISPR/Cas9技术针对植物病毒序列进行编辑多选择在双生病毒IR区，抗病毒效果在不同病毒间具有较大差异，并没有较好的特异性。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体及其构建方法和应用。本发明基于CRISPR/Cas9系统靶标并编辑TYLCCNV/TYLCCNB复制核心区(Iteron区)来抑制双生病毒侵染的载体具有显著高效的抗病毒的功能，而作用靶点是由本实验室鉴定出的与病毒复制直接相关的Iteron区域，通过阻碍病毒的复制来达到抗病毒效果，具有更高的特异性和抗病性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
一种基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体，包括针对中国番茄黄化曲叶病毒TYLCCNV的Iteron区构建的pCambia 1300-BKG-g4、pCambia 1300-BKG-g5和pCambia 1300-BKG-g6，简称BKG-g4、BKG-g5和BKG-g6；
还包括针对中国番茄黄化曲叶病毒beta(TYLCCNB)的Iteron区构建的pCambia
1300-BKG-g1、pCambia 1300-BKG-g2和pCambia 1300-BKG-g3，简称BKG-g1、BKG-g2和BKG-g3。
基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体的构建方法：
在TYLCCNV序列的Iteron区附近选定PAM位点并设计gRNA；包括BKG-g4、BKG-g5、BKG-g6载体分别所需的三个靶点的六条gRNA链g4-A、g4-B、g5-A、g5-B、g6-A、g6-B，其序列如SEQ ID：NO.1-NO.6所示；并将上述单链gRNA合成为双链；
在TYLCCNB序列的Iteron区附近选定PAM位点并设计gRNA；包括BKG-g1、BKG-g2、BKG-g3载体分别所需的三个靶点的六条gRNA链g1-A、g1-B、g2-A、g2-B、g3-A、g3-B，其序列如SEQ ID：NO.7-NO.12；并将上述单链gRNA合成为双链。
其中，单链gRNA合成为双链，具体方法如下：
①先将上述单链gRNA稀释为50μM/μL；
②按照5×Oligo buffer：4μL；单链A：4μL；单链B：4μL；H2O：8μL做成20μL体系；
③PCR仪器控温：95℃2min；以0.1℃/s下降到25℃；4℃5min降温；
④得到的片段稀释50倍，保存于-20℃；
其中，BKG-g4载体的构建方法包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4 DNA连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；鉴定引物为SEQ ID:NO.13、SEQ ID:NO.2；
④提取质粒，并用SEQ ID:NO.13-NO.14引物测序，得到加g4靶点的BKG-g4载体。
其中，BKG-g5载体的构建方法包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4 DNA连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；鉴定引物为SEQ ID:NO.13、NO.4；
④提取质粒，并用SEQ ID:NO.13-NO.14引物测序，得到加g5靶点的BKG-g5载体。
其中，BKG-g6载体的构建方法包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4 DNA 连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；鉴定引物为SEQ ID:NO.13、SEQ ID:NO.6；
④提取质粒，并用SEQ ID:NO.13-NO.14引物测序，得到加g6靶点的BKG-g6载体。
其中，BKG-g1载体的构建方法包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4 DNA 连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；鉴定引物为SEQ ID:NO.13、SEQ ID:NO.8；
④提取质粒，并用SEQ ID:NO.13-NO.14引物测序，得到加g1靶点的BKG-g1载体。
其中，BKG-g2载体的构建方法包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4 DNA 连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；鉴定引物为SEQ ID:NO.13、SEQ ID:NO.10；
④提取质粒，并用SEQ ID:NO.13-NO.14引物测序，得到加g2靶点的BKG-g2载体。
其中，BKG-g3载体的构建方法包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4 DNA 连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；鉴定引物为SEQ ID:NO.13、SEQ ID:NO.12；
④提取质粒，并用SEQ ID:NO.13-NO.14引物测序，得到加g3靶点的BKG-g3载体。
针对TYLCCNV的Iteron区BKG-g4，BKG-g5，BKG-g6以及针对TYLCCNB的Iteron区BKG-g1，BKG-g2，BKG-g3各载体农杆菌转化：农杆菌LBA4404菌株50uL，质粒5uL，电击转化；28℃孵育90min；卡那霉素加利福平抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定，鉴定引物与前述转化大肠杆菌引物相同；-80℃保存菌株。
CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体在抵御双生病毒中的应用：适用于TYLCCNV/TYLCCNB寄主植物的瞬时表达以及转上述载体的寄主植物材料的获取。
CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体在抵御双生病毒中的应用：通过改造靶点的gRNA，适用于所有包含复制核心区(Iteron区)的植物病毒。
本发明通过设计针对TYLCCNV/TYLCCNB特定的复制核心区(Iteron区)的gRNA，构建了利用编辑Iteron区实现抗双生病毒的农杆菌侵染性克隆载体。此套载体具有以下特征和优势：
(1)此套载体依靠CRISPR/Cas9系统，可以实现对TYLCCNV/TYLCCNB序列的定点编辑，并且编辑效率高；
(2)sgRNA设计具有更高创新性，sgRNA设计在TYLCCNV/TYLCCNB序列的Iteron区，该区域是病毒完成复制的关键位点，对其进行编辑能更好的阻止病毒复制；
(3)此套载体与已经报道的在双生病毒中，尤其是TYLCCNV中其他编辑位点相比具有更加明显的抗病毒效果，瞬表抗病表型明显，经检测病毒积累量显著下降；
(4)此套载体针对的是病毒本身基因序列而非寄主植物序列，不会对寄主植物的农艺性状产生影响，利于投入实际田间生产中；
(5)此套系统由于针对的是病毒而非寄主，提高了其应用范围，在所有TYLCCNV/TYLCCNB侵染的寄主植物上均可应用。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体及其构建方法和应用作进一步说明。
附图说明
图1为基于CRISPR/Cas9系统靶标并编辑中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)及卫星(TYLCCNB)复制核心区即Iteron区来抑制双生病毒侵染的载体BKG-g4、BKG-g5、BKG-g6、BKG-g1、BKG-g2、BKG-g3构建示意图；
图2为针对TYLCCNV序列的Iteron区各载体构建流程图；
图3为针对TYLCCNB序列的Iteron区各载体构建流程图；
图4为检测各个载体的抗病毒效果；
图5为各个载体混合接种病毒后提取总DNA，经过对病毒序列的PAM位点附近进行PCR，并用T7核酸内切酶(T7 endonuclease)处理后检测对病毒序列的编辑情况；
图6为针对TYLCCNV序列的Iteron区(BKG-g4,BKG-g5,BKG-g6)和针对TYLCCNB序列(BKG-g1，BKG-g2，BKG-g3)的Iteron区各载体的农杆菌，及空载体对照(Mock)分别混合TYLCCNV/TYLCCNB侵染性克隆农杆菌接种本氏烟7天后的表型差异对照图。
具体实施方式
如图1-3所示，基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体：包括针对中国番茄黄化曲叶病毒TYLCCNV的Iteron区构建的pCambia 1300-BKG-g4、pCambia1300-BKG-g5和pCambia 1300-BKG-g6，简称BKG-g4、BKG-g5和BKG-g6；
还包括针对中国番茄黄化曲叶病毒beta(TYLCCNB)的Iteron区构建的pCambia1300-BKG-g1、pCambia 1300-BKG-g2和pCambia 1300-BKG-g3，简称BKG-g1、BKG-g2和BKG-g3。
其构建方法包括以下步骤：
(1)在TYLCCNV序列的Iteron区附近选定PAM位点并设计gRNA；包括BKG-g4,BKG-g5,BKG-g6载体分别所需的三个靶点的六条gRNA链：g4-A/B，g5-A/B，g6-A/B；其序列如SEQID：NO.1-NO.6所示；
g4-A:TGATTGAATTGGTGTCTCTCAAACT
g4-B:AAACAGTTTGAGAGACACCAATTCA
g5-A:TGATTGGCTATGCAATCGGTGTCTG
g5-B:AAACCAGACACCGATTGCATAGCCA
g6-A:TGATTGCTGGGGTCTTATTTATATG
g6-B:AAACCATATAAATAAGACCCCAGCA
(2)将(1)中所述单链gRNA合成为双链，具体方法如下：
①先将上述单链gRNA稀释为50μM/μL；
②按照5×Oligo buffer：4μL；单链A：4μL；单链B：4μL；H2O：8μL做成20μL体系；
③PCR仪器控温：95℃2min；以0.1℃/s下降到25℃；4℃5min降温；
④得到的片段稀释50倍，保存于-20℃；
(3)加g4靶点的BKG-g4载体的构建：
①1μg BKG质粒，BsaI酶1μL，10×buffer 2μL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切30min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存；
②10×T4 DNA ligase buffer 2μL，酶切后的BKG载体80ng，双链化gRNA 1μL，T4DNA ligase 1μL，ddH2O定容至20μL；PCR仪控温22℃反应15min；
③将10uL连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；
鉴定引物：如SEQ ID:NO.13、SEQ ID:NO.2所示；
F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；
R：g4-B：AAACAGTTTGAGAGACACCAATTCA；
将正确的克隆摇菌培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序(如SEQ ID:NO.13-14所示)，至此得到加g4靶点的BKG-g4载体；
(4)加g5靶点的BKG-g5载体的构建：
①1μg BKG质粒，BsaI酶1μL，10×buffer 2μL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切30min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存；
②10×T4 DNA ligase buffer 2μL，酶切后的BKG载体80ng，双链化gRNA 1μL，T4DNA ligase 1μL，ddH2O定容至20μL；PCR仪控温22℃反应15min；
③将10uL连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；
鉴定引物：如SEQ ID:NO.13、SEQ ID:NO.4所示；
F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；
R:g5-B：AAACCAGACACCGATTGCATAGCCA；
将正确的克隆摇菌培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序(如SEQ ID:NO.13-14所示)，至此得到加g5靶点的BKG-g5载体；
(5)加g6靶点的BKG-g6载体的构建：
①1μg BKG质粒，BsaI酶1μL，10×buffer 2μL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切30min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存；
②10×T4 DNA ligase buffer 2μL，酶切后的BKG载体80ng，双链化gRNA 1μL，T4DNA ligase 1μL，ddH2O定容至20μL；PCR仪控温22℃反应15min；
③将10uL连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；
鉴定引物：如SEQ ID:NO.13、SEQ ID:NO.6所示；
F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；
R：g6-B：AAACCATATAAATAAGACCCCAGCA；
将正确的克隆摇菌培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序(如SEQ ID:NO.13-14所示)，至此得到加g6靶点的BKG-g6载体；
(6)在TYLCCNB序列的Iteron区附近选定PAM位点并设计gRNA；包括BKG-g1,BKG-g2,BKG-g3载体分别所需的三个靶点的六条gRNA链：g1-A/B，g2-A/B，g3-A/B；
g1-A:TGATTGTAAATAATTGGGACACCAA
g1-B:AAACTTGGTGTCCCAATTATTTACA
g2-A:TGATTGTCGGTGTCCCAATTACCAT
g2-B:AAACATGGTAATTGGGACACCGACA
g3-A:TGATTGTGGGACACCAATGGTAATT
g3-B:AAACAATTACCATTGGTGTCCCACA
(7)将(6)中所述单链gRNA合成为双链，具体方法如下：
①先将上述单链gRNA稀释为50μM/μL；
②按照5×Oligo buffer：4μL；单链A：4μL；单链B：4μL；H2O：8μL做成20μL体系；
③PCR仪器控温：95℃2min；以0.1℃/s下降到25℃；4℃5min降温；
④得到的片段稀释50倍，保存于-20℃；
(8)加g1靶点的BKG-g1载体的构建：
①1μg BKG质粒，BsaI酶1μL，10×buffer 2μL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切30min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存；
②10×T4 DNA ligase buffer 2μL，酶切后的BKG载体80ng，双链化gRNA 1μL，T4DNA ligase 1μL，ddH2O定容至20μL；PCR仪控温22℃反应15min；
③将10uL连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；
鉴定引物：如SEQ ID:NO.13、SEQ ID:NO.8所示；
F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；
R：g1-B：AAACTTGGTGTCCCAATTATTTACA；
将正确的克隆摇菌培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序(如SEQ ID:NO.13-14所示)，至此得到加g1靶点的BKG-g1载体；
(9)加g2靶点的BKG-g2载体的构建：
①1μg BKG质粒，BsaI酶1μL，10×buffer 2μL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切30min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存；
②10×T4 DNA ligase buffer 2μL，酶切后的BKG载体80ng，双链化gRNA 1μL，T4DNA ligase 1μL，ddH2O定容至20μL；PCR仪控温22℃反应15min；
③将10uL连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；
鉴定引物：如SEQ ID:NO.13、SEQ ID:NO.10所示；
F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；
R：g2-B：AAACATGGTAATTGGGACACCGACA；
将正确的克隆摇菌培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序(如SEQ ID:NO.13-14所示)，至此得到加g2靶点的BKG-g2载体；
(10)加g3靶点的BKG-g3载体的构建：
①1μg BKG质粒，BsaI酶1μL，10×buffer 2μL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切30min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存；
②10×T4 DNA ligase buffer 2μL，酶切后的BKG载体80ng，双链化gRNA 1μL，T4DNA ligase 1μL，ddH2O定容至20μL；PCR仪控温22℃反应15min；
③将10uL连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；
鉴定引物：如SEQ ID:NO.13、SEQ ID:NO.12所示；
F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；
R：g3-B：AAACAATTACCATTGGTGTCCCACA；
将正确的克隆摇菌培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序(如SEQ ID:NO.13-14所示)，至此得到加g3靶点的BKG-g3载体。
农杆菌转化：
针对TYLCCNV的Iteron区BKG-g4，BKG-g5，BKG-g6以及针对TYLCCNB的Iteron区BKG-g1，BKG-g2，BKG-g3各载体农杆菌转化：农杆菌LBA4404菌株50μL，质粒5μL，电击转化；28℃孵育90min；卡那霉素加利福平抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定，鉴定引物与前述转化大肠杆菌引物相同；-80℃保存菌株。
活化农杆菌，将含有BKG-g4，BKG-g5，BKG-g6，BKG-g1，BKG-g2，BKG-g3的各载体及空载体(Mock)的农杆菌分别混合TYLCCNV/TYLCCNB侵染性克隆农杆菌在野生型本氏烟上进行接种。如图4所示，随后检测各个载体的抗病毒效果，提取混合接种后65小时的本氏烟植株叶片DNA，通过qPCR分析TYLCCNV/TYLCCNB的DNA积累量变化，确定病毒DNA积累量相较于对照组显著下降。说明基于CRISPR/Cas9系统对TYLCCNV/TYLCCNB的Iteron区编辑的各个载体可以发挥作用，能够显著抑制病毒DNA的积累水平。
将各个载体提取的混合接种后65小时的本氏烟植株叶片总DNA通过T7核酸内切酶进行处理，该酶会识别非对称匹配的碱基序列并进行切割，如果发生碱基编辑后，经该酶处理后会出现多条DNA带；如图5所示，基于CRISPR/Cas9系统对TYLCCNV的Iteron区编辑的各个载体可以发挥作用。
如图6所示，表达针对TYLCCNV序列的Iteron区(BKG-g4,BKG-g5,BKG-g6)和针对TYLCCNB序列(BKG-g1，BKG-g2，BKG-g3)的Iteron区各载体的农杆菌相对于空载体对照(Mock)于本氏烟植物上7天后，植物表现出明显的抗病毒效果。
进一步对PAM位点附近DNA进行PCR，并测序，验证了T7核酸内切酶的处理结果，该系统对TYLCCNV/TYLCCNB的Iteron区进行了编辑。
通过组培技术得到包含此套载体系统的本氏烟材料。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体及其构建方法和应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> g4-A(Artificial Sequence)
<400> 1
tgattgaatt ggtgtctctc aaact 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> g4-B(Artificial Sequence)
<400> 2
aaacagtttg agagacacca attca 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> g5-A(Artificial Sequence)
<400> 3
tgattggcta tgcaatcggt gtctg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> g5-B(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaccagaca ccgattgcat agcca 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> g6-A(Artificial Sequence)
<400> 5
tgattgctgg ggtcttattt atatg 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> g6-B(Artificial Sequence)
<400> 6
aaaccatata aataagaccc cagca 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> g1-A(Artificial Sequence)
<400> 7
tgattgtaaa taattgggac accaa 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> g1-B(Artificial Sequence)
<400> 8
aaacttggtg tcccaattat ttaca 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> g2-A(Artificial Sequence)
<400> 9
tgattgtcgg tgtcccaatt accat 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> g2-B(Artificial Sequence)
<400> 10
aaacatggta attgggacac cgaca 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> g3-A(Artificial Sequence)
<400> 11
tgattgtggg acaccaatgg taatt 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> g3-B(Artificial Sequence)
<400> 12
aaacaattac cattggtgtc ccaca 25
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> M13F(Artificial Sequence)
<400> 13
gttgtaaaac gacggccag 19
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> M13R(Artificial Sequence)
<400> 14
caggaaacag ctatgac 17

Claims (10)

1.一种基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体，其特征在于：包括针对中国番茄黄化曲叶病毒TYLCCNV的复制核心区(Iteron区)构建的pCambia 1300-BKG-g4、pCambia 1300-BKG-g5和pCambia 1300-BKG-g6，简称BKG-g4、BKG-g5和BKG-g6；
还包括针对中国番茄黄化曲叶病毒beta(TYLCCNB)的Iteron区构建的pCambia 1300-BKG-g1、pCambia 1300-BKG-g2和pCambia 1300-BKG-g3，简称BKG-g1、BKG-g2和BKG-g3。
2.权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体的构建方法，其特征在于：在TYLCCNV序列的Iteron区附近选定PAM位点并设计gRNA；包括BKG-g4、BKG-g5、BKG-g6载体分别所需的三个靶点的六条gRNA链g4-A、g4-B、g5-A、g5-B、g6-A、g6-B，其序列如SEQ ID：NO.1-NO.6所示；并将上述单链gRNA合成为双链；
在TYLCCNB序列的Iteron区附近选定PAM位点并设计gRNA；包括BKG-g1、BKG-g2、BKG-g3载体分别所需的三个靶点的六条gRNA链g1-A、g1-B、g2-A、g2-B、g3-A、g3-B，其序列如SEQID：NO.7-NO.12；并将上述单链gRNA合成为双链。
3.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体的构建方法，其特征在于：BKG-g4载体的构建方法包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4 DNA连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；鉴定引物为SEQ ID:NO.13、SEQ ID:NO.2；
④提取质粒，并用SEQ ID:NO.13-NO.14引物测序，得到加g4靶点的BKG-g4载体。
4.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体的构建方法，其特征在于：BKG-g5载体的构建方法包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4 DNA连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；鉴定引物为SEQ ID:NO.13、NO.4；
④提取质粒，并用SEQ ID:NO.13-NO.14引物测序，得到加g5靶点的BKG-g5载体。
5.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体的构建方法，其特征在于：BKG-g6载体的构建方法包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4 DNA连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；鉴定引物为SEQ ID:NO.13、SEQ ID:NO.6；
④提取质粒，并用SEQ ID:NO.13-NO.14引物测序，得到加g6靶点的BKG-g6载体。
6.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体的构建方法，其特征在于：BKG-g1载体的构建方法包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4 DNA连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；鉴定引物为SEQ ID:NO.13、SEQ ID:NO.8；
④提取质粒，并用SEQ ID:NO.13-NO.14引物测序，得到加g1靶点的BKG-g1载体。
7.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体的构建方法，其特征在于：BKG-g2载体的构建方法包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4 DNA连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；鉴定引物为SEQ ID:NO.13、SEQ ID:NO.10；
④提取质粒，并用SEQ ID:NO.13-NO.14引物测序，得到加g2靶点的BKG-g2载体。
8.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体的构建方法，其特征在于：BKG-g3载体的构建方法包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4 DNA连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；鉴定引物为SEQ ID:NO.13、SEQ ID:NO.12；
④提取质粒，并用SEQ ID:NO.13-NO.14引物测序，得到加g3靶点的BKG-g3载体。
9.权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体在抵御双生病毒中的应用，适用于TYLCCNV/TYLCCNB寄主植物的瞬时表达以及转上述载体的寄主植物材料的获取。
10.权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体在抵御双生病毒中的应用，其特征在于：通过改造靶点的gRNA，适用于所有包含复制核心区(Iteron区)的植物病毒。
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