CN112538488A - 本氏烟NbSMG7基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种本氏烟NbSMG7基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法，所述病毒为黄瓜绿斑驳花叶病毒，NbSMG7基因的转录本序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过克隆本氏烟中NbSMG7基因，将其构建为带有荧光标签的YFP‑NbSMG7载体，将YFP‑NbSMG7载体转入农杆菌后侵染烟草进行烟草的遗传转化，获得YFP‑NbSMG7转基因植物。获得的本氏烟过表达YFP‑NbSMG7植物能够显著阻碍黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染。

Description

本氏烟NbSMG7基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物 培育方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种可稳定遗传的、抗黄瓜绿斑驳花叶病毒的NbSMG7转基因植物的培育方法。

背景技术

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)属帚状病毒科(Virgaviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，可以侵染黄瓜、葫芦、甜瓜、西瓜等葫芦科作物，造成植株生长迟缓、叶片褪绿斑驳、果实变色和纤维化，导致严重损失，是我国重要的植物检疫性有害生物。

CGMMV是正义单链RNA病毒，全长约6400nt，编码4个蛋白，分别为129kD的复制酶、186kD的复制相关蛋白、29kD运动蛋白和17.4kD的外壳蛋白。

CGMMV对葫芦科作物上的危害是世界性难题，目前没有有效的化学药剂可防治CGMMV。通过保守的方法可以在一定程度上减轻CGMMV的为害，如使用消毒种子、通过改进栽培技术培育健壮植株、田间及时铲除发病单株、利用杀虫剂切断病毒的传播载体等。但是现阶段仍未有针对CGMMV有防治效果的药剂及抗病植株被开发出来，且已有研究表明种子处理措施效率不高且不稳定。另外，嫁接技术一直以来是葫芦科作物在生产中普遍应用的农事操作技术，也是防治病虫害的有力措施之一，然而有报道称CGMMV可从西瓜砧木中运输到其接穗中，从而使得CGMMV通过嫁接传播而潜在地成为田间的初侵染来源。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种本氏烟NbSMG7基因在调控植物抗病毒中的应用。

本发明的第二目的是提供一种本氏烟NbSMG7高表达植物的培育方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

本氏烟NbSMG7基因在调控植物抗病毒中的应用，其中，所述病毒为黄瓜绿斑驳花叶病毒。

具体的，通过克隆本氏烟中NbSMG7基因，将其构建为带有荧光标签的YFP-NbSMG7载体，将YFP-NbSMG7载体转入农杆菌后侵染烟草进行烟草的遗传转化，获得的本氏烟过表达YFP-NbSMG7植物能够显著阻碍黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染。

其中，所述NbSMG7的转录本序列如SEQ ID NO:1所示。

一种抗黄瓜绿斑驳花叶病毒的NbSMG7转基因植物的培育方法：通过农杆菌转化的方法，将NbSMG7基因导入目的植物中，获得本氏烟NbSMG7高表达的转基因植物。

具体包括以下步骤：

(1)获得本氏烟植株，用Trizol法从本氏烟植株叶片中提取RNA，去除RNA样品中基因组DNA，并反转录得到cDNA；

(2)利用引物对NbSMG7-F和NbSMG7-R，如SEQ ID NO:2-3所示，以cDNA为模板进行PCR扩增，所使用的引物序列为：

NbSMG7-F：atgatgaccattccaatgga，

NbSMG7-R：cacaaacaaacggccttc；

(3)将扩增产物构建到n-YFP载体上，获得YFP-NbSMG7重组质粒；

(4)将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500V电击转化，加入LB培养基培养2小时恢复后涂布到抗性培养基上筛选获得带有YFP-NbSMG7重组质粒的农杆菌；

(5)将带有重组质粒的农杆菌侵染烟草叶片，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗，转移继续培养；

(6)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，用CTAB法从植物叶片中提取DNA，以提取DNA为模板进行PCR扩增，确定YFP-NbSMG7是否转化成功；所使用的引物序列为：

35S-F：cgcaagacccttcctctatataaggaa，

NbSMG7-R：CACAAACAAACGGCCTTC；如SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:3所示，

以上样品抽提总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，再使用GFP抗体进行Western blot确定植物表达了带YFP荧光标签的YFP-NbSMG7；对转化成功的过表达YFP-NbSMG7转基因烟草留种。

本发明根据CGMMV基因组的特点，其基因组内含有提前终止密码子(prematuretermination codon，PTC)，利用无义介导mRNA降解(Nonsense-mediated mRNA decay，NMD)的机制：其具有靶向PTC RNA的功能，导致目标RNA被切割和降解。本发明中克隆的NbSMG7基因是NMD途径的关键因子，它能参与NMD途径，靶标目标RNA，导致RNA被切割和降解。本发明通过遗传转化获得本氏烟过表达YFP-NbSMG7植物，经验证可有效抵御CGMMV的侵染，与野生型本氏烟植物相比，YFP-NbSMG7转基因植物中CGMMV的病毒RNA表达量约降低了50％-75％。

同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

本发明成功克隆到烟草NbSMG7，并首次发现此基因具有抗黄瓜绿斑驳花叶病毒的功能。通过农杆菌转化的方法，将NbSMG7基因导入目的植物中，获得本氏烟NbSMG7高表达转基因植株经鉴定可阻碍黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染，具有重要的生产意义。

下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的本氏烟NbSMG7基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法作进一步说明。

附图说明

图1为YFP-NbSMG7的构建及载体表达鉴定。其中，(A)YFP-NbSMG7载体构建示意图。35S为花椰菜花叶病毒强组成型启动子，能够启动下游融合基因YFP(黄色荧光蛋白)—NbSMG7(克隆的目标基因)的表达，NOS为转录终止位点；(B)共聚焦观察YFP-NbSMG7农杆菌浸润接种48小时的本氏烟叶片瞬时荧光；H2B-RFP表示细胞核位置；Merge栏为YFP、RFP与明场的叠加；(C)Western blot分析来自于农杆菌浸润接种YFP-NbSMG7的本氏烟叶片中的蛋白表达量，二磷酸核酮糖羧化酶大亚基(rbcL)用丽春红(Ponceau S)染色以表明相同的蛋白上样量水平，Mock为野生型本氏烟。

图2为YFP-NbSMG7转基因植物的鉴定。其中，(A)T1代YFP-NbSMG7转基因植物与野生型本氏烟表型对比，Wt为野生型本氏烟，Line 2与Line 5为YFP-NbSMG7转基因本氏烟两个不同株系，转基因植物与野生型表型无差异。(B)PCR检测培养成功的转基因YFP-NbSMG7植物DNA，目的条带约为3700bp。(C)Western blot分别分析来自于本氏烟野生型、YFP-NbSMG7转基因植物(Line2、Line5)叶片中的蛋白表达量，蛋白大小约为140kDa，二磷酸核酮糖羧化酶大亚基(rbcL)用丽春红(Ponceau S)染色以表明相同的蛋白上样量水平。Wt为野生型本氏烟，Line 2与Line 5为YFP-NbSMG7转基因本氏烟两个不同株系。

图3为YFP-NbSMG7转基因植物对黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)的抗性分析。其中，(A)农杆菌浸润接种CGMMV于野生型本氏烟及YFP-NbSMG7转基因本氏烟不同株系YFP-NbSMG7-Line2、YFP-NbSMG7-Line5后14天的症状图，野生型本氏烟的病毒症状更加严重；(B)RT-qPCR分析(A)中植物14天时的CGMMV的RNA积累量，结果显示YFP-NbSMG7转基因植物能够明显降低CGMMV的RNA积累量。

具体实施方式

一种抗黄瓜绿斑驳花叶病毒的NbSMG7转基因植物的培育方法，具体包括以下步骤：

(1)获得本氏烟植株，用Trizol法从本氏烟植株叶片中提取RNA，去除RNA样品中基因组DNA，并反转录得到cDNA；

(2)利用引物对NbSMG7-F和NbSMG7-R，如SEQ ID NO:2-3所示，以cDNA为模板进行PCR扩增，所使用的引物序列为：

NbSMG7-F：atgatgaccattccaatgga，

NbSMG7-R：cacaaacaaacggccttc；

(3)将扩增产物构建到n-YFP载体上，获得YFP-NbSMG7重组质粒；如图1(A)所示；

(4)将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500V电击转化，加入LB培养基培养2小时恢复后涂布到抗性培养基上筛选获得带有YFP-NbSMG7重组质粒的农杆菌；

(5)将带有重组质粒的农杆菌侵染烟草叶片，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗，转移继续培养；

(6)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，用CTAB法从植物叶片中提取DNA，以提取DNA为模板进行PCR扩增，确定YFP-NbSMG7是否转化成功；所使用的引物序列为：

35S-F：cgcaagacccttcctctatataaggaa，

NbSMG7-R：CACAAACAAACGGCCTTC；如SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:3所示，

以上样品抽提总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，再使用GFP抗体进行Western blot确定植物表达了带YFP荧光标签的YFP-NbSMG7。如图2所示，PCR检测培养成功的转基因YFP-NbSMG7植物DNA，Line2、Line5可检测到目的条带，约为3.7kb，YFP-NbSMG7转基因植物(Line2、Line5)叶片中均能检测到YFP-NbSMG7，蛋白大小约为140kDa。对转化成功的过表达YFP-NbSMG7转基因烟草留种。

(7)播种本氏烟野生型Nb-WT、过表达YFP-NbSMG7转基因烟草，播种20天后，接种对照(Buffer)和CGMMV。接种14天后，观察病毒症状和分析病毒积累量。如图3A所示，相对于野生型本氏烟，YFP-NbSMG7转基因植物两个株系表现出的病毒症状更轻。qRT-PCR检测系统叶病毒RNA积累量，转基因两个株系的病毒RNA积累量显著低于野生型本氏烟，如图3B所示。

实验结果表明：通过农杆菌遗传转化的方法获得的本氏烟NbSMG7过表达植物能够显著减轻黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染，抑制黄瓜绿斑驳花叶病毒造成的病害。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 本氏烟NbSMG7基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法

<130> DS201-050

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2982

<212> DNA

<213> NbSMG7(Artificial Sequence)

<400> 1

atgatgacca ttccaatgga tagtgctgct gatcaattgt ctcgcgagca agttcagcgc 60

ctctacaaca agaatgttga gttggagaat aaacggagaa aggcagcaca agctagagtt 120

ccttctgacc caagtgcatg gcaacaaatg cgagaaaact acgaatctat catccttgag 180

gataatgcct tctcagaaca acatgaaata gagtatgcct tgtggcagtt gcattacagg 240

agaattgagg aattgcgcgc acacttcaat gctgctgtaa gttctagtgt gtcaaccaat 300

tctcagaatg ggaaagttcc ccatcgtggt ggacctgatc gcgtcacaaa gatcaggaca 360

cagtttaaaa cttttctttc agaagcaaca ggattttatc atgatttgat gctaaaaatt 420

agggctaagt atggcttgca gctgggatat ttctctgatg atcacgaaaa tcagattcct 480

tcctctaaag atggtaataa atctgtggag gtgaagaaag gattgatatc ctgccatcgt 540

tgtttgattt accttggcga tcttgctcgg tacaaaggct tatatggtgt gggtgattcc 600

aaagcttgtg attttgcggc tgcttcgagt tattacctgc aagcttcttc actctggcct 660

tcaagtggca atcctcatca ccagcttgca atactggctt cctattccaa tgatgagctt 720

gtggctattt atcgctattt tcgcagtctt gcgatagaaa gcccttttgc cacggcaagg 780

gataacttga tcattgcatt tgagaagaac cgtcagtgtt actctcaact tgtgggggat 840

actaaagctt cctccaccaa ggccgtacgt cctcgtacaa ctggcgaagg aagaagcaaa 900

ggagaaacga ggtatccact gaaagatggt agggttgaag caagttcagt ccaggaaaag 960

ggttttatgt ctgacatctt caaaaccttc agcacaagat ttgttcgatt gaatggtatt 1020

cttttcactc gcactagttt ggagactttt ggagaagtgc agtcgatggt taaaaatgat 1080

ctgcttgagc ttctctcctc tgggactgat gagaagtata attttggttc tgacgctgcc 1140

gactgtaaac tggcttttgt aaggcttgtg gccatcctaa tattcactgt tcataacgtg 1200

aataaggaaa gcgaaaacca gtcatatgct gagattttac aaagatcggt tcttctacag 1260

aatgcattta ctgctgtgtt tgagatgatg ggtcatgtag ttgaaagatg tatccagtta 1320

aatgatccca cgacaagctt ccttttgcca ggggttttgg tgtttgtaga atggttagcg 1380

agccgtcaag atgttgcact tggcaacgat ccagaagaga agcaaaccag ggctagatca 1440

tttttctgga agaactgcat tgctttcttt aataagcttt tgtctagtgg gtttaagttt 1500

gttgatgctg acaaggatga tacgtgcttc ttcaatatga acagatatga tgaaggagag 1560

agggatagtc gtcttgcatt acccgaggat tttgagctga gaggatttat accttttctt 1620

ccggcacaac ttatccttga tttttcaagg aaacattctt ttggtggtga tggtggtatc 1680

aaagagaaga aatcacgtct ccagaggata atagcagcag gaaaggctct tgctaatgtg 1740

gtccgtgttg gagaagaggg aatttatttt gacggtagag caaagaaatt catcattggc 1800

attgagcctc aagtatctga tgattgtgcg cttaattgct ccatggaagt tcccaaattg 1860

agtggtattg atttggagaa ttcagctgca gggcagttaa ctgtaggagc tctgcagcca 1920

aagcaacgat tgtatgtaga aggtgaggaa gaagacgagg taattgtttt taagccatcg 1980

gtggtgcaaa agcatgtgaa tggaagcgct tcaaacatga tgacctcaga aggttatgtt 2040

tctggtgtta gtgctgccag tgttcctcct ggggttagca tggcatctgt tggtctagga 2100

aatgaaatgg gtccattttc agctgcactt gatggattga ttatgcagag tgcagtacat 2160

gcttgtgcaa ggccaccctc aagtattgcc aataacggtg gccaatatat gcagcctatt 2220

caaccaagta cttcattgtg gtccgttgaa caagctgctc ttatgaatgg atttgccagc 2280

ttgaacatga taggaaatgg tccaactata atatctgagt tgcaagatca agtatttcca 2340

cctgtgccat attctgtccc ttttccccag tctgtcaatt ttggcacaag taatattcct 2400

gtgcatatcc cagatgctgc cataccatct aacttcagtt cactttcatc gtcagtagtt 2460

ggtattgata gcatgtcagt taagtcccca tcagtcatgt caacaggcat aaggaaaaat 2520

ccagttagca gacctattag gcatctgggc ccgcctccag gctttggttc tgttcctttg 2580

aaagtcctag aggagtcttc ttcagcaatg accataaaga atgaacatat tactcttcct 2640

cctgtggatg actatagctg gctggatgga tatcggttgc cttcatcaca tgagagcatt 2700

ggtttcaata actccattaa tcattcaacg cacaattacc actcaatgaa caagagtagt 2760

agctccgttg ggatggtgag ctttcctttc cctgggaagc aggtaaactc tctgcatgtg 2820

caaacaggga accagagagg ttgggaggac taccagatat ctgaacaatt aaaactgtac 2880

caggagcaac ctcagcaact ccagagtgga aaccaacagt ctgttgaact gcctcagcgg 2940

catgaaggac agtctctgtg ggaaggccgt ttgtttgtgt ga 2982

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> NbSMG7-F(Artificial Sequence)

<400> 2

atgatgacca ttccaatgga 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> NbSMG7-R(Artificial Sequence)

<400> 3

cacaaacaaa cggccttc 18

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 35S-F(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcaagaccc ttcctctata taaggaa 27

Claims (5)

1.本氏烟NbSMG7基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：所述病毒为黄瓜绿斑驳花叶病毒。

2.根据权利要求1所述的本氏烟NbSMG7基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：通过克隆本氏烟中NbSMG7基因，将其构建为带有荧光标签的YFP-NbSMG7载体，将YFP-NbSMG7载体转入农杆菌后侵染烟草进行烟草的遗传转化，获得的本氏烟过表达YFP-NbSMG7植物能够显著阻碍黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染。

3.根据权利要求2所述的本氏烟NbSMG7基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：所述NbSMG7的转录本序列如SEQ ID NO:1所示。

4.一种抗黄瓜绿斑驳花叶病毒的NbSMG7转基因植物的培育方法，其特征在于：通过农杆菌转化的方法，将NbSMG7基因导入目的植物中，获得本氏烟NbSMG7高表达的转基因植物。

5.根据权利要求4所述的NbSMG7转基因植物的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获得本氏烟植株，用Trizol法从本氏烟植株叶片中提取RNA，去除RNA样品中基因组DNA，并反转录得到cDNA；

(2)利用引物对NbSMG7-F和NbSMG7-R，如SEQ ID NO:2-3所示，以cDNA为模板进行PCR扩增，所使用的引物序列为：

NbSMG7-F：atgatgaccattccaatgga，

NbSMG7-R：cacaaacaaacggccttc；

(3)将扩增产物构建到n-YFP载体上，获得YFP-NbSMG7重组质粒；

(4)将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500V电击转化，加入LB培养基培养2小时恢复后涂布到抗性培养基上筛选获得带有YFP-NbSMG7重组质粒的农杆菌；

(5)将带有重组质粒的农杆菌侵染烟草叶片，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗，转移继续培养；

(6)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，用CTAB法从植物叶片中提取DNA，以提取DNA为模板进行PCR扩增，确定YFP-NbSMG7是否转化成功；所使用的引物序列为：

35S-F：cgcaagacccttcctctatataaggaa，

NbSMG7-R：CACAAACAAACGGCCTTC；如SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:3所示，

以上样品抽提总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，再使用GFP抗体进行Western blot确定植物表达了带YFP荧光标签的YFP-NbSMG7；对转化成功的过表达YFP-NbSMG7转基因烟草留种。

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