CN111041043A - 基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的载体及其构建方法和应用 - Google Patents

基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的载体及其构建方法和应用，包括针对本氏烟UbEF1B基因构建的BKG‑g10、BKG‑g11载体和/或针对本氏烟CCR4/NOT基因构建的BKG‑g12、BKG‑g13载体。上述载体将UbEF1B基因或CCR4/NOT基因编辑后本氏烟生长状态正常，表型相较于野生型未发生明显变化；不会对其性状产生影响，利于后代的延续。依靠CRISPR/Cas9系统编辑本氏烟内源基因相较于传统的育种方法能更快更有效的获得抗病材料。

Description

基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的载体及其构建方法和 应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的载体及其构建方法和应用。
背景技术
云南番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Yunnan virus,TLCYnV)主要通过烟粉虱传播，受感染的植株生长缓慢、叶片褪绿、扭曲，危害轻则导致减产，重则导致绝收。目前，该病毒引起的病害由于治理困难，已经在多种作物上造成了严重的危害，除了以预防为主的防治措施外，需要极寻求更为有效的防治措施，比如抗病品种的选育和种植。
现阶段，虽然在寄主植物中鉴定到了一些与双生病毒相关的内源基因，但尚未在农业生产生活中提高其进一步的应用价值。而且本氏烟作为双生病毒研究的重要模式植物，获得更多的抗病品种在接下来的病毒致病，寄主抗病机理的研究中尤为重要。
在当前的背景条件下，双生病毒的防治还有很大的空白需要填写：
(1)在目前的条件下，田间抗病毒工程多以预防为主，防治结合，田间选育抗病品种费时费力，而且往往达不到预想的效果；
(2)本氏烟作为双生病毒研究的重要模式植物，相关的抗双生病毒品种需要进一步的完善，这样才能更好的揭示病毒与植物互作的机制；
(3)双生病毒多依靠昆虫媒介进行传播，大量化学试剂的使用严重污染了环境以及生物安全；
(4)目前利用本氏烟内源基因进行抗病毒研究的载体多存在抗病效果不稳定或影响寄主植物原表型，效果不理想。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的载体及其构建方法和应用。本发明通过设计针对TLCYnV研究的模式植物本氏烟的UbEF1B以及CCR4/NOT基因gRNA，构建了利用编辑上述内源基因实现抗双生病毒的农杆菌侵染性克隆载体。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
一种基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的载体，包括针对本氏烟UbEF1B基因构建的pCambia 1300-BKG-g10、pCambia 1300-BKG-g11(简称BKG-g10、BKG-g11)和/或针对本氏烟CCR4/NOT基因构建的pCambia 1300-BKG-g12、pCambia 1300-BKG-g13载体(简称BKG-g12、BKG-g13)。
上述载体的构建方法为：在本氏烟UbEF1B基因CDS区的序列中选定PAM位点并设计gRNA；包括BKG-g10,BKG-g11载体分别所需的两个靶点的四条gRNA链，如SEQ ID：NO.1-NO.4所示；并将上述单链gRNA合成为双链；
在本氏烟CCR4/NOT基因的CDS区序列中选定PAM位点并设计gRNA；包括BKG-g12,BKG-g13载体分别所需的两个靶点的四条gRNA链，如SEQ ID：NO.5-NO.8所示；并将上述单链gRNA合成为双链。
其中，所述BKG-g10载体的构建包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4DNA连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；鉴定引物如SEQ ID:NO.9、NO.2所示；
④提取质粒，并用如SEQ ID:NO.9-NO.10所示的引物测序，得到加g10靶点的BKG-g10载体。
其中，所述BKG-g11载体的构建包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4DNA连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；鉴定引物如SEQ ID:NO.9、NO.4所示；
④提取质粒，并用如SEQ ID:NO.9-NO.10所示的引物测序，得到加g11靶点的BKG-g11载体。
其中，所述BKG-g12载体的构建包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4DNA连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体,鉴定引物如SEQ ID:NO.9、NO.6所示；
④提取质粒，并用如SEQ ID:NO.9-NO.10所示的引物测序，得到加g12靶点的BKG-g12载体。
其中，所述BKG-g13载体的构建包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4DNA连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；鉴定引物如SEQ ID:NO.9、NO.8所示；
④提取质粒，并用如SEQ ID:NO.9-NO.10所示引物测序，得到加g13靶点的BKG-g13载体。
采用上述任一载体可用于抵御任何依赖本氏烟寄主UbEF1B基因以及CCR4/NOT基因完成复制侵染的植物病毒侵染。
上述任一载体可在接种上述载体本氏烟的瞬时表达或转上述载体的本氏烟材料的获取中应用。
上述任一载体在抵御双生病毒中应用，通过寻找本氏烟UbEF1B以及CCR4/NOT基因在双生病毒寄主的同源基因，改造靶点的gRNA。
本发明基于CRISPR/Cas9系统靶标并编辑本氏烟UbEF1B基因以及CCR4/NOT基因来抑制TLCYnV侵染。本氏烟UbEF1BB以及CCR4/NOT基因是最近鉴定出的与病毒复制侵染尤其是与TLCYnV的Rep蛋白直接相关的基因，通过对上述基因的编辑阻碍病毒依靠其进行复制从而达到抗病毒效果。
本发明构建出的抑制TLCYnV侵染的载体BKG-g10、BKG-g11、BKG-g12、BKG-g13具有以下特征和优势：
(1)上述载体依靠经典的CRISPR/Cas9系统，可以实现对本氏烟的UbEF1B基因和CCR4/NOT基因序列的定点编辑，并且编辑效率高；
(2)依靠CRISPR/Cas9系统编辑本氏烟内源基因相较于传统的育种方法能更快更有效的获得抗病材料；
(3)上述载体sgRNA设计在TLCYnV复制时所依赖的关键性的寄主基因，是病毒完成复制的重要参与者；该载体相比与其他针对本氏烟内源基因的载体具有更加明显的抗病毒效果，经检测病毒积累量显著下降；
(4)上述载体将UbEF1B基因或CCR4/NOT基因编辑后本氏烟生长状态正常，表型相较于野生型未发生明显变化；不会对其性状产生影响，利于后代的延续；
(5)本氏烟作为研究双生病毒最为常见的模式种，获得其抗病毒株系无论是在后续的双生病毒在寄主体内复制侵染的机理研究还是抗病品种选育中都有广阔的应用空间；
(6)上述载体可以推广到其他依赖本氏烟寄主UbEF1B和CCR4/NOT基因的双生病毒的抗病研究中。此套系统由于针对的是寄主内源基因，对其他利用UbEF1B以及CCR4/NOT进行复制侵染的双生病毒均有抗性。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的载体及其构建方法和应用作进一步说明。
附图说明
图1为载体BKG-g10、BKG-g11、BKG-g12、BKG-g13的示意图；
图2为基于CRISPR/Cas9系统靶标并编辑本氏烟UbEF1B基因关键位点来抵御TLCYnV侵染的各载体构建流程图；
图3基于CRISPR/Cas9系统靶标并编辑本氏烟CCR4/NOT基因关键位点来抵御TLCYnV侵染的各载体构建流程图；
图4检测针对UbEF1B基因和CCR4/NOT基因编辑载体BKG-g10和g12的抗病毒效果。(A)将含有BKG-g10，BKG-g12的载体及空载体(Mock)农杆菌分别混合TLCYnV侵染性克隆农杆菌在野生型本氏烟上进行接种。提取混合接种后60小时的本氏烟植株叶片DNA，通过qPCR分析病毒TLCYnV积累量变化，确定病毒TLCYnV积累量相较于对照组显著下降。(B)以上载体接种本氏烟植株9天后，观察植物症状表型的差异，确定构建的BKG-g10、BKG-g12的载体确实有抑制TLCYnV的效果(C)抽取系统叶片DNA，通过qPCR分析病毒TLCYnV积累量变化。
图5为将含有BKG-g10，BKG-g12的载体通过组培技术得到包含此套载体系统的本氏烟材料。对转基因呈阳性的植物进行进一步鉴定，发现BKG-g10与BKG-g12载体转入能够有效对UbEF1B或CCR4/NOT基因进行编辑。WT代表健康植物上UbEF1B以及CCR4/NOT基因原始的序列。不同的Line(株系)代表不同的转基因植物，横线标识被编辑的序列。
具体实施方式
如图1所示，一种基于CRISPR/Cas9系统靶标并编辑本氏烟UbEF1B基因来抑制TLCYnV侵染的载体BKG-g10、BKG-g11以及靶标并编辑本氏烟CCR4/NOT基因来抑制TLCYnV侵染的载体BKG-g12、BKG-g13。
其构建方法具体包括以下步骤：
(1)如图2所示，在本氏烟UbEF1B基因CDS区序列中选定PAM位点并设计gRNA；包括BKG-g10、BKG-g11载体分别所需的两个靶点的四条gRNA链：g10-A/B，g11-A/B；如SEQ ID：NO.1-NO.4所示；
g10-A:TGATTGCTGGTCTGCCGTACATCGG
g10-B:AAACCCGATGTACGGCAGACCAGCA
g11-A:TGATTGGATGTGGAGCGCCGGTTGC
g11-B:AAACGCAACCGGCGCTCCACATCCA
(2)将(1)中所述单链gRNA合成为双链，具体方法如下：
①先将上述单链gRNA稀释为50μM/μL；
②按照5×Oligo buffer：4μL；单链A：4μL；单链B：4μL；H2O：8μL做成20μL体系；
③PCR仪器控温：95℃2min；以0.1℃/s下降到25℃；4℃5min降温；
④得到的片段稀释50倍，保存于-20℃；
(3)加g10靶点的BKG-g10载体的构建：
①1μg BKG质粒，BsaI酶1μL，10×buffer 2μL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切30min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存；
②10×T4DNA ligase buffer 2μL，酶切后的BKG载体80ng，双链化gRNA 1μL，T4DNA ligase 1μL，ddH2O定容至20μL；PCR仪控温22℃反应15min；
③将10μL连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；
鉴定引物：如SEQ ID：NO.9和NO.2所示；
F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；
R：g10-B：AAACCCGATGTACGGCAGACCAGCA；
将正确的克隆摇菌培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到加g10靶点的BKG-g10载体；
(4)加g11靶点的BKG-g11载体的构建：
①1μg BKG质粒，BsaI酶1μL，10×buffer 2μL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切30min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存；
②10×T4DNA ligase buffer 2μL，酶切后的BKG载体80ng，双链化gRNA 1μL，T4DNA ligase 1μL，ddH2O定容至20μL；PCR仪控温22℃反应15min；
③将10μL连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；
鉴定引物：如SEQ ID：NO.9和NO.4所示；
F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；
R：g11-B：AAACGCAACCGGCGCTCCACATCCA；
将正确的克隆摇菌培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到加g11靶点的BKG-g11载体；
(5)如图3所示，在本氏烟CCR4/NOT基因的CDS区序列中选定PAM位点并设计gRNA；包括BKG-g12,BKG-g13载体分别所需的两个靶点的四条gRNA链：g12-A/B，g13-A/B；如SEQID：NO.5-NO.8所示；
g12-A:TGATTGGTGTTGCATGACTGCCAGC
g12-B:AAACGCTGGCAGTCATGCAACACCA
g13-A:TGATTGAGGGGAAGGCTTTCGACCA
g13-B:AAACTGGTCGAAAGCCTTCCCCTCA
(6)将(5)中所述单链gRNA合成为双链，具体方法如下：
①先将上述单链gRNA稀释为50μM/μL；
②按照5×Oligo buffer：4μL；单链A：4μL；单链B：4μL；H2O：8μL做成20μL体系；
③PCR仪器控温：95℃2min；以0.1℃/s下降到25℃；4℃5min降温；
④得到的片段稀释50倍，保存于-20℃；
(7)加g12靶点的BKG-g12载体的构建：
①1μg BKG质粒，BsaI酶1μL，10×buffer 2μL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切30min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存；
②10×T4DNA ligase buffer 2μL，酶切后的BKG载体80ng，双链化gRNA 1μL，T4DNA ligase 1μL，ddH2O定容至20μL；PCR仪控温22℃反应15min；
③将10μL连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；
鉴定引物：如SEQ ID：NO.9和NO.6所示；
F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；
R：g12-B：AAACGCTGGCAGTCATGCAACACCA；
将正确的克隆摇菌培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到加g12靶点的BKG-g12载体；
(8)加g13靶点的BKG-g13载体的构建：
①1μg BKG质粒，BsaI酶1μL，10×buffer 2μL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切30min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存；
②10×T4DNA ligase buffer 2μL，酶切后的BKG载体80ng，双链化gRNA 1μL，T4DNA ligase 1μL，ddH2O定容至20μL；PCR仪控温22℃反应15min；
③将10μL连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；
鉴定引物：如SEQ ID：NO.9和NO.8所示；
F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；
R：g13-B：AAACTGGTCGAAAGCCTTCCCCTCA；
将正确的克隆摇菌培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到加g13靶点的BKG-g13载体。
将针对本氏烟UbEF1B基因的BKG-g10、BKG-g11以及针对CCR4/NOT的BKG-g12、BKG-g13载体农杆菌转化：
农杆菌LBA4404菌株50μL，质粒5μL，电击转化；28℃孵育90min；卡那霉素加利福平抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定，鉴定引物与前述转化大肠杆菌引物相同；-80℃保存菌株。
活化农杆菌：将含有BKG-g10、BKG-g12的载体及空载体(Mock)农杆菌分别混合TLCYnV侵染性克隆农杆菌在野生型本氏烟上进行接种。提取混合接种后65小时的本氏烟植株叶片DNA，通过qPCR分析病毒TLCYnV积累量变化，如图4A所示，确定病毒TLCYnV积累量相较于对照组显著下降；
以上载体接种本氏烟植株7天后，观察植物症状表型的差异，如图4B所示，确定构建的BKG-g10，BKG-g12的载体确实有抗云南番茄曲叶病毒(TLCYnV)的效果，抽取系统叶片DNA，通过qPCR分析病毒TLCYnV积累量变化，如图4C所示，确定病毒TLCYnV积累量相较于对照组显著下降。结果证实针对UbEF1B基因和CCR4/NOT基因编辑载体BKG-g10和BKG-g12具有明显的抑制TLCYnV侵染的能力。
将各个载体通过组培技术得到包含此套载体系统的本氏烟材料，对转基因呈阳性的植物进行进一步鉴定，发现BKG-g10与BKG-g12载体转入能够有效对UbEF1B以及CCR4/NOT基因进行编辑(如图5所示)。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的载体及其构建方法和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> g10-A(Artificial Sequence)
<400> 1
tgattgctgg tctgccgtac atcgg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> g10-B(Artificial Sequence)
<400> 2
aaacccgatg tacggcagac cagca 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> g11-A(Artificial Sequence)
<400> 3
tgattggatg tggagcgccg gttgc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> g11-B(Artificial Sequence)
<400> 4
aaacgcaacc ggcgctccac atcca 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> g12-A(Artificial Sequence)
<400> 5
tgattggtgt tgcatgactg ccagc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> g12-B(Artificial Sequence)
<400> 6
aaacgctggc agtcatgcaa cacca 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> g13-A(Artificial Sequence)
<400> 7
tgattgaggg gaaggctttc gacca 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> g13-B(Artificial Sequence)
<400> 8
aaactggtcg aaagccttcc cctca 25
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> M13F(Artificial Sequence)
<400> 9
gttgtaaaac gacggccag 19
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> M13R(Artificial Sequence)
<400> 10
caggaaacag ctatgac 17

Claims (9)

1.一种基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的载体，其特征在于：包括针对本氏烟UbEF1B基因构建的pCambia 1300-BKG-g10、pCambia 1300-BKG-g11(简称BKG-g10、BKG-g11)和/或针对本氏烟CCR4/NOT基因构建的pCambia 1300-BKG-g12、pCambia 1300-BKG-g13载体(简称BKG-g12、BKG-g13)。
2.权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的载体的构建方法，其特征在于：在本氏烟UbEF1B基因CDS区的序列中选定PAM位点并设计gRNA；包括BKG-g10,BKG-g11载体分别所需的两个靶点的四条gRNA链，如SEQ ID：NO.1-NO.4所示；并将上述单链gRNA合成为双链；
在本氏烟CCR4/NOT基因的CDS区序列中选定PAM位点并设计gRNA；包括BKG-g12,BKG-g13载体分别所需的两个靶点的四条gRNA链，如SEQ ID：NO.5-NO.8所示；并将上述单链gRNA合成为双链。
3.根据权利要求2所述的载体构建方法，其特征在于：所述BKG-g10载体的构建包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4 DNA连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；鉴定引物如SEQ ID:NO.9、NO.2所示；
④提取质粒，并用如SEQ ID:NO.9-NO.10所示的引物测序，得到加g10靶点的BKG-g10载体。
4.根据权利要求2所述的载体构建方法，其特征在于：所述BKG-g11载体的构建包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4 DNA连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；鉴定引物如SEQ ID:NO.9、NO.4所示；
④提取质粒，并用如SEQ ID:NO.9-NO.10所示的引物测序，得到加g11靶点的BKG-g11载体。
5.根据权利要求2所述的载体构建方法，其特征在于：所述BKG-g12载体的构建包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4 DNA连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体,鉴定引物如SEQ ID:NO.9、NO.6所示；
④提取质粒，并用如SEQ ID:NO.9-NO.10所示的引物测序，得到加g12靶点的BKG-g12载体。
6.根据权利要求2所述的载体构建方法，其特征在于：所述BKG-g13载体的构建包括以下步骤：
①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；
②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4 DNA连接酶进行连接；
③将连接产物转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；鉴定引物如SEQ ID:NO.9、NO.8所示；
④提取质粒，并用如SEQ ID:NO.9-NO.10所示的引物测序，得到加g13靶点的BKG-g13载体。
7.权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的任一载体在抵御任何依赖本氏烟寄主UbEF1B基因以及CCR4/NOT基因完成复制侵染的植物病毒侵染中的应用。
8.权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的任一载体在接种上述载体本氏烟的瞬时表达或转上述载体的本氏烟材料的获取中的应用。
9.权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的任一载体在抵御双生病毒中的应用，通过寻找本氏烟UbEF1B以及CCR4/NOT基因在双生病毒寄主的同源基因，改造靶点的gRNA。
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