CN101704885A - 一种控制水稻抽穗期和籽粒大小的蛋白及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种控制水稻抽穗期和籽粒大小的蛋白及其编码基因。该蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成；(b)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加形成的、并具有与(a)蛋白相同功能的蛋白。本发明可用于培育在短日照下抽穗开花早，并且籽粒大的品种；同时由于其对光照的不敏感性，可用于培育适用性广、生育期短的品种，可以扩大作物的种植范围；此外，利用本发明进行转基因育种可缩短育种周期，育种速度快。

Description

一种控制水稻抽穗期和籽粒大小的蛋白及其编码基因

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种控制水稻抽穗期和籽粒大小的蛋白及其编码基因。

背景技术

生育期和产量是水稻重要的农艺性状，直接影响水稻品种的地区适应性和推广潜力。控制水稻产量的性状较多，例如有效穗、穗长、着粒密度，谷粒大小等。水稻的产量性状一般认为是由大量微效基因协同控制。但近年来，通过QTL和定位克隆的方法，几个控制水稻产量的重要基因相继被克隆。例如GHD7、GW2、DEP1、GS3等。但是它们的遗传机制却并不相同：在水稻中GHD7(Weiya Xue等，Nature Genetics.2008(6).761～767)是控制抽穗基因HD1的同源基因，主要通过调控水稻的抽穗时间影响水稻穗长；GW2(Xian-Jun Song第，NatureGenetics 2008(5)623～630)在水稻中编码一个E3泛素连接酶，主要影响谷粒大小；DEP1(Xianzhong Huang等Nature Genetics Advance OnlinePublication.2009)和GS3(Chuchuan Fan等.Theor Appl Genet.2006，(112)：1164-1171)均编码磷脂酰乙醇胺绑定蛋白，但它们却通过不同的方式影响水稻的产量，DEP1影响穗直立，而GS3影响谷粒大小。因此影响水稻产量的方式是复杂的，不同性状和不同遗传途径都可能影响水稻产量。所以一般不能把穗长的增加，谷粒的变大等同于水稻产量增加，而是看作水稻产量增加的潜力。

水稻的生育期分为营养生长期(从稻种发芽至幼穗分化)、生殖生长期(从幼穗分化到抽穗开花)及成熟期(从抽穗开花到灌浆成熟)三个阶段。其中，成熟期在品种间差异较小，且较稳定。抽穗期指从播种到抽穗的天数，由于水稻从抽穗到成熟品种间差异较大，因此，常用抽穗期的长短来描述生育期的长短。目前几个控制水稻抽穗期的基因已被克隆，例如HD1(Masahiro Yano等.ThePlant Cell，2000.12，2473-2483)，HD3a(Shoko Kojima等.Plant Cell Physiol.2002.43(10)：1096-1105)，OsGI，OsLHY(Ryosuke Hayama等.Nature2003.422：719-722)等等。植物节律基因的保守性，使得双子叶植物拟南芥光周期途径控制开花的基因，在单子叶水稻中几乎都存在同源基因。HD1、HD3a、OsGI、OsLHY分别是拟南芥CO、FT、GI、LHY的同源基因。在拟南芥中，ELF3(Xing Liang Liu等.Plant Cell；2001，13(6)：1294-1304.Karen A.Hicks等.The Plant Cell，2001，13(6)：1281-1292.Michael F Covington等.Plant Cell；2001，13(6)：1305-1315)被认为是一种门控基因，控制光信号输入生物节律钟，促进拟南芥在长日照开花。ELF3的蛋白功能现在仍然不清楚，但它和其它蛋白的相互作用已被大量研究：ELF3可以和PHYB结合影响拟南芥光信号的输入(Xing Liang Liu等.Plant Cell；2001.13(6)1294-1304)，控制开花。最近ELF3被发现可与COP1结合影响GI的稳定性(Jae-Woong Yu等.Molecular Cell.2008(32)，1-14)，从而控制拟南芥开花。

有关水稻与ELF3相似基因尚未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种控制水稻抽穗期和籽粒大小的蛋白。

本发明另一目是提供上述蛋白的编码基因。

本发明还一目的是提供上述蛋白或基因在控制抽穗期和籽粒大小方面的用途。

本发明所提供的控制水稻抽穗期和籽粒大小的蛋白来源于稻属普通栽培稻(Oriza sativa L.)，命名为OsELF3，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成；

(b)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加形成的、并具有与(a)蛋白相同功能的蛋白。

编码上述控制植物抽穗期和籽粒大小相关的蛋白的基因，选自下述(i)、(ii)或(iii)的核苷酸序列：

(i)由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成；

(ii)由与SEQ ID No.2的核苷酸序列具有80％以上同源性的核苷酸序列组成；优选由与SEQ ID No.2的核苷酸序列具有85％或90％以上同源性，且编码与(i)具有相同功能蛋白的核苷酸序列组成。

(iii)在严谨杂交条件下，与(i)或(ii)互补的核苷酸序列。

编码控制植物抽穗期和籽粒大小的蛋白的基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；其中1401～3208、4149～5598为内含子序列，1～1400、3209～4149、5599～6081为外显子序列。

含有上述基因的表达载体、宿主细胞或植物等都属于本发明的保护范围。

所述的植物是指单子叶植物或双子叶植物；如：水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜蓿等。

按照本发明技术领域人员熟知的方法，携带上述控制水稻抽穗期和籽粒大小的基因的表达载体如可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

上述基因在构建到植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前的启动子可以为一般性启动子、增强启动子或诱导型启动子。

为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记GUS基因、荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。

本发明具有的优点和有益效果：(1)利用本发明OsELF3编码基因进行转基因可培育出在短日照下抽穗开花早，并且籽粒大的植物品种；(2)本发明基因对光照不敏感，因而所培育的植物适应性广、生育期短、产量高，可以扩大作物种植范围，提高农作物产量；(3)利用OsELF3的基因进行转基因育种可缩短育种周期，育种速度快。

附图说明

图1为水稻OsELF3基因的PCR扩增产物电泳图谱

其中1为分子量标准，2为扩增产物。

图2为菌落PCR检测HYG潮霉素基因的PCR扩增产物电泳图谱

其中1为重组质粒，2为阳性对照，3为DL2000

图3为pZH01-OsELF3重组质粒的酶切电泳图谱

其中1为Xba I和BamH I双酶切后的Pzh01-EF3质粒

2为分子量标准

图4为pZH01-OsELF3质粒表达载体结构示意图。

图5为用Hpt引物对T₀代进行PCR检测电泳图谱

其中1-14转基因植株；-：阴性对照；+：阳性对照；M：DL2000。

图6为用se引物对T₀代进行PCR检测电泳图谱，其中M：DL2000；+：阳性对照；-：阴性对照；1-10：转基因植株。

图7为含潮霉素培养基上的T1代种子的筛选图，其中1为转基因T0代的种子，2为中花11。

图8为OX-OsELF3 T0代植株谷粒照片，其中左侧3粒为转基因种子，右侧3粒为中花11。

图9为OX-OsELF3 T1定量PCR分析曲线图，其中横坐标表示时间，纵坐标表示表达量。

图10为T1代OX-OsELF3中PCR扩增到全长cDNA序列电泳图。其中1 CK(Oself3突变体)2 OX-OsELF3 3 1kb ladder。

具体实施方式

实施例1 水稻OsELF3基因的克隆

按照如下步骤进行：

(1)目的基因片段的扩增 以水稻品种中花11(中国农业科学院作物科学研究所培育，已经在天津审定推广)的基因组DNA为模板，根据推断性OsELF3基因的上游和下游，利用Primer5.0软件分别设计目标基因的上游和下游引物，并在上、下游引物的5’端分别添加Xba I和BamHI的酶切位点，以及2-3个保护碱基，进行PCR扩增；所述的引物序列为：

Chr3-F：5’GCTCTAGAGTCCGTCTATGGATGAGCATGACTG 3’(SEQ ID No.4)

Chr3-R：5’CGGGATCCCAGCAACGAGTCATCTTGTTGCC 3’(SEQ ID No.5)

PCR反应体系为：中花11基因组DNA 20～100ng，dNTP Mixture(2.5mM)(飞克生物技术有限公司)〕8μL，LA buffer(TaKaRa公司)5μL，Mg2+(TaKaRa公司)4μL，Chr3引物(Invitrogen公司)0.1μM，LaTaq(TaKaRa公司)2.5U；共50μl。PCR反应条件：94℃ 5min；96℃ 10s，68℃ 10min，30个循环；72℃ 10min。电泳检测，结果(见图1)所得PCR扩增产物大小约为5825bp。利用回收试剂盒(TIANGEN公司)进行PCR扩增产物回收(按照产品说明书进行)。

(2)PCR产物的连接：使用宝生物PMD-20测序载体试剂盒进行PCR产物的连接，在16℃连接反应过夜，得连接产物PMD20-OsELF3；其中连接反应体系为：PCR扩增产物0.1pmol～0.3pmol，PMD-20 1μL，加ddH₂O至5μL，再加Solution I 5μL，共10μl。

(3)大肠杆菌转化按照下述步骤进行：

(a)取大肠杆菌感受态细胞DH5α；

(b)按每200μl菌液加100ng已纯化的重组质粒PMD20-T，混匀后放置冰上30min；

(c)在42℃热激90s，迅速取出并立即置于冰上1～2min；

(d)加800μL SOC液体培养基(37℃预热)，在37℃、200rpm条件下培养1hr左右至菌复活；

(e)4000rpm离心10min，去上清液，将剩余的100μL左右菌液混匀；

(f)用涂布棒将大肠杆菌菌液涂于加相应抗生素(Amp)的LB(3+)固体培养基(组成成份及比例：Tryptone 10g/L，Yeast Extract 5g/L，NaCl 10g/L，Agar 15g/L)上，37℃倒置过夜培养，得大肠杆菌抗性单菌落。

(4)阳性克隆的筛选和鉴定

将连接产物转化到大肠杆菌菌株DH5α的感受态细胞中，经预培养后将菌液涂布于含有AMP的LB(3+)平板过夜培养。次日挑取转化后的LB(3+)平板的白斑，到3mL LB液体培养基扩大培养，使用普通质粒小提试剂盒(天根公司)提取质粒(方法参考试剂盒说明书)。将回收质粒在37℃下进行酶切反应4h；酶切反应体系为：20μL，10×K buffer 2μL，BamH I(宝生物产品)1μL，Xba I(宝生物产品)1μL，回收质粒PMD20-EF3 5μL，水11μL。经电泳检测确定含有目的片断的阳性克隆。

使用HPT-1引物(参考潮霉素基因设计)对潮霉素基因进行特异性PCR检测，所述引物为：

HPT1 F：5’TACACAGGCCATCGGTCCAGA 3’(SEQ ID No.6)

HPT1 R：5’TAGGAGGGCGTGGATATGTC 3’(SEQ ID No.7)

将所得PCR产物进行电泳分析，结果(见图2)扩增的目的片段大小为832bp。(这部分检测的是什么片段？或者说所得的是什么片段？)

(5)DNA测序及核苷酸序列分析

将步骤(4)中经酶切检测鉴定过的阳性克隆送上海英俊生物技术有限公司进行测序。结果所得序列见SEQ ID No.1(是全序列还是编码序列？)。

利用NCBI对测序结果进行在线比对分析，结果所克隆的OsELF3与日本晴的核苷酸序列完全一致。

通过双酶切和PCR能同时检测到阳性植株。

实施例2 OsELF3基因表达载体的构建

1试验方法：

1.1植物互补表达载体的构建

(1)OsELF3基因片段和Pzh01载体片段的获得

用Xba I对实施例1所得pMD20-T重组质粒和pZH01(由中科院遗传所提供)在37℃分别进行酶切反应4h(酶切反应体系为：10×M buffer 5μL，Xba I 2.5μL，0.1×BSA 5μL，质粒15μL，加水至50μL)，利用DNA产物纯化试剂盒(天根公司)进行纯化，纯化后再用BamHI在30℃进行酶切反应4h(酶切反应体系为：10×M buffer 5μL，BamHI 2.5μL，质粒30μL，加水至50μL)，电泳后切胶，用胶回收试剂盒(TIANGEN公司)进行回收。

(2)连接转化

将回收片段使用DU800测定浓度，总DNA含量控制在200ng左右.将步骤(1)所回收得到的DNA片段与载体pZH01片段摩尔比控制在大于10∶1，在16℃进行连接反应(连接反应体系：T4连接酶buffer 2.5μL，载体片段3μL，DNA片段5μL，T4酶1μL，ddH2O 13.5μL)，得重组质粒pZH01-OsELF3。

(3)重组质粒的鉴定

挑取转化子并用加入了卡那霉素的LB液体培养基进行液体培养，然后用菌液提取质粒进行酶切和PCR检测，PCR检测结果结果发现扩增出预期片段的很少，假阳性比较多，得到阳性克隆。

将菌落PCR检测为阳性的克隆扩大培养，提取质粒，用Xba I和BamH I进行双酶切鉴定，酶切产物与预期片段大小一致(如图3)，表明OsELF3基因片段已经连在pZH01载体上。将构建好的植物表达载体命名为pZH01-OsELF3。(其表达载体结构见图4)。

实施例3 OsELF3基因的转化

1.1.1供试水稻品种

一个以中花11为受体的T-DNA突变体库中的Oself3突变体，由四川农业大学水稻研究所保存。

1.1.2质粒及菌种

本实验农杆菌(A.tumefaciens)采用EHA105菌株；构建好的植物互补表达载体pZH01-OsELF3。

1.1.3转化材料

所用的转化材料为水稻幼胚诱导形成的胚性愈伤组织。

1.2主要试剂

植物组织培养及细菌培养试剂购自Sigma公司

潮霉素(hyg)购自Roche公司

1.4试验方法：

1.4.1农杆菌感受态的制备

(1)农杆菌感受态细胞的制备从YEP平板上挑取根癌农杆菌EHA105菌株(由中科院遗传所提供)单菌落，接种于5mL含50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，200rpm、28℃培养过夜；取2mL过夜培养液接种于50mL含有利福平的YEP液体培养基中；摇农杆菌至OD600＝0.5，菌液冰浴30min；在4℃、5000rpm下离心10min收集菌体；将菌体悬浮于10mL 0.15mol/L的NaCl中，离心收集菌体；再将菌体悬浮于1mL 20mmol/L CaCl₂溶液中；以0.2mL一份将菌悬浮液分装在1.5mL EP管中，置液氮速冻1min，-70℃冰箱保存。

(2)农杆菌的转化 在室温下融化根癌农杆菌感受细胞，向其中加入1μg载体质粒DNA后混匀，冰浴30min后置液氮中速冻1min；经37℃保温3min后加1mLYEP摇匀，置28℃保温3h；在5000rpm下离心3min，收集菌体；将菌液涂布于含50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP平板上，28℃暗培养2-3d。待转化子菌落长出后挑取单菌落进行鉴定。

1.4.4农杆菌介导法转化水稻

(1)培养基的配制

农杆菌介导法中愈伤的诱导、继代、浸染及筛选所采用的培养基其基本培养基为NB培养；分化和生根所用的培养基其基本培养基为MS培养基。

表1本实验所用的基本培养基MS培养基和N₆培养基

	MS培养基(mg/L)	N6培养基
			NH4NO3	1650
(NH4)2SO4		463
			KNO3	1900	2830
KH2PO4	170	400
			MgSO4·7H2O	370	185
CaCl2·2H2O	440	166
			FeSO4·7H2O	27.85	27.85
Na2-EDTA	37.25	37.25
			MnSO4·4H2O	22.3	4.4
ZnSO4·7H2O	8.6	1.5
			H3BO3	6.2	1.6
KI	0.83	0.8
			NaMoO4·2H2O	0.25
CuSO4·5H2O	0.025
			CoCl2·6H2O	0.025
甘氨酸	2	2
			盐酸硫胺素	0.4	1
盐酸吡哆醇	0.5	0.5
			烟酸	0.5	0.5
肌醇	100	100
			蔗糖	30000	30000

表2用于粳稻转化的培养基

培养基	主要成分
		诱导培养基(NMB)ph＝5.8	N6大量+MS微量+B5有机+水解酪蛋白300mg/L+肌醇100mg/L+脯氨酸500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7.2g/L+2，4-D 2mg/L
AAM液体重悬培养基ph＝5.2	AAM大量+L-脯氨酸0.5g/L+蔗糖36g/L+葡萄糖68.5g/L+AS100μmol/L
		共培养基ph＝5.8	NMB+AS 100μmol/L
筛选培养基1ph＝5.8	NMB+hyg40mg/L+Cef500mg/L
		筛选培养基2ph＝5.8	NMB+hyg50-60mg/L+Cef500mg/L
分化培养基ph＝5.8	MS盐分和维生素+水解酪蛋白300mg/L+脯氨酸500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7.2g/L+6-BA1mg/L+KT1mg/L+NAA0.2mg/L
		生根培养基ph＝5.8	1/2MS+NAA0.5mg/L+Hyg25-30mg/L

(2)愈伤组织的诱导

取开花后15d左右的水稻种子，去壳，用75％酒精消毒3min，然后用无菌水冲洗2次，再用0.1％的升汞消毒18min，接着用无菌水冲洗5次，最后接种到NB培养基上。于28℃培养7d，每隔7-10天继代一次。

(3)愈伤组织的预培养

继代2～3次，然后挑取生长良好、颜色鲜黄的愈伤组织，把它们夹成直径为2～3mm的小颗粒接于预培养基(组成成分与诱导培养基相同)上，28℃暗培养4d。

(4)菌的活化

取用甘油保存于-70℃的农杆菌20μl于2mL含有利福平和卡那霉素的YEP液体培养基中，在200rpm、28℃下振荡培养24-36h；再取其中1mL于含有利福平和卡那霉素的50mL的YEP液体培养基中28℃振荡培养5-6h。

(5)共培养转化将菌液在5000rpm下离心5min，收集菌体，用添加有100μM/L乙酰丁香酮的AAM液体培养基30mL重悬菌体，使农杆菌液的OD600大约为0.8.将预先挑好的愈伤组织浸在菌液中18min，再用无菌滤纸或吸水纸吸去多余的菌液，置于共培养固体培养基上，25℃暗培养2d.

(6)洗菌与筛选将共培养的愈伤组织用无菌水冲洗3-5次至水澄清，然后用含头孢霉素(500mg/L)的无菌水振荡30-40min，再将愈伤组织用无菌滤纸或吸水纸吸干，然后接种于选择培养基1上培养21天。接着挑选新长出的愈伤组织接种于选择培养基2上21天。

(7)分化与生根将上述所得到的抗性愈伤组织接种到分化培养基上进行光照培养1-2个月，然后将所产生的2cm左右高的幼苗转到生根培养基上，当苗长至约10cm时，炼苗后移栽于大田，获得抗性植株223株。

1.4.5转基因植株的分子生物学检测

(1)转化植株的PCR检测

利用潮霉素基因的特异引物和在pZH01-OsELF3载体上面跨35s启动子和OsELF3基因设计的特异引物对转基因植株进行常规的PCR检测。分别以非转化水稻DNA、中花11总DNA和pZH01-OsELF3质粒DNA为模板，在相同条件下进行PCR扩增作为阴性和阳性对照。其中所述的潮霉素基因(HPT)扩增引物为：

HPT1 F：5’TACACAGGCCATCGGTCCAGA 3’(SEQ ID No.6)

HPT1 R：5’TAGGAGGGCGTGGATATGTC 3’(SEQ ID No.7)

扩增的目的片段为832bp(见图5)

所述的载体特异引物为：

Se1 F：5’CATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAA 3’(SEQ ID No.8)

Se2 R：5’TGGAAGGCGAAGGAAGCTACGGAGGAGGAGAAAG 3’(SEQ ID No.9)

扩增片段为389bp(见图6)

PCR反应总体系：25μL，模板20-100ng，10×buffer(含Mg²⁺25mmol/L)2.5μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，Taq酶1U，引物(0.25mmol/L)2μL。HPT反应条件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；20℃5min。Se反应条件：94℃5min；94℃30s，68℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；20℃5min。

用CTAB法从转基因植株中提取基因组DNA，以基因组DNA为模板对潮霉素抗性基因片段以及目的基因的特异片段进行扩增，结果表明，有11株呈阳性。部分结果见图5、图6。

(2)转基因植株T1代的潮霉素抗性试验

水稻转化植株经分子检测后，按单株收取T₀代阳性自交种子，部分种子用于室内的潮霉素抗性发芽实验，并以未转化种子作为对照。种子去壳后经活体灭菌处理，转到含有Hyg的1/2MS培养基上光照培养(12h光照/12h黑暗)。筛选培养基的潮霉素浓度为50mg/L。结果表明转基因植株的自交种子(图7-1)在含有Hyg的培养基上有部分能正常生长，而对照植株的种子(图7-2)在同样的培养基上基本不能生长。

通过转基因植株T1代潮霉素抗性分析，可以确定OsELF3基因转化成功。

实施例4 OsELF3基因作用或功能的证明

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1供试水稻品种

Oself3突变体转基因T₁代(来源于转基因T₀代自交)，由四川农业大学水稻研究所保存。

1.2主要试剂

宝生物One Step

PrimeScript TM RT-PCR Kit II试剂盒

Trizol Reagent(Invitrogen公司)

宝生物PrimeScript Reverse Transcriptase

宝生物LA酶

宝生物pMD19测序试剂盒

氯仿

异丙醇

75％乙醇(DEPC H₂O配制)

DEPC H₂O

1.3主要仪器

天根RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒

ABI7900荧光定量PCR仪

ABI384well光学PCR板

ABI Optical adhensive covers

1.4主要步骤

1.4.1 T₁田间性状调查

T₀代11株阳性克隆，将它们的自交种T₁代11个株系，种于大田。每个株系5次重复，一次重复种植12株，栽植规格：13cm×27cm。调查其抽穗期。成熟后分单株收种，用于考察千粒重。

1.4.2定量分析引物设计

引物设计使用Applied biosystem primer express

OsELF3-3-f：5’CTCCAGCAGTGTCCAAATCAC 3’(SEQ ID No.10)，

OsELF3-3-r：5’GGTCCTGTCTCCTTGTCTTTCTG 3’(SEQ ID No.11)；

Action-1-f：5’tgctatgtacgtcgccatccag 3’(SEQ ID No.12)

Action-1-r：5’aatgagtaaccacgctccgtca 3’(SEQ ID No.13)

1.4.3定量分析材料准备

将T₁中第5株系中提前抽穗的单株OX-OsELF3和同期播种未抽穗中花11分别取两株种于水桶中带回实验室平台，便于取材。

间隔4h取材料，连续取材48h；OX-OsELF3单株和CK单株每个时期需要二次重复。

将材料使用天根RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒提取RNA(步骤参考试剂盒说明)。将提取的RNA样品浓度稀释到50ng/μL，并使用96孔PCR板分装，离心后保存于-80℃冰箱。

1.4.4定量分析

使用宝生物One Step

PrimeScript TM RT-PCR Kit II试剂盒进行反应，将2×One Step

RT-PCR Buffer 4(840μL×3支)、PrimeScript TM 1Step Enzyme Mix 2(200μL)、ROX Reference Dye*3(50×、100μL)配成混合buffer.引物终浓度为2.5pmol/μL.

1.4.4.1反应体系

RNA 2μL，引物1.5μL，混合buffer 3.5μL，

1.4.4.2反应程序

Pattern 1：反转录反应Hold 42℃ 5min，95℃ 10sec。

Pattern 2：PCR反应Cycle：40，95℃ 5sec，60℃ 30sec

Pattern 3：Dissociation

1.4.5 T₁代中OsELF3全长cDNA扩增

1 RNA样品提取采用Trizol Reagent(Invitrogen公司)提取提前抽穗的材料RNA，具体方法如下：取50～100mg组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置1.5mL离心管中，加入1mL TrizoL充分匀浆，室温静置5min；加入0.2mL氯仿，振荡15sec，静置2min；在4℃、12000g下离心15min，取上清；加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；在4℃、12000g下离心10min，弃上清；加入1mL 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀；在4℃、7500g下离心5min，弃上清；晾干，加入适量的DEPC H₂O溶解(65℃促溶10～15min)，获得全基因组RNA。

2反转录及RT-PCR

2.1反转录 采用PrimeScript Reverse Transcriptase进行

(1)在Microtube管中配制下列混合液。

模板RNA，Oligo dT Primer(50μM)1μL，dNTP Mixture(10mM each)1μL，不含RNase酶的dH₂O至10μL。

*Total RNA的使用量一般为5μg以下；mRNA的使用量一般为1μg以下

(2)65℃保温5min后迅速在冰上急冷2min以上。

(3)离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部。

(4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

上述模板RNA/引物等的混合液10μL，5×PrimeScript Buffer 4μL，RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL，PrimeScript Reverse Transcriptase(200U/μL)100～200units，不含RNA酶的dH2O至20μL。

(5)30℃10min*42℃(～50℃)**30～60min

2.2RT-PCR  使用LA酶进行RT-PCR

引物序列：

cDNA-5-f：CCCCCGGGCCTCGACCTGCTGCTGGTGGGTTG(SEQ ID No.14)

cDNA-5-r：CGGGATCCCAGCAACGAGTCATCTTGTTGCC(SEQ ID No.15)

RT-PCR体系：反转录产物1μL，引物2.5μL，GCbuffer 12.5μL，dNTP2.5μL，LA酶0.25μL，ddH₂O至25μL。

反应程序：94℃ 1min；94℃ 30s，68℃ 3min，30个循环；72℃10min。

1.4.5.3克隆测序

使用宝生物PMD-19载体连接，转化测序。(方法同前实施例1(2))

2结果与分析

2.1 T₁代田间性状调查结果

对T₁代的11个株系进行抽穗期的调查，发现其中2个株系抽穗时期发生分离，其中一个株系的分离比为44∶12χ²＝0.119＜3.84，分离比符合3∶1。且OX-OsELF3(+)粒型明显大于OX-OsELF3(-)(见图8)，同时千粒重比较发现差异显著，有芒、无芒的差异可能是由于启动子是35S所造成的。统计数据见表3。另外9个株系的分离比不完全符合分离规律有可能造成了多个位点的插入又或者是破坏了其他的一些基因的功能。

表3

基因型	单株数	抽穗期(天)	千粒重(克)
				Ox-OsELF3(+)	44	68.0000±0.7385	36.1957±0.3012
Ox-OsELF3(-)	12	76.8636±0.9299	24.5267±0.8500
				P		0.4152	2×10-4

2.2定量PCR结果

结果(见图9)提前抽穗植株OX-OsELF3的OsELF3基因被35s过量表达，而中花11中OsELF3基因带有24h的自身节律性。

2.3 T₁代中OsELF3全长cDNA扩增结果

T₁代OX-OsELF3中可以扩增到全长cDNA序列，将测序结果与NCBI数据库比对一致，而Oself3突变体无法得到全长cDNA序列(见图10)。

3结论

OsELF3在过量表达的T₁代植株中，表达量高，在短日照促进植株提前抽穗(开花)，同时促进其籽粒的增大。同时在OX-OsELF3中能得到全长cDNA，而在其转基因受体Oself3突变体中却无法得到全长cDNA，说明35s启动子能正常启动OsELF3基因表达，并不影响其内含子剪辑方式，最终产生能编码OsELF3蛋白的mRNA。综上所述，OsELF3是水稻中一个重要的生物节律钟基因，它可以调控光信号的输入。OsELF3在白昼被抑制表达，夜晚表达增加控制光信号输入到生物节律钟，从而调节水稻的生理节律周期控制水稻抽穗，同时影响水稻谷粒的大小。

序列表

<110>四川农业大学

<120>一种控制水稻抽穗期和籽粒大小的蛋白及其编码基因

<160>15

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>6081

<212>DNA

<213>Oryza sativa  L.

<400>1

gaagctttgg ggtcaacatc tttttaaata tataaatttg atacatgaaa atcatacatg     60

tcgattttgc atcaaaaagc actttcctag tataacacat tgagcgagtt ctattaagta    120

ttttacattg tatattagtg atcaaagttg tatttgagag aacatattga tgcccaaaat    180

gaagtctatt tgcgactttg agggactaca agtatgtaca gtaaacataa gatcaatcat    240

agcatccaat ctacttctaa taaatggtca agacaaaaaa agcgcttacc ataatctggc    300

aaaactcttc tctacattta caagcagtca aatgccatcc agcatataag tgccagtttc    360

ccagctacga gtcatcttgt tgcctttcca tctgtattga ccggaaaatc cgtgctgctg    420

actctgaagc tgtttgtgaa ttattatgcg gaatgaccct aataacattg gtctggttgt    480

cccggctgcc agatgagggc tgaggctgtg tgttctgagc tgatgctgta gggaaggcgg    540

acacaggacc acttccaccg cattggagcc tgtcaaaagg actgctagcg ctgctggctt    600

gcgcctcact atctcttgag gcatgaaatc tccaaatgcc acttggatgt gacatgttgc    660

atgacatccg agagtgttgc tccaagttcc cataaggctg tggcatagaa ggatgcctgc    720

cttgttctac tgcagatgct agtgcaactg ggttcatcac tggtacactg aaaggcggga     780

agtagttcat aggcatggta ggagtgccag gagcacccat atgttgtggt tgatgaggta     840

taggaacacc atatgctgaa ttcatgaaat ctccagttgt cgatgggagc ctcaggggag     900

tacaattggc ataaaatggg gccaatatgc ttccggctgg aggacatggg ccagaataag     960

gcttatagac aagcccttct gaaggagaca tgacagggat aagccactga ttctgcggtg    1020

gttgtagttg aaccccacag ttattctgtc tgttatcaga agcaacgggc gtagctcgaa    1080

gattgctttt tgatgcaccg atttttgcag tttgatcatg atgaccactg acaggtgcag    1140

tatcacgagg agagggtggg ttctcttcag aattttcttt cgataattct ggttcctgta    1200

gacttggctg cacatcatca ttggttgcaa ctaacacagg ctgagctttc aagttctctt    1260

ccgccatttt tttcttgcta gctaacaagg cattgccaag gcaaggatca ccttcaataa    1320

gtacatgtgg cgatgctgca atcaacttct gcacctgttt gtaagtcaaa tacaaatttt    1380

ggttattttc atactctaca ccaaattcta tccatgaact aacctgctta tgagtgacaa    1440

aaaagaagag aacttatatc tttttgatgt agagtgtaga ctcactttta ccaacttatg    1500

cagctcaaaa acttgggcag caaaaaccct ctgttgactg catagagttc aaagaagatt    1560

ttgagtgtaa accgagaaac aaaactatgc aatgatttgg taaagcaata ttcattgcat    1620

caatttaata gtaacacctt tacaattgtt atgggcaaac accacttaga gggtgacagg    1680

gtagcattga cttggttggt atgagaggag actataggtt ggaatgaaaa acttgtggga    1740

gagaggccag attgattcat ctacattgct taatttctaa tggctatgtg ctaatttttt    1800

attggaatga ctactgcaaa gagaatctct ctctctaaga ttagctcctc taatacctag    1860

gagatatgta caaagaggaa accccaacta ataaggaaac aaactattct tatctcaaat    1920

ttccaactaa tagcaaacca gcag，ccac atgaatacta tccctgcaca taacaatatt    1980

tttcaataaa attgtgcctt tctacttcac tgaaaggaaa agaaaattga aaccattgta    2040

catctgtaaa agagaacatt tcaagagcac agctgtacag tacaacaaaa ggcatggaca    2100

aacagattga cctagttgac aaaagaggtt ggtgtttctg acatggtatc acttaagttt    2160

ttttaacagg cctgcatcct ttcctgacaa taactaatcc agttacagca aatgtgacac    2220

caaatataag tattcatatc ttagaatcaa taaacatgct gatttgtaag ctcaatatat    2280

ttggcataag ttaggtttat gttcagctct tgtttgatgg ctaaagtatc gatgtcagaa    2340

aattaggtaa gtgagcatag cttgcatgct caagacggag tgccatgcat ggtcttttaa    2400

atatcgtcag gagctcatat attttgctca cataccagaa aaaacaaaaa ataatgagat    2460

agtttgtctt catttttttt ccctcttaag acgattacaa tcaactgtaa gctaagaaca    2520

aatgactgta aagcaaggaa acagaacatg gacattttgt tcatgaatgc tacacaaact    2580

aaattgtaac tactaatgtc aagtttaagc aggctagaat aaagctccgt tcgactcatc    2640

ttaaaaatcg aacaagctca aacagtttca aaccaaatat aaacaacgaa ccaccgtatg    2700

attacctttc taaacctttc aaatttgcat atcaatttgg gaacaagaac tacataaata    2760

aatagaatta taaagaaaca atcaaaatga cattatgata gcaaccgagc tcgcttaaat    2820

ccttggatac tgaatgttga cgtcgcgaaa gttagttaat tagttttttt tttttctttt    2880

ttcttttttt tttttttttt tgcgatagtt taagttagtt atctgaaatc tacatgtttg    2940

cagaaacaag gctagaaaga tatgacctcg actcacactc atcttttaca gtcaaactac    3000

aaaatacacc caaactcatc tcatttgtat tttagttgat cttgagttga ggtaaaaagc    3060

aagttgattg agcagctcat gagcctagta gcctacagct attcttgcag ccctatactt    3120

actatagaag aatcagtata tcattatatt ttgctttcat caatgatata cttaatacaa    3180

tcaaattatt ctagtgtagt acacttactt tatgatagcc cgccttgctt tccaaaaatg    3240

ctttgcacca atggcaccaa caatttcatc tggagaaatc tcccaagcag ttatacactc    3300

cactgaggaa tcagacaaat catcaatttt ctctgcatta tcctgtgctt ccaacctttt    3360

tctctttgta ccagcttcct ttaagcctcc ttgaggtaaa ttacaatgcc cattggtatt    3420

ttcaatacca ggagatggtt tagcggatat tgtatttctt ctcactggag ggttctgaaa    3480

tttcacggaa ctcccgtttc tacttgtcgc ttgatgctcg ctgttttcca aatgtggctc    3540

atccaaatca tttatagtgc ctgtcttagg acatacttta gcatgtttgc ttccaaacat    3600

atctttggat gcctcaaatg atgaaaaatg ttcaacttcc acatttttca atgtttgtgc    3660

tggtcctgtc tccttgtctt tctgagaacc ccttgatttc acatcagaaa cattgattct    3720

ctccaagttc ttactaacag tgttataaca ctttgtcggt gatttggaca ctgctggagg    3780

gcttttgtgc ggactgagag caacaagggg tgttgattcc tcttgaaccc ccgcacgctc    3840

tttagtagaa tattgaggaa atctggcact gaaaacagaa ggtacaatga attcatcatc    3900

atcagccaat ttccttcccg aagaactctt tatgcccttt tccacccttt gctgtggggc    3960

acactcagcc cttgatcctg aaccatattt atcaatgccc ttaggctgag tggataacat    4020

ccccgaatct tttcttgaac cattaatctg tctgttgaca gaatttgaat tcatcttttc    4080

aacagactgg ccaggtccat tggaaggcac attgaacggc tcaaaaagag gcatgtcaca    4140

tccatatacc tggaagcaga aatttgtttc agtacttcat ttattgaata tatataattg    4200

gaatacgaag cgtgaatgag catgcagttc agtggtagag cactcgttac aggcgccgcc    4260

caccctgggc tcgaatccta ggtgccgcat ttgtgcccaa ctgccccccc cccccccccc    4320

ctcataaggt ttaggtggcc ccttctttaa agctaagtga agggtcgtcc ttcccccttc    4380

atcgagttta ttttttttaa aggaatacta agttacttca agctatgact tgggacattt    4440

gccacaggta caggtacttc atgtctacaa ctacccaatt atagaaaatt aattgatttc    4500

ttgtaggaag atattacagg attgtcctcc agtgtagttt tcccctcata caaactcaaa    4560

gaagatgata atagtcaata atcgatattt atcacatatg ctttgaacat cataacaaag    4620

taacttttga tcattccagt ttacctgtca accgtatatt acaaacacca gacctcagca    4680

aacacaactt ttaccaaatc tagtaatagc aattcgcaat agactataat atccaatagt    4740

agcagttaag ctgagttggc atctcctcag cacacaattg gttgaaacta gaaacattgt    4800

cctgatgttt tccaatccca gccatagaat tgaaatgttc cgaaataaaa gcttgcgaag    4860

aagaatttcc taaacaataa ctcctaatac gtgataattg gccaggcgat cctaatataa    4920

gaaagaactc tgggtattga gttgcgttaa ctgccagttc acccaaaagc agctgatgag    4980

aaatgagagc caattcaatt ataatttgac cctacgctct ctccaggttt cagaagtgga    5040

atagaactgg actgtgattt ttattttgaa aataattcaa caagccaaga tacaaacttg    5100

agacctcttg gctttgatac catgtcgagt cgcatgcacc tggccacctg ttagttcacc    5160

cgaaagttta agctaatgtg gaaaggtaga caattcaatt gtacttcaac attgaagaac    5220

tcgcatgaat aacattctta gacggacagt tgcccgatta gtatactttt acaaacagcg    5280

gagtcagcac acgattttac aagaagggat gccaaacatg tgagcaaagt gcacatcaaa    5340

tgggttgtta gccatggagg aagaggctca attatggaag tgcacaagca tatgctaatc    5400

ggtctatgac tacatataga gaggtattac tacatactga cggcatgtga atcggcacat    5460

gaattgaata cgcacgcaac ggaaggaaga tgataagatg tcatttgtgc ctcgaaatca    5520

tcttcctagc tttaattcta tccgattcac tagtcacaac cccacaacaa tcgagcacaa    5580

gcgcagaccc cctcacctgg ctctggctcg ccgccgacgt cgagcgcgcc aggctgcccc    5640

gagccgaggc gagcgcgccg cctccgccgc tgaagcggtg ggacggcacg gtgaactgct    5700

cgtagagcgc catcttgttc ctgggcggcg cccgcgggcc gccgcccttg gcggcgtcgt    5760

tgacgtggag ccgcgggaac agcgggccca tcaccttccc cctctcctcc acctccttcc    5820

ctcctcctcc tcctcccctc atcgccgcct ccccccgcag aaaccaccaa cccaccagca    5880

gcaggtcgag gaaaggaagg agaaccccct ctcccgatcg attcgtaggc cgcaggttgt    5940

gggggaggtc aggtcaggcc atggcggggc ggaggaggag cgcgaggcgg ggggcggtgt    6000

ctgtggtggc catggaatgg aaggcgaagg aagctacgga ggaggagaaa gggggggaga   6060

tagtttgccc tttttggggg t                                             6081

<210>2

<211>2229

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<400>2

atgaggggag gaggaggagg agggaaggag gtggaggaga gggggaaggt gatgggcccg     60

ctgttcccgc ggctccacgt caacgacgcc gccaagggcg gcggcccgcg ggcgccgccc    120

aggaacaaga tggcgctcta cgagcagttc accgtgccgt cccaccgctt cagcggcgga    180

ggcggcgcgc tcgcctcggc tcggggcagc ctggcgcgct cgacgtcggc ggcgagccag    240

agccaggtat atggatgtga catgcctctt tttgagccgt tcaatgtgcc ttccaatgga    300

cctggccagt ctgttgaaaa gatgaattca aattctgtca acagacagat taatggttca    360

agaaaagatt cggggatgtt atccactcag cctaagggca ttgataaata tggttcagga    420

tcaagggctg agtgtgcccc acagcaaagg gtggaaaagg gcataaagag ttcttcggga    480

aggaaattgg ctgatgatga tgaattcatt gtaccttctg ttttcagtgc cagatttcct    540

caatattcta ctaaagagcg tgcgggggtt caagaggaat caacacccct tgttgctctc    600

agtccgcaca aaagccctcc agcagtgtcc aaatcaccga caaagtgtta taacactgtt    660

agtaagaact tggagagaat caatgtttct gatgtgaaat caaggggttc tcagaaagac    720

aaggagacag gaccagcaca aacattgaaa aatgtggaag ttgaacattt ttcatcattt    780

gaggcatcca aagatatgtt tggaagcaaa catgctaaag tatgtcctaa gacaggcact    840

ataaatgatt tggatgagcc acatttggaa aacagcgagc atcaagcgac aagtagaaac     900

gggagttccg tgaaatttca gaaccctcca gtgagaagaa atacaatatc cgctaaacca     960

tctcctggta ttgaaaatac caatgggcat tgtaatttac ctcaaggagg cttaaaggaa    1020

gctggtacaa agagaaaaag gttggaagca caggataatg cagagaaaat tgatgatttg    1080

tctgattcct cagtggagtg tataactgct tgggagattt ctccagatga aattgttggt    1140

gccattggtg caaagcattt ttggaaagca aggcgggcta tcataaatca acagagggtt    1200

tttgctgccc aagtttttga gctgcataag ttggtaaaag tgcagaagtt gattgcagca    1260

tcgccacatg tacttattga aggtgatcct tgccttggca atgccttgtt agctagcaag    1320

aaaaaaatgg cggaagagaa cttgaaagct cagcctgtgt tagttgcaac caatgatgat    1380

gtgcagccaa gtctacagga accagaatta tcgaaagaaa attctgaaga gaacccaccc    1440

tctcctcgtg atactgcacc tgtcagtggt catcatgatc aaactgcaaa aatcggtgca    1500

tcaaaaagca atcttcgagc tacgcccgtt gcttctgata acagacagaa taactgtggg    1560

gttcaactac aaccaccgca gaatcagtgg cttatccctg tcatgtctcc ttcagaaggg    1620

cttgtctata agccttattc tggcccatgt cctccagccg gaagcatatt ggccccattt    1680

tatgccaatt gtactcccct gaggctccca tcgacaactg gagatttcat gaattcagca    1740

tatggtgttc ctatacctca tcaaccacaa catatgggtg ctcctggcac tcctaccatg    1800

cctatgaact acttcccgcc tttcagtgta ccagtgatga acccagttgc actagcatct    1860

gcagtagaac aaggcaggca tccttctatg ccacagcctt atgggaactt ggagcaacac    1920

tctcggatgt catgcaacat gtcacatcca agtggcattt ggagatttca tgcctcaaga    1980

gatagtgagg cgcaagccag cagcgctagc agtccttttg acaggctcca atgcggtgga    2040

agtggtcctg tgtccgcctt ccctacagca tcagctcaga acacacagcc tcagccctca    2100

tctggcagcc gggacaacca gaccaatgtt attagggtca ttccgcataa taattcacaa    2160

acagcttcag agtcagcagc acggattttc cggtcaatac agatggaaag gcaacaagat    2220

gactcgtag                                                            2229

<210>3

<211>742

<212>PRT

<213>Oryza sativa

<400>3

Met Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Glu Val Glu Glu Arg Gly Lys

1                 5                     10                      15

Val Met Gly Pro Leu Phe Pro Arg Leu His Val Asn Asp Ala Ala Lys

             20                     25                      30

Gly Gly Gly Pro Arg Ala Pro Pro Arg Asn Lys Met Ala Leu Tyr Glu

         35                     40                     45

Gln Phe Thr Val Pro Ser His Arg Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ala Leu

    50                      55                     60

Ala Ser Ala Arg Gly Ser Leu Ala Arg Ser Thr Ser Ala Ala Ser Gln

65                      70                     75                     80

Ser Gln Val Tyr Gly Cys Asp Met Pro Leu Phe Glu Pro Phe Asn Val

                   85                     90                     95

Pro Ser Asn Gly Pro Gly Gln Ser Val Glu Lys Met Asn Ser Asn Ser

              100                    105                    110

Val Asn Arg Gln Ile Asn Gly Ser Arg Lys Asp Ser Gly Met Leu Ser

         115                     120                    125

Thr Gln Pro Lys Gly Ile Asp Lys Tyr Gly Ser Gly Ser Arg Ala Glu

    130                     135                     140

Cys Ala Pro Gln Gln Arg Val Glu Lys Gly Ile Lys Ser Ser Ser Gly

145                    150                     155                     160

Arg Lys Leu Ala Asp Asp Asp Glu Phe Ile Val Pro Ser Val Phe Ser

                  165                    170                    175

Ala Arg Phe Pro Gln Tyr Ser Thr Lys Glu Arg Ala Gly Val Gln Glu

             180                     185                     190

Glu Ser Thr Pro Leu Val Ala Leu Ser Pro His Lys Ser Pro Pro Ala

         195                     200                     205

Val Ser Lys Ser Pro Thr Lys Cys Tyr Asn Thr Val Ser Lys Asn Leu

    210                     215                     220

Glu Arg Ile Asn Val Ser Asp Val Lys Ser Arg Gly Ser Gln Lys Asp

225                     230                    235                    240

Lys Glu Thr Gly Pro Ala Gln Thr Leu Lys Asn Val Glu Val Glu His

                  245                    250                    255

Phe Ser Ser Phe Glu Ala Ser Lys Asp Met Phe Gly Ser Lys His Ala

              260                     265                    270

Lys Val Cys Pro Lys Thr Gly Thr Ile Asn Asp Leu Asp Glu Pro His

         275                     280                    285

Leu Glu Asn Ser Glu His Gln Ala Thr Ser Arg Asn Gly Ser Ser Val

    290                     295                    300

Lys Phe Gln Asn Pro Pro Val Arg Arg Asn Thr Ile Ser Ala Lys Pro

305                    310                   315                   320

Ser Pro Gly Ile Glu Asn Thr Asn Gly His Cys Asn Leu Pro Gln Gly

                    325                    330                    335

Gly Leu Lys Glu Ala Gly Thr Lys Arg Lys Arg Leu Glu Ala Gln Asp

             340                      345                  350

Asn Ala Glu Lys Ile Asp Asp Leu Ser Asp Ser Ser Val Glu Cys Ile

        355                     360                     365

Thr Ala Trp Glu Ile Ser Pro Asp Glu Ile Val Gly Ala Ile Gly Ala

    370                      375                      380

Lys His Phe Trp Lys Ala Arg Arg Ala Ile Ile Asn Gln Gln Arg Val

385                    390                      395                     400

Phe Ala Ala Gln Val Phe Glu Leu His Lys Leu Val Lys Val Gln Lys

                  405                     410                     415

Leu Ile Ala Ala Ser Pro His Val Leu Ile Glu Gly Asp Pro Cys Leu

            420                        425                    430

Gly Asn Ala Leu Leu Ala Ser Lys Lys Lys Met Ala Glu Glu Asn Leu

        435                      440                      445

Lys Ala Gln Pro Val Leu Val Ala Thr Asn Asp Asp Val Gln Pro Ser

    450                     455                   460

Leu Gln Glu Pro Glu Leu Ser Lys Glu Asn Ser Glu Glu Asn Pro Pro

465                   470                    475                    480

Ser Pro Arg Asp Thr Ala Pro Val Ser Gly His His Asp Gln Thr Ala

                  485                      490                    495

Lys Ile Gly Ala Ser Lys Ser Asn Leu Arg Ala Thr Pro Val Ala Ser

              500                    505                     510

Asp Asn Arg Gln Asn Asn Cys Gly Val Gln Leu Gln Pro Pro Gln Asn

        515                   520                    525

Gln Trp Leu Ile Pro Val Met Ser Pro Ser Glu Gly Leu Val Tyr Lys

    530                     535                     540

Pro Tyr Ser Gly Pro Cys Pro Pro Ala Gly Ser Ile Leu Ala Pro Phe

545                     550                     555                     560

Tyr Ala Asn Cys Thr Pro Leu Arg Leu Pro Ser Thr Thr Gly Asp Phe

                  565                    570                    575

Met Asn Ser Ala Tyr Gly Val Pro Ile Pro His Gln Pro Gln His Met

             580                     585                     590

Gly Ala Pro Gly Thr Pro Thr Met Pro Met Asn Tyr Phe Pro Pro Phe

         595                     600                     605

Ser Val Pro Val Met Asn Pro Val Ala Leu Ala Ser Ala Val Glu Gln

    610                     615                     620

Gly Arg His Pro Ser Met Pro Gln Pro Tyr Gly Asn Leu Glu Gln His

625                     630                    635                    640

Ser Arg Met Ser Cys Asn Met Ser His Pro Ser Gly Ile Trp Arg Phe

                  645                     650                     655

His Ala Ser Arg Asp Ser Glu Ala Gln Ala Ser Ser Ala Ser Ser Pro

             660                     665                       670

Phe Asp Arg Leu Gln Cys Gly Gly Ser Gly Pro Val Ser Ala Phe Pro    

         675                   680                       685

Thr Ala Ser Ala Gln Asn Thr Gln Pro Gln Pro Ser Ser Gly Ser Arg

    690                     695                     700

Asp Asn Gln Thr Asn Val Ile Arg Val Ile Pro His Asn Asn Ser Gln

705                   710                       715                    720

Thr Ala Ser Glu Ser Ala Ala Arg Ile Phe Arg Ser Ile Gln Met Glu

                 725                      730                      735

Arg Gln Gln Asp Asp Ser

              740

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Chr3-F

<400>4

gctctagagt ccgtctatgg atgagcatga ctg                                            33

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Chr3-R

<400>5

cgggatccca gcaacgagtc atcttgttgc c                                              31

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>HPT1 F

<400>6

tacacaggcc atcggtccag a                                                         21

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>HPT1 R

<400>7

taggagggcg tggatatgtc                                                            20

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Se1 F

<400>8

catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaa                                             33

<210>9

<211>34

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Se1 R

<400>9

tggaaggcga aggaagctac ggaggaggag aaag                                            34

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>OsELF3-3-f

<400>10

ctccagcagt gtccaaatca c                                                        21

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>OsELF3-3-r

<400>11

ggtcctgtct ccttgtcttt ctg                                                      23

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Action-1-f

<400>12

tgctatgtac gtcgccatcc ag                                                        22

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Action-1-r

<400>13

aatgagtaac cacgctccgtca                                                         22

<210>14

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>cDNA-5-f

<400>14

cccccgggcc tcgacctgct gctggtgggt tg                                              32

<210>15

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>cDNA-5-r

<400>15

cgggatccca gcaacgagtc atcttgttgc c                                                31

Claims (10)

1.一种控制水稻抽穗期和籽粒大小的蛋白，其特征在于是选自下述(a)或(b)的蛋白质：

(a)由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成；

(b)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加形成的、并具有与(a)相同功能的蛋白。

2.编码权利要求1所述的控制植物抽穗期和籽粒大小的蛋白的基因，其特征在于是由选自下述(i)、(ii)或(iii)所示的核苷酸序列组成：

(i)由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成；

(ii)由与SEQ ID No.2的核苷酸序列具有80％以上同源性的核苷酸序列组成；且编码与(i)具有相同功能蛋白的核苷酸序列组成。

(iii)在严谨杂交条件下，与(i)或(ii)互补的核苷酸序列。

3.按照权利要求2所述的基因，其特征在于所述的核苷酸序列与SEQ IDNo.2的核苷酸序列具有85％或90％以上同源性。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体。

5.含有权利要求4所述表达载体的宿主细胞。

6.含有权利要求2或3所述基因的植物。

7.含有权利要求4所述表达载体的植物。

8.含有权利要求5所述宿主细胞的植物。

9.权利要求6、7或8任一所述的植物，其特征在于所述的植物是指单子叶植物或双子叶植物。

10.按照权利要求9所述的植物，其特征在于所述的植物是指水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜蓿。

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