CN111172160B - 水稻绿色组织特异表达合成启动子gssp2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及水稻绿色组织特异表达合成启动子GSSP2及其应用。本发明将一些功能清晰且与水稻组织特异表达相关的调控序列以不同的方式进行融合，并将上述合成启动子融合GUS报告基因导入水稻品种“中花11”中。转基因水稻GUS分析结果显示，本发明成功获得了5个新的水稻绿色组织特异表达合成启动子，其中：核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示的合成启动子GSSP2在水稻叶片、叶鞘、穗和茎中特异表达，该启动子的应用，可以作为水稻遗传改良的重要遗传资源。

Description

水稻绿色组织特异表达合成启动子GSSP2及其应用

技术领域

本发明是申请号为2015104810801(申请日为2015-08-03，发明名称为：水稻绿色组织特异表达合成启动子的构建及鉴定)母案的分案申请。

本发明属于水稻基因工程技术领域。具体涉及一种水稻绿色组织特异表达合成启动子GSSP2及其应用。

背景技术

合成生物学是结合生物科学与工程学来设计和构建新的生物零件、组件和系统的一门学科(Baltes,N.J.and Voytas,D.F.Enabling plant synthetic biology throughgenome engineering.Trends Biotechnol.2014,33,120-131)，已经在多个领域显示出巨大的应用潜力，例如：通过人工合成基因组调控细胞(Gibson,D.G.et al.Creation of abacterial cell controlled by a chemically synthesized genome.Science,2010,329,52-56)；通过人工合成基因回路来合成生物能源物质以及药物(Slusarczyk,A.L.,Lin,A.and Weiss,R.Foundations for the design and implementation of syntheticgenetic circuits.Nat.Rev.Genet.2012,13,406-420)；通过人工合成启动子驱动外源基因在受体中精确表达(Chen,Y.S.et al.A late embryogenesis abundant protein HVA1regulated by an inducible promoter enhances root growth and abiotic stresstolerance in rice without yield penalty.Plant Biotechnol.J.2015,13,105-116)。人工合成启动子作为合成生物学的一个重要领域已逐渐成为研究的热点(Venter,M.Synthetic promoters:genetic control through cis engineering.Trends PlantSci.2007,12,118-124)。

启动子是调控基因转录的一段DNA序列，它是基因表达调控中最关键的因子，能够精确调控目的基因的表达模式及表达丰度(Cai,M.,Wei,J.,Li,X.,Xu,C.and Wang,S.Arice promoter containing both novel positive and negative cis-elements forregulation of green tissue-specific gene expression in transgenicplants.Plant Biotechnol.J.2007,5,664-674)。随着研究的深入，人们在基因组中发现了不同类型的天然启动子，如：组成型启动子、时空特异型启动子、诱导型启动子等。在基因工程研究中，天然启动子的使用和开发占较大部分。但由于人们对天然启动子中的许多序列认识不足，增加了其在应用中的不确定性。与天然启动子相比，人工合成启动子可根据不同目的自由构建，提高基因表达时期、部位和条件的精确性。随着合成生物学的发展，人工合成启动子的报道逐渐增多，其中最多的是微生物合成启动子的研究，采用的主要策略是将大批量的不同顺式元件或者随机序列与核心启动子融合，筛选与试验设计相符合的合成启动子(Rytter,J.V.et al.Synthetic promoter libraries for Corynebacterium glutamicum.Appl.Microbiol.Biotechnol.2014,98,2617-2623；Sohoni,S.V.,Fazio,A.,Workman,C.T.,Mijakovic,I.and Lantz,A.E.Synthetic Promoter Library formodulation of actinorhodin production in Streptomyces coelicolor A3(2).PLoSOne,2014,9,e99701)。但是这种途径的筛选工作量大，不适合植物尤其是水稻这种生长周期较长的受体生物。在动物中，已经报道通过不同启动子的同向组合创造出高效且特异性强的启动子(Dai,J.et al.The combination of a synthetic promoter and a CMVpromoter improves foreign gene expression efficiency inmyocytes.J.Biotechnol.2012,158,91-96；Kang,W.et al.A macrophage-specificsynthetic promoter for therapeutic application of adiponectin.Gene Ther.2014,21,353-362)。

植物合成启动子的研究相对较少，主要利用顺式元件融合核心启动子的方法。2012年，Koschmann等人根据PathoPlant数据库中的拟南芥芯片数据，挑选出受病原菌诱导上调表达的基因，利用BEST软件寻找这些基因启动子区的保守序列，然后与AthaMap，PLACE和AGRIS数据库中的顺式元件进行比对，挑选与已知顺式元件的相似度低或不相似的保守序列，通过合成启动子的方法进行验证(Koschmann,J.et al.Integration ofbioinformatics and synthetic promoters leads to the discovery of novelelicitor-responsive cis-regulatory sequences in Arabidopsis.PlantPhysiol.2012,160,178-191)。2013年，Liu等人将受病原菌和植物防御信号分子诱导的顺式元件与核心启动子融合并稳定转化烟草和拟南芥，对转基因植株进行病原菌、水杨酸、乙烯和茉莉酸甲酯处理，结果证实合成的诱导型启动子在转基因烟草和拟南芥中能够发挥预期功能(Liu,W.et al.Bacterial pathogen phytosensing in transgenic tobacco andArabidopsis plants.Plant Biotechnol.J.2013,11,43-52)。2014年，该研究小组根据大豆基因芯片数据，挑选出受大豆胞囊线虫(SCN)诱导的基因，综合七种生物信息学工具寻找这些基因启动子中可能受SCN诱导的顺式元件，并通过合成启动子的方法在转基因大豆毛状根中对候选的顺式元件进行验证(Liu,W.et al.Computational discovery of soybeanpromoter cis-regulatory elements for the construction of soybean cystnematode-inducible synthetic promoters.Plant Biotechnol.J.2014,12,1015-1026)。在植物中，很多研究工作都集中于诱导型合成启动子方面，组织特异型合成启动子的报道却非常少，在水稻中仍然没有相关的报道。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，亦是禾本科作物功能基因组学研究的模式植物。完备的基因组信息(Goff,S.A.et al.A draft sequence of the rice genome(Oryza sativa L.ssp.japonica).Science,2002,296,92-100；Yu,J.et al.A draftsequence of the rice genome(Oryza sativa L.ssp.indica).Science,2002,296,79-92)及较为清楚的基因表达信息(Wang,L.et al.A dynamic gene expression atlascovering the entire life cycle of rice.Plant J.2010,61,752-766)为组织特异表达启动子的研究提供了极大的便利。前人已经克隆了多个水稻组织特异表达启动子，并在性状遗传改良和基因功能研究中进行应用(Azria,D.and Bhalla,P.L.Agrobacterium-mediated transformation of Australian rice varieties and promoter analysis ofmajor pollen allergen gene,Ory s 1.Plant cell rep.2011,30,1673-1681；Ha,S.H.etal.Application of two bicistronic systems involving 2A and IRES sequences tothe biosynthesis of carotenoids in rice endosperm.Plant Biotechnol.J.2010,8,928-938；Jeong,J.S.et al.OsNAC5 overexpression enlarges root diameter in riceplants leading to enhanced drought tolerance and increased grain yield in thefield.Plant Biotechnol.J.2013,11,101-114；Molla,K.A.et al.Rice oxalate oxidasegene driven by green tissue-specific promoter increases tolerance to sheathblight pathogen(Rhizoctonia solani)in transgenic rice.Mol.Plant Pathol.2013,14,910-922；Ye,R.et al.Development of insect-resistant transgenic rice withCry1C*-free endosperm.Pest Manag.Sci.2009,65,1015-1020)，这些为水稻组织特异表达合成启动子的研究奠定了坚实的基础。

发明内容

本发明的目的在于设计并获得水稻绿色组织特异表达的人工合成启动子。本发明将一些功能清晰且与水稻组织特异表达相关的调控序列以不同的方式进行融合，并将上述合成启动子融合报告基因β-葡糖醛酸酶基因(以下简称GUS基因)导入水稻中，获得转基因水稻。对转基因水稻GUS分析结果显示，本发明已成功获得了5个新的水稻绿色组织特异表达合成启动子，且它们在不同绿色组织中的表达强度不尽相同，能够满足不同的应用目的。本发明为水稻组织特异表达合成启动子的构建及鉴定提供了一个成功的方法。

本发明的技术方案如下所述：

将5个已报道的水稻组织特异表达相关的调控序列(P_D540-544，P_Osrbcs-550，P_Osrbcs-62，GT1和水稻Act1基因第一内含子)以图1所示的结构组装成5个新的合成启动子，并送交南京金斯瑞生物科技公司合成。所述的5个合成启动子(分别命名为GSSP1、GSSP2、GSSP3、GSSP4和GSSP5)的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5所示。通过GUS组织化学染色分析上述启动子驱动GUS报告基因在转基因水稻中的表达模式发现：合成启动子GSSP1驱动GUS基因在转化植株的叶片、叶鞘和穗中特异表达尤其是在叶鞘中高强度表达；合成启动子GSSP2驱动GUS基因在转化植株的叶片、叶鞘、穗和茎中特异表达的尤其是在叶片中高强度表达；合成启动子GSSP3驱动GUS基因在转化植株的叶片、叶鞘、穗和茎中特异表达的尤其是在叶片、叶鞘和穗中高强度表达；合成启动子GSSP4驱动GUS基因在转化植株的叶片、叶鞘、穗和茎中特异表达尤其是在穗和茎中高强度表达；合成启动子GSSP5驱动GUS基因在转化植株的叶片、叶鞘、穗和茎中特异表达。该结果表明：上述合成启动子都只在绿色组织中具有表达活性，均为绿色组织特异表达启动子。其后，对转化植株的不同组织进行GUS蛋白活性检测，该结果显示的GUS基因表达模式与组织化学染色结果均相符，同时进一步证明：上述合成启动子在不同绿色组织中的表达强度不尽相同。

本发明公开了合成启动子的构建、转化载体的构建、水稻遗传转化和转化植物的GUS组织化学染色，GUS蛋白活性检测等过程。

本发明的具体步骤是：

首先选取了5个水稻组织特异表达相关的调控序列：P_D540-544，P_Osrbcs-550，P_Osrbcs-62，GT1和水稻Act1基因第一内含子，它们的序列分别如序列表SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10所示。按照图2所示的结构组装成5个新的合成启动子，并送交南京金斯瑞生物科技公司合成。然后将上述合成启动子分别插入启动子功能分析载体pDX2181的多克隆位点(载体图及多克隆位点等信息见图3)，得到重组的植物表达载体，分别命名为：GSSP1-pDX2181、GSSP2-pDX2181、GSSP3-pDX2181、GSSP4-pDX2181、GSSP5-pDX2181(见图4)。将上述表达载体分别转化农杆菌菌株EHA105。

将水稻品种中花11(来源于中国农业科学院作物科学研究所)的成熟种子消毒后诱导胚性愈伤组织。将含有表达载体GSSP1-pDX2181、GSSP2-pDX2181、GSSP3-pDX2181、GSSP4-pDX2181、GSSP5-pDX2181的农杆菌菌株EHA105分别与胚性愈伤组织进行共培养后，在含有50mg/L潮霉素的筛选培养基上进行抗性愈伤组织的筛选，经过两次筛选之后，挑取抗性愈伤转入分化培养基上进行分化，当分化的小苗长到2-3cm时，切掉原生根，放到生根培养基上进行生根，当新根生长到2cm左右时，炼苗后移栽到温室。这些再生小苗即为T₀代转基因苗。同时转化空载体pDX2181作为阴性对照，转化花椰菜花叶病毒35S启动子驱动GUS(CaMV 35S-pDX2181)作为阳性对照。

获得转基因植株后，通过GUS组织化学染色及GUS蛋白活性检测，考察上述合成启动子在水稻不同组织的表达差异。检测结果表明：上述合成启动子只在绿色组织中具有表达活性，均为绿色组织特异表达启动子。同时，它们在不同绿色组织中的表达强度不尽相同，能够满足不同的应用目的。

本发明的优点在于：

(1)本发明首次在水稻中通过人工合成的方式获得组织特异表达启动子，为水稻组织特异表达合成启动子的构建提供了一个成功的范例。

(2)本发明获得了5个绿色组织特异表达合成启动子，为基因工程和分子育种提供了新的组织特异表达启动子资源。

附图说明

图1：本发明的总体技术路线图。

图2：本发明设计的合成启动子GSSP1-GSSP5的结构示意图。

图3：是pDX2181质粒图，本发明利用其骨架构建转化载体。

图4：是本发明的转化载体构建示意图。该载体是在pDX2181的基础上改造而来，将不同合成启动子片段插入质粒pDX2181的多克隆位点构建而成。附图标记说明：图4中的(a)图：转化载体GSSP1-pDX2181结构示意图；图4中的(b)图：转化载体GSSP2-pDX2181结构示意图；图4中的(c)图：转化载体GSSP3-pDX2181结构示意图；图4中的(d)图：转化载体GSSP4-pDX2181结构示意图；图4中的(e)图：转化载体GSSP5-pDX2181结构示意图。

图5：由各个合成启动子驱动GUS基因的转化植株的不同组织的组织化学染色结果。附图标记说明：a：根；b：叶片；c：叶鞘；d：穗；e：茎杆；f：种子(含胚与胚乳)；PC：阳性对照；NC：阴性对照。

图6：由各个合成启动子驱动GUS基因的转化植株的不同组织的GUS蛋白活性检测结果。图中标记说明：PC：阳性对照；NC：阴性对照。

具体实施方式

对序列表的说明：

序列表SEQ ID NO：1是本发明中合成启动子GSSP1的核苷酸序列；序列长度为1136bp。

序列表SEQ ID NO：2是本发明中合成启动子GSSP2的核苷酸序列；序列长度为865bp。

序列表SEQ ID NO：3是本发明中合成启动子GSSP3的核苷酸序列；序列长度为1450bp。

序列表SEQ ID NO：4是本发明中合成启动子GSSP4的核苷酸序列；序列长度为436bp。

序列表SEQ ID NO：5是本发明中合成启动子GSSP5的核苷酸序列；序列长度为899bp。

序列表SEQ ID NO：6是本发明中P_D540-544的核苷酸序列；序列长度为585bp。

序列表SEQ ID NO：7是本发明中P_Osrbcs-550的核苷酸序列；序列长度为551bp。

序列表SEQ ID NO：8是本发明中P_Osrbcs-62的核苷酸序列；序列长度为62bp。

序列表SEQ ID NO：9是本发明中GT1的核苷酸序列；序列长度为15bp。

序列表SEQ ID NO：10是本发明中水稻Act1基因第一内含子的核苷酸序列；序列长度为314bp。

实施例1：植物表达载体的构建

本发明如无特别说明，所参考的方法及相应分子生物学常规操作参考了：J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南(第二版)》(中译本)，科学出版社1996版的相关信息。

本发明首先选取了5个组织特异表达相关的调控序列：P_D540-54，P_Osrbcs-550，P_Osrbcs-62，GT1和水稻Act1基因的第一内含子，它们的序列分别是SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10所示的序列。按照图2所示的设计方式组装成5个新的合成启动子，并送交南京金斯瑞生物科技有限公司。然后将上述合成启动子通过Hind III和Pst I内切酶位点分别连入启动子功能分析载体pDX2181(载体图及多克隆位点等信息见图3)，得到重组的植物表达载体，即本发明使用的转化载体，分别命名为：GSSP1-pDX2181、GSSP2-pDX2181、GSSP3-pDX2181、GSSP4-pDX2181、GSSP5-pDX2181(见图4)。将上述5个重组的植物表达载体转化农杆菌菌株EHA105，将转化后的农杆菌菌株EHA105菌株于-70℃下保存待用。

实施例2：农杆菌介导的遗传转化

农杆菌介导的遗传转化方法主要参照华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室发表的“农杆菌介导的遗传转化操作手册”所示的方法(林拥军等，2002)。转化受体为水稻品种中花11(为常规品种，来源于中国农业科学院作物科学研究所)的成熟种子所诱导产生的胚性愈伤组织。经过预培养、侵染、共培养、筛选得到具有潮霉素抗性的愈伤，再经过分化、生根、练苗和移栽，得到转基因植株。本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：

(1)农杆菌介导的遗传转化步骤

1)愈伤诱导

a.将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；

b.用灭菌水洗种子4-5次；

c.将种子放在诱导培养基上；

d.将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

2)愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3)预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

4)农杆菌培养

a.在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司商业化的农杆菌菌株)两天，温度28℃；

b.将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

5)农杆菌侵染

a.将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

b.调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；

c.将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

d.转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

6)愈伤洗涤和选择培养

a.灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

b.浸泡在含400mg/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；

c.转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

d.转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

7)分化

将生长旺盛的抗性愈伤转入分化培养基中，放置于光照培养室中进行光照培养至分化出再生小苗。

8)生根

待再生小苗的芽长至2-3cm高时即可进行生根。用剪刀和镊子将再生植株在分化培养基上长出的根清除干净，将再生植株芽的下部插入生根培养基中，放置于光照培养室培养直至长出白色的新根。

9)炼苗及移栽

当新根生长到2cm左右时，可进行炼苗：将生根培养基的封口膜揭掉，加入适量自来水，在光照培养室继续培养3天。移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

(2)主要溶液配方

1)N₆培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)：

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制：

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ml。

3)铁盐(Fe_2-EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)：

将3.73g乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78g FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000ml，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)：

加蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(按照10X浓缩液配制)：

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(按照100X浓缩液配制)：

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml。

7)2,4-D贮存液(1mg/ml)的配制：

称取2,4-D 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：

称取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

称取NAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

称取IAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：

称取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

称取AS 0.392g，加入DMSO 10ml溶解，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液配制：

称取氢氧化钾5.6g，用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250ul AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250ul AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。

使用前加入1ml无菌葡萄糖贮存液和100ul AS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250ul HN(50mg/ml)和400ul CN(250mg/ml)分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400mg/l，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250mg/l)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250ul HN(50mg/ml)250ul CN(250mg/ml)，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口，按上述方法灭菌。

实施例3：利用PCR法检测转基因阳性植株

转化苗移入温室后，待其返青，然后分单株取1-2cm幼嫩叶片，抽提其基因组DNA为模板，利用PCR法检测阳性植株。扩增片段为报告基因gus的部分片段，大小为699bp。引物序列为GUS-F:GGGCGAACAGTTCCTGATTA，GUS-R:AACGTATCCACGCCGTATTC。PCR反应条件：94℃5min，94℃50sec，57℃40sec，72℃50sec，30个循环，72℃7min。PCR产物经0.8％琼脂糖胶电泳检测。对所有T₀代植株进行PCR检测，根据检测结果剔除假阳性的转化植株。

利用小量叶片基因组DNA的提取方法提取基因组DNA:取适量幼嫩叶片，加800μl1.5×CTAB(1.5×CTAB配方：1.5％CTAB、75mM Tris-HCl、15mM EDTA及1.05M NaCl)研磨，转入1.5ml离心管中；65℃水浴30min；加入600μL氯仿/异戊醇(体积比为24:1)上下颠倒数次(约15min)，下层液相呈深绿色为止；室温下12000r/min离心10min；取500μL上清于一新1.5ml离心管，加入预冷的95％乙醇1mL，混匀后置-20℃，30min；室温下12000r/min离心10min，去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，自然干燥；加入100μL ddH₂O溶解，备用。

实施例4：各个合成启动子在不同组织中的表达模式

分别取GSSP1-GUS，GSSP2-GUS，GSSP3-GUS，GSSP4-GUS和GSSP5-GUS的阳性转化植株(参考实施例3)的不同组织(包括：根、叶片、叶鞘、茎杆、穗及种子)切成约0.5CM长度的适当大小，浸入约200μl的GUS染液，37℃过夜，然后用75％酒精脱色，观察是否有蓝色出现。染色液的配方参照Jefferson等报道的方法(Jefferson,R.A.,Kavanagh,T.A.and Bevan,M.W.GUS fusions:β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusionmarker in higher plants.EMBO J.1987,6,3901-3907)。结果显示：GSSP1驱动GUS基因在转化植株的叶片、叶鞘和穗中特异表达，GSSP2-GSSP 5驱动GUS基因在转化植株的叶片、叶鞘、穗和茎中特异表达(见图5)。该结果证实：上述合成启动子都只在绿色组织中具有表达活性，均为绿色组织特异表达启动子。

实施例5：各个合成启动子在不同组织中的表达强度

分别取GSSP1-GUS，GSSP2-GUS，GSSP3-GUS，GSSP4-GUS和GSSP5-GUS的阳性转化植株(参考实施例3)的不同组织(包括：根、叶片、叶鞘、茎杆、穗及种子)并抽提总蛋白，然后测定其GUS活性。总蛋白的抽提及浓度测定参考Bradford的方法(Bradford,M.M.A rapid andsensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding.Anal.Biochem.1976,72,248-254)，GUS活性测定参考Xu的方法(Xu,L.et al.Isolation of the endosperm-specific LPAATgene promoter from coconut(Cocos nucifera L.)and its functional analysis intransgenic rice plants.Plant Cell Rep.2010,29,1061-1068)。结果表明：GSSP1-GSSP5这五个绿色组织特异表达合成启动子在不同绿色组织中的表达强度不尽相同(见图6)。它们在叶片中的表达强度从强到弱依次是：GSSP3、GSSP5、GSSP1、GSSP7、GSSP6；在叶鞘中的表达强度从强到弱依次是：GSSP1、GSSP5、GSSP3、GSSP6、GSSP7；在穗中的表达强度从强到弱依次是：GSSP5、GSSP6、GSSP7、GSSP3、GSSP1；在茎杆中的表达强度从强到弱依次是：GSSP6、GSSP5、GSSP7、GSSP3、GSSP1。合成启动子GSSP1驱动GUS基因在转化植株的叶片、叶鞘和穗中特异表达尤其是在叶鞘中高强度表达；合成启动子GSSP2驱动GUS基因在转化植株的叶片、叶鞘、穗和茎中特异表达的尤其是在叶片中高强度表达；合成启动子GSSP3驱动GUS基因在转化植株的叶片、叶鞘、穗和茎中特异表达的尤其是在叶片、叶鞘和穗中高强度表达；合成启动子GSSP4驱动GUS基因在转化植株的叶片、叶鞘、穗和茎中特异表达尤其是在穗和茎中高强度表达；合成启动子GSSP5驱动GUS基因在转化植株的叶片、叶鞘、穗和茎中特异表达。因此，可以利用它们驱动不同目的基因在水稻不同绿色组织中高效表达，实现不同的应用目的。同时，本发明也首次在水稻中通过人工合成的方式获得组织特异表达启动子，为水稻组织特异表达合成启动子的构建提供了一个成功的范例。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 水稻绿色组织特异表达合成启动子GSSP2及其应用

<130>

<141> 2021-12-17

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1136

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(1136)

<223>

<400> 1

tagataatgg attaaaacct ggcctctata tccaaactcg gatgtacatg gccaaattaa 60

catccagttc ttcatccacc ttcatatcag aacattccag aatacagatt gcaatggcat 120

ccattggcac cacatgtttt gactgattct ttcactgttt cttgatatat ttgttgattt 180

ttaatggtaa atagctcatc tgtccaatcc tggcaccaca taatttcccc tgttaaaaca 240

gtgccaacac aaatttactc atgtccactg aaaatcccca gaggataacg ttctggcact 300

gccatatcag gaccggacca tacgcggcgc gccacgtggc gcgccggcgg tcacacctgt 360

gctggtgcac cctggcatta tccccatcca ccatcctgtg ggtgactggc caccaaaggt 420

ttttggcgcc acaattatat tgagctgcca ttgcttctca cctctgcttt gcatccatcc 480

atccatcaga gatcaggtag aacagtgaga gtgaggtgca gaaaaatttg agctgaagct 540

gaggatggca acatccatga tcacctcgcc gctggtggcg ccggcgctta atgagggccc 600

aaagttttga tgaccttttg cttgatctcg aaattaaaat tcaagtacct gttaagggag 660

gtcacaccac catcaatttt cagcctgaag aaacagttaa acaacgaccc cgatgaccag 720

tctactgctc tccacatact agcagcatta ttgatcacaa aagaaaccaa aataaaaatc 780

agcaccgagt gtgcagaggg agacaaaggt gatctggcag tggatatctc cccatccatc 840

ctcacccgcg ctgcccatca ctcgccgccg catactacat catgtggaga gaggaagacg 900

aggaccacag ccagagcccg ggtcgagatg ccaccacggc cacaatccac gagcccggcg 960

cgacaccacc gcgcgcgcgt gagccagcca caaacgcccg cggataggcg cgcgcacgcc 1020

ggccaatcct accacatccc cggcctccgc ggctcgcgag cgccgctgcc atccgatccg 1080

ctgagttttg gctatttata cgtaccgcgg gagcctgtgt gcagagcagt gcatct 1136

<210> 2

<211> 865

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(865)

<223>

<400> 2

gcttaatgag ggcccaaagt tttgatgacc ttttgcttga tctcgaaatt aaaattcaag 60

tacctgttaa gggaggtcac accaccatca attttcagcc tgaagaaaca gttaaacaac 120

gaccccgatg accagtctac tgctctccac atactagcag cattattgat cacaaaagaa 180

accaaaataa aaatcagcac cgagtgtgca gagggagaca aaggtgatct ggcagtggat 240

atctccccat ccatcctcac ccgcgctgcc catcactcgc cgccgcatac tacatcatgt 300

ggagagagga agacgaggac cacagccaga gcccgggtcg agatgccacc acggccacaa 360

tccacgagcc cggcgcgaca ccaccgcgcg cgcgtgagcc agccacaaac gcccgcggat 420

aggcgcgcgc acgccggcca atcctaccac atccccggcc tccgcggctc gcgagcgccg 480

ctgccatccg atccgctgag ttttggctat ttatacgtac cgcgggagcc tgtgtgcaga 540

gcagtgcatc tgtaaccacc ccgcccctct cctctttctt tctccgtttt ttttttcgtc 600

tcggtctcga tctttggcct tggtagtttg ggtgggcgag agcggcttcg tcgcccagat 660

cggtgcgcgg gaggggcggg atctcgcggc tggcgtctcc gggcgtgagt cggcccggat 720

cctcgcgggg aatggggctc tcggatgtag atcttctttc tttcttcttt ttgtggtaga 780

atttgaatcc ctcagcattg ttcatcggta gtttttcttt tcatgatttg tgacaaatgc 840

agcctcgtgc ggagcttttt tgtag 865

<210> 3

<211> 1450

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(1450)

<223> <400> 3

tagataatgg attaaaacct ggcctctata tccaaactcg gatgtacatg gccaaattaa 60

catccagttc ttcatccacc ttcatatcag aacattccag aatacagatt gcaatggcat 120

ccattggcac cacatgtttt gactgattct ttcactgttt cttgatatat ttgttgattt 180

ttaatggtaa atagctcatc tgtccaatcc tggcaccaca taatttcccc tgttaaaaca 240

gtgccaacac aaatttactc atgtccactg aaaatcccca gaggataacg ttctggcact 300

gccatatcag gaccggacca tacgcggcgc gccacgtggc gcgccggcgg tcacacctgt 360

gctggtgcac cctggcatta tccccatcca ccatcctgtg ggtgactggc caccaaaggt 420

ttttggcgcc acaattatat tgagctgcca ttgcttctca cctctgcttt gcatccatcc 480

atccatcaga gatcaggtag aacagtgaga gtgaggtgca gaaaaatttg agctgaagct 540

gaggatggca acatccatga tcacctcgcc gctggtggcg ccggcgctta atgagggccc 600

aaagttttga tgaccttttg cttgatctcg aaattaaaat tcaagtacct gttaagggag 660

gtcacaccac catcaatttt cagcctgaag aaacagttaa acaacgaccc cgatgaccag 720

tctactgctc tccacatact agcagcatta ttgatcacaa aagaaaccaa aataaaaatc 780

agcaccgagt gtgcagaggg agacaaaggt gatctggcag tggatatctc cccatccatc 840

ctcacccgcg ctgcccatca ctcgccgccg catactacat catgtggaga gaggaagacg 900

aggaccacag ccagagcccg ggtcgagatg ccaccacggc cacaatccac gagcccggcg 960

cgacaccacc gcgcgcgcgt gagccagcca caaacgcccg cggataggcg cgcgcacgcc 1020

ggccaatcct accacatccc cggcctccgc ggctcgcgag cgccgctgcc atccgatccg 1080

ctgagttttg gctatttata cgtaccgcgg gagcctgtgt gcagagcagt gcatctgtaa 1140

ccaccccgcc cctctcctct ttctttctcc gttttttttt tcgtctcggt ctcgatcttt 1200

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cattgttcat cggtagtttt tcttttcatg atttgtgaca aatgcagcct cgtgcggagc 1440

ttttttgtag 1450

<210> 4

<211> 436

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(436)

<223>

<400> 4

tgtgtggtta atatgtgtgt ggttaatatg tgtgtggtta atatgtgtgt ggttaatatg 60

gatccgctga gttttggcta tttatacgta ccgcgggagc ctgtgtgcag agcagtgcat 120

ctgtaaccac cccgcccctc tcctctttct ttctccgttt tttttttcgt ctcggtctcg 180

atctttggcc ttggtagttt gggtgggcga gagcggcttc gtcgcccaga tcggtgcgcg 240

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gaatggggct ctcggatgta gatcttcttt ctttcttctt tttgtggtag aatttgaatc 360

cctcagcatt gttcatcggt agtttttctt ttcatgattt gtgacaaatg cagcctcgtg 420

cggagctttt ttgtag 436

<210> 5

<211> 899

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(899)

<223>

<400> 5

tagataatgg attaaaacct ggcctctata tccaaactcg gatgtacatg gccaaattaa 60

catccagttc ttcatccacc ttcatatcag aacattccag aatacagatt gcaatggcat 120

ccattggcac cacatgtttt gactgattct ttcactgttt cttgatatat ttgttgattt 180

ttaatggtaa atagctcatc tgtccaatcc tggcaccaca taatttcccc tgttaaaaca 240

gtgccaacac aaatttactc atgtccactg aaaatcccca gaggataacg ttctggcact 300

gccatatcag gaccggacca tacgcggcgc gccacgtggc gcgccggcgg tcacacctgt 360

gctggtgcac cctggcatta tccccatcca ccatcctgtg ggtgactggc caccaaaggt 420

ttttggcgcc acaattatat tgagctgcca ttgcttctca cctctgcttt gcatccatcc 480

atccatcaga gatcaggtag aacagtgaga gtgaggtgca gaaaaatttg agctgaagct 540

gaggatggca acatccatga tcacctcgcc gctggtggcg ccggcgtaac caccccgccc 600

ctctcctctt tctttctccg tttttttttt cgtctcggtc tcgatctttg gccttggtag 660

tttgggtggg cgagagcggc ttcgtcgccc agatcggtgc gcgggagggg cgggatctcg 720

cggctggcgt ctccgggcgt gagtcggccc ggatcctcgc ggggaatggg gctctcggat 780

gtagatcttc tttctttctt ctttttgtgg tagaatttga atccctcagc attgttcatc 840

ggtagttttt cttttcatga tttgtgacaa atgcagcctc gtgcggagct tttttgtag 899

<210> 6

<211> 585

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> gene

<222> (1)..(585)

<223>

<400> 6

tagataatgg attaaaacct ggcctctata tccaaactcg gatgtacatg gccaaattaa 60

catccagttc ttcatccacc ttcatatcag aacattccag aatacagatt gcaatggcat 120

ccattggcac cacatgtttt gactgattct ttcactgttt cttgatatat ttgttgattt 180

ttaatggtaa atagctcatc tgtccaatcc tggcaccaca taatttcccc tgttaaaaca 240

gtgccaacac aaatttactc atgtccactg aaaatcccca gaggataacg ttctggcact 300

gccatatcag gaccggacca tacgcggcgc gccacgtggc gcgccggcgg tcacacctgt 360

gctggtgcac cctggcatta tccccatcca ccatcctgtg ggtgactggc caccaaaggt 420

ttttggcgcc acaattatat tgagctgcca ttgcttctca cctctgcttt gcatccatcc 480

atccatcaga gatcaggtag aacagtgaga gtgaggtgca gaaaaatttg agctgaagct 540

gaggatggca acatccatga tcacctcgcc gctggtggcg ccggc 585

<210> 7

<211> 551

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> gene

<222> (1)..(551)

<223>

<400> 7

gcttaatgag ggcccaaagt tttgatgacc ttttgcttga tctcgaaatt aaaattcaag 60

tacctgttaa gggaggtcac accaccatca attttcagcc tgaagaaaca gttaaacaac 120

gaccccgatg accagtctac tgctctccac atactagcag cattattgat cacaaaagaa 180

accaaaataa aaatcagcac cgagtgtgca gagggagaca aaggtgatct ggcagtggat 240

atctccccat ccatcctcac ccgcgctgcc catcactcgc cgccgcatac tacatcatgt 300

ggagagagga agacgaggac cacagccaga gcccgggtcg agatgccacc acggccacaa 360

tccacgagcc cggcgcgaca ccaccgcgcg cgcgtgagcc agccacaaac gcccgcggat 420

aggcgcgcgc acgccggcca atcctaccac atccccggcc tccgcggctc gcgagcgccg 480

ctgccatccg atccgctgag ttttggctat ttatacgtac cgcgggagcc tgtgtgcaga 540

gcagtgcatc t 551

<210> 8

<211> 62

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> gene

<222> (1)..(62)

<223>

<400> 8

gatccgctga gttttggcta tttatacgta ccgcgggagc ctgtgtgcag agcagtgcat 60

ct 62

<210> 9

<211> 15

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> gene

<222> (1)..(15)

<223>

<400> 9

tgtgtggtta atatg 15

<210> 10

<211> 314

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> gene

<222> (1)..(314)

<223>

<400> 10

gtaaccaccc cgcccctctc ctctttcttt ctccgttttt tttttcgtct cggtctcgat 60

ctttggcctt ggtagtttgg gtgggcgaga gcggcttcgt cgcccagatc ggtgcgcggg 120

aggggcggga tctcgcggct ggcgtctccg ggcgtgagtc ggcccggatc ctcgcgggga 180

atggggctct cggatgtaga tcttctttct ttcttctttt tgtggtagaa tttgaatccc 240

tcagcattgt tcatcggtag tttttctttt catgatttgt gacaaatgca gcctcgtgcg 300

gagctttttt gtag 314

Claims (2)

1.一个在水稻叶片、叶鞘、穗和茎中特异表达的合成启动子GSSP2，其特征在于所述合成启动子GSSP2的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述的水稻启动子GSSP2在水稻遗传改良中的应用。

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