CN115976040A - 本氏烟NbTSG101基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种本氏烟NbTSG101基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法，其中，所述病毒为芜菁花叶病毒(TuMV)、番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)和烟草花叶病毒(TMV)；NbTSG101基因的转录本序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过农杆菌转化的方法，将携带目的基因靶点的基因敲除载体导入目的植物中，获得了NbTSG101基因突变的本氏烟植株，该突变本氏烟后代植株生长状态正常，且能够显著减轻TuMV、TYLCV和TMV的侵染，具有广谱的抗病毒效果。

Description

本氏烟NbTSG101基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及本氏烟NbTSG101基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法。

背景技术

芜菁花叶病毒(TuMV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，寄主范围广泛且分布在北美洲、欧洲、亚洲等世界各地，能够侵染至少43个双子叶植物科植物，是农业生产上最重要的植物病毒之一。在自然条件下，TuMV主要侵染油菜、甘蓝、白菜、青花菜等十字花科作物和蔬菜。被感染后的植物会出现黄萎、花叶、斑驳、矮化等症状。可造成严重的减产和经济损失。TuMV不仅寄主范围广泛、还能通过多种途径进行传播，如它能由蚜虫以非持久方式传播，也可以通过摩擦接种或汁液接触传染。

番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，能够侵染烟草、番茄、辣椒等多种茄科作物，感染的作物产生明显的矮化、叶片卷曲、黄化等症状，严重导致作物减产，造成巨大的经济损失，危害农业生产。目前TYLCV是全球危害番茄生产最严重的植物病毒。

烟草花叶病毒(TMV)属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，是一种危害严重且分布广泛的病毒，除了危害烟草以外，还能侵染番茄、茄子、马铃薯、辣椒、龙葵等茄科植物，此外还能侵染葫芦科、十字花科、豆科、菊科等30个科的300多种植物，全球每年仅因为烟草花叶病毒造成的损失达1亿多美元，目前还没有开发出很好的抗病毒药剂。

以上三种病毒是我国农业生产中严重危害作物的病毒，目前缺少有效的化学药剂进行防治，而且无有效的抗病毒作物品种可用。

植物病毒在寄主体内以寄生方式生存，因此一般的化学农药不适合用于病毒病害的防治上。在自然界中，植物病毒的传播媒介很多，通过化学药剂防治传毒昆虫效果差强人意，而且带来严重的农药残留超标和环境污染。如今农业上防治方法以清除感病植株、灭杀植物病毒传播昆虫为主，对于此类防治方式，效率低且在人力等方面也存在着许多问题。因此，对于病毒防控最有效、最重要的方法就是创制抗病毒材料、选育抗病毒品种。通过CRISPR-Cas9系统，研究人员具备了对植物内源基因进行定点突变的能力。通过此技术，可以实现对寄主感病基因进行特异性敲除，得到抗病毒作物，且获得的后代植物不含有转基因，在食品安全中更容易被大众接受。因此，鉴定具有广谱作用的感病基因是获得抗病毒品种的关键。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种本氏烟NbTSG101基因在调控植物抗病毒中的应用。

本发明的第二目的是提供一种本氏烟NbTSG101基因敲除植物的培育方法。

本发明基于CRISPR-Cas9介导的基因编辑工具，通过前期大量的筛选工作，鉴定到一个本氏烟中的广谱感病毒的基因NbTSG101，进一步通过转基因技术获得了广谱、高效的抗病毒材料。该抗病材料的创制和使用将在植物病毒病害绿色防控中起到重要作用。

本发明通过农杆菌转化的方法，将携带NbTSG101靶点的CRISPR载体导入目的植物中，获得的本氏烟NbTSG101基因敲除植物能够显著减轻芜菁花叶病毒(TuMV)、番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)和烟草花叶病毒(TMV)的侵染，有效控制其危害。

具体而言，本发明采用的技术方案如下：

本氏烟NbTSG101基因在调控植物抗病毒中的应用：通过将本氏烟NbTSG101基因突变抵御植物病毒的侵染；其中，所述病毒为芜菁花叶病毒TuMV、番茄黄化曲叶病毒TYLCV和烟草花叶病毒TMV，所述NbTSG101基因的转录本序列如SEQ ID NO:1所示。

具体为：通过构建本氏烟NbTSG101基因敲除载体，即：针对本氏烟NbTSG101基因编码区序列靠近5’端的PAM位点设计特异性靶向NbTSG101的gRNA，构建pCambia1300-BKG-g1载体；以无菌培养的本氏烟叶片做愈伤组织，使用农杆菌介导的T-DNA方式进行遗传转化，将敲除载体导入目的植物中，获得的本氏烟NbTSG101基因突变的本氏烟植物能够显著减轻TuMV、TYLCV和TMV的侵染。

一种抗TuMV、TYLCV和TMV的NbTSG101转基因植物的培育方法：通过农杆菌转化法，将携带NbTSG101基因靶点的基因敲除载体导入目的植物中，获得本氏烟NbTSG101基因突变的植物。

具体包括以下步骤：

(1)设计能够特异性靶向本氏烟内源基因NbTSG101的gRNA，得到gRNA靶点序列，如SEQ ID NO:2所示；设计引物进行PCR扩增，克隆得到NbTSG101-gRNA片段；其中，引物为NbTSG101-gRNA-F和NbTSG101-gRNA-R，序列分别如SEQ ID NO:3-4所示；

(2)用限制性内切酶Eco31I线性化BKG载体，纯化回收；

(3)用T4 DNA连接酶连接线性化的BKG载体与双链化的gRNA；

(4)转化DH5α大肠杆菌，筛选鉴定阳性克隆，阳性克隆质粒测序，获得正确插入gRNA的BKG载体；

(5)将1μl重组质粒与50μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500V电击转化，恢复后涂布到抗性培养基上筛选已经转入重组质粒的农杆菌；

(6)将带有重组质粒的农杆菌侵染烟草叶片，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗，转移继续培养；

(7)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，使用CTAB法抽提DNA；利用引物对M13-F与BKG-gRNA-R，以提取DNA为模板进行PCR扩增，确定植物中转入了外源CRISPR-Cas9序列；引物M13-F和BKG-gRNA-R的序列分别如SEQ ID NO:5-6所示；

(8)在阳性转基因材料上，BKG-NbTSG101-F与BKG-NbTSG101-R引物，克隆本氏烟NbTSG101的基因靶点序列，通过测序，筛选基因被编辑的株系，留种；BKG-NbTSG101-F与BKG-NbTSG101-R的序列分别如SEQ ID NO:7-8所示。

同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

本发明发现了烟草中新的感病毒基因NbTSG101，并且通过农杆菌转化的方法，将携带NbTSG101靶点的CRISPR载体导入目的植物中，通过转基因敲除本氏烟中的NbTSG101基因，获得的NbTSG101基因敲除植物能够显著减轻TuMV、TYLCV和TMV造成的病害。

下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的本氏烟NbTSG101基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法作进一步说明。

附图说明

图1为NbTSG101基因敲除载体构建示意图；

图2为NbTSG101基因敲除本氏烟的突变形式(A)及突变体表型(B)；

图3为NbTSG101基因敲除增强本氏烟对芜芜菁花叶病毒(TuMV)、番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)和烟草花叶病毒(TMV)的抗病性。

其中，(A)TuMV-GFP浸润接种本氏烟野生型及NbTSG101基因敲除植物，在第6天紫外灯照射下观察到系统叶病毒积累；(B)对接种TuMV-GFP不同植物的同一发病部位取样进行qRT-PCR检测。(C)TYLCV浸润接种本氏烟野生型及NbTSG101基因敲除植物，在第10天观察到系统叶表型；(D)对接种TYLCV不同植物的同一发病部位取样进行qPCR检测；(E)TMV-GFP浸润接种本氏烟野生型及NbTSG101基因敲除植物，在第6天紫外灯照射下观察到系统叶病毒积累；(F)对接种TMV-GFP不同植物的同一发病部位取样进行qRT-PCR检测。

具体实施方式

一种抗TuMV、TYLCV和TMV的NbTSG101转基因植物的培育方法，通过农杆菌转化，将携带NbTSG101基因靶点的基因敲除载体导入目的植物中，获得本氏烟NbTSG101基因突变的植物。NbTSG101基因的转录本序列如SEQ ID NO:1所示。

具体包括以下步骤：

(1)设计能够特异性靶向本氏烟内源基因NbTSG101的gRNA，得到gRNA靶点序列：CAGTTTGTGAATCCGTCCG，如SEQ ID NO:2所示；设计引物进行PCR扩增，克隆得到NbTSG101-gRNA片段；其中，引物为NbTSG101-gRNA-F和NbTSG101-gRNA-R，序列分别如SEQ ID NO:3-4所示；

NbTSG101-gRNA-F：tgattgcagtttgtgaatccgtccg；

NbTSG101-gRNA-R：aaaccggacggattcacaaactgca；

(2)然后将得到的引物经过退火得到双链DNA，使用碧云天Annealing Buffer forDNA Oligos(D0251)的方法。将步骤(1)中所述的NbTSG101-gRNA-F/R退火合成双链，具体步骤如下：

①将NbTSG101-gRNA-F/R干粉用ddH₂O配置为50μM；

②在PCR管中配置反应体系：

<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	4μL
		Annealing Buffer for DNA Oligo	2μL
Oligo A	2μL
		Oligo B	2μL
总共	10μL

③用PCR仪器控温：95℃2分钟；每8秒下降0.1℃，降到25℃；4℃5分钟暂时存放；

④退火产物用于后续的连接。

(3)将BKG载体进行酶切与以上产物通过T4连接酶连接，转入DH5α大肠杆菌，菌液涂板于卡那霉素筛选的培养平板，鉴定阳性后进行质粒提取，获得重组质粒，NbTSG101基因敲除载体构建示意图如图1所示。

(4)将1μl重组质粒与50μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500V电击转化，恢复后涂布到抗性培养基上筛选已经转入重组质粒的农杆菌；

(5)将带有重组质粒的农杆菌侵染烟草叶片，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗，转移继续培养；

(6)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，使用CTAB法抽提DNA；利用引物对M13-F与BKG-gRNA-R，以提取DNA为模板进行PCR扩增，确定植物中转入了外源CRISPR-Cas9序列；引物M13-F和BKG-gRNA-R的序列分别如SEQ ID NO:5-6所示；

M13-F：gttgtaaaacgacggccag；

BKG-gRNA-R：ggccatttgtctgcagaattgg；

(7)在阳性转基因材料上，BKG-NbTSG101-F与BKG-NbTSG101-R引物，克隆本氏烟NbTSG101的基因靶点序列，通过测序，筛选基因被编辑的株系，留种；BKG-NbTSG101-F与BKG-NbTSG101-R的序列分别如SEQ ID NO:7-8所示；

BKG-NbTSG101-F：attatttggcttatggaatcttaccc；

BKG-NbTSG101-R：gctagggctagggttagg；

(8)在获得的阳性编辑材料中，筛选到两个突变的本氏烟材料。如图2A所示，第一个材料在靶点序列中引入了C碱基的插入突变，命名为：Cas9-NbTSG101-1。第二个材料在靶点序列发生了5个碱基的缺失突变，命名为：Cas9-NbTSG101-2。

(9)通过筛选获得转基因株系，NbTSG101的突变对本氏烟正常生长没有影响(图2B)。

(10)将本次获得的两个NbTSG101基因突变体进行带有GFP荧光的芜菁花叶病毒(TuMV-GFP)侵染性克隆、TYLCV侵染性克隆、带有GFP荧光的烟草花叶病毒(TMV-GFP侵染性克隆接种，两个突变体植物相对于野生型有较强的抗病毒表型(图3)。

TuMV-GFP、TMV-GFP浸润接种本氏烟野生型及NbTSG101基因敲除植物，在第6天紫外灯照射下观察到系统叶病毒积累，如图3A、3E所示；同样地，TYLCV接种本氏烟野生型以及NbTSG101基因敲除植物，在第10天观察到表型变化，如图3C所示；并对不同植物的同一发病部位取样进行qRT-PCR和qPCR检测，结果如图3B、3D、3F所示，显示TuMV-GFP、TYLCV和TMV-GFP的病毒RNA积累量在两个NbTSG101基因敲除株系中显著低于野生型。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.本氏烟NbTSG101基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：通过将本氏烟NbTSG101基因突变抵御植物病毒的侵染；其中，所述病毒为芜菁花叶病毒TuMV、番茄黄化曲叶病毒TYLCV和烟草花叶病毒TMV，所述NbTSG101基因的转录本序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的本氏烟NbTSG101基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：所述植物为本氏烟。

3.根据权利要求2所述的本氏烟NbTSG101基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：针对本氏烟NbTSG101基因编码区序列靠近5’端的PAM位点设计特异性靶向NbTSG101的gRNA，构建pCambia1300-BKG-g1载体，将基因敲除载体导入目的植物中，获得的本氏烟NbTSG101基因突变的植物可显著减轻TuMV、TYLCV和TMV的侵染。

4.根据权利要求3所述的本氏烟NbTSG101基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：以无菌培养的本氏烟叶片做愈伤组织，使用农杆菌转化的方式，将基因敲除载体导入目的植物中。

5.一种抗TuMV、TYLCV和TMV病毒的NbTSG101转基因植物的培育方法，其特征在于：通过农杆菌转化法，将携带NbTSG101基因靶点的基因敲除载体导入目的植物中，获得NbTSG101基因突变的本氏烟植物。

6.根据权利要求5所述的NbTSG101转基因植物的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)设计能够特异性靶向本氏烟内源基因NbTSG101的gRNA，得到gRNA靶点序列，如SEQID NO:2所示；设计引物合成两条单链gRNA，然后经退火后合成互补双链；

(2)用限制性内切酶Eco31I线性化BKG载体，纯化回收；

(3)用T4 DNA连接酶连接线性化的BKG载体与双链化的gRNA；

(4)转化DH5α大肠杆菌，筛选鉴定阳性克隆，阳性克隆质粒测序，获得正确插入gRNA的BKG载体；

(5)将1μl重组质粒与50μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500V电击转化，恢复后涂布到抗性培养基上筛选获得已经转入重组质粒的农杆菌；

(6)将带有重组质粒的农杆菌侵染烟草叶片，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗，转移继续培养；

(7)待小苗生长稳定后，取叶片样品，使用CTAB法抽提DNA；以提取的DNA为模板，利用引物对M13-F与BKG-gRNA-R进行PCR扩增，确定植物中转入了外源CRISPR-Cas9序列；

(8)在阳性转基因材料上，通过使用BKG-NbTSG101-F与BKG-NbTSG101-R引物，克隆本氏烟NbTSG101的基因靶点序列，通过测序，筛选被编辑的株系，留种。

7.根据权利要求6所述的NbTSG101转基因植物的培育方法，其特征在于：所述步骤(1)中的引物为NbTSG101-gRNA-F和NbTSG101-gRNA-R，序列分别如SEQ ID NO:3-4所示。

8.根据权利要求7所述的NbTSG101转基因植物的培育方法，其特征在于：所述步骤(7)中，引物M13-F和BKG-gRNA-R的序列分别如SEQ ID NO:5-6所示。

9.根据权利要求8所述的NbTSG101转基因植物的培育方法，其特征在于：所述步骤(8)中，BKG-NbTSG101-F与BKG-NbTSG101-R的序列分别如SEQ ID NO:7-8所示。

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