CN102154271A - 一种培育抗蚜虫转基因小麦的方法及专用载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培育抗蚜虫转基因小麦的方法及专用表达载体。本发明的重组载体为将SEQ ID NO：1中自5′末端起第1-3828位核苷酸所示基因表达盒插入载体pG4AB的多克隆位点，得到的重组载体。实验证明，转入本发明载体的转基因小麦的抗虫性能明显高于野生型小麦，因此，本发明载体在植物的遗传育种领域具有重要意义。

Description

一种培育抗蚜虫转基因小麦的方法及专用载体

技术领域

本发明涉及一种培育抗蚜虫转基因小麦的方法及专用载体。

背景技术

小麦作为最重要的粮食作物之一，是人类蛋白质主要摄取来源；同时富含维生素B、维生素E、纤维及镁、磷等物质(Vasil I K，Anderson O D.Genetic engineering of wheat gluten.Trends in Plant Science，1997，2(8)：292-297.)。据1997年召开的“世界食物和可持续发展农业”大会估计，世界小麦需求量将以每年1.6％的速率增长，2020年将达到7.75亿吨，比1993年的5.52亿吨增长40％(Rosengrant M W，Agcaoili-Sombilla M，Perez N D.Global food projections to 2020：implications for investment.1995，Washington，DC：IFPRI.)。届时我国小麦需求量约为1.4～1.5亿吨，比目前产量增加4600～5600万吨，增长49～60％(甘吉生.2006-2020年《作物科技发展规划》研究报告.//路明主编，2003中国作物学会学术年会文集.2003：47-62.)。建国以来，我国已培育出小麦品种2000多个，实现品种更新换代6～8次，单产从43公斤/亩提高到285公斤/亩，为我国粮食的有效供给作出了巨大贡献(喻修道，徐兆师，陈明，李连城，马有志.2010.小麦转基因技术研究及其应用.中国农业科学，43(8)，1539-1553.)。但近十多年来，小麦产量提高速度趋缓。鉴于目前耕地面积不断减少和人口的持续增长，病虫害及干旱等胁迫的日益严重，我国小麦生产依然面临很大挑战，转基因技术可能为新形势下的小麦有效供给提供保障。

虫害一直是小麦生产的重要障碍之一，其防治好坏直接影响到小麦产量和品质。据不完全统计，危害中国麦类作物的害虫超过110种，隶属于8目40科以上，主要包括麦蚜、吸浆虫、地下害虫、麦蜘蛛、黏虫、蓟马、麦叶蜂、麦茎蜂等10余类群(曹雅忠，李克斌，尹姣，张克诚.小麦主要害虫的发生动态及可持续控制的策略与实践.中国植保导刊，2006，26(8)：11-14.)。其中以麦蚜为害最为严重，中国常年发生面积达1.5-2.0亿亩，造成小麦减产10％左右，大发生年份减产超过30％(武予清，李素娟，刘爱芝，李世功.小麦抗蚜育种研究进展.河南农业科学，2002(2)：19-20.)。近年来，由于全球CO2浓度不断增加、耕作制度变化等使麦蚜的繁殖能力和适应性显著增强(Awmack C S，Harrington R.Elevated CO2 affects the interactions between aphid pests and host plant flowering.Agricultural and Forest Entomology，2000，2：57-61)，其危害面积和危害程度正在不断扩大并日趋严重。

现有小麦种质资源中几乎找不到对麦蚜免疫的材料，高抗材料也很少，因此通过植物基因工程创造小麦抗蚜新种质是非常必要的。转基因技术与常规育种手段相结合进行品种选育，可以缩短育种周期，提高育种效率，是非常有效的育种新途径，中国农业科学院生物技术研究所郭三堆课题组开展的抗虫棉选育已充分证明了此途径的有效性(倪万潮，张震林，郭三堆(1998).转基因抗虫棉的培育.中国农业科学，31，36-40.；郭三堆，崔洪志，夏兰芹，武东亮，倪万潮，张震林，张保龙，徐英俊(1999).双价抗虫转基因棉花研究.中国农业科学，32(3)，1-7.)。目前已有研究者将几个抗虫基因导入了小麦，如Vishnudasan等(Vishnudasan D，Tripathi M N，Rao U，Khurana P.Assessment of nematode resistance in wheat transgenic plants expressing potato proteinase inhibitor(PIN2)gene.Transgenic Research，2005，14(5)：665-675.)将马铃薯来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PIN2通过农杆菌介导法转入小麦，转基因小麦株系对禾谷孢囊线虫具有很高的抗性。Altpeter等(Altpeter F，Diaz I，McAuslane H，Gaddour K，Carbonero P，Vasil I K.Increased insect resistance in transgenic wheat stably expressing trypsin inhibitor CMe.Molecular Breeding，1999，5：53-63.)将大麦胰蛋白酶抑制基因BTI-CMe转入小麦，该基因对储存害虫麦蛾有较强的抑制作用，但对小麦叶面害虫作用不大。就抗蚜转基因小麦而言，研究最成功的是转外源凝集素基因，如人工合成及来源于雪花莲的凝集素基因(gna)，半夏凝集素基因(pta)。凝集素是一类具有特异糖结合活性的蛋白，对蚜虫等同翅目害虫有很强的抗杀作用。Stoger等(Stoger E，Williams S，Christou P，Down R E，Gatehouse J A.Expression of the insecticidal lectin from snowdrop (Galanthus nivalis agglutinin；GNA)in transgenic wheat plants：effects  on predation by the grain aphid Sitobion avenae.Molecular Breeding，1999，5：65-73.)将韧皮部特异启动子调控下的gna导入小麦，发现转基因株系对小麦长管蚜有抗性，目的基因表达量高于0.04％的植株可以显著降低蚜虫繁殖率，但不影响蚜虫存活率。Yu等(Yu Y，Wei Z.Increased oriental armyworm and aphid resistance in transgenic wheat stably expressing Bacillus thuringiensis(Bt)endotoxin and Pinellia ternate agglutinin(PTA).Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2008，94(1)：33-44.)构建了cry Ia和pta双元表达载体，通过农杆菌介导法转入小麦，对2个转基因小麦株系进行抗虫鉴定，蚜虫的存活率分别为对照的54％和78％，粘虫的存活率分别为对照的65％和73％。但根据Birch等(Birch A N E，Geoghegan I E，Majerus M E N，Mcnicol J W，Hackett C，Gatehouse A M R，Gatehouse J A.Tri-trophic interaction involving pest aphids，predatory 2-spot ladybirds and transgenic potatoes expressing snowdrop lectin for aphid resistance.Molecular Breeding，1999，5：75-83.)的报道，二星瓢虫取食转gna马铃薯上的蚜虫后，其产卵力、卵的生存力和寿命明显降低，因而，转gna植物对生态环境的影响引起了人们的关注。挖掘利用新的更加安全有效的抗蚜基因将是小麦抗虫转基因育种的重要课题(喻修道，徐兆师，陈明，李连城，马有志(2010).小麦转基因技术研究及其应用.中国农业科学，43(8)，1539-1553.)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种培育抗蚜虫转基因小麦的方法。

本发明所提供的培育抗蚜虫转基因小麦的方法，包括如下步骤：将如下1)或2)所示基因表达盒导入出发小麦中，得到抗蚜虫转基因小麦：

1)由如下元件依次连接而成：启动子、增强子、kozak片段、SEQ ID NO：3所示蛋白的编码基因、终止子；

2)由如下元件依次连接而成：启动子、增强子、kozak片段、水稻Rubisco小亚基叶绿体导肽的编码序列、SEQ ID NO：3所示蛋白的编码基因、终止子。

上述方法中，所述1)所示基因表达盒为SEQ ID NO：1中自5′末端起第1-3828位核苷酸所示基因表达盒；

上述方法中，所述2)所示基因表达盒为SEQ ID NO：2中自5′末端起第1-3981位核苷酸所示基因表达盒。

上述方法中，所述基因表达盒是通过如下I或II所述重组载体导入所述出发小麦中的；

I、为如下I-1或I-2所示：

I-1、将SEQ ID NO：1中自5′末端起第1-3828位核苷酸所示基因表达盒插入载体pG4AB的多克隆位点，得到的重组载体；

I-2、将SEQ ID NO：2中自5′末端起第1-3981位核苷酸所示基因表达盒插入载体pG4AB的多克隆位点，得到的重组载体；

II、为如下II-1或II-2所示：

II-1、将SEQ ID NO：1中自5′末端起第1-3828位核苷酸所示基因表达盒插入载体pG∏UB中，得到的重组载体；

II-2、将SEQ ID NO：2中自5′末端起第1-3981位核苷酸所示基因表达盒插入载体pG∏UB中，得到的重组载体。

上述方法中，所述蚜虫为麦长管蚜(Sitobion avenae)；所述出发小麦为扬麦12或科农199。

本发明的另一个目的是提供一种基因表达盒。

本发明所提供的基因表达盒，为如下1)或2)所示：

1)由如下元件依次连接而成：启动子、增强子、kozak片段、SEQ ID NO：3所示蛋白的编码基因、终止子；

2)由如下元件依次连接而成：启动子、增强子、kozak片段、水稻Rubisco小亚基叶绿体导肽的编码基因、SEQ ID NO：3所示蛋白的编码基因、终止子。

上述基因表达盒中，所述1)所示基因表达盒为SEQ ID NO：1中自5′末端起第1-3828位核苷酸所示基因表达盒；

上述基因表达盒中，所述2)所示基因表达盒为SEQ ID NO：2中自5′末端起第1-3981位核苷酸所示基因表达盒。

含有上述任一所述基因表达盒的重组载体也属于本发明的保护范围。含有上述任一所述基因表达盒的重组菌也属于本发明的保护范围。含有上述任一所述基因表达盒的重组细胞也属于本发明的保护范围。

所述重组载体按照包括如下步骤的方法得到：将上述任一所述基因表达盒插入载体pG4AB的多克隆位点，得到所述重组载体。

所述重组载体还可按照包括如下步骤的方法得到：将权利要求5或6所述基因表达盒插入载体pG∏UB中，得到所述重组载体。

上述任一所述基因表达盒在培育抗蚜虫转基因小麦中的应用也属于本发明的保护范围。上述任一所述重组载体在培育抗蚜虫转基因小麦中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述蚜虫为麦长管蚜(Sitobion avenae)；所述小麦为扬麦12或科农199。

本发明载体中含有表达盒rbcS-Ω序列-kozak-MhβFS-poly(A)-Nos或表达盒rbcS-Ω序列-kozak-CTP-MhβFS-poly(A)-Nos。其中，rbcS为水稻核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基基因(rbcS)启动子，CTP为水稻rbcS基因的叶绿体转导肽；为了能够有效的表达MhβFS1和/或MhβFS1+CTP，在目的基因前添加了Ω和kozak序列，在目的基因后添加了polyA。所述kozak序列是指包括MhβFS1和/或MhβFS1+CTP起始密码子在内的‘GCCATGG’，Ω序列在MhβFS1和/或MhβFS1+CTP基因上游，中间间隔2bp。kozak序列和Ω序列能显著提高外源基因的表达量。

实验证明，转入本发明载体的转基因小麦的抗虫性能明显高于野生型小麦，因此，本发明载体在植物的遗传育种领域具有重要意义。

附图说明

图1为基因枪法转基因小麦的表达载体构建流程。

图2为基因枪法转基因小麦的表达载体鉴定。

图3为农杆菌介导法转基因小麦表达载体的构建流程。

图4为农杆菌介导法转基因小麦表达载体的鉴定。

图5为转基因小麦的获得。

图6为转基因小麦植株的PCR检测。

图7为转基因小麦植株的Southern杂交。

图8为转基因小麦植株的蚜虫鉴定。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

SEQ ID NO：1所示(即rbcS-Ω序列-kozak-MhβFS-poly(A)-Nos)，其中，自SEQ ID NO：1的5′末端起，第1-1619位核苷酸为水稻Rubisco小亚基启动子rbcSPromotor，第1621-1702位核苷酸为Ω序列，第1705-1711位核苷酸为kozak，第1708-3360位核苷酸为MhβFS，第3361-3575位核苷酸为poly(A)，第3576-3828位核苷酸为Nos。

SEQ ID NO：2所示(即rbcS-Ω序列-kozak-CTP-MhβFS-poly(A)-Nos)，其中，自SEQ ID NO：2的5′末端起，第1-1619位核苷酸为水稻Rubisco小亚基启动子rbcS Promotor，第1621-1702位核苷酸为Ω序列，第1705-1711位核苷酸为kozak，第1708-1854位核苷酸为CTP，1856-1860位核苷酸为所加Spe I酶切位点，第1861-3513位核苷酸为MhβFS，第3514-3728位核苷酸为poly(A)，第3729-3981位核苷酸为Nos。

实施例1、MhβFS基因的cDNA克隆制备

亚洲薄荷(Mentha asiatica)购自北京汤河香草艺术庄园。平末端载体pEASY-Blunt购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CB101。

提取亚洲薄荷的总RNA，反转录成cDNA，以该cDNA为模板，用引物对MhβFSF1/MhβFS R1进行PCR扩增，得到的PCR产物即为MhβFS基因。

MhβFS F1：5’-ATGGCTACAAACGGCGTC-3’

MhβFS R1：5’-TCAAAAGACTATGGCATCAACA-3’。

扩增体系如下：ddH₂O 31.5μl，5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺plus)10.0μl，dNTPMixture(2.5mM each)4.0μl，MhβFS F1(10μM)1.5μl，MhβFS R1(10μM)1.5μl，反转录产物1.0μl，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl，Total50.0μl。

PrimeSTAR高保真酶扩增得到的是平末端片段，因此回收的PCR产物可与平末端载体pEASY-Blunt连接，得到重组载体pEASY-Blunt/MhβFS。将重组载体转入大肠杆菌DH5a感受态细胞，Amp抗性筛选培养，挑取阳性单克隆，将阳性单克隆进行液体培养，提取质粒，进行测序，测得在载体pEASY-Blunt中插入了SEQ ID NO：1的自5′末端起第1708-3360位核苷酸所示基因，即为MhβFS基因。证明构建的载体pEASY-Blunt/MhβFS正确。

实施例2、基因枪法转基因小麦

一、基因枪法转基因小麦的表达载体构建

载体MhβFS 1-pG4AB和载体MhβFS 1+CTP-pG4AB的构建流程如图1所示。

(一)载体MhβFS 1-pG4AB的制备

水稻品种为日本晴，购自中国农业科学院作物科学研究所国家农作物种质保存中心。

A.水稻Rubisco小亚基启动子(rbcS Promoter)制备

提取水稻叶片DNA，用引物对rbcSP F1/rbcSP R1进行PCR扩增，得到Rubisco小亚基启动子(rbcS Promoter)。

rbcSP F1：5’-TCGGGTCGAGGTGAACTTTA-3’；

rbcSP R1：5’-AGATGCACTGCTCTGCACAC-3’；

将rbcS Promoter与T-easy载体连接，将重组载体进行测序验证，结果得到正确的重组载体，记作T-easy/rbcSP，该载体中含有SEQ ID NO：1的自5′末端起第1-1619位核苷酸所示基因，即为Rubisco小亚基基因启动子(rbcS Promoter)。Rubisco小亚基基因启动子(rbcS Promoter)的电泳图如图2A所示。

B.R-pG4AB载体构建：用水稻rbcS Promoter置换pG4AB上的35S CaMV启动子。

pG4AB为表达载体提供Ω序列、kozak序列、poly(A)和Nos序列。pG4AB在文献“毛立群，郭三堆.1996.Ω序列和3’poly(A)序列长度与基因表达效率的关系.植物学报，1998，40(7)：1-3”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

具体步骤如下：

1)pG4AB载体用BamH I酶切，酶切后纯化；

2)用Klenow Fragment填平末端，具体步骤反应体系如下：

Reaction Buffer     5μl

dNTP(2.5mM)         2μl

Klenow Fragment     1μl

BamH I酶切后的质粒  42μl

37℃孵育20min，70℃孵育10min使酶失活。

3)以重组载体T-easy/rbcSP为模板，用引物对rbcSP F2/rbcSP R2进行PCR扩增；

rbcSP F2：5’-GGGaagcttTCGGGTCGAGGTGAACTTTA-3’(5’端加酶切位点Hind III)

rbcSP R2：5’-AGATGCACTGCTCTGCACAC-3’。

4)将用BamH I酶切后填平末端的pG4AB载体用Hind III半酶切(半酶切条件：37℃10min)，回收载体大片段；将步骤3)的PCR扩增产物用Hind III酶切，回收酶切后基因片段；将回收的载体大片段与酶切后基因片段连接，得到重组载体，记作R-pG4AB；将重组载体进行测序验证，结果在载体pG4AB的Hind III和BamH I之间插入了SEQ ID NO：1的自5′末端起第1-1620位核苷酸所示基因，证明该重组载体正确，记作R-pG4AB载体。用水稻rbcS置换了pG4AB上的35S CaMV启动子。

酶切验证：将重组载体R-pG4AB用Hind III酶进行酶切验证，以pG4AB为对照(CK)；结果如图2C所示，重组载体R-pG4AB得到3.1Kb和3.8Kb的片段，对照组得到3.1Kb和2.7Kb的片段。

C.MhβFS1-pG4AB构建

以重组载体pEASY-Blunt/MhβFS为模板，用引物对MhβFS F6/MhβFS R6进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，将PCR扩增产物用Nsi I和Sal I双酶切，回收酶切后的PCR产物；将R-pG4AB载体用Pst I和Xho I双酶切，回收载体大片段；将回收酶切后的PCR产物与回收的载体大片段连接，得到重组载体，记作MhβFS1-pG4AB；

将重组载体用引物对MhβFS F6/MhβFS R6进行PCR验证，扩增结果如图2E所示。

MhβFS F6：5’-CCAatgcatATGGCTACAAACGGCGTC-3’(加酶切位点Nsi I)

MhβFS R6：5’-GCGCgtcgacTCAAAAGACTATGGCATCAACA-3’(加酶切位点Sal I)。

将MhβFS1-pG4AB进行测序验证，结果：在载体pG4AB的两个Hind III酶切位点之间的基因片段如SEQ ID NO：1(即rbcS-Ω序列-kozak-MhβFS-poly(A)-Nos)所示，SEQ ID NO：1中，第1-1619位核苷酸为rbcS Promotor，第1621-1702位核苷酸为Ω序列，第1705-1711位核苷酸为kozak，第1708-3360位核苷酸为MhβFS，第3361-3575位核苷酸为poly(A)，第3576-3828位核苷酸为Nos。

(二)载体MhβFS 1+CTP-pG4AB的制备

1、提取水稻叶片DNA，用引物对rbcSC F1/rbcSC R1进行PCR扩增，得到水稻Rubisco小亚基叶绿体转导肽(CTP)的编码基因。

rbcSC F1：5’-ATGGCCCCCTCCGTGATGG-3’

rbcSC R1：5’-CTGCATGCACCTGATCCTGC-3’

将水稻Rubisco小亚基叶绿体转导肽(CTP)的编码基因与pEASY-Blunt载体连接，将重组载体进行测序验证，结果得到正确的重组载体，记作pEASY-Blunt/CTP，该载体中含有SEQ ID NO：2中第1708-1854位核苷酸所示，即为水稻Rubisco小亚基叶绿体转导肽(CTP)的序列。CTP的凝胶电泳图如图2B所示。

2、MhβFS1+CTP表达盒扩增

1)以pEASY-Blunt/CTP为模板，用引物对rbcSC F2/rbcSC R2进行PCR扩增，用高保真酶扩增，得到CTP1；

rbcSC F2：5’-ATGGCCCCCTCCGTGATGG-3’

rbcSC R2：5’-AGactagtCTGCATGCACCTGATCCTGC-3’(加上Spe I酶切位点)

2)以重组载体pEASY-Blunt/MhβFS为模板，用引物对MhβFS F5/MhβFS R5进行PCR扩增，用高保真酶扩增，得到MhβFS1；

MhβFS F5：5’-CAactagtATGGCTACAAACGGCGTC-3’(加上Spe I酶切位点)

MhβFS R5：5’-TCAAAAGACTATGGCATCAACA-3’

3)将CTP1用Spe I酶切，回收酶切后的CTP1；将MhβFS1用Spe I酶切，回收酶切后的MhβFS1；将酶切后的CTP1和酶切后的MhβFS1连接，得到MhβFS1和CTP1的连接产物；

4)以MhβFS1和CTP1的连接产物为模板，用引物对MhβFS+CTPF1/MhβFS+CTPR1进行扩增MhβFS+CTP，得到的PCR扩增产物即为MhβFS1+CTP融合片段。

MhβFS+CTP F1：5-CCCatgcatATGGCCCCCTCCGTGATGG-3(加酶切位点Nsi I)

MhβFS+CTP R1：5-GCGCgtcgacTCAAAAGACTATGGCATCAACAAAGAG-3(加酶切位点SalI)。

CTP-MhβFS 1的凝胶电泳图如图2D所示。

3、MhβFS 1+CTP-pG4AB构建

将MhβFS1+CTP融合片段用Nsi I和Sal I双酶切，回收酶切后的PCR产物；将R-pG4AB载体用Pst I和Xho I双酶切，回收载体大片段；将回收酶切后的PCR产物与回收的载体大片段连接，得到重组载体，记作MhβFS 1+CTP-pG4AB；

将重组载体用引物对MhβFS+CTP F1/MhβFS+CTP R1进行PCR验证，扩增结果如图2E所示。

MhβFS 1+CTP-pG4AB进行测序验证，结果：在载体pG4AB的Hind III和Hind III之间的基因片段如SEQ ID NO：2所示(即rbcS-Ω序列-kozak-CTP-MhβFS-poly(A)-Nos)，其中，自SEQ ID NO：2的5′末端起，第1-1619位核苷酸为rbcS，第1621-1702位核苷酸为Ω序列，第1705-1711位核苷酸为kozak，第1708-1854位核苷酸为CTP，1855-1860位核苷酸为所加Spe I酶切位点，第1861-3513位核苷酸为MhβFS，第3514-3728位核苷酸为poly(A)，第3729-3981位核苷酸为Nos。

二、小麦基因枪介导的遗传转化

扬麦12在文献“刘永伟，徐兆师，杜丽璞，徐惠君，李连城，马有志，陈明.病毒复制酶基因Nib8和ERF转录因子W17基因枪法共转化小麦.作物学报，2007，33(9)：1548-1552.”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

pAHC20在文献“徐惠君，庞俊兰，叶兴国，杜丽璞，李连城，辛志勇，马有志，陈剑平，陈炯，程顺和，吴宏亚.基因枪介导法向小麦导入黄花叶病毒复制酶基因的研究.作物学报，2001，27(6)：688-693”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

(一)方法

A.外植体和靶材料

取授粉后14天左右的扬麦12幼胚为外植体，接种于诱导培养基(MS+1mg/L VB₁+150mg/L ASP+2mg/L 2，4-D)，22-25℃条件下暗培养3-7天，得到幼胚愈伤组织。

B.基因枪法共转化及转化体筛选

采用BIO-RAD公司的PDS-1000/He基因枪进行轰击(Psi1100，27.5cm Hg柱)，金粉、质粒(MhβFS1+CTP-R-pG4AB和pAHC20)浓度分别为45μg/枪和1μg/枪，轰击后的愈伤组织转移到新的诱导培养基上培养2-3周，培养条件为22-25℃、黑暗。

再生、筛选和壮苗等方法除培养基中不含150mg/lTimentin外，其余均与下面农杆菌转化中所述相同。

(二)鉴定

1、T₀、T₁代转基因小麦的PCR检测

鉴定引物为MhβFS-J F1/MhβFS-J R1。预期产物长度为817bp。

MhβFS-J F1：5’-GCTCTTCGTTTCCGTTTGCTC-3’

MhβFS-J R1：5’-GCTCCTCATTAAATGCCCTTGC-3’

2、T₂代转基因小麦PCR检测

检测采用的是巢式PCR，先用MhβFS-J F1/MhβFS-J R1扩增，将PCR产物稀释100倍，取1μl为模板，用MhβFS-J F2/MhβFS-J R2进行第二轮扩增，第二轮PCR扩增的预期产物长度为329bp；

MhβFS-J F2：5’-CGAGTCGTGGAGGCTTATGT-3’

MhβFS-J R2：5’-GCCCTTGCCAGTTGTTTCA-3’

3、T₀代转基因小麦的Southern杂交

提取T₀代转基因小麦株系的DNA，纯化后用Xho I酶切，转膜、标记探针和杂交。

以载体MhβFS 1-pG4AB为模板，利用引物MhβFS-J F2和MhβFS-J R2扩增，PCR产物即为探针；探针标记使用TaKaRa Random primer DNA Labeling Kit。

本实验基因枪法共获得547棵再生植株，

为了检测目标基因MhβFS1或MhβFS1+CTP是否转入到小麦基因组中，根据MhβFS1基因序列设计引物，以T₀、T₁再生植株叶片的基因组DNA为模板进行PCR检测(图6A为T₀代检测结果；图6B为T₁代检测结果)，阳性植株中扩增出了一特异性片段，在800bp左右，符合预期大小(预期产物长度为817bp)，而对照植株(小麦受体品种，CK)中没有扩增出相应片段；T₀植株共检测到12个阳性株系，11、44、50、215、249、274、538等7个株系为MhβFS1基因枪法获得的转基因小麦株系；C321、C322、C360、C428、C491等5个为MhβFS1+CTP基因枪法获得的转基因小麦株系；将部分T₁转基因植株种于温室加代，获得T₂转基因植株，T₂转基因植株检测采用的是巢式PCR扩增，两轮PCR之后扩增出330bp左右的特异性片段，阴性对照植株(小麦受体品种)中没有扩增出相应片段(图6C)，随后获得转基因小麦T₃种子。Southern杂交显示目的基因已经整合到小麦基因组中。

实施例2、农杆菌法转基因小麦

载体MhβFS1-pG∏UB和载体MhβFS1+CTP-pG∏UB的构建流程如图3所示。

载体pG∏UB在文献“Hellens RP，Edwards EA，Leyland NR，Bean S，MullineauxPM.2000.pGreen：a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.Plant Molecular Biology 42，819-832”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。pG∏UB提供表达载体由Ubiqutin启动子调控的Bar盒子。

pENTR/D-TOPO载体购自Invitrogen公司，产品目录号为K2420-20。

一、农杆菌法转基因小麦表达载体的构建

本载体构建过程中，在正向引物的5’端加上CACC，扩增得到整个表达盒片段，这样片段的5’端与入门载体pENTR/D-TOPO的突出末端GTGG序列互补，在拓扑异构酶I的作用下使基因以正确的方向插入到pENTR/D-TOPO载体的两个attL重组位点之间，形成带有两个attL重组位点的入门克隆；提取构建正确的入门克隆质粒，BspH I酶切后，按比例与目的载体pG∏UB混合，在LR Clonase ∏ Enzyme Mix的作用下，入门克隆载体的两个attL重组位点与pG∏UB的两个attR位点进行LR位点特异性重组反应，得到目的重组载体。

(一)MhβFS1-pG∏UB构建

1、入门克隆载体构建

以重组质粒MhβFS 1-pG4AB为模板，用引物对V-G F/V-G R进行PCR扩增。扩增片段的凝胶电泳如图4中A泳道1所示。

V-G F：5-CACCTCGGGTCGAGGTGAACTTTA-3

V-G R：5-GATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3。

pENTR/D-TOPO载体1μl，Salt Solution 1μl，PCR扩增产物X μl，ddH₂O补充到6μl。

将PCR扩增产物与pENTR/D-TOPO载体按照摩尔比1∶1比例混合，室温下连接5min，将连接产物热激转化大肠杆菌DH5α后涂布在含有Kan(100mg/L)的平板上筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，提取质粒并测序，将测序正确的重组载体即为入门克隆载体，记作MhβFS1-pENTRTM/D-TOPO。

2、MhβFS1-pG∏UB载体构建

由于入门克隆载体MhβFS1-pENTRTM/D-TOP和pG∏UB载体均为Kan抗性，故在重组反应前先将入门克隆载体用BspH I酶切，反应体系如下：10×NEB Buffer 4 10μl，BspH I 3μl，MhβFS1-pENTRTM/D-TOPO入门克隆载体50μl，ddH₂O 37μl，Total 100μl。

37℃酶切过夜，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切情况，结果如图4中B泳道2所示，并切胶回收目的片断。

参照Invitrogen公司Gateway LR Clonase ∏ Enzyme Mix说明书，在0.5ml EP管中依次加入如下组分进行LR重组反应：酶切后的入门克隆载体2μl，pG∏UB 2μl，TE buffer(pH 8.0)4μl，LR Clonase ∏ Enzyme Mix 2μl。

短暂混匀后25℃孵育过夜，待反应完全后加入1μl蛋白酶K于37℃10min终止反应。取2μl反应液热激转化大肠杆菌DH5α，菌液涂布在含有Kan(100mg/l)的平板上筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，提取质粒并测序。测序结果表明，将SEQ IDNO：1中第1-3828所示DNA片段(rbcS-Ω序列-kozak-MhβFS-poly(A)-Nos片段)插在了pG∏UB的attR1和attR2之间，表明得到的重组载体正确，记作MhβFS1-pG∏UB。

MhβFS1-pG∏UB的菌液PCR鉴定结果如图4中C所示。(泳道1-4为载体pG∏UB引物扩增结果，泳道5-8为MhβFS1鉴定结果)。

鉴定载体引物为pG∏UB F/pG∏UB R。鉴定MhβFS1引物为MhβFS F3/MhβFS R3。

pG∏UB F：5’-GATTCCTTTCCCACCGCTCCT-3’；pG∏UB R：5’-GGCGTTGCGTGCCTTCCAG-3’。

MhβFS F3：5-ATGGCTACAAACGGCGTC-3

MhβFS R3：5-TCAAAAGACTATGGCATCAACA-3。

(二)MhβFS1+CTP-pG∏UB构建

1、入门克隆载体构建

参照Invitrogen公司Gateway pENTR Directional TOPO Cloning Kits说明书对引物的要求，设计了引物对V-G F/V-G R。以重组质粒MhβFS 1+CTP-pG4AB为模板，用引物对V-G F/V-G R进行PCR扩增。扩增片段的凝胶电泳如图4中A泳道2所示。

V-G F：5-CACCTCGGGTCGAGGTGAACTTTA-3

V-G R：5-GATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3。

将PCR扩增产物与pENTR/D-TOPO载体按照摩尔比1∶1比例混合，室温下连接5min，将连接产物热激转化大肠杆菌DH5α后涂布在含有Kan(100mg/L)的平板上筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，提取质粒并测序，将测序正确的重组载体即为入门克隆载体，记作MhβFS1+CTP-pENTRTM/D-TOPO。

2、MhβFS1+CTP-pG∏UB载体构建

由于入门克隆载体MhβFS1+CTP-pENTRTM/D-TOP和pG∏UB载体均为Kan抗性，故在重组反应前先将入门克隆载体用BspH I酶切，反应体系如下：10×NEB Buffer 410μl，BspH I 3μl，MhβFS1+CTP-pENTRTM/D-TOPO入门克隆载体50μl，ddH₂O 37μl，Total 100μl。

37℃酶切过夜，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切情况，结果如图4中B泳道2所示，并切胶回收目的片断。

参照Invitrogen公司Gateway LR Clonase ∏ Enzyme Mix说明书，在0.5ml EP管中依次加入如下组分进行LR重组反应：酶切后的入门克隆载体2μl，pG∏UB 2μl，TE buffer(pH 8.0)4μl，LR Clonase ∏ Enzyme Mix 2μl。

短暂混匀后25℃孵育过夜，待反应完全后加入1μl蛋白酶K于37℃10min终止反应。取2μl反应液热激转化大肠杆菌DH5α，菌液涂布在含有Kan(100mg/l)的平板上筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，提取质粒并测序。测序结果表明，将SEQ IDNO：2中第1-3981所示DNA片段(rbcS-Ω序列-kozak-CTP-MhβFS1-poly(A)-Nos片段)插在了pG∏UB的attR1和attR2之间，表明得到的重组载体正确，记作MhβFS1+CTP-pG∏UB。

MhβFS1+CTP-pG∏UB的菌液PCR鉴定结果如图4中D所示。(泳道1-4为pG∏UB载体引物扩增结果，泳道5-8为CTP-MhβFS1鉴定结果)。

鉴定载体引物为pG∏UB F/pG∏UB R。鉴定CTP-MhβFS1引物为MhβFS+CTP F2/MhβFS+CTP R2。

pG∏UB F：5’-GATTCCTTTCCCACCGCTCCT-3’；pG∏UB R：5’-GGCGTTGCGTGCCTTCCAG-3’。

MhβFS+CTP F2：5-ATGGCCCCCTCCGTGATGG-3

MhβFS+CTP R2：5-TCAAAAGACTATGGCATCAACA-3。

二、农杆菌转化

科农199在文献“李俊明，张相岐，张爱民，王志国，安调过，纪军，王静.高产广适小麦新品种-科农199.麦类作物学报，2007，39(2)：368-368”中公开过，公众可从国家种质资源库获得，也可中国农业科学院作物科学研究所获得。

根癌农杆菌菌株AGL1在文献“Lazo GR，Stein PA，Ludwig RA.1991.A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium.Biotechnology9，963-967.”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

载体pAL154和载体pGreen-UB-UG在文献“Hellens RP，Edwards EA，Leyland NR，Bean S，Mullineaux PM.Pgreen：A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.Plant Mol Biol 2000，42：819-832。”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

pAL154和pGreen-UB-UG，是由JIC基于pSoup/pGreen双元载体系统发展而来。pAL154作为辅助质粒，除具有促进pGreen复制和扩增功能外，还含有额外的15-kb的Komari片段，大大增强和提高了菌株侵染和转移Ti质粒的效率。

(一)方法

该转化方法及所用的培养基等与中国专利(申请号200810116723.2，公开号CN101307324A)中所述方法相同。

1、重组农杆菌的构建

选用农杆菌菌株为：根癌农杆菌菌株AGL1。

载体：载体pAL154和载体pGreen-UB-UG。

将辅助载体pAL154和重组载体MhβFS1-pG∏UB(或载体pAL154和重组载体MhβFS1+CTP-pG∏UB)通过电击法导入农杆菌AGL1，电击参数按Biorad公司电击仪使用指南进行。

阳性重组农杆菌的筛选：将重组菌在含有200ug/ml羧苄青霉素和100ug/ml的卡那霉素的培养基中培养三天，筛选得到含有载体pAL154和MhβFS1-pG∏UB的重组农杆菌，或含有载体pAL154和MhβFS1+CTP-pG∏UB的重组农杆菌。

2、重组菌的培养及接种菌液的制备：

将重组农杆菌接种于MG/L培养基，进行培养，至其对数生长期；离心菌液，弃上清，收集菌体，然后用不含植物凝胶的接种培养基重悬菌体，使菌液OD₆₀₀值为1-1.5。

3、受体材料和组织培养

将中国小麦品种科农199种植在可控温室条件下，条件为18-20℃/10-14℃(白天/黑夜)，光照为16/8小时(光/暗)，400W钠灯，光强为750μEs^-1m^-2，湿度为50-70％。取授粉后12-14天的未成熟种子(其中含有心型胚)，在70％乙醇中浸泡30-60s，然后用10％次氯酸钠Bleach(Lever)消毒15min，再用无菌水冲洗3-5次，在无菌条件下分离幼胚，幼胚大小一般为0.8-1.5mm。

4、接种

将步骤3获得的新鲜剥离的幼胚盾片向上接种在含有植物凝胶的接种培养基上，然后向其中倒入步骤2获得的接种菌液4ml，使幼胚浸泡在步骤2获得的接种菌液中，同时向其中加入60ul 1％(体积百分比)表面活性剂(Silwet-77)(Lehle seeds，USA)至其终浓度为0.015％(体积百分含量)，然后在黑暗条件下浸泡1h。

5、共培养：共培养：将侵染后的外植体转移到共培养培养基上，然后在22-25℃条件下暗培养3天。6、诱导培养：将共培养3天后的外植体转移到含有150mg/LTimentin(Smithkline Beecham，UK；Ticarcillin：clavulanic acid 15∶1)的诱导培养基中，然后在22-25℃暗培养3周，形成愈伤组织(图5A)。7、再生培养：将诱导培养形成的愈伤组织转移到含有150mg/lTimentin的再生培养基(RDZ)中，然后在24-25℃、光照强度750μEs^-1m^-2、光照时间16h/d的条件下共培养3-4周。8、筛选培养与壮苗培养：一次筛选：将再生苗转移到含有150mg/lTimentin的筛选培养基(RPPT)中，在22-25℃、光照强度750μEs^-1m^-2、光照时间16h/d的条件下培养3-4周，筛选得到存活苗。筛选培养基是在R培养基的基础上添加了Glufosinate ammonium(PPT)，其浓度从2.5mg/l。二次筛选：将一次筛选得到的存活苗再进行一次在4mg/lPPT培养基筛选，方法同一次筛选相同(图5B)。壮苗培养：将经过二筛的存活植株，可以转移到R培养基上进行壮苗培养1-2周(图5C)。9、移栽：将经过两轮PPT筛选仍然存活的植株，壮苗培养1-2周后移栽到温室土钵中(图5D)。

(二)鉴定

1、T₀、T₁代转基因小麦的PCR检测

鉴定引物为MhβFS-J F1/MhβFS-J R1。预期产物长度为817bp。

MhβFS-J F1：5’-GCTCTTCGTTTCCGTTTGCTC-3’

MhβFS-J R1：5’-GCTCCTCATTAAATGCCCTTGC-3’。

2、T₂代转基因小麦PCR检测

检测采用的是巢式PCR，先用MhβFS-J F1/MhβFS-J R1扩增，将PCR产物稀释100倍，取1μl为模板，用MhβFS-J F2/MhβFS-J R2进行第二轮扩增，第二轮PCR扩增的预期产物长度为330bp；

MhβFS-J F2：5’-CGAGTCGTGGAGGCTTATGT-3’

MhβFS-J R2：5’-GCCCTTGCCAGTTGTTTCA-3’。

3、T₀代转基因小麦的Southern杂交

提取T₀代转基因小麦株系的DNA，纯化后用Xho I酶切，转膜、标记探针和杂交。

以载体MhβFS 1-pG4AB为模板，利用引物MhβFS F2和MhβFS R2扩增，PCR产物即为探针；探针标记使用TaKaRa Random primer DNA Labeling Kit。

农杆菌介导法获得116棵再生植株。为了检测目标基因MhβFS1是否转入到小麦基因组中，根据MhβFS1基因序列设计引物，以T₀、T₁再生植株叶片的基因组DNA为模板进行PCR检测，阳性植株中扩增出了一特异性片段，在800bp左右，符合预期大小(预期产物长度为817bp)，而对照植株(小麦受体品种，CK)中没有扩增出相应片段；T₀植株共检测到四个阳性株系，编号分别为BH-5、BH-7、BH-14、BH-19。将部分T₁转基因植株种于温室加代，获得T₂转基因植株，T₂转基因植株检测采用的是巢式PCR扩增，两轮PCR之后扩增出330bp左右的特异性片段，阴性对照植株(小麦受体品种)中没有扩增出相应片段，随后获得转基因小麦T₃种子。Southern杂交显示目的基因已经整合到小麦基因组中(图7)。(CK⁺表示Xho I酶切的MhβFS 1-pG4AB质粒，CK^-表示科农199，1表示BH-7，2表示BH-14，3表示BH-19)。

三、转基因小麦的抗蚜虫鉴定

麦长管蚜(Sitobion avenae)(Fabricius)在文献“王万磊，刘勇，纪祥龙，王光，周海波.小麦间作大蒜或油菜对麦长管蚜及其主要天敌种群动态的影响.应用生态学报，2008，19(6)：1331-1336”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

1.共试虫源：麦长管蚜Sitobion avenae(Fabricius)饲养条件：温度18-20℃；光照16小时；相对湿度60±10％。

2.抗蚜虫实验步骤

采用多目标综合判别法进行室内抗蚜虫鉴定。调查方法：选择长势一致的小麦叶片，用正立方体生态盒(2.5*2.5*2.5cm)将其夹住，接24h内的初产若蚜，接虫量为10只/株；接虫后的小麦在可控温室条件下，条件为18-20℃/10-14℃(白天/黑夜)，光照为16/8小时(光/暗)，400W钠灯，光强为750μEs^-1m^-2，湿度为50-70％条件下培养，每天观察两次，记载麦长管蚜的生长发育情况。每盆材料重复2-10次。期间随时移去蚜蜕、仔蚜和死蚜，直到成蚜死亡为止。根据调查结果，计算如下三个生物学参数：麦长管蚜若虫的发育历期(X1)、麦长管蚜若虫的世代历期(X2)和麦长管蚜若虫的产仔量(X3)。

发育历期定义为：昆虫各虫态在一定的温度条件下完成其发育过程所需要的天数。

世代历期定义为：昆虫的卵(或幼虫、若虫)从离开母体到成虫性成熟产生后代为止的个体发育过程，称为生命周期或1个世代，完成一个世代所需要的时间，称为世代历期。

抗蚜级别的划分：根据调查结果，将发育历期(X1)、世代历期(X2)和产仔量(X3)极差标准化，取其平均值(抗蚜指标(R))作为抗性定级的依据。

公式中各参数意义如下：

i表示第i个生物学参数，

n表示生物学参数的个数，

Xi表示第i个生物学参数(如发育历期)的平均值，

Xi max表示第i个生物学参数(如发育历期)的最大值，

Xi min表示第i个生物学参数(如发育历期)的最小值。

实验中，对于每个材料，重复m次实验，则某个生物学参数(如发育发育历期)具有m个值，其中，最大值为Xi max，最小值为Xi min，平均值为Xi，将Xi、Xi min、Xi max带入上述公式(此时n＝1)，得出每一个材料的值Ri；这个实验有三个参数，每个材料就会得到三个值(R1，R2，R3)，求R1、R2和R3的均值就是某个材料的最终结果R(抗蚜指标)。

根据R值来划分小麦抗蚜虫的类型：其中0为免疫，0.01-0.15为高抗，0.16-0.30为中抗，0.31-0.45为低抗，0.46-0.60为低感，0.61-1.00为中、高感。

同时以野生型扬麦12和野生型科农199为野生型对照。

3.转基因小麦抗蚜鉴定结果

抗虫实验后的小麦表型如图8和表1所示。

表1、抗虫实验结果

注：受体YM12为扬麦12，KN199为科农199；转化方法B为基因枪，A为农杆菌介导；载体名称：1为MhβFS 1-pG4AB，2为MhβFS 1+CTP-pG4AB，3为MhβFS1-pG∏UB，4为MhβFS1+CTP-pG∏UB。

Claims (10)

1.一种培育抗蚜虫转基因小麦的方法，包括如下步骤：将如下1)或2)所示基因表达盒导入出发小麦中，得到抗蚜虫转基因小麦：

1)由如下元件依次连接而成：启动子、增强子、kozak片段、SEQ ID NO：3所示蛋白的编码基因、终止子；

2)由如下元件依次连接而成：启动子、增强子、kozak片段、水稻Rubisco小亚基叶绿体导肽的编码序列、SEQ ID NO：3所示蛋白的编码基因、终止子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述1)所示基因表达盒为SEQ ID NO：1中自5′末端起第1-3828位核苷酸所示基因表达盒；

所述2)所示基因表达盒为SEQ ID NO：2中自5′末端起第1-3981位核苷酸所示基因表达盒。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述基因表达盒是通过如下I或II所述重组载体导入所述出发小麦中的；

I、为如下I-1或I-2所示：

I-1、将SEQ ID NO：1中自5′末端起第1-3828位核苷酸所示基因表达盒插入载体pG4AB的多克隆位点，得到的重组载体；

I-2、将SEQ ID NO：2中自5′末端起第1-3981位核苷酸所示基因表达盒插入载体pG4AB的多克隆位点，得到的重组载体；

II、为如下II-1或II-2所示：

II-1、将SEQ ID NO：1中自5′末端起第1-3828位核苷酸所示基因表达盒插入载体pG∏UB中，得到的重组载体；

II-2、将SEQ ID NO：2中自5′末端起第1-3981位核苷酸所示基因表达盒插入载体pG∏UB中，得到的重组载体。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述蚜虫为麦长管蚜(Sitobion avenae)；所述出发小麦为扬麦12或科农199。

5.一种基因表达盒，为如下1)或2)所示：

1)由如下元件依次连接而成：启动子、增强子、kozak片段、SEQ ID NO：3所示蛋白的编码基因、终止子；

2)由如下元件依次连接而成：启动子、增强子、kozak片段、水稻Rubisco小亚基叶绿体导肽的编码基因、SEQ ID NO：3所示蛋白的编码基因、终止子。

6.根据权利要求5所述的基因表达盒，其特征在于：

所述1)所示基因表达盒为SEQ ID NO：1中自5′末端起第1-3828位核苷酸所示基因表达盒；

所述2)所示基因表达盒为SEQ ID NO：2中自5′末端起第1-3981位核苷酸所示基因表达盒。

7.含有权利要求5或6所述基因表达盒的重组载体、重组菌或重组细胞。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体按照包括如下步骤的方法得到：将权利要求5或6所述基因表达盒插入载体pG4AB的多克隆位点，得到所述重组载体。

9.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体按照包括如下步骤的方法得到：将权利要求5或6所述基因表达盒插入载体pG∏UB中，得到所述重组载体。

10.权利要求5或6所述基因表达盒或权利要求7-9中任一所述重组载体在培育抗蚜虫转基因小麦中的应用；

和/或，所述蚜虫为麦长管蚜(Sitobion avenae)；所述小麦为扬麦12或科农199。

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