CN113999872B - 烟草DCP1/ATG8i基因在抑制番茄黄曲叶病毒侵染中的应用 - Google Patents

烟草DCP1/ATG8i基因在抑制番茄黄曲叶病毒侵染中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了烟草DCP1/ATG8i基因在抑制番茄黄曲叶病毒侵染中的应用，利用农杆菌介导的表达系统，在本氏烟中单独或者共同表达烟草DCP1和ATG8i能够显著减弱番茄黄曲叶病毒的侵染，说明烟草DCP1和ATG8i基因可调控番茄黄曲叶病毒的侵染。本发明方案具有以下优势：(1)操作简易，周期较短；(2)安全高效；(3)表达效率高，表达时间长；(4)在植株叶片上过表达烟DCP1/ATG8i基因抑制番茄黄曲叶病毒的侵染，不会对植物造成损伤，保证植株的完整性。

Description

烟草DCP1/ATG8i基因在抑制番茄黄曲叶病毒侵染中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种烟草DCP1/ATG8i基因在抑制番茄黄曲叶病毒侵染中的应用。
背景技术
番茄黄曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，其基因组为单链环状DNA，大小约为2.8kb，病毒颗粒为孪生形态。TYLCV是发现最早、危害最严重的侵染番茄的双生病毒，目前已经传播到许多国家。
受TYLCV侵染的植株主要表现为植株矮缩，叶片黄化并且伴有皱缩，叶脉增厚，流行时可造成农作物的产量和品质下降，造成严重的农业经济损失。中国自2006年在上海发现TYLCV后，伴随贸易流通，TYLCV在我国多个省份大面积发生，且已呈扩展蔓延的趋势，严重制约着番茄的产量。
目前，由于市场上缺乏有效的化学农药可以防治TYLCV，主要通过常规育种的方法选育抗病品种防治该病毒。然而，常规育种具有选育周期长、选育工作繁琐、抗性容易被突破等缺点。利用基因工程技术表达抗病基因，提高作物对病毒病的抗性，是一种高效和快速的途径。
因此，如何快速有效的抑制番茄黄曲叶病毒侵染、提高作物抗性成为了本领域亟需解决的难题之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种烟草DCP1/ATG8i基因在抑制番茄黄曲叶病毒侵染中的应用。本发明通过前期实验筛选出RNA降解途径的DCP1基因和细胞自噬相关的ATG8i基因，利用农杆菌介导的瞬时表达系统，在本氏烟中瞬时过表达烟草DCP1和/或ATG8i基因可以显著抑制TYLCV的侵染，为TYLCV的防治提供一种新途径、新方法。DCP1/ATG8i在烟草中过表达介导的抗病性具有操作简易、周期较短、安全高效等特点，能够有效抑制番茄黄曲叶病毒的侵染。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
烟草DCP1/ATG8i基因在抑制番茄黄曲叶病毒侵染中的应用，其中，DCP1转录本序列如SEQ ID NO:1所示，ATG8i基因转录本序列如SEQ ID NO:2所示。
具体方法为：通过农杆菌介导的瞬时表达系统，在本氏烟中瞬时过表达烟草DCP1或ATG8i基因，可减轻番茄黄曲叶病毒的侵染。
或者，通过农杆菌介导的瞬时表达系统，在本氏烟中同时瞬时过表达烟草DCP1和ATG8i基因，可显著减轻番茄黄曲叶病毒的侵染。
烟草DCP1/ATG8i基因在抗番茄黄曲叶病毒侵染中的应用，具体包括以下步骤：
(1)利用TRIzol法提取本氏烟叶片中的总RNA，利用RNA反转录试剂盒进行基因组DNA的去除与反转录，获得cDNA；
(2)利用引物对NbDCP1-F与NbDCP1-R，NbATG8i-F与NbATG8i-R，以上述cDNA为模板进行PCR扩增，克隆获得NbDCP1和NbATG8i基因片段；
其中，NbDCP1-F、NbDCP1-R、NbATG8i-F与NbATG8i-R引物序列如SEQ ID NO:3-6所示；
(3)利用Gateway载体将NbDCP1构建到带有Myc荧光标签的载体上，获得Myc-NbDCP1重组质粒，将NbATG8i构建到带有YFP荧光标签的载体上，获得YFP-NbATG8i重组质粒；
(4)将1μl重组质粒加入100μl农杆菌EHA105感受态中，轻轻混匀转入电击杯中，使用电击装置2500V电击转化，加入LB培养基恢复2h后，涂布到抗性培养基上28℃培养48h；利用引物对35S-F与NbDCP1-1R、NbATG8i-1R鉴定出阳性单克隆，获得带有Myc-NbDCP1、YFP-NbATG8i重组质粒的农杆菌；
其中，35S-F与NbDCP1-1R、NbATG8i-1R引物序列如SEQ ID NO:7-9所示；
(5)将含Myc-NbDCP1的菌液、含YFP-NbATG8i的菌液、同时含有Myc-NbDCP1和YFP-NbATG8i的菌液，分别与含番茄黄曲叶病毒的菌液以1:1的比例混合后，浸润野生型本氏烟叶片背面；
(6)浸润后的烟草植株放于温室培养，培养条件为：温度为25℃，相对湿度为60％，光照周期为16h光照/8h黑暗。
(7)接种2天后，取瞬时过表达NbDCP1、NbATG8i以及同时表达NbDCP1和NbATG8i的浸润叶，用尿素的方法提取总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，再使用GFP、Myc抗体进行Western blot分析Myc-NbDCP1、YFP-NbATG8i是否在叶片中表达；
(8)接种10天后观察本氏烟中瞬时过表达NbDCP1、NbATG8i以及同时表达NbDCP1和NbATG8i对TYLCV抗性的表型；
(9)利用Western blot分析以上处理中TYLCV衣壳蛋白的积累量，并qPCR分析其感染的病毒基因组DNA积累的水平。
同现有技术相比，本发明的突出效果在于：
本发明通过农杆菌介导的瞬时表达系统，在本氏烟中瞬时过表达烟草DCP1和ATG8i基因能够抑制TYLCV的侵染，具有以下优势：
(1)操作简易，周期较短：农杆菌介导的表达系统仅需要1～2天就能使得表达基因发挥功能；
(2)安全高效：瞬时表达中的基因转移及其表达是一个独立的过程，不产生可遗传的后代，其生物安全性高；
(3)表达效率高，表达时间长：通过高效、稳定的表达烟草DCP1/ATG8i基因，能够有效抑制番茄黄曲叶病毒的侵染；
(4)植株完整：在植株叶片上过表达烟DCP1/ATG8i基因抑制番茄黄曲叶病毒的侵染，不会对植物造成损伤，保证植株的完整性。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的烟草DCP1/ATG8i基因在抑制番茄黄曲叶病毒侵染中的应用作进一步说明。
附图说明
图1为瞬时过表达DCP1与ATG8i表型图。
其中，(A)在本氏烟中瞬时过表达NbDCP1、NbATG8i以及同时表达NbDCP1和NbATG8i的表型图，Mock为接种buffer作为对照。
(B)Western blot分析图A中Myc-NbDCP1、YFP-NbATG8i以及同时表达Myc-NbDCP1和YFP-NbATG8i的蛋白水平，使用GFP的抗体(WB:GFP)和Myc的抗体(WB:GFP)确认目标蛋白表达，丽春红染色(Ponceau S)的Rubisco大亚基代表上样量。
图2为瞬时过表达DCP1与ATG8i抑制TYLCV的侵染。
其中，(A)瞬时过表达植物接种TYLCV 10天后的症状。图中：+Vec代表接种含有pCambia2300空载体的农杆菌菌液，+TYLCV代表接种含有pCambia2300-TYLCV-BJ(北京分离物)-1.4A侵染性克隆的农杆菌菌液。
(B)Western blot分析图A中TYLCV衣壳蛋白(CP)的积累量，使用CP抗体(WB:GFP)确认目标蛋白表达。丽春红染色(Ponceau S)的Rubisco大亚基代表上样量。
(C)qPCR定量分析感染TYLCV的烟草植物(A)的病毒基因组DNA积累的水平。星号代表显著差异(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。
具体实施方式
烟草DCP1/ATG8i基因在抗番茄黄曲叶病毒侵染中的应用，具体实验步骤为：
(1)TRIzol法提取本氏烟叶片中的总RNA
1)称取0.1g的本氏烟叶片装入2ml离心管中，加入0.5mm钢珠，液氮速冻后放入打样机中破碎两分钟；
2)在装有破碎样品2ml离心管中快速加入1ml TRIzol抽提液，上下混匀，充分裂解，室温放置5min；
3)加入0.3ml的氯仿，剧烈震荡15sec，室温放置2min；
4)4℃，12,000rpm离心15min，取0.5ml上清至一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，上下混匀，室温放置20min；
5)4℃，12,000rpm离心10min，弃去上清。再用1ml 70％乙醇清洗沉淀两次；4℃，12,000rpm离心5min；
6)弃去上清，吸取残余的乙醇，放通风橱干燥。加入30μl DEPC处理的ddH2O，用枪头吹打助溶，10,000rpm离心3min，取上清，可用于下一步实验或保存于-80℃。
(2)样品中基因组DNA的去除与反转录：利用TaKaRa PrimeScriptTM RT reagentKit with gDNA Eraser试剂盒进行基因组DNA的去除与反转录。
1)将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Eraser Buffer、RT Primer Mix、5xPrimeScript Buffer 2、RNase-Free ddH2O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。
2)按照如下的基因组DNA的去除反应体系配制混合液，混匀，简短离心后并置于42℃，孵育2min，然后置于冰上放置；
3)按照如下的反转录反应体系配制混合液；
4)将反转录反应体系中的混合液，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀；
5)42℃，孵育15min；85℃，孵育5sec之后放于冰上，获得的cDNA经稀释后可直接用于后续实验，或-30℃保存。
(3)利用引物对NbDCP1-F与NbDCP1-R，NbATG8i-F与NbATG8i-R(如SEQ ID NO：3-6所示)，上述cDNA为模板，利用TOYOBO公司KOD–Plus-Neo Kit进行PCR扩增，获得NbDCP1和NbATG8i基因片段；
NbDCP1-F：ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatgtcacagaacggaaaatta
NbDCP1-R：ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcacaggtccatagtttgggt
NbATG8i-F：ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatggggaaggctttcaaaa
NbATG8i-R：ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctcaactatttgcacgaccaaag
(4)利用Gateway载体将NbDCP1构建到带有Myc荧光标签的载体上，获得Myc-NbDCP1重组质粒，将NbATG8i构建到带有YFP荧光标签的载体上，获得YFP-NbATG8i重组质粒；
(5)将1μl重组质粒加入100μl农杆菌EHA105感受态中，轻轻混匀转入电击杯中，使用电击装置2500V电击转化，加入LB培养基恢复2h后，涂布到抗性培养基上28℃培养48h。利用引物对35S-F与NbDCP1-1R、NbATG8i-1R(如SEQ ID NO：7-9所示)鉴定出阳性单克隆，获得带有Myc-NbDCP1、YFP-NbATG8i重组质粒的农杆菌；
35S-F：gacgcacaatcccactatcc；
NbDCP1-1R：ttgggttaggggcagaagcaggagtgagaga
NbATG8i-1R：caactatttgcacgaccaaaggttttc
(6)将含Myc-NbDCP1、YFP-NbATG8i的菌液与同时含有Myc-NbDCP1和YFP-NbATG8i的菌液用一次性注射器浸润野生型本氏烟叶片背面，并吸取上述菌液分别与含TYLCV的菌液以1:1的比例混合后，浸润野生型本氏烟叶片背面；
(7)浸润后的烟草植株放于温室培养，培养条件为：温度为25℃，相对湿度为60％，光照周期为16/8h(光照/黑暗)；
(8)接种2天后，取瞬时过表达NbDCP1、NbATG8i以及同时表达NbDCP1和NbATG8i的浸润叶，用尿素的方法提取总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，再使用GFP、Myc抗体进行Western blot分析Myc-NbDCP1、YFP-NbATG8i是否在叶片中表达。
(9)接种10天后观察本氏烟中瞬时过表达NbDCP1、NbATG8i以及同时表达NbDCP1和NbATG8i的表型，如图1A所示，可以看出瞬时表达以上基因不会引起明显的植物发育缺陷。
(10)接种10天后观察本氏烟中瞬时过表达NbDCP1、NbATG8i以及同时表达NbDCP1和NbATG8i，并接种TYLCV植株新叶症状，如图2A所示。发现瞬时过表达NbDCP1、NbATG8i以及同时表达NbDCP1和NbATG8i后病毒症状有明显减轻。
(11)利用Western blot分析以上处理中TYLCV衣壳蛋白(CP)的积累量，并qPCR分析其感染的病毒基因组DNA积累的水平，如图1B、2B、2C所示。。
通过上述实验结果可以看出，通过农杆菌介导的瞬时表达系统，在本氏烟中单独瞬时过表达烟草DCP1或ATG8i基因，同时瞬时过表达烟草DCP1和ATG8i基因，均能够抑制TYLCV的侵染，农杆菌介导的表达系统仅需要1～2天就能使得表达基因发挥功能。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 烟草DCP1/ATG8i基因在抑制番茄黄曲叶病毒侵染中的应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1010
<212> DNA
<213> DCP1 转录本(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtcacaga acggaaaatt aatgccgaat ttggaccaga acagcaccaa gctcctcaac 60
ttgaccgttc ttcagcgtat cgatcctttc attgaagaaa ttcttatcac tgctgctcat 120
gttaccttct acgaattcaa catcgataac agccaatgga gtcgaaagga cgtggaagga 180
tctctatttg ttagagggtg ttacaggagt tctcaaccgc gatttcagtt tattgttatg 240
aaccgaagaa atacagataa tttggtggag gatctcctgg gggattttga gtatgaggtc 300
caggttccat atttgttgta tcgaaatgct tcccaagaag taaatgggat atggttttat 360
aatcagcgtg aatgtgaaga agttgcaaat ctctttgaca ggatactcgg tgcatattcc 420
aaggtgccta ccaagtcaaa agtaccactg acaaagagtg aatttgaaga gctggaagca 480
gttccaacca tggctgtaat tgatggtcct ctggagccat cgttgtctac tgcctcaaat 540
gctccgcatc tccccgagga aaatgccttt ttgaacttct tcagtaatgc tatgacaatt 600
gggaatgctc cctgtactac agttccaggg cagccatgcc actcatcttc accggtcctg 660
cctcctcctc gtcctgctac tgctgttcct ccctcttcag cacctgccct gattccatct 720
ccacctcttt caacttccct tttgaggccc ctccttgatg catctgaatc agacagcagt 780
gctaaatggt cttcaaatct ggtgaagcca tcatcatttt ttggtcctcc aaccgcctcc 840
tctccgctga tgcctgccgt ttcttcatct gtgcccactg ctcccccact tcttccgctt 900
gggaatctcc aacgtcctta tggagctcct ttgcttcaac catttcctcc gccaacccct 960
cctccatctc tcactcctgc ttctgcccct aacccaaact atggacctgt 1010
<210> 2
<211> 363
<212> DNA
<213> ATG8i 转录本(Artificial Sequence)
<400> 2
atggggaagg ctttcaaaaa agaattttca gacgatgaga gactcgcaga atctcaagat 60
ataatcgcca aatatcctga tcgactgccg gtggtggttg aaagatattc aaagactgac 120
cttcctgaga tggaaaagaa gaagtacctg gtaccccgtg atatgtccgt tggccaattt 180
atccacattc tgagtggcag actccatctg gctcctggga aagctctctt catgtttgtg 240
aataacacct tgcctcaaac aacaagcttg atggagacgg tgtatgattc tttcaaggat 300
aaagatgggt tcctctacat gtgctacagc agtgagaaaa cctttggtcg tgcaaatagt 360
tga 363
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> NbDCP1-F(Artificial Sequence)
<400> 3
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catgtcacag aacggaaaat ta 52
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> NbDCP1-R(Artificial Sequence)
<400> 4
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc acaggtccat agtttgggt 49
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> NbATG8i-F(Artificial Sequence)
<400> 5
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catggggaag gctttcaaaa 50
<210> 6
<211> 52
<212> DNA
<213> NbATG8i-R(Artificial Sequence)
<400> 6
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcaactattt gcacgaccaa ag 52
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 35S-F(Artificial Sequence)
<400> 7
gacgcacaat cccactatcc 20
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> NbDCP1-1R(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgggttagg ggcagaagca ggagtgagag a 31
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> NbATG8i-1R(Artificial Sequence)
<400> 9
caactatttg cacgaccaaa ggttttc 27

Claims (7)

1.烟草DCP1基因在抑制番茄黄曲叶病毒侵染中的应用，以及烟草DCP1和ATG8i基因在抑制番茄黄曲叶病毒侵染中的应用，其特征在于：DCP1转录本序列如SEQ ID NO:1所示，ATG8i基因转录本序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：抑制番茄黄曲叶病毒对烟草的侵染。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：通过农杆菌介导的瞬时表达系统，在本氏烟中瞬时过表达烟草DCP1基因，可减轻番茄黄曲叶病毒的侵染。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：通过农杆菌介导的瞬时表达系统，在本氏烟中同时瞬时过表达烟草DCP1和ATG8i基因，可显著减轻番茄黄曲叶病毒的侵染。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用TRIzol法提取本氏烟叶片中的总RNA，利用RNA反转录试剂盒进行基因组DNA的去除与反转录，获得cDNA；
（2）利用引物对NbDCP1-F与NbDCP1-R，NbATG8i-F与NbATG8i-R，以上述cDNA为模板进行PCR扩增，克隆获得NbDCP1和NbATG8i基因片段；
其中，NbDCP1-F、NbDCP1-R、NbATG8i-F与NbATG8i-R引物序列如SEQ ID NO:3-6所示；
（3）利用Gateway载体将NbDCP1构建到带有Myc荧光标签的载体上，获得Myc- NbDCP1重组质粒，将NbATG8i构建到带有YFP荧光标签的载体上，获得YFP-NbATG8i重组质粒；
（4）将1 μl重组质粒加入100 μl农杆菌EHA105感受态中，轻轻混匀转入电击杯中，使用电击装置2500 V电击转化，加入LB培养基恢复2h后，涂布到抗性培养基上28℃培养48h；利用引物对35S-F与NbDCP1-1R、NbATG8i-1R鉴定出阳性单克隆，获得带有Myc-NbDCP1、YFP-NbATG8i重组质粒的农杆菌；
其中，35S-F与NbDCP1-1R、NbATG8i-1R引物序列如SEQ ID NO:7-9所示；
（5）将含Myc-NbDCP1的菌液、同时含有Myc-NbDCP1和YFP-NbATG8i的菌液，分别与含番茄黄曲叶病毒的菌液以1:1的比例混合后，浸润野生型本氏烟叶片背面；
（6）浸润后的烟草植株放于温室培养。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述步骤（6）的培养条件为：温度为25℃，相对湿度为60%，光照周期为16h光照/8h黑暗。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：（1）接种2天后，取瞬时过表达NbDCP1以及同时表达NbDCP1和NbATG8i的浸润叶，用尿素的方法提取总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，再使用GFP、Myc抗体进行Western blot分析Myc-NbDCP1、YFP-NbATG8i是否在叶片中表达；
（2）接种10天后观察本氏烟中瞬时过表达NbDCP1以及同时表达NbDCP1和NbATG8i对TYLCV抗性的表型；
（3）利用Western blot分析以上处理中TYLCV衣壳蛋白的积累量，并qPCR分析其感染的病毒基因组DNA积累的水平。
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