CN113528559A - 西瓜融合基因、遗传转化方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种西瓜融合基因、遗传转化方法及应用。其中，西瓜融合基因由ClGRF4基因和ClGIF1基因融合而成，该西瓜融合基因能够提高西瓜的遗传转化效率，解决了现有技术中西瓜遗传转化效率低的问题，适用于西瓜遗传转化和育种领域。

Description

西瓜融合基因、遗传转化方法及应用
技术领域
本发明涉及西瓜遗传转化领域，具体而言，涉及一种西瓜融合基因、遗传转化方法及应用。
背景技术
西瓜属于葫芦科西瓜属，是一种重要的园艺作物，位居世界十大水果之列。我国作为世界最大的西瓜生产国，种植面积约占的世界种植面积的52.7％，产量达70％。由于我国不是西瓜的原产国，同源性高、遗传基础狭窄等问题导致难以通过常规育种手段对西瓜进行品种改良。
基因工程技术有助于解决西瓜遗传基础狭窄，种质资源缺乏的问题，成为常规育种的重要补充手段。随着生物技术的不断发展，利用转基因技术及基因编辑技术对遗传物质进行人为操作开始广泛应用于各种植物中，为创制新种质提供了新方法。
包括西瓜在内的葫芦科作物开展转基因研究相对缓慢，制约的瓶颈就是遗传转化的效率问题，参考文献见刘丽锋，古勤生，西瓜组织培养与遗传转化研究进展。果树学报,2017,34(7):905-916。
因此，寻找针对于西瓜的遗传转化方法，提高遗传转化效率，是促进西瓜遗传转化和育种的有效手段。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种西瓜融合基因、遗传转化方法及应用，以提高西瓜遗传转化效率。
为了实现上述目的，根据本申请的一个方面，提供了一种西瓜融合基因，该融合基因由ClGRF4基因和ClGIF1基因融合而成。
进一步地，ClGRF4基因的序列如SEQ ID NO：1所示，ClGIF1基因的序列如SEQ IDNO：2所示；优选地，ClGRF4基因和ClGIF1基因经连接序列连接形成西瓜融合基因；优选地，连接序列为：GGCAGCGGCCGC；优选地，西瓜融合基因的序列如SEQ ID NO：4所示。
根据本申请的第二个方面，提供了一种融合蛋白，该融合蛋白由上述西瓜融合基因编码而成。
根据本申请的第三个方面，提供了一种重组载体，该重组载体包括西瓜生长调节基因及驱动西瓜生长调节基因表达的驱动元件，西瓜生长调节基因为上述西瓜融合基因。
进一步地，驱动元件包括启动子序列和终止子序列；优选地，启动子序列为双子叶植物基因表达的启动子，更优选地，启动子序列选自来源于拟南芥的UBQ10启动子序列、花椰菜花叶病毒35s启动子；优选地，终止子序列选自适用于植物基因的终止子，更优选地，终止子序列选自来源于拟南芥的HspT终止子序列、Nos终止子或花椰菜花叶病毒35s polyA。
进一步地，重组载体还包括转化目的基因；优选地，重组载体进一步还包括转化目的基因和/或西瓜融合基因的报告基因；优选地，报告基因包括抗性基因和/或编码荧光蛋白的基因；更优选地，抗性基因选自如下任意一种或多种：卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因及草铵膦抗性基因；更优选地，编码荧光蛋白的基因选自如下任意一种或多种：红色荧光蛋白表达基因DsRed2、GFP基因、mCherry基因及YFP基因；优选地，重组载体选自如下任意一种：pKSE401、pBSE401、pHSE401及pAS083。
根据本申请的第四个方面，提供了一种非植物的宿主细胞，该宿主细胞转化有上述重组载体。
进一步地，宿主细胞选自大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌菌株EHA105、LBA4404、AGL1或GV3101。
根据本申请的第五个方面，提供了一种西瓜的遗传转化方法，该遗传转化方法包括将上述西瓜融合基因导入西瓜基因组中。
进一步地，通过上述重组载体将上述西瓜融合基因导入西瓜基因组中；优选地，将转化目的基因与西瓜融合基因共同导入西瓜基因组中；或者通过上述重组载体将转化目的基因与西瓜融合基因共同导入西瓜基因组中。
进一步地，遗传转化方法包括如下任意一种转化方法：土壤农杆菌介导的转化、基因枪法、PEG介导的原生质体转化、植物病毒介导的转化、花粉管通道法和子房注射法；优选地，利用农杆菌侵染法进行遗传转化包括：将重组载体导入农杆菌菌株中得到重组菌；将重组菌制备成浸染液；将西瓜外植体置于浸染液中浸染，得到侵染后的外植体；对侵染后的外植体进行共培养，得到共培养外植体；对共培养外植体依次进行抗生素抗性筛选和荧光筛选，得到阳性转化体；优选地，农杆菌菌株为EHA105；优选地，西瓜外植体选自如下任意一种：子叶、子叶节、幼胚、成熟胚和原生质体；优选地，抗生素选自卡那霉素、潮霉素或壮观霉素；优选地，荧光为红色荧光或绿色荧光。
进一步地，对共培养外植体依次进行抗生素抗性筛选和荧光筛选，得到阳性转化体包括：将共培养外植体置于抗性筛选培养基上培养，得到抗性阳性幼芽组织；将抗性阳性幼芽组织置于芽伸长培养基中培养至新的芽头再生，对再生的芽头进行荧光检测，得到阳性转化体；优选地，抗性筛选培养基为由MS固体培养基与6-BA、特美汀和卡那霉素组成的无菌培养基，6-BA、特美汀和卡那霉素在抗性筛选培养基中的浓度分别为1.5mg/L、200mg/L、100mg/L，pH为5.8；优选地，芽伸长培养基为由MS固体培养基与KT、特美汀和卡那霉素组成的无菌培养基，KT、特美汀和卡那霉素在芽伸长培养基中的浓度分别为0.2mg/L、200mg/L、和100mg/L，pH为5.8。
根据本申请的第六个方面，提供了一种遗传转化方法在西瓜遗传转化和育种中的应用，该应用利用上述西瓜融合基因、重组载体或遗传转化方法。
应用本发明的技术方案，通过将西瓜中ClGRF4和ClGIF1基因进行融合得到的融合基因有助于提高西瓜的遗传转化效率，因而利用西瓜融合基因和农杆菌介导的转化方法，通过西瓜融合基因帮助转化目的基因导入西瓜基因组中，提高西瓜遗传转化效率。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了本发明的实施例1中ClGRF4与其他同源基因的亲缘关系进化树。
图2示出了本发明的实施例1中ClGIF1与其他同源基因的亲缘关系进化树。
图3示出了本发明的实施例3中转基因植株和非转基因植株在荧光照射下的发光情况。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，由于现有的西瓜遗传转化方法的效率低，限制对于西瓜遗传转化和育种的研究，为提高西瓜遗传转化效率，本申请的发明人对现有的西瓜遗传转化方法进行深入研究，提出了一种西瓜融合基因，该西瓜融合基因由ClGRF4基因和ClGIF1基因融合而成。
上述西瓜融合基因中的ClGRF4和ClGIF1分别是已报道的小麦GRF4和GIF1在西瓜中的同源基因。具体地，通过blastP搜索西瓜基因组数据库找到西瓜同源基因ClGRF4(基因号Cla97C02G034420，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)和ClGIF1(基因号Cla97C11G213520，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)。
在小麦中GRF4和GIF1基因的融合能够提高小麦的遗传转化效率报道之后，发明人也尝试了从不同物种中查找相关同源基因，以期提高相应物种遗传转化效率。结果发现，尽管能够找到在不同物种中的不同的同源性基因，但基于同源基因的功能在不同物种中的保守性并不相同，因而对于在目的物种中的是否具有与在小麦中同样或类似的提高遗传转化效率的效果则是不可预期的。比如，发明人对黄瓜中的聚类关系最近的GRF4同源基因CsaV3_1G040860(同源性为38％)和GIF1同源基因CsaV3_2G003880(同源性为60.9％)进行融合后，检测融合基因对黄瓜遗传转化效率的影响，结果发现并不具有提高遗传转化效率的效果。类似的，番茄中的聚类关系最近的GRF4同源基因和GIF1基因融合后用于遗传转化，也没有发现对遗传转化有明显的提高效果。
因而，在本申请中发明人尝试将西瓜中的同源基因进行融合来检测其是否能够提高西瓜的遗传转化效率。经试验验证发现，在西瓜中ClGRF4和ClGIF1的融合基因能够提高西瓜的遗传转化效率，因而提出了本申请的一系列保护方案。
本申请的上述融合基因中，ClGRF4基因的序列如SEQ ID NO：1所示，ClGIF1基因的序列如SEQ ID NO：2，两者形成融合基因的方法可以参照现有融合基因的构建方法构建而成。具体地，可以通过现有的连接序列进行连接，或者适当调整后进行连接。
在一种优选的实施例中，上述西瓜融合基因中的连接序列为GGCAGCGGCCGC。上述西瓜融合基因的序列如SEQ ID NO：4所示。
在本申请第二种典型的实施方式中，还提供了上述西瓜融合基因编码的融合蛋白，该融合蛋白的在西瓜中的表达，有助于提高待转化的目的基因的遗传转化效率。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种重组载体，该重组载体包括了西瓜生长调节基因及驱动该西瓜生长调节基因表达的驱动元件，其中西瓜生长调节基因为上述西瓜融合基因。
如上述，本申请的西瓜融合基因能够提高待转化的目的基因的遗传转化效率，因而携带有该融合基因的重组载体导入西瓜中时，也能够提高待转化的目的基因的遗传转化效率。
重组载体中，驱动元件包括启动子序列和终止子序列，具体地，可以从已知的商业重组载体中的启动子和终止子中进行合理选择，或者通过对已知的启动子和终止子进行改造得到。
在本申请一种优选的实施例中，启动子序列为双子叶植物基因表达的启动子,更优选地，启动子序列选自来源于拟南芥的UBQ10启动子序列、花椰菜花叶病毒35s启动子；优选地，终止子序列选自适合于植物基因的终止子，更优选地，终止子序列选自来源于拟南芥的HspT终止子序列、Nos终止子，花椰菜花叶病毒35s polyA。
在本申请一种优选的实施例中，重组载体还包括转化目的基因；优选地，重组载体进一步还包括转化目的基因和/或西瓜融合基因的报告基因；优选地，报告基因包括抗性基因和/或编码荧光蛋白的基因；更优选地，抗性基因选自如下任意一种或多种：卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因及草铵膦抗性基因；更优选地，编码荧光蛋白的基因选自如下任意一种或多种：红色荧光蛋白表达基因DsRed2、GFP基因、mCherry基因及YFP基因；优选地，重组载体选自如下任意一种：pKSE401、pBSE401、pHSE401或pAS083。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种非植物的宿主细胞，该宿主细胞转化有上述任一种重组载体。
具体地，宿主细胞包括但不限于大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌菌株EHA105、LBA4404、AGL1或GV3101。
在本申请第五种典型的实施方式中，提供了一种西瓜的遗传转化方法，该遗传转化方法包括：将前述西瓜融合基因导入西瓜基因组中。
在一种优选的实施例中，所欲转化的目标基因与本申请改进的西瓜融合基因构建于同一载体上，则上述任一种重组载体将西瓜融合基因导入西瓜基因组中。
在另一种优选的实施例中，所欲转化的目标基因与本申请改进的西瓜融合基因分别构建于不同载体上，则通过将携带待转化的目的基因重组载体与上述携带西瓜融合基因的重组载体共同导入西瓜基因组中。
本申请的西瓜遗传转化方法中，具体的遗传转化方法包括但不限于如下任意一种：土壤农杆菌介导的转化、基因枪法、PEG介导的原生质体转化、植物病毒介导的转化、花粉管通道法和子房注射法。上述各遗传转化方法各具优势，比如，农杆菌介导的遗传转化方法可以获得更多的低拷贝插入转化体，原生质体转化用于瞬时检测等。
利用农杆菌侵染法对西瓜进行遗传转化，具体步骤与已报道的西瓜遗传转化方法相同。在本申请一种优选的实施例中，遗传转化方法包括：将重组载体导入农杆菌菌株中得到重组菌；将重组菌制备成浸染液；将西瓜外植体置于浸染液中浸染，得到侵染后的外植体；对侵染后的外植体进行共培养，得到共培养外植体；对共培养外植体依次进行抗生素抗性筛选和荧光筛选，得到阳性转化体。
具体的农杆菌菌株也无特殊限定，只要能够感染西瓜并将重组载体导入西瓜即可。在一种优选的实施例中，农杆菌菌株为EHA105。
上述西瓜外植体可以根据实际需要进行合理选择，本申请中西瓜外植体包括但不仅限于如下任意一种：子叶、子叶节、幼胚、成熟胚和原生质体。
优选地，抗生素选自卡那霉素、潮霉素、壮观霉素或草铵膦；优选地，荧光为红色荧光、或绿色荧光。
在一种优选的实施例中，对共培养外植体依次进行抗生素抗性筛选和荧光筛选，得到阳性转化体包括：将共培养外植体置于抗性筛选培养基上培养，得到抗性阳性幼芽组织；将抗性阳性幼芽组织置于芽伸长培养基中培养至新的芽头再生，对再生的芽头进行荧光检测，得到阳性转化体；优选地，抗性筛选培养基为由MS固体培养基与6-苄氨基嘌呤(6-BA)、特美汀和卡那霉素组成的无菌培养基，6-BA、特美汀和卡那霉素在抗性筛选培养基中的浓度分别为1.5mg/L、200mg/L、100mg/L，pH为5.8；优选地，芽伸长培养基为由MS固体培养基与6-糠基氨基嘌呤(KT)、特美汀和卡那霉素组成的无菌培养基，KT、特美汀和卡那霉素在芽伸长培养基中的浓度分别为0.2mg/L、200mg/L、和100mg/L，pH为5.8。
将本申请的上述融合基因整合到质粒上，构建重组载体：以pKSE401质粒为基础，对载体进行酶切连接，构建重组载体，重组载体包括融合基因ClGRF4-ClGIF1及驱动融合基因ClGRF4-ClGIF1的驱动元件启动子和终止子，启动子来源于拟南芥的UBQ10，终止子来源于拟南芥的HspT终止子序列。重组载体中包含转化目的基因DsRed2和抗性基因卡那霉素抗性基因。
将构建的重组载体导入农杆菌EHA105中，培养制备侵染液。选取西瓜种子，去除种壳，黑暗中种植，切取子叶中部的部分，制备西瓜外植体。将外植体于含有重组菌的侵染液中，进行侵染。将侵染后的外植体于共培养培养基和筛选培养基中培养，进行阳性芽鉴定。
在本申请第五种典型的实施方式中，提供了上述任一种西瓜融合基因，或者上述任一种重组载体，或者任一种遗传转化方法在西瓜遗传转化和育种中的应用。
下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。
实施例1：西瓜ClGRF4-ClGIF1基因片段的获取
根据已报道的小麦GRF4和GIF1的蛋白序列，GRF4和GIF1相关信息参见文献JuanM.Debernardi,David M.Tricoli,Maria F.Ercoli,Sadiye Hayta,Pamela Ronald,JavierF.Palatnik&Jorge Dubcovsky.2020，A GRF–GIF chimeric protein improves theregeneration efficiency of transgenic plants，Nature Biotechnology volume 38,pages1274–1279，blastP搜索西瓜基因组数据库找到西瓜同源基因ClGRF4(基因号Cla97C02G034420，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)和ClGIF1(基因号Cla97C11G213520，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)。以ClGRF4蛋白搜索NCBI数据库，下载其它物种中的GRF基因，用在线Clustal Omega软件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)，获得图1进化关系图，可以看出，ClGRF4与小麦GRF4亲缘关系最近(同源性为44％)。以ClGIF1蛋白搜索NCBI数据库，下载其它物种中的GIF1蛋白，用在线Clustal Omega软件，获得图2的进化关系图，可以看出，ClGIF1与小麦GIF1亲缘关系最近(同源性为51％)。ClGRF4和ClGIF1通过GGCAGCGGCCGC(如SEQ ID NO：3所示)连接起来，人工合成ClGRF4-ClGIF1融合基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)。
SEQ ID NO：1的具体序列如下：
>ClGRF4.Cla97C02G034420
atgaacaacagtggcggtggtggtgaggatgggagtaggacagtagcagcaatagcaagtggaatgatggggatgaataggtcacctttcacagtgttacagtggcaggagctggagcatcaggctctgatcttcaaatatatgatggcaggtctgcccgttccacctgatcttgtactccctattcagaagagcttcgagtccatttctcataggttcttccatcatcccaccatggcttattgttcattctatgggaagaaggtggacccagagcctggaagatgcagaaggactgatggaaagaaatggaggtgctccaaagatgcgtacccagactccaaatactgtgagcgccacatgcaccgtggccgcaatcgttcaagaaagcctgtggaatctcaaactatgacacagtcgtcgtccactgtgacatctcttaccgctaccggaagtagcagcactggaactggaagcttccatggccttccattgaatgccttaagcagttcccagaccactaccactgggaccagtcagcctcattatcccttggactccattccctatggaatcccaagcaaagattataggtatcttcaagggcttagacctgaagctggagtgcatagtttcttttctgaggcatcaggaagcagcagggctgttcaaatggatgcaccaatcgacaacacgtggccaatgatgccatccagatccccgtctttcccggcatcaaaatcaactgaaaactcaatcttccaaagcggatatccgcagcattcgttccttggtggggaatatgcatctggggaaactctgaaacaagagggtcaatctcttcagccgctctttgacgaatggccgagaactagggagtcatggaccggactcgacgatgaaagatccaatcaaacttccttctccacaacacagctgtccatatcaattccaatggcctcatctgacttgtcgaccacaagttcaaaatctcctcatggt。
SEQ ID NO：2
>ClGIF1.Cla97C11G213520
atgcagcaaccaccgcaaatgttgcccatgatgccttcatttccccccaccaatatcaccaccgagcagattcaaaagtatcttgatgagaacaaaaagttgatattggccatactggacaaccaaaatctggggaaactagctgaatgtgctcagtaccaagctcaacttcagaagaatttgatgtatttagctgcaattgctgatgcccagccacaggcaccagctatgcctccgcagatggccccacatcctgccatgcagcaagggggttattatatgcagcaccctcaggcagctataatggcccagcaatcaggacttttccctccaaaagttccattgcagttcggcaatccccatcaattacaagatccacagcagcaactacaccaacaacaccagcaagcaatgcaagggcaaatgggactaagacctattggtggggctaacaatggcatgcatcacccacatcatactgagagtacccttgggggtggtgttagtgctggaggccctcctcgaagttcagtgcaaactgatggtcgtggaggtgggaaacaggactcaggtgatgtgggaggtgcaggtgctgatggtcaggggagctcggctggtggtcgtggcggtggtggtgatggtgaggaagctaagtag。
SEQ ID NO：3
>linker
ggcagcggccgc
SEQ ID NO：4
>ClGRF4-ClGIF1
atgaacaacagtggcggtggtggtgaggatgggagtaggacagtagcagcaatagcaagtggaatgatggggatgaataggtcacctttcacagtgttacagtggcaggagctggagcatcaggctctgatcttcaaatatatgatggcaggtctgcccgttccacctgatcttgtactccctattcagaagagcttcgagtccatttctcataggttcttccatcatcccaccatggcttattgttcattctatgggaagaaggtggacccagagcctggaagatgcagaaggactgatggaaagaaatggaggtgctccaaagatgcgtacccagactccaaatactgtgagcgccacatgcaccgtggccgcaatcgttcaagaaagcctgtggaatctcaaactatgacacagtcgtcgtccactgtgacatctcttaccgctaccggaagtagcagcactggaactggaagcttccatggccttccattgaatgccttaagcagttcccagaccactaccactgggaccagtcagcctcattatcccttggactccattccctatggaatcccaagcaaagattataggtatcttcaagggcttagacctgaagctggagtgcatagtttcttttctgaggcatcaggaagcagcagggctgttcaaatggatgcaccaatcgacaacacgtggccaatgatgccatccagatccccgtctttcccggcatcaaaatcaactgaaaactcaatcttccaaagcggatatccgcagcattcgttccttggtggggaatatgcatctggggaaactctgaaacaagagggtcaatctcttcagccgctctttgacgaatggccgagaactagggagtcatggaccggactcgacgatgaaagatccaatcaaacttccttctccacaacacagctgtccatatcaattccaatggcctcatctgacttgtcgaccacaagttcaaaatctcctcatggtggcagcggccgcatgcagcaaccaccgcaaatgttgcccatgatgccttcatttccccccaccaatatcaccaccgagcagattcaaaagtatcttgatgagaacaaaaagttgatattggccatactggacaaccaaaatctggggaaactagctgaatgtgctcagtaccaagctcaacttcagaagaatttgatgtatttagctgcaattgctgatgcccagccacaggcaccagctatgcctccgcagatggccccacatcctgccatgcagcaagggggttattatatgcagcaccctcaggcagctataatggcccagcaatcaggacttttccctccaaaagttccattgcagttcggcaatccccatcaattacaagatccacagcagcaactacaccaacaacaccagcaagcaatgcaagggcaaatgggactaagacctattggtggggctaacaatggcatgcatcacccacatcatactgagagtacccttgggggtggtgttagtgctggaggccctcctcgaagttcagtgcaaactgatggtcgtggaggtgggaaacaggactcaggtgatgtgggaggtgcaggtgctgatggtcaggggagctcggctggtggtcgtggcggtggtggtgatggtgaggaagctaagtag。
实施例2：转化载体的构建
以pKSE401质粒用HindIII酶切，质粒信息参见文献Hui-Li Xing,Li Dong,Zhi-Ping Wang,Hai-Yan Zhang,Chun-Yan Han,Bing Liu,Xue-Chen Wang and Qi-Jun Chen.(2014)BMC Plant Biology,14:327-338，回收14kb片段后用T4连接酶连接。得到的质粒用XbaI和SacI酶切，去掉4kb的Cas9序列，将其替换为DsRed2序列。得到表达DsRed2的卡那霉素抗性双元载体。第二步，使用拟南芥基因组为模板扩增UBQ10启动子序列和HspT终止子序列，与HindIII酶切后的上述表达DsRed2的卡那霉素抗性双元载体进行无缝克隆，得到W500载体。KpnI酶切W500载体，同时用下面的引物扩增合成的1.67kb的ClGRF4-ClGIF1片段，ClGG-KD504-F：gtttttctgattaacagggtaccatgaacaacagtggcggtgg(如SEQ ID NO：5所示)，ClGG-KD504-R：tcatcttcatcttcatatctacttagcttcctcaccatcac(如SEQ ID NO：6所示)，然后进行无缝克隆，无缝克隆使用碧云天的无缝克隆试剂盒，载体片段和PCR片段按照1:2的摩尔比混好，然后加入等体积的2×Seamless cloning mix混匀，50度孵育30min即可。将重组质粒转化到大肠杆菌菌株DH5α，在50μg/mL卡那霉素固体平板上于37℃培养，挑选单菌落，通过北京擎科生物科技有限公司测序验证其序列正确性。测序结果表明，所获得的ClGRF4-ClGIF1基因编码区序列与预计相符，说明重组质粒构建成功。
实施案例3、农杆菌介导的西瓜遗传转化
选择栽培西瓜品种西农八号母本、京欣母本、Sugarlee进行遗传转化，实验各重复2次。
外植体的制备。选取栽培西瓜品种西农8号的饱满、外观正常的种子，小心的去除种壳，不要伤到子叶及生长点。灭菌后，在MS固体培养基中28℃黑暗下种植生长3天左右。选择处于胚根伸长、但两片子叶尚未分开的时期的植株，切取子叶中部的部分，并将其切为1.5mm×1.5mm的小块作为外植体。
侵染液的制备。重组表达载体的制备：按照上一步步骤构建包含西瓜生长调节基因和DsRed2筛选标记的双元载体。重组菌的制备：将上述重组载体导入农杆菌菌株EHA105中得到重组菌。侵染液的制备：将重组菌活化并进行培养，在菌株浓度为在OD600＝0.6-0.8之间时，离心，收集菌体，将菌体利用MS液体无菌培养基重悬，侵染液的OD600均为0.6。
侵染。将得到的外植体置于含有重组菌的侵染液中，并使外植体浸没在液体中，室温侵染10分钟，侵染过程中伴有间或摇动，然后取出外植体，将液体吸干，得到侵染后的外植体。
共培养。将侵染后的外植体于共培养培养基中，暗培养3天，得到共培养后的外植体。所用共培养培养基为由MS固体培养基和6-BA组成的无菌培养基，6-BA在共培养培养基中的浓度为1.5mg/L，pH为5.8。
筛选。将共培养后的外植体于筛选培养基上培养，每个平板上放25个左右的外植体。每周更换一次培养基，约4周后，可观察到阳性幼芽从子叶块边缘长出，即得到含有芽的植物组织。所用筛选培养基为由MS固体培养基与6-BA、特美汀和卡那霉素组成的无菌培养基，6-BA、特美汀、卡那霉素在筛选培养基中的浓度分别为1.5mg/L、200mg/L、100mg/L，pH为5.8。
芽伸长培养。将含有芽的植物组织或芽在芽伸长培养基中进行培养，每两周更换一次培养基，至幼芽长大。所用芽伸长培养基为由MS固体培养基与KT、特美汀和卡那霉素组成的无菌培养基，KT、特美汀和卡那霉素在芽伸长培养基中的浓度分别为0.2mg/L、200mg/L和100mg/L，pH为5.8。
阳性芽的鉴定。阳性植株采用手持式LUYOR-3415RG双波长荧光蛋白激发光源紫外线灯进行检测。按照LUYOR-3410紫外线灯的使用说明，打开红色光源激发荧光，使用相应红色滤光镜检测是否表达红色荧光，如图3所示。
测试了ClGRF4-ClGIF1在不同自交系中的转化率(见表1所示)，结果现在3个品种的转化率均高于20％，Sugarlee的转化率略高于京欣母本。
此外，本申请还对其他物种中的同源基因的遗传转化效率进行了检测，结果如下：
1)对黄瓜中的聚类关系最近的GRF4同源基因CsaV3_1G040860(同源性为38％)和GIF1同源基因CsaV3_2G003880(同源性为60.9％)进行融合后(连接序列与本申请相同)，采用与本申请相同的遗传转化方法，检测融合基因对黄瓜遗传转化效率的影响，结果发现转化效率均小于1％，不具有提高遗传转化效率的效果。
2)类似的，对番茄中的聚类关系最近的GRF4同源基因和GIF1基因融合后用于遗传转化，转化效率均在16％～30％，没有明显的提高效果。
表1：不同品种的转化效率
Figure BDA0003198495940000091
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过利用西瓜融合基因和农杆菌介导的转化方法，可以帮助转化目的基因导入西瓜基因组中，从而提高西瓜遗传转化效率。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京大学现代农业研究院
<120> 西瓜融合基因、遗传转化方法及应用
<130> PN160748XDNY
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1002
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 1
atgaacaaca gtggcggtgg tggtgaggat gggagtagga cagtagcagc aatagcaagt 60
ggaatgatgg ggatgaatag gtcacctttc acagtgttac agtggcagga gctggagcat 120
caggctctga tcttcaaata tatgatggca ggtctgcccg ttccacctga tcttgtactc 180
cctattcaga agagcttcga gtccatttct cataggttct tccatcatcc caccatggct 240
tattgttcat tctatgggaa gaaggtggac ccagagcctg gaagatgcag aaggactgat 300
ggaaagaaat ggaggtgctc caaagatgcg tacccagact ccaaatactg tgagcgccac 360
atgcaccgtg gccgcaatcg ttcaagaaag cctgtggaat ctcaaactat gacacagtcg 420
tcgtccactg tgacatctct taccgctacc ggaagtagca gcactggaac tggaagcttc 480
catggccttc cattgaatgc cttaagcagt tcccagacca ctaccactgg gaccagtcag 540
cctcattatc ccttggactc cattccctat ggaatcccaa gcaaagatta taggtatctt 600
caagggctta gacctgaagc tggagtgcat agtttctttt ctgaggcatc aggaagcagc 660
agggctgttc aaatggatgc accaatcgac aacacgtggc caatgatgcc atccagatcc 720
ccgtctttcc cggcatcaaa atcaactgaa aactcaatct tccaaagcgg atatccgcag 780
cattcgttcc ttggtgggga atatgcatct ggggaaactc tgaaacaaga gggtcaatct 840
cttcagccgc tctttgacga atggccgaga actagggagt catggaccgg actcgacgat 900
gaaagatcca atcaaacttc cttctccaca acacagctgt ccatatcaat tccaatggcc 960
tcatctgact tgtcgaccac aagttcaaaa tctcctcatg gt 1002
<210> 2
<211> 657
<212> DNA
<213> Citrullus lanatus
<400> 2
atgcagcaac caccgcaaat gttgcccatg atgccttcat ttccccccac caatatcacc 60
accgagcaga ttcaaaagta tcttgatgag aacaaaaagt tgatattggc catactggac 120
aaccaaaatc tggggaaact agctgaatgt gctcagtacc aagctcaact tcagaagaat 180
ttgatgtatt tagctgcaat tgctgatgcc cagccacagg caccagctat gcctccgcag 240
atggccccac atcctgccat gcagcaaggg ggttattata tgcagcaccc tcaggcagct 300
ataatggccc agcaatcagg acttttccct ccaaaagttc cattgcagtt cggcaatccc 360
catcaattac aagatccaca gcagcaacta caccaacaac accagcaagc aatgcaaggg 420
caaatgggac taagacctat tggtggggct aacaatggca tgcatcaccc acatcatact 480
gagagtaccc ttgggggtgg tgttagtgct ggaggccctc ctcgaagttc agtgcaaact 540
gatggtcgtg gaggtgggaa acaggactca ggtgatgtgg gaggtgcagg tgctgatggt 600
caggggagct cggctggtgg tcgtggcggt ggtggtgatg gtgaggaagc taagtag 657
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12)
<223> 融合基因连接序列
<400> 3
ggcagcggcc gc 12
<210> 4
<211> 1671
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1003)..(1014)
<223> 融合基因连接序列
<400> 4
atgaacaaca gtggcggtgg tggtgaggat gggagtagga cagtagcagc aatagcaagt 60
ggaatgatgg ggatgaatag gtcacctttc acagtgttac agtggcagga gctggagcat 120
caggctctga tcttcaaata tatgatggca ggtctgcccg ttccacctga tcttgtactc 180
cctattcaga agagcttcga gtccatttct cataggttct tccatcatcc caccatggct 240
tattgttcat tctatgggaa gaaggtggac ccagagcctg gaagatgcag aaggactgat 300
ggaaagaaat ggaggtgctc caaagatgcg tacccagact ccaaatactg tgagcgccac 360
atgcaccgtg gccgcaatcg ttcaagaaag cctgtggaat ctcaaactat gacacagtcg 420
tcgtccactg tgacatctct taccgctacc ggaagtagca gcactggaac tggaagcttc 480
catggccttc cattgaatgc cttaagcagt tcccagacca ctaccactgg gaccagtcag 540
cctcattatc ccttggactc cattccctat ggaatcccaa gcaaagatta taggtatctt 600
caagggctta gacctgaagc tggagtgcat agtttctttt ctgaggcatc aggaagcagc 660
agggctgttc aaatggatgc accaatcgac aacacgtggc caatgatgcc atccagatcc 720
ccgtctttcc cggcatcaaa atcaactgaa aactcaatct tccaaagcgg atatccgcag 780
cattcgttcc ttggtgggga atatgcatct ggggaaactc tgaaacaaga gggtcaatct 840
cttcagccgc tctttgacga atggccgaga actagggagt catggaccgg actcgacgat 900
gaaagatcca atcaaacttc cttctccaca acacagctgt ccatatcaat tccaatggcc 960
tcatctgact tgtcgaccac aagttcaaaa tctcctcatg gtggcagcgg ccgcatgcag 1020
caaccaccgc aaatgttgcc catgatgcct tcatttcccc ccaccaatat caccaccgag 1080
cagattcaaa agtatcttga tgagaacaaa aagttgatat tggccatact ggacaaccaa 1140
aatctgggga aactagctga atgtgctcag taccaagctc aacttcagaa gaatttgatg 1200
tatttagctg caattgctga tgcccagcca caggcaccag ctatgcctcc gcagatggcc 1260
ccacatcctg ccatgcagca agggggttat tatatgcagc accctcaggc agctataatg 1320
gcccagcaat caggactttt ccctccaaaa gttccattgc agttcggcaa tccccatcaa 1380
ttacaagatc cacagcagca actacaccaa caacaccagc aagcaatgca agggcaaatg 1440
ggactaagac ctattggtgg ggctaacaat ggcatgcatc acccacatca tactgagagt 1500
acccttgggg gtggtgttag tgctggaggc cctcctcgaa gttcagtgca aactgatggt 1560
cgtggaggtg ggaaacagga ctcaggtgat gtgggaggtg caggtgctga tggtcagggg 1620
agctcggctg gtggtcgtgg cggtggtggt gatggtgagg aagctaagta g 1671
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(43)
<223> ClGG-KD504-F
<400> 5
gtttttctga ttaacagggt accatgaaca acagtggcgg tgg 43
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(41)
<223> ClGG-KD504-R
<400> 6
tcatcttcat cttcatatct acttagcttc ctcaccatca c 41

Claims (13)

1.一种西瓜融合基因，其特征在于，所述西瓜融合基因由ClGRF4基因和ClGIF1基因融合而成。
2.根据权利要求1所述的西瓜融合基因，其特征在于，所述ClGRF4基因的序列如SEQ IDNO：1所示，所述ClGIF1基因的序列如SEQ ID NO：2所示；
优选地，所述ClGRF4基因和所述ClGIF1基因经连接序列连接形成所述西瓜融合基因；
优选地，所述连接序列为：GGCAGCGGCCGC；
优选地，所述西瓜融合基因的序列如SEQ ID NO：4所示。
3.权利要求1或2所述的西瓜融合基因编码的融合蛋白。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括西瓜生长调节基因及驱动所述西瓜生长调节基因表达的驱动元件，所述西瓜生长调节基因为权利要求1或2所述的西瓜融合基因。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述驱动元件包括启动子序列和终止子序列；
优选地，所述启动子序列为双子叶植物基因表达的启动子；更优选地，所述启动子序列来源于拟南芥的UBQ10启动子序列或花椰菜花叶病毒35s启动子；
优选地，所述终止子序列为适用于植物基因的终止子；更优选地，所述终止子序列选自拟南芥的HspT终止子序列、Nos终止子或花椰菜花叶病毒35s的终止子。
6.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体还包括转化目的基因；
优选地，所述重组载体进一步还包括所述转化目的基因和/或所述西瓜融合基因的报告基因；
优选地，所述报告基因包括抗性基因和/或编码荧光蛋白的基因；
更优选地，所述抗性基因选自如下任意一种或多种：卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因及草铵膦抗性基因；
更优选地，所述编码荧光蛋白的基因选自如下任意一种或多种：红色荧光蛋白表达基因DsRed2、绿色荧光蛋白表达基因GFP、红色荧光蛋白表达基因mCherry及黄色荧光蛋白表达基因YFP；
优选地，所述重组载体选自如下任意一种：pKSE401、pBSE401、pHSE401及pAS083。
7.一种非植物的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞转化有权利要求4至6中任一项所述的重组载体。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌菌株EHA105、LBA4404、AGL1或GV3101。
9.一种西瓜的遗传转化方法，其特征在于，所述遗传转化方法包括：
将权利要求1或2所述的西瓜融合基因导入西瓜基因组中。
10.根据权利要求9所述的遗传转化方法，其特征在于，通过权利要求4或5所述的重组载体将所述西瓜融合基因导入所述西瓜基因组中；
优选地，将转化目的基因与所述西瓜融合基因共同导入所述西瓜基因组中；或者
通过权利要求6所述的重组载体将所述转化目的基因与所述融合基因共同导入所述西瓜基因组中。
11.根据权利要求10所述的遗传转化方法，其特征在于，所述遗传转化方法包括如下任意一种转化方法：土壤农杆菌介导的转化、基因枪法、PEG介导的原生质体转化、植物病毒介导的转化、花粉管通道法和子房注射法；
优选地，利用农杆菌侵染法进行所述遗传转化包括：
将所述重组载体导入农杆菌菌株中得到重组菌；
将所述重组菌制备成浸染液；
将西瓜外植体置于所述浸染液中浸染，得到侵染后的外植体；
对所述侵染后的外植体进行共培养，得到共培养外植体；
对所述共培养外植体依次进行抗生素抗性筛选和荧光筛选，得到阳性转化体；
优选地，所述农杆菌菌株为EHA105；
优选地，所述西瓜外植体选自如下任意一种：子叶、子叶节、幼胚、成熟胚和原生质体；
优选地，所述抗生素选自卡那霉素、潮霉素或壮观霉素；
优选地，所述荧光筛选所用荧光为红色荧光或绿色荧光。
12.根据权利要求11所述的遗传转化方法，其特征在于，对所述共培养外植体依次进行抗生素抗性筛选和荧光筛选，得到阳性转化体包括：
将所述共培养外植体置于抗性筛选培养基上培养，得到抗性阳性幼芽组织；
将所述抗性阳性幼芽组织置于芽伸长培养基中培养至新的芽头再生，对再生的芽头进行荧光检测，得到所述阳性转化体；
优选地，所述抗性筛选培养基为由MS固体培养基与6-BA、特美汀和卡那霉素组成的无菌培养基，所述6-BA、所述特美汀和所述卡那霉素在所述抗性筛选培养基中的浓度分别为1.5mg/L、200mg/L、100mg/L，pH为5.8；
优选地，所述芽伸长培养基为由MS固体培养基与KT、特美汀和卡那霉素组成的无菌培养基，所述KT、所述特美汀和所述卡那霉素在所述芽伸长培养基中的浓度分别为0.2mg/L、200mg/L、和100mg/L，pH为5.8。
13.权利要求1或2所述的西瓜融合基因，或者权利要求4至6中任一项所述的重组载体，或者权利要求9至12中任一项所述的遗传转化方法在西瓜遗传转化和育种中的应用。
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