CN105949291A - 水稻mis1蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程，具体公开了一种水稻MIS1蛋白及其编码基因。所述水稻MIS1蛋白为a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或b)由SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与a)具有同等功能(控制水稻株高或影响籽粒大小)的蛋白质。本发明进一步公开了编码前述蛋白的基因(如SEQ ID NO.2所示)。本发明首次发现了对水稻株高、水稻穗型和籽粒大小存在影响的蛋白及其编码基因，并通过试验验证了所述基因的功能。本发明技术方案为水稻的选育和转基因水稻的制备提供了新的方向，且通过构建转化有该基因的转基因水稻，能够显著提高水稻的产量。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程，具体地说，涉及一种水稻蛋白及其编码基因。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是我国重要的粮食作物之一，其产量和品质直接影响着我国粮食安全和人民生活水平。粒形性状一直是水稻遗传与育种研究的重要内容之一，是影响水稻产量和品质的重要性状。籽粒大小决定了粒重，而粒重与单株穗数、每穗粒数一起构成了水稻产量的三大要素，三者之间相互影响、制约和补偿。水稻颖壳是谷粒的保护组织，颖壳大小与籽粒库容量有直接的关系从而影响到影响千粒重，因此，其形态构建在稻类作物中起着重要作用。随着水稻全基因组测序工作的完成，目前，与水稻粒形性状及颖壳调控相关基因分子调控机理仍不太清楚，要真正从分子水平改良水稻产量及品质，需要克隆更多的相关基因并进行功能分析。
水稻粒形的分子生物学研究早已展开，不少研究者经过对粒形性状的遗传研究后，普遍认为水稻粒形性状在杂交后代群体中呈正态连续分布，被认为是由多基因控制的数量性状。水稻粒长的遗传大多受单基因、双基因、多基因或微效基因控制，现在主要倾向于以多基因控制为主，属于数量遗传性状。粒宽的遗传多数呈正态分布，受多基因控制，但有些研究认为粒宽是受单基因或主效基因控制。粒厚基本上表现为正态分布，受多基因控制，有的也受主效基因和微效基因的共同作用。粒重是粒长、粒宽和粒厚的综合指标，以千粒重表示，一般认为粒重受多基因控制，基本呈正态分布。
近年来，随着水稻分子生物学和功能基因组学的发展，利用遗传群体和突变体的方法克隆了许多粒型基因。目前，与谷粒性状相关的QTL遍布于水稻12条染色体，基因效应也各有差异。在已定位的与水稻粒形性状相关的QTL中，有20个基因被克隆。GS3是首个被克隆的控制水稻粒长和粒重主效QTL基因，位于第3染色体上的着丝粒附近区域，该基因编码一种232个氨基酸的跨膜蛋白，包含四种已知功能结构域，包括位于N端的一个植物特异的调控器官大小的结构域organ size regulation(OSR)结构域、一个跨膜蛋白结构域、TNFR/NGFR家族富含半胱氨酸的结构域和位于C端的VWFC结构域。其中OSR结构域缺失使水稻籽粒长度增加，TNFR/NGFR家族结构域和VWFC结构域缺失时，水稻籽粒变小。进一步分析发现N端的OSR结构域是控制粒型的关键区域，TNFR/NGFR家族结构域和VWFC结构域对OSR结构域的功能起抑制作用。GL3.1编码一种含有两个Kelch功能域的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶OsPPKL1，它是PPKL蛋白家族成员之一，是粒长的负调节因子。酶活测定结果显示，GL3.1蛋白具有去磷酸化的功能。它主要影响小穗在细胞分裂时蛋白质的去磷酸化水平从而加速细胞分裂，导致籽粒变长。TGW6位于6号染色体上，TGW6编码一个吲哚乙酸-葡萄糖水解酶，能将吲哚乙酸-葡萄糖结合物水解为吲哚乙酸和葡萄糖单体。TGW6基因的突变或者表达水平的下降会导致粒长增加，不影响粒宽和粒厚。GW2定位于第2染色体的短臂上，是控制粒宽的负调控因子，利用大粒粳稻品种WY3和小粒籼稻品种FAZ1为亲本的高代回交群体克隆的。与轮回亲本FAZ1相比，携带大粒亲本GW2位点的近等基因系种子宽度增加了26.2％，千粒重增加了49.8％。GW5定位于第5染色体，用宽粒粳稻品种Asominori与籼稻窄粒品种IR24构建的染色体片段替换系和高代回交定位群体克隆获得。与窄粒品种相比，宽粒品种的基因组中都缺失了一段1212bp的序列，GW5就位于这段缺失的序列中。GW2和GW5在种子发育过程中可能都参与泛素-蛋白酶途径负向调控粒宽，但两者可能以不同的调控途径。GS5定位于5号染色体短臂端，是第一个被克隆的控制水稻粒宽和粒重的正向调控因子。GS5基因编码一个含有480个氨基的丝氨酸羧肽酶，属于肽酶S10蛋白家族。在宽粒亲本或者过量表达植株中，GS5能够上调细胞周期基因的表达，促进了水稻颖壳细胞的横向分裂，从而增加颖壳的宽度，使谷粒的重量和单株产量增加。相反，gs5突变体种子的粒宽和粒重都减小。GW8定位于水稻第8染色体长臂上，该基因是细胞分裂的正调控因子，植物体中该基因表达量升高促进细胞分裂和加速籽粒灌浆，最终表现为籽粒宽度增加，千粒重增加。
除此之外，影响种子大小的基因还有DEP2/EP2/SRS1、SRS3及SR5等，灌浆相关的基因FLO2、GIF1对水稻籽粒大小也影响显著。过表达FLO2则能明显增加谷粒的大小，导致籽粒宽度和厚度明显增大。GIF1定位于水稻第4染色体上，编码一种细胞壁蔗糖酶，在灌浆早期发挥作用，能够控制谷粒淀粉数量，从而影响谷粒的性状。栽培稻的GIF1基因有严格的组织表达特异性，在发育籽粒背部维管束中特异表达，有利于籽粒灌浆，提高水稻产量；野生稻的基因表达部位则不同，不利于灌浆而低产，以栽培稻G1F1基因自身启动子进行过量表达，可以使谷粒变厚变大，从而增加产量。但如果以35S启动子将栽培稻的GIF1基因进行异位过量表达，则会导致谷粒变小。
粒形性状是由多个QTL控制的复杂性状，颖壳发育在一定程度上也限制了谷粒大小。近年来，在水稻已经中发现了不少与颖壳器官发育相关的突变体，在基因克隆方面也有不少的报道。在水稻第9染色体上克隆得到了RETARDED PALEA1(REP1)基因，该基因属于TCP家族转录因子。rep1内稃发育明显延缓，最终使得内稃变小。该基因主要调节颖壳中内稃发育，早期仅在内稃原基中表达，在花器官发育后期则扩散到内外稃和雄蕊中表达。同时REP1基因还属于双子叶植物中CYCLOIDEA(CYC)类同源基因，异位表达会改变花的不对称性，这说明CYC类基因在双子叶植物和水稻等禾本科植物中控制花左右对称机制中是相对保守的。在水稻第6染色体上克隆得到了DEPRESSED PALEA1(DP1)基因，它编码一种AT-hook DNA核蛋白，主要控制内稃发育和花器官的数目，定位克隆发现DP1基因的增强子就是REP1基因，该基因位于DP1基因的下游并且受其调控。在水稻第7染色体上克隆得到了long sterilelemma1(G1)基因，该基因编码蛋白中包含一个ALOG结构域，该结构在拟南芥和水稻中相对保守，属于植物特有的基因家族成员。g1突变体由于不育外稃的同源异型转换形成了长不育外稃结构，说明G1基因调控不育外稃的发育方向，抑制其发育成外稃结构。在水稻第2染色体上克隆得到了TRIANGΜLAR HΜLL1(TH1)，编码一个DUF640的蛋白，生物信息学研究发现该蛋白中也包含ALOG结构域，与G1基因属于同一个基因家族。通过原位杂交发现，TH1基因在内外稃原基中有很高的表达水平，该基因主要在水稻颖壳发育中起重要作用。在水稻第1染色体上克隆得到了EXTRA GLUME1(EG1)，该基因编码一种脂肪酶，其突变会导致在水稻4轮花器官外产生新的颖壳结构，EG1基因在花序原基中表达量很高，但在发育中的小花原基中表达很弱，该基因同时调节水稻护颖的命运和小穗发育。
目前根据水稻与拟南芥的花发育之间的保守性并利用这种关系在发现了水稻中与花器官发育相关基因，但是水稻作为单子叶模式植物与双子叶植物在花器官方面的差异主要在外轮花器官上，双子叶植物中没有与颖壳类似的器官，同时，对水稻突变体的研究大多局限于形态学和生理学特征的描述，从突变体出发，直接鉴定和克隆的基因还很少，因此目前对颖壳发育的调控机制还不是很明确。因此发现与颖壳发育有关的突变体并对其进行深人研究，对阐明水稻颖壳发育的调控网络具有重要的理论意义，为水稻籽粒的遗传改良提供更多的基因资源。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供水稻MIS1蛋白及其编码基因与应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种水稻MIS1蛋白，其为如下a)或b)中的任意一种：
a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)由SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与a)具有同等功能(控制水稻株高或影响籽粒大小)的蛋白质。
进一步地，本发明还提供了编码前述蛋白的基因。
具体而言，所述基因为如下1)～3)中的任意一种：
1)由SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
2)与SEQ ID NO.2所示的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码前述蛋白的DNA分子。
进一步地，本发明还提供了含有所述基因的载体，以及含有所述基因或所述载体的工程菌或宿主细胞。
所述工程菌和宿主细胞可理解为本领域技术人员在转基因过程中所使用的工程菌或宿主细胞。但随着科技发展，所述工程菌和宿主细胞的选择也许会发生变化，或在非转基因目的的应用领域，也同样涉及载体和工程菌的利用，但只要含有本发明所述基因或本发明所述的载体，均在本发明的保护范围之内。
进一步地，本发明还提供了含有前述基因的植物细胞。所述植物细胞可为转基因植物细胞，即将前述基因利用转基因技术转化植物细胞后得到的转化植物细胞。本发明所述的植物细胞不作为繁殖材料，即不包括可分化成为完整植株的植物细胞。
第二方面，本发明提供了所述基因在影响水稻株高方面的应用。本发明通过实验发现，MIS1基因发生突变的水稻mis1突变体植株高度较野生型植株的株高降低了17.8％。
此外，本发明还提供了所述基因在调控水稻穗型和水稻籽粒大小方面的应用。
从穗型上分析，mis1突变体穗长明显变短。水稻mis1突变体籽粒形状发生显著改变，其成熟籽粒长度、宽度、厚度较野生型籽粒极显著降低。同时其长宽比较野生型显著增加，说明mis1突变体的籽粒在宽度上的变异程度要明显高于长度，且成熟小粒突变体的千粒重也极显著降低。
本发明进一步通过试验发现，将本发明所述MIS1基因转化水稻mis1突变体，可以恢复突变体正常籽粒大小的表型。因而发现本发明所述MIS1基因可以直接调控细胞大小而被应用于水稻籽粒大小的控制，以提高水稻生产力。
鉴于此，本发明还同时提供了所述基因在制备转基因水稻中的应用。
转基因水稻的制备为本领域常规技术手段，本发明不另作限定，利用本发明所述基因进行水稻转基因的技术方案均在本发明的保护范围之内。
本发明的有益效果在于：
本发明首次发现了对水稻株高、水稻穗型和籽粒大小存在影响的蛋白及其编码基因，并通过试验验证了所述基因的功能。本发明技术方案为水稻的选育和转基因水稻的制备提供了新的方向，且通过构建转化有该基因的转基因水稻，能够显著提高水稻的产量。
附图说明
图1为本发明所述mis1突变体与野生型日本晴的表型。
图2为本发明所述MIS1基因定位与结构图。
图3为本发明所述载体pCAMBIA 1305.1::MIS1结构示意图。
图4为本发明所述载体pCAMBIA1305.1-APFHN::MIS1结构示意图。
图5为本发明所述pCAMBIA1305.1-APFHN::MIS1转化水稻mis1突变体可恢复其表型。
图6为本发明所述MIS1基因在水稻各组织中表达模式分析。
图7为本发明所述水稻mis1突变体的颖壳细胞变小。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 mis1突变体的获得与表型分析
通过EMS化学诱变粳稻品种日本晴，得到一个小粒突变体mis1(mini seed1)。表型分析表明，水稻mis1突变体植株高度较野生型变矮，株高降低了17.8％，但单株分蘖数目无明显差异(图1A、1E、1F)。从穗型上分析，mis1突变体穗长明显变短，仅相当于野生型的73.5％(图1B、1G)。水稻mis1突变体籽粒形状发生显著改变，其成熟籽粒长度、宽度、厚度较野生型籽粒极显著降低，降低的幅度分别是10.8％、25.1％、20.2％(图1C、1D、1H、1I、1J)。同时其长宽比较野生型显著增加，说明mis1突变体的籽粒在宽度上的变异程度要明显高于长度(图1K)。此外，成熟小粒突变体的千粒重也极显著降低，仅相当于野生型的44.6％(图1L)。
实施例2水稻MIS1基因的获得
将mis1突变体与表型正常且多态性高的籼稻品种Dular杂交获得F2分离群体，进行遗传分析与基因定位。对F2代发生性状分离的株系分析表明，正常单株与突变单株均符合3:1的分离比例，由此表明该突变性状受一对隐性基因控制。
以F2的20个突变体为材料，利用均匀分布于水稻12条染色体上的170个Indel标记，将候选基因定位于第2号染色体短臂，与Indel标记R8-2与R8-3连锁，两个标记间的物理距离为2.56Mb(图2A)。为了进一步精细定位候选基因，继续扩大F2代定位群体到1355株，同时发展新标记R8-47、R8-31、R8-45用于连锁分析，发现s2-135在这些标记处发生的重组事件分别为27、6和5，说明候选基因定位于R8-45和R8-47之间。由于R8-45和R8-47之间的InDel标记较少，我们又重新发展了8对CAPs标记(见表1)，最终将候选基因定位在标记S8-57和S8-84之间，两个标记间物理距离为37Kb(图2A)。
根据TIGR网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)提供的基因注释信息，在标记S8-57和S8-84之间有6个基因(图2B)。其中编号为LOC_Os02g08060的基因序列，其基因功能与表型有关，为此分8段对该基因的全长基因组DNA进行PCR扩增，每段大小为1.5kb左右，所用引物见表2，使用DNAStar软件分析野生型和突变体的测序结果。在mis1突变体中，该基因第5个外显子和第5个内含子的拼接位点内侧第5个碱基由G突变成A(图2C)，这可能影响mRNA前体的拼接效率从而导致其转录水平降低。进一步Real-time的结果也验证了这一结论，mis1突变体中该基因的表达量极显著低于野生型(图2D)。MIS1基因组DNA全长约9380bp，CDS全长3003bp(如SEQ ID NO.2所示序列)，含有23个外显子，22个内含子，编码一个由1000个氨基酸组成的蛋白产物(如SEQ ID NO.1所示序列)。
实施例2中涉及的引物序列如表1所示。
表1
实施例2中涉及的测序引物序列如表2所示。
表2
实施例3 pCAMBIAl305.1：：MIS1载体转化水稻mis1突变体
为了进行功能互补实验，分别构建了由自身启动子驱动的MIS1基因功能互补载体和水稻ACTIN1启动子驱动的过表达载体。MIS1基因功能互补载体由基因自身启动子驱动，选取翻译起始位点ATG前2030bp作为基因的启动子，由于MIS1的基因组较大，因此采用三步法进行连接，所用到的扩增引物如表3所示的02g08060S1S、02g08060S1B和02g08060S2B。第一个片段的5’端引入SalI位点，3’端引入SacI，PCR产物长为4894bp，重组到pCAMBIA1305.1的SalI+SacI位点中去；第二个片段的5’端引入BstEII位点,3’端引入SalI位点,PCR产物长为4686bp,重组到含第一个片段的载体的BstEII+SalI中去；第三个片段的两端均引入BstEII位点，PCR片段长为2125bp，重组到含第一和第二个片段的载体的BstEII位点中去，最终将自身启动子连同整个基因组11705bp(SEQ ID NO.3所示序列)一起连入pCAMBIAl305.1载体中，组成由自身启动子驱动的回复载体(图3)。另外使用植物双元表达载体pCAMBIAl305.1-APFHN构建过量表达载体，以cDNA为模板进行PCR扩增，所用扩增引物如表3所示的02g08060CDSS。5’和3’端都引入SalI位点，PCR产物长为3003bp(如SEQ ID NO.2所示序列)，重组到pCAMBIA1305.1-APFHN的SalI位点中去，由组成型高表达的水稻Actin1启动子驱动。构建好的载体如图4所示。
将构建好的互补载体与过表达载体用电击法转入农杆菌EHA105，水稻mis1突变体结的种子诱导愈伤作为受体材料，用农杆菌介导的转化方法进行水稻的转化。由自身启动子驱动的功能互补载体获得了4个独立转化株系，其中3个恢复为野生型表型。而由ACTIN1启动子驱动的过表达载体获得了9个独立转化株系，其中8个恢复为野生型表型(图5A)。对过表达转基因植株的粒形进行测量，结果表明转基因植株的籽粒长度、宽度及厚度明显大于突变体，略大于野生型，长宽比也与野生型吻合(图5B、5C、5D、5E)。这些结果表明，确实是由于MIS1基因的突变造成了mis1突变体粒形变小。实施例3中涉及的引物序列如表3所示。
表3
实施例4水稻MIS1基因表达模式
为明确MIS1基因的组织表达模式，采用Real-time PCR的方法检测水稻各个组织包括根、茎、叶、叶鞘、花、种子、分蘖芽以及不同长度的幼穗该基因表达水平，结果显示MIS1基因在水稻的根、茎、叶片、穗子、叶鞘、节等几乎所有组织中都有表达，其中叶鞘和幼穗表达量较高，在花和种子中相对较低(图6)。同时，我们发现随着幼穗的发育，MIS1基因表达强度逐渐减弱(图6)。MIS1基因在各个不同器官、部位中的表达强弱与与该基因的功能作用是一致的，当MIS1基因突变后导致植株变矮、颖壳及籽粒变小。实施例4中涉及的引物序列如表4所示。
表4
实施例5mis1突变体细胞分裂进程
水稻籽粒的形状和大小受到颖壳形状和大小的严格控制。为明确造成mis1突变体籽粒变小的细胞学基础，本研究对mis1突变体和野生型日本晴的水稻颖壳横截面进行石蜡切片观察，与野生型相比，mis1突变体的颖壳的横截面明显变小(图7A、7B)。测定结果表明，mis1突变体外稃及内稃横截面周长均极显著地低于野生型(图7D)。将水稻颖壳进一步放大倍数进行观察，由外到内依次是硅化细胞SC、纤维厚壁细胞FS、中间薄壁细胞SPC及非硅化细胞NSC。统计发现，与野生型相比，mis1突变体纤维厚壁细胞及非硅化细胞的细胞数目无明显变化(图7E、7G)。同时结合横截面的面积，进而计算出厚壁细胞和非硅化细胞平均每个细胞的大小。结果表明，mis1突变体纤维厚壁细胞及非硅化细胞的细胞面积较野生型极显著减小(图7F、7H)。该细胞学的观察结果表明，mis1突变体颖壳形态上变小极有可能与细胞大小有关。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.水稻MIS1蛋白，其特征在于，其为如下a)或b)中的任意一种：
a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)由SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与a)具有同等功能的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其为如下1)～3)中的任意一种：
1)由SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
2)与SEQ ID NO.2所示的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求2或3所述基因或权利要求3所述载体的工程菌或宿主细胞。
6.含有权利要求2或3所述基因的植物细胞。
7.权利要求2或3所述基因在影响水稻株高方面的应用。
8.权利要求2或3所述基因在调控水稻穗型方面的应用。
9.权利要求2或3所述基因在调控水稻籽粒大小方面的应用。
10.权利要求2或3所述基因在制备转基因水稻中的应用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20190712 |