CN111471697A

CN111471697A - 水稻脆杆调控基因dbc2及其应用

Info

Publication number: CN111471697A
Application number: CN202010199071.4A
Authority: CN
Inventors: 桑贤春; 王晓雯; 何光华; 熊毓贞; 史岭
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2040-03-20
Also published as: CN111471697B

Abstract

本发明属于水稻育种技术领域，具体涉及一种水稻脆杆调控基因DBC2及其应用。本发明公开了一种水稻脆杆调控基因DBC2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白为氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的糖苷水解酶OsGH9A3。本发明所公开的水稻脆杆调控基因DBC2通过直接或间接影响纤维素和木质素合成基因以及次生细胞壁生长相关转录因子基因的表达量来调控水稻脆杆性状和矮化性状，且其调控脆杆性状表达还受温度调控。将本发明公开的水稻脆杆调控基因DBC2应用于水稻改良中，有望改造出具有脆嫩秸秆的水稻，其脆嫩的秸秆可用于饲料生产，解决现有水稻的秸秆不便于处理的问题。

Description

水稻脆杆调控基因DBC2及其应用

技术领域

本发明属于水稻育种技术领域，具体涉及一种水稻脆杆调控基因DBC2及其应用。

背景技术

水稻是我国主要的粮食作物，在我国的农业生产占有举足轻重的地位。水稻在提供粮食的同时也会产生大量的秸秆，由于水稻秸秆存在口感差，难以消化，牲畜不喜爱等原因，使其很难应用于饲料生产中。目前，水稻秸秆的处理主要采用焚烧或直接还田两种方式进行处理，秸秆的焚烧会产生大量的烟雾和二氧化碳，会对大气环境造成严重污染，而秸秆直接还田不仅增加了耕作难度，也提升了病虫害发生的概率，因此，如何处理水稻秸秆成为了当前水稻生产面临的重要问题。

为了解决如何处理水稻秸秆的问题，现在研究的主要方向为对水稻秸秆进行脆杆突变，使其变得脆嫩，使其具有较好的牲畜饲用口感和易于消化的特性，使其能很好的应用于饲料生产。

脆杆通常伴随着纤维素和木质素的改变，是解决秸秆废物利用的有效材料，如何保持脆杆突变体的正常生长又能维持一定的脆性是这一新型生物材料要解决的主要难题(Li et al., 2018)。目前，报道的水稻脆杆突变体有8个，并且全部已经基因定位(Singh，K.etal,1994)，有1个已证明与DS转座因子插入有关(张芳梅等，2002)，但离完全揭开水稻脆杆的机制还有一定的距离，对某些水稻脆杆特性在生产上的应用还无法做出应用。因此，对水稻脆杆性状的研究对新品种的选育和种质资源的开发利用具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻脆杆调控基因DBC2及其应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

1.本发明提供了一种水稻脆杆调控基因DBC2,所述水稻脆杆调控基因DBC2为LOC_Os03g52630基因在第6外显子上发生了一个G至A的碱基替换，第561位编码氨基酸由天冬氨酸Asp变为了天冬酰胺Asn。

进一步地，所述水稻脆杆调控基因DBC2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白为氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的糖苷水解酶OsGH9A3。

进一步地，所述水稻脆杆调控基因DBC2通过直接或间接影响纤维素和木质素合成基因以及次生细胞壁生长相关转录因子基因的表达量来调控水稻脆杆性状和矮化性状。

进一步地，所述水稻脆杆调控基因DBC2调控脆杆性状表达还受温度调控，在35℃及以上时调控水稻表现为脆杆。

本发明还提供了含有所述水稻脆杆调控基因DBC2的表达载体，所述表达载体可以通过将DBC2基因克隆进真核表达载体获得。

本发明还提供了含有所述表达载体的宿主，可选的宿主为水稻。

本发明还提供了所述水稻脆杆调控基因DBC2或含有所述水稻脆杆调控基因DBC2的表达载体在水稻株型改良中的应用。应用所述水稻脆杆调控基因DBC2或含有所述水稻脆杆调控基因DBC2的表达载体可以改良获得矮化脆杆水稻，且其脆杆性状的表达受温度的影响，可通过调控温度控制脆杆性状。

本发明的发明人利用EMS诱变籼型水稻恢复系缙恢10号，获得了一个稳定遗传的植株变脆且伴有矮化性状的突变体(突变体命名为dbc2，其控制基因命名为DBC2)，表型上一方面变现为矮化，田间自然栽培条件下，从苗期开始，dbc2株高相比于野生型明显降低，特别是在成熟期dbc2株高相比于野生型极显著的降低了26.98％，另一方面变现为脆杆，在成熟期，受外力压迫下，dbc2茎秆和叶片易断裂，其断裂面齐整，而野生型表现出一定的韧性，不易被折断。产量性状上与野生型相比，dbc2籽粒长度无明显变化，籽粒宽度、厚度以及千粒重均极显著增加了12.76％、13.82％和12.26％。叶片、茎秆和叶鞘中纤维素与木质素含量与野生型相比，dbc2叶片、茎秆和叶鞘中纤维素含量分别为野生型的80.10％、84.88％和 86.10％，下降均达极显著水平；dbc2叶片、茎秆和叶鞘中木质素含量分别为野生型的1.41 倍、1.78倍和1.18倍，升高达显著或极显著水平。

进一步地，发明人对dbc2进行了遗传分析，利用西大1A与dbc2配制杂交组合，获得的F₁植株均为正常表型，F₂群体中分离出正常和矮脆两种表型的植株，分别为2780株和863株，经卡平方检测，符合3∶1分离比([χ²＝1.03<3.84(χ² _0.05)])，表明dbc2矮脆性状受一对隐性核基因控制。

进一步地，发明人对DBC2基因进行了精细定位，以西大1A与dbc2杂交的F₂群体中863 株矮脆单株作为定位群体，利用平均分布于水稻12条染色体上的400对SSR标记和60对InDel标记在西大1A和dbc2之间进行多态性筛选，利用筛选得到的136对多态性标记扩增亲本、正常基因池和突变基因池(由10株F₂群体中具有典型矮脆表型单株的等量DNA构成)。结果发现，位于第3染色体上的SSR标记RM15793在两基因池间表现多态性，推测DBC2基因可能与SSR标记RM15793连锁，进一步利用F₂群体中正常单株和矮脆单株各10株进行单株验证，发现RM15793与DBC2基因连锁。为初步确定定位区间，分别在标记RM15793的上、下游区段开发新的多态性标记，发现标记S-76与标记RM15793的交换株不同，因此，初步确定DBC2基因在标记RM15793与标记S-76之间。

为精细定位DBC2基因，发明人根据重测序获得的西大1A和缙恢10号序列差异，在初步定位区间内，进一步设计了20对InDel标记。亲本间多态性筛选发现其中5对差异是真实存在的，分别命名为J118-1、2、3、4、5。发明人利用这些InDel标记进一步分析863 株西大1A/dbc2组合F₂矮脆单株，结果发现标记J118-1、J118-2、J118-3、J118-4和J118-5 的交换株分别为38、21、3、2和10，最终将DBC2精细定位在InDel标记J118-3和J118-4 之间52.78kb的物理范围内。

根据Gramene网站(http://www.gramene.org/)和水稻基因组注释计划网站RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)的注释结果，在DBC2基因精细定位区间内，共有10个注释基因，其中4个是编码假定蛋白的基因，其余6个基因分别编码内切葡聚糖酶、突触融合相关蛋白、ATP合成酶F1、GRAM结构域蛋白、CBS结构域膜蛋白和镁依赖性磷酸激酶1。发明人对该定位区间内的注释基因进行测序，结果发现LOC_Os03g52630基因在第6外显子上发生了一个G至A的碱基替换，导致第561位编码氨基酸由野生型的天冬氨酸Asp变为突变体的天冬酰胺Asn。因此，发明人初步确定LOC_Os03g52630为DBC2的候选基因,且DBC2 的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白为氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的糖苷水解酶OsGH9A3。

进一步地，发明人对DBC2基因进行了互补验证，构建了植物互补表达载体，转化突变体，测序验证转基因阳性植株后进行表型观察，结果发现dbc2的脆杆、叶色、农艺性状等特性均得到了恢复，进一步证明了LOC_Os03g52630就是DBC2的目的基因。提取根、茎、倒 1叶、倒2叶、穗和SAM等部位的RNA，反转录成cDNA后进行QPCR分析，结果发现DBC2在各个组织部位均有表达。

进一步地，发明人对DBC2的表达模式进行了研究，发明人采用QPCR分析了DBC2在水稻各个组织部位中的表达，结果表明，DBC2在水稻各个组织部位中均有表达。进一步地，发明人构建了DBC2启动子+GUS表达载体，导入到野生型缙恢10号后进行了GUS组织化学染色，结果发现，DBC2在根、茎、叶、叶鞘和SAM中均有表达，结果与QPCR结果一致，发明人进一步分析发现，DBC2在根的成熟区表达较高，在伸长区表达相对较低，在根尖则几乎不表达，在茎秆中，DBC2的表达则主要在维管束部位，在叶片中，叶尖部位的表达高于叶中下部，发明人进一步分析发现，DBC2在叶肉细胞和维管束中均有表达，在SAM中，与根尖一样，DBC2几乎检测不到表达量。

进一步地，发明人还对DBC2基因的功能进行了研究，发明人构建了 PAN580::CamV35S::DBC2::GFP亚细胞定位载体，与质膜标记蛋白一起，通过PEG介导的共转化方法转至水稻原生质体，用共聚焦显微镜检测荧光信号。结果发现，DBC2::GFP融合蛋白所发出的荧光与质膜标记蛋白重叠，结果表明DBC2蛋白定位在质膜上。

进一步地，发明人还对相关基因表达进行了分析，在成熟期，发明人对野生型和dbc2 纤维素合成与木质素合成相关基因以及次生细胞壁生长相关转录因子基因进行qRT-PCR表达差异分析，结果发现：与野生型相比，dbc2中初生细胞壁纤维素合成相关基因(CesA1、CesA3、 CesA8)和次生细胞壁纤维素合成相关基因(CesA4、CesA7、CesA9)的表达量均上调；dbc2 中木质素合成相关基因PAL1的表达量大幅上调，为野生型的1.79倍，4CL3、CAD2和LAC17 基因的表达量均呈现不同程度的下调；调控次生细胞壁生长的转录因子基因NAC29和 MYB103L的表达量大幅上调，SWN7和MYB58的表达量均下调。表明，DBC2基因突变通过直接或间接影响纤维素和木质素合成基因以及次生细胞壁生长相关转录因子基因的表达量。

进一步地，发明人还研究了DBC2的表达和温度之间的关系，发明人将WT和dbc2的种子分别播种于25℃、30℃和35℃，长到1心1叶期时调查表型变化。结果发现，WT在三种温度下均不表现脆杆，即折180°不断；dbc2在25℃和30℃的条件下也折180°不断，但在 35℃条件下，折180°后产生明显的断切口。表明DBC2的功能受温度的调控。

本发明的有益效果为：

(1)本发明提供了水稻脆杆调控基因DBC2(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)及其编码的蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，为糖苷水解酶OsGH9A3)。

(2)本发明所述水稻脆杆调控基因DBC2调控脆杆性状表达还受温度调控，可以在不同温度下实现不同的表达。

(3)本发明所述水稻脆杆调控基因DBC2对选育出脆杆水稻具有潜在的利用价值，对水稻秸秆的处理问题提供了新的方向。

附图说明

图1为野生型(WT)和dbc2的表型分析，其中：A：分蘖期野生型(WT)和dbc2的植株，标尺＝15cm；B：成熟期野生型(WT)和dbc2的植株，标尺＝15cm；C：成熟期野生型(WT) 和dbc2节间和穗部，标尺＝10cm；D、E：野生型(WT)和dbc2叶片和茎秆的断裂口比较，标尺分别为0.5cm和3.5cm；F：野生型(WT)和dbc2的籽粒与糙米，标尺＝5mm；G：成熟期野生型(WT)和dbc2的株高统计；H：成熟期野生型(WT)和dbc2的倒1至倒6节间长度统计；I：成熟期野生型(WT)和dbc2的倒1至倒3叶片长度统计。数据以平均值和标准差的形式展示，Student’s t-test(*0.01≤p<0.05,**p<0.01)用于统计学分析；

图2为成熟期野生型(WT)和dbc2产量性状分析，其中，A：籽粒千粒重(g)；B：糙米千粒重(g)；C:颖壳千粒重(g)；D：籽粒粒长、粒宽和粒厚度(mm)；E：糙米粒长、粒宽和粒厚度(mm),数据以平均值和标准差的形式展示，Student’s t-test(*0.01≤p<0.05, **p<0.01)用于统计学分析；

图3为成熟期野生型(WT)和dbc2节间机械强度分析,其中，A：野生型(WT)和dbc2节间机械强度比较；B：野生型(WT)和dbc2节间断裂时延伸长度比较。数据以平均值和标准差的形式展示，Student’s t-test(*0.01≤p<0.05,**p<0.01)用于统计学分析；

图4为野生型(WT)和dbc2纤维素与木质素含量分析，其中，A：成熟期野生型(WT)和dbc2叶片中纤维素与木质素含量比较；B：成熟期野生型(WT)和dbc2茎秆中纤维素与木质素含量比较；C：成熟期野生型(WT)和dbc2叶鞘中纤维素与木质素含量比。.数据以平均值和标准差的形式展示，Student’s t-test(*0.01≤p<0.05,**p<0.01)用于统计学分析；

图5为野生型(WT)与dbc2茎秆细胞学分析，其中，A、B：野生型(A)与dbc2(B) 茎秆纵切面，标尺＝100μm；C、D：分别为A、B红框中对应部分放大图，标尺＝25μm；E、 F：野生型(C)与dbc2(D)茎秆横切面，标尺＝1mm；G、H：野生型(G)与dbc2(H)茎秆横切面放大图，标尺＝0.1mm；I、J、K、L：分别是野生型与dbc2茎秆横切面厚度、纵切面细胞长度和细胞宽度以及细胞层数的统计；数据以平均值和标准差的形式展示，Student’s t-test(**p<0.01)用于统计学分析；

图6DBC2基因在第3染色体上的基因定位图谱；

图7为DBC2候选基因的分析；

图8为DBC2目的基因的互补验证，其中，A：野生型WT和突变体dbc2植株；B：dbc2 转基因互补植株；C：转基因互补植株的茎秆机械强度得到了恢复；D：转基因互补植株的叶片机械强度得到了恢复；E：转基因互补植株的测序验证，突变碱基位置表现为双峰(方框所示)；F：DBC2基因的QPCR表达模式分析；

图9为GUS染色分析DBC2表达模式，其中，A：DBC2在根部的表达；B：DBC2在茎杆中的表达；C：DBC2在叶中部的表达；D：DBC2在叶尖部的表达；E：DBC2在叶鞘中的表达；F： DBC2在生长点(SAM)中的表达；G：DBC2在根尖部位的表达；H：DBC2在叶肉细胞和维管束中均有表达其中，a、b、c为图G相应方框部位的放大，d为图D相应方框部位的放大，e 为图H相应方框部位的放大，f则为图e相应方框部位的放大；

图10为DBC2蛋白的亚细胞定位；

图11为相关基因在野生型(WT)和dbc2中的qRT-PCR表达分析；

图12为温度影响DBC2的功能，其中，A：DBC2对温度的响应；B：突变体dbc2和野生型WT在25℃的表型；C：突变体dbc2和野生型WT在30℃的表型；D：突变体dbc2和野生型WT在35℃的表型。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验材料：

(1)突变体dbc2来自于缙恢10号(Jin10)甲基磺酸乙酯EMS诱变体库，经连续自交8代，突变性状已稳定遗传。

(2)突变体dbc2、野生型缙恢10号和各类转基因植株均种植于西南大学研究所田间试验基地(重庆.北碚)，田间种植规格为：株行距20cm×25cm，常规管理，其中，转基因材料种植在具有隔离条件的专用试验田内，种子收获后植株统一销毁。

实验方法

(1)互补载体pCAMBIA1301::DBC2构建及遗传转化

提取野生型水稻缙恢10号幼嫩组织的基因组DNA，利用互补引物cDBC2-F和cDBC2-R (表1)扩增基因组DNA，取5μL PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳，检测获得单一目标条带后，BamH I和Kpn I分别酶切pCAMBIA1301载体质粒和PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳后胶回收目的片段。将PCR产物连接到pCAMBIA1301载体上，转化大肠杆菌感受态DH5a，37℃培养24h，挑选长势正常、菌落单一的菌斑，LB液体摇菌培养。PCR菌液检测阳性克隆后，提质粒酶切和测序验证。序列测序验证准确性的质粒分成两部分，一份放入-80℃冰箱长期保存，一份转化根癌农杆菌EHA105，进行dbc2突变体的转基因互补验证。植物遗传转化由武汉伯远生物科技有限公司完成，GUS染色和测序鉴定阳性单株。

表1实验所用的引物序列

(2)超表达载体pCAMBIA1301::Camv35S::DBC2::GFP构建

利用本实验室改造过的载体Pca1301-35S-S65T-NOS设计一对特异引物GFP-F和GFP-R (表1)，将GFP编码框序列扩增出来，Spe I和Kpn I双酶切PCR扩增产物和PTCK303载体，1％琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的片段，T4连接酶将GFP连接到PTCK303载体上，转化大肠杆菌感受态DH5a，获得阳性质粒PTCK303：：GFP，一部分-80℃冰箱长期保存，一部分进行后续实验。

野生型缙恢10号，根据DBC2基因的表达模式，选择表达较高的组织器官，提取RNA，反转录成cDNA后，利用超表达引物oDBC2-F和oDBC2-R(表1)扩增DBC2基因全长编码框DBC2-cds(ATG开始一直到TAG前面一个碱基的全部CDS序列)，1％琼脂糖凝胶电泳检测目的片段的准确性。用BamH I和Kpn I双酶切PCR产物DBC2-cds和PTCK303：： GFP质粒，利用1％琼脂糖电泳检测目的片段的正确性，胶回收后T4连接酶连接过夜，转化DH5a，挑斑、摇菌，PCR菌检后再酶切和测序验证，阳性质粒一部分-80℃冰箱长期保存，一部分用于转化根癌农杆菌EHA105，然后进行超表达转基因功能验证。

植物遗传转化由武汉伯远生物科技有限公司完成，GUS染色、测序鉴和QCPR等鉴定阳性单株，进行相应的分析。

(3)pCAMBIA1301::DBC2启动子::GUS载体构建及遗传转化

在DBC2启动子部位设计特异引物pDBC2-F和pDBC2-R(表1)，扩增野生型缙恢10 号的基因组DNA，BamH I和Nco I双酶切后，连接到pCAMBIA1301载体上，转化大肠杆菌感受态DH5a，PCR验证阳性菌斑，测序验证DNA序列的准确性。正确的质粒转化根癌农杆菌EHA105，并导入野生型缙恢10号中。遗传转化由武汉伯远生物科技有限公司完成， GUS染色和测序鉴定阳性单株。

(4)DBC2亚细胞定位载体的构建

设计特异引物slDBC2-F和slDBC2-R(表1)，从野生型缙恢10号的cDNA中扩增出DBC2的CDS目的条带，1％琼脂糖凝胶电泳检测后BamH I和Xba I双酶切，回收目的产物，T4连接酶将GFP连接到PAN580载体上，转化大肠杆菌感受态DH5a，获得阳性质粒 PAN580：：DBC2：：GFP，一部分-80℃冰箱长期保存，一部分用来做DBC2的亚细胞定位。

(5)DBC2亚细胞定位

1)水稻原生质体的提取

a)水稻种子35℃浸种催芽，露白后播种在沙床上，35℃培养10天左右，洗净干净后，剥去白色幼茎部位切成0.5mm小段，均匀放于盛有10mL酶液(Cellulose 0.15g，Macerozyme 0.03g，K3buffer定容至10mL)的三角瓶中；

b)三角瓶放在真空泵中抽真空30min，28℃、40rpm摇床暗培养4h左右；

c)培养液用200目尼龙膜过滤到培养皿内，过滤时可用勺子轻压滤渣使酶液尽量滤干，过滤液I转入50mL离心管中备用；将滤渣重新倒入三角瓶中，立即加入20mL W5 溶液，28℃、80rpm摇床振荡培养35min；

d)200目尼龙膜再次过滤，获得过滤液Ⅱ，移入一新的50mL离心管中；

e)装有滤液I和滤液Ⅱ的离心管，分别加入5～7mL W5溶液，200g RT离心5min，弃上清液；

f)用1～2mL(10个样品的量)重悬液小心缓慢重悬一摇沉淀，再用一摇溶液小心缓慢重悬二摇沉淀；

g)配制20mL 20％蔗糖溶液，使用注射器小心缓慢从底部注入10mL蔗糖溶液，使原生质体悬浮于液体表面，然后120g离心7min，此时位于液体表面的绿色层即为原生质体；

h)小心吸取上层原生质体到一新的50mL离心管内，加入W5溶液至40mL刻度线，200g离心5min，弃上清液；

i)用1-2mL重悬液重悬，镜检，40倍镜下3～5个原生质体最佳。

2)质粒转化

a)在2ml离心管中加入10μL质粒DNA，然后加入100μL按照上述步骤所提取的原生质体，轻柔地吸打混匀；

b)小心加入110μL40％PEG迅速轻柔混匀(加入的PEG的量为原生质体和所加质粒的总量)；

c)28°黑暗条件下放置20min；

d)缓慢沿壁加入440μL的W5溶液并混匀；

e)150g离心4min，去除PEG；

f)用100μLW5溶液小心重悬沉淀，并小心将所混液体缓慢转移至细胞培养板内；28°黑暗培养过夜(可加入0.1μL氨苄)。

实施例

实施例1突变体的获得和表型鉴定

突变体dbc2来自于缙恢10号(Jin10)甲基磺酸乙酯EMS诱变体库，经连续自交8代，突变性状已稳定遗传。

田间自然栽培条件下，从苗期开始，dbc2株高相比于野生型明显降低，特别是在成熟期 dbc2株高相比于野生型极显著的降低了26.98％(图1A、B、G)。dbc2的节间数目相比于野生型无明显变化，节间长度相比于野生型有不同程度的减少(图1C)，倒1至倒6节间长度分别极显著减少了29.67％、28.74％、22.46％、28.62％、30.82％和17.07％(图1H)。同时发现，相比于野生型，dbc2的叶片长度明显变短，宽度无明显变化。其中，倒2和倒3 功能叶的长度分别是野生型的84.81％和81.00％(图1I)。

除矮化表型外，dbc2的另一主要特征是植株变脆。在成熟期，受外力压迫下，dbc2茎秆和叶片的断裂面齐整，而野生型表现出一定的韧性，不易被折断(图1D、E)。

实施例2 dbc2产量性状分析

成熟期，对野生型与dbc2的产量性状进行统计分析，结果表明，dbc2籽粒长度无明显变化，籽粒宽度、厚度以及千粒重均极显著增加了12.76％、13.82％和12.26％(图1F；图2D、A)。颖壳重量和糙米重量是籽粒重量的两个组成部分，为了探究造成dbc2籽粒千粒重增加的直接原因，发明人对糙米的长度、宽度、厚度、千粒重以及颖壳千粒重分别进行了统计分析。结果表明，与野生型相比，dbc2糙米的长度无明显变化，厚度显著增加了7.90％，千粒重显著增加了8.21％，与籽粒变化趋势一致；宽度显著降低了10.12％，与籽粒变化趋势相反(图1F；图2E、B)。此外，dbc2的颖壳千粒重相比于野生型极显著增加了(图2C)。因此，dbc2千粒重极显著增加可能是由颖壳重量增加和粒厚增加引起的。

实施例3 dbc2拉力测定分析

在田间自然生长条件下，考察发现dbc2的茎秆相比于野生型更容易被折断。茎秆是水稻重要的地上器官之一，其中的厚壁组织和维管束为水稻植株提供机械支持。为了进一步了解dbc2与野生型在茎秆机械强度上的差异，在成熟期，对野生型和dbc2的倒二节间进行拉力测定，结果发现dbc2的机械强度为野生型的38.21％，下降程度达到了极显著水平(图3A)；断裂时dbc2的延伸长度为野生型的53.71％，断裂时延伸长度的改变达到了显著水平(图3B)。因此，DBC2基因突变会导致茎秆机械强度明显降低。

实施例4 dbc2纤维素和木质素含量分析

由于细胞壁是维持植株机械强度的主要因子，而纤维素是植物细胞壁的主要成分且细胞壁中含有一定量的木质素有助于增加机械强度。因而dbc2机械强度的下降暗示dbc2中纤维素与木质素含量可能发生了改变。因此，发明人分别测定了成熟期野生型与dbc2叶片、茎秆和叶鞘中纤维素与木质素含量。结果表明，dbc2叶片、茎秆和叶鞘中纤维素含量分别为野生型的80.10％、84.88％和86.10％，下降均达极显著水平(图4A、B、C)；dbc2叶片、茎秆和叶鞘中木质素含量分别为野生型的1.41倍、1.78倍和1.18倍，升高达显著或极显著水平(图4A、B、C)。这表明DBC2基因突变会造成细胞壁中纤维素和木质素含量的改变。

实施例5 dbc2细胞学分析

为了进一步分析导致dbc2植株矮脆表型的原因，在抽穗期，发明人对野生型和dbc2的茎秆进行了石蜡切片观察，并且统计了纵切面细胞层数及薄壁细胞的长度和宽度以及横切面茎秆的厚度。纵切观察发现，dbc2的薄壁细胞层数比野生型多一倍(图5A、B、L)；同时观察到dbc2薄壁细胞明显变小(图5A-D)，其宽度和长度分别比野生型减少了27.68％和37.84％，减少均达到了极显著水平(图5K、J)。因此，细胞变小可能是导致dbc2变矮的直接原因。横切观察发现，相比于野生型dbc2茎秆厚度极显著增加了28.33％(图5E、F、 I)，dbc2茎秆增厚是由细胞层数增多引起的，这表明DBC2基因突变可能通过影响细胞分裂和生长从而造成茎秆部位细胞数目和细胞大小的改变。进一步放大横切面观察发现，dbc2 维管束面积比野生型明显减小(图5G、H)，这与dbc2中纤维素含量下降的结果相一致；此外，如图5G、F所示，相比于野生型，dbc2厚壁组织的厚度明显增加，这与dbc2木质素含量升高的结果相一致。因此发明人认为，dbc2中维管束和厚壁组织的改变可能是导致dbc2 变脆的原因。

实施例6 dbc2的遗传分析

为了探究dbc2变矮变脆的分子机制，发明人利用西大1A与dbc2配制杂交组合，获得的F₁植株均为正常表型，F₂群体中分离出正常和矮脆两种表型的植株，分别为2780株和863 株，经卡平方检测，符合3∶1分离比([χ²＝1.03<3.84(χ² _0.05)])，表明dbc2矮脆突变性状受一对隐性核基因控制。

以西大1A与dbc2杂交的F₂群体中863株矮脆单株作为定位群体，利用平均分布于水稻12条染色体上的400对SSR标记和60对InDel标记在西大1A和dbc2之间进行多态性筛选，利用筛选得到的136对多态性标记扩增亲本、正常基因池和突变基因池。结果发现，位于第3染色体上的SSR标记RM15793在两基因池间表现多态性，推测DBC2基因可能与SSR 标记RM15793连锁，进一步利用F₂群体中正常单株和矮脆单株各10株进行单株验证，发现RM15793与DBC2基因连锁。为初步确定定位区间，分别在标记RM15793的上、下游区段开发新的多态性标记，发现标记S-76与标记RM15793的交换株不同，初步确定DBC2基因在标记RM15793与标记S-76之间。

为精细定位DBC2基因，根据重测序获得的西大1A和缙恢10号序列差异，在初步定位区间内，进一步设计了20对InDel标记。亲本间多态性筛选发现其中5对差异是真实存在的，分别命名为J118-1、2、3、4、5(表2)。发明人利用这些InDel标记进一步分析863株西大1A/dbc2组合F₂矮脆单株，结果发现标记J118-1、J118-2、J118-3、J118-4和J118-5的交换株分别为38、21、3、2和10，最终将DBC2精细定位在InDel标记J118-3和J118-4之间 52.78kb的物理范围内(图6)。

表2用于DBC2基因定位新开发的分子标记引物序列

实施例8 DBC2候选基因确定

根据Gramene网站(http://www.gramene.org/)和水稻基因组注释计划网站RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)的注释结果，在DBC2基因精细定位区间内，共有10个注释基因，其中4个是编码假定蛋白的基因，其余6个基因分别编码内切葡聚糖酶、突触融合相关蛋白、ATP合成酶F1、GRAM结构域蛋白、CBS结构域膜蛋白和镁依赖性磷酸激酶1(表3)。发明人对该定位区间内的注释基因进行测序，测序引物如表4所示，结果发现 LOC_Os03g52630基因在第6外显子上发生了一个G至A的碱基替换，导致第561位编码氨基酸由野生型的天冬氨酸Asp变为突变体的天冬酰胺Asn(图7C,D)。因此，发明人初步确定LOC_Os03g52630为DBC2的候选基因，其中，DBC2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白为氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的糖苷水解酶OsGH9A3。

表3精细定位区间内的注释基因

表4 DBC2基因DNA测序引物

实施例9 DBC2基因的互补验证

为验证候选基因，发明人构建了植物互补表达载体，转化突变体，测序验证转基因阳性植株(图8E)后进行表型观察，结果发现dbc2的脆杆、叶色、农艺性状等特性均得到了恢复 (图8A,B,C,D)，进一步证明了LOC_Os03g52630就是DBC2的目的基因。提取根、茎、倒1叶、倒2叶、穗和SAM等部位的RNA，反转录成cDNA后进行QPCR分析，结果发现 DBC2在各个组织部位均有表达(图8F)。

实施例10 DBC2基因的表达模式

QPCR分析表明DBC2在水稻各个组织部位均有表达，为进一步分析该基因的表达模式。发明人构建了DBC2启动子+GUS表达载体，导入到野生型缙恢10号后进行了GUS组织化学染色，结果发现，DBC2在根、茎、叶、叶鞘和SAM中均有表达(图9A,B,C,D,E,F,G)，与QPCR分析结果相一致。

进一步分析发现，DBC2在根的成熟区表达较高，在伸长区表达相对较低，在根尖则几乎不表达(图9A、G)。在茎秆中，DBC2的表达则主要在维管束部位(图9B)。在叶片中，叶尖部位的表达高于叶中下部(图9C、D)，进一步分析发现，DBC2在叶肉细胞和维管束中均有表达(图9H)。在SAM中，与根尖一样，DBC2几乎检测不到表达量(图9F)。

实施例11 DBC2蛋白的亚细胞定位

生物信息学分析发现DBC2含有一个质膜信号肽，推测可能定位在细胞膜上。为了进一步研究DBC2基因的功能，发明人构建了PAN580::CamV35S::DBC2::GFP亚细胞定位载体，与质膜标记蛋白一起，通过PEG介导的共转化方法转至水稻原生质体，用共聚焦显微镜检测荧光信号。结果发现，DBC2::GFP融合蛋白所发出的荧光与质膜标记蛋白重叠(图10)，表明DBC2蛋白的确定位在质膜上。

实施例12相关基因表达分析

成熟期，发明人对野生型和dbc2纤维素合成与木质素合成相关基因以及次生细胞壁生长相关转录因子基因进行qRT-PCR表达差异分析(其中，qRT-PCR表达分析引物如表5所示)。结果发现：与野生型相比，dbc2中初生细胞壁纤维素合成相关基因(CesA1、CesA3、CesA8)和次生细胞壁纤维素合成相关基因(CesA4、CesA7、CesA9)的表达量均上调(图 11A、B)；dbc2中木质素合成相关基因PAL1的表达量大幅上调，为野生型的1.79倍，4CL3、 CAD2和LAC17基因的表达量均呈现不同程度的下调(图11C)；调控次生细胞壁生长的转录因子基因NAC29和MYB103L的表达量大幅上调，SWN7和MYB58的表达量均下调(图11D)。结果表明，DBC2基因突变直接或间接影响纤维素和木质素合成基因以及次生细胞壁生长相关转录因子基因的表达量。

表5 qRT-PCR表达分析引物

实施例13 DBC2表达受温度调控

田间种植条件下，发明人发现dbc2随着生育期的进程突变特征愈加明显，且分期播种显示DBC2可能受温度调节。为进一步研究DBC2与温度之间的关系，发明人将25℃培养至1 心1叶期的WT和dbc2幼苗，至于35℃下，分不同时段取材。结果发现，35℃热激0.5h后，DBC2表达量最低，仅为对照25℃下表达量的1/12左右，随着热激时间的延长，表达略有升高，但均极显著低于25℃时的表达量，表明DBC2基因的表达受温度的影响(图12A)。

为进一步研究温度与表型之间的关系，发明人将WT和dbc2的种子分别播种于25℃、 30℃和35℃，长到1心1叶期时调查表型变化。结果发现，WT在三种温度下均不表现脆杆，即折180°不断；dbc2在25℃和30℃的条件下也折180°不断(图12B、C)，但在35℃条件下，折180°后产生明显的断切口(图12D)。这进一步表明了DBC2的功能可能受温度的调控。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 西南大学

<120> 水稻脆杆调控基因DBC2及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3518

<212> DNA

<213> 水稻突变体(Oryza sativa L.)

<400> 1

gaaacgaaaa gacggggggc gacgaggcga gcgcgagaaa gagaaagaga gagcaacgcc 60

ccaaccacca ccccctctgc ccaggcccca gatccctcca ccccatcgca cgccacaaca 120

taacataaca ccgcaaacac gcaccctccc aacagacgcc tcctcccctc cctccctccc 180

acctacactc cgctgcgcag ccagcttcgc tcgcccgcta cctcactcac tctcgggtga 240

gcgcggccac cgctgccggc gacgaggtag ggaggaggag gagggcaaga tgttcgggcg 300

ggacccgtgg ggcgggccgc tggagatctc gaatgcggac tcggcgacgg acgacgaccg 360

gagccgggac ctggacaggg gggcgctgat gcggcagctg gacgagacgc agcagagctg 420

gctcctggcc gggccgggcg accaggccgg caagaagaag aagaagtacg tcgacctcgg 480

ctgcatggtc ctcgaccgca agatcttcat gtggaccgtc ggcaccatcc tcggcgtcgg 540

cctcttcatc ggcttcgtca tgatgatcgt caagctcgtc ccccacaagc gcccccctcc 600

tcctcccccc gaccagtaca cccaggccct ccacaaggcc ctcatgttct tcaacgcgca 660

acgatgtgag tttttttcac tcctttcctc cctccgtctc catctctgtc tgcatcagaa 720

gaagaggagg aagaagattt cagaattcag atccggtttt gcacggcaat gtcgtgcgaa 780

aaagacgggc acttgcagct gtctctcccc tgtctcggag tggcctctgc tgcctcactc 840

tgtttctaca tttagcatgt ctttgttgct aaaagatctg gtcatttgca ctaaattacc 900

cccacatata ttctctccac gcatgtttaa ccagatcacg gtccacgtgc aataaactac 960

tgtcaaaatg acattttttt cctcggtcct ggatcttgag agaggatgaa caaaagtcaa 1020

tgtgaattcg aattcatata agcaaattct gctcaccttc tgacgatgta tcgttctgaa 1080

tgtcagctgg tccgctgccg aagcataacg gcgtcagctg gagggggaat tcttgcatga 1140

aggatggcct ctccgacagc accgtccgga agagcttggt cggaggcttc tacgacgcag 1200

gagacgccat caagttcaac taccccatgg cctggtccat gaccatgctc agctggagtg 1260

tgatcgagta caaggccaag tatgaggcga tcggtgagct cgaccatgtc aaggagctga 1320

tcaagtgggg cacagattac ctcctcaaga ccttcaattc atcagccgat actatcgatc 1380

ggatcgtcgc acaggttggt agaagccgac catctgttaa tcctgagttt tcactttcct 1440

gtcccaagaa ataaggcgtc agatccactc aaatatgtag agtaaacttc acagcagatt 1500

ttctaaatca ttggtatcat atgaacttct tattgcaggt gggtgtaggt gacacctcaa 1560

aaggtggtgc ccaacctaat gaccactact gctggatgag gccagaggat atcgattacc 1620

ccagacctgt cactgagtgc cactcttgct cagatcttgc ttccgaaatg gctgctgccc 1680

ttgctgcagc ttccatagtg ttcaaggaca gcaagactta ctctgacaag ctcgtgcgtg 1740

gcgcaaaggc cctgtacaag ttcggtaggc tgcagcgtgg gagatacagc cccaatggct 1800

ctgatcaagc aattttctac aattccacca gttactggga tgagtttgtg tggggtggtg 1860

cgtggatgta ctttgccaca gggaacaata catacctatc ggttgcaaca gctccgggga 1920

tggcaaagca tgctggagca tactggctcg atagtccgaa ttatggagtt tttacctggg 1980

atgacaagct tccaggagct caggttagca tacttcacac ctctgtactc agtgcactgg 2040

ttagctagaa ccacattgca gttagtgtaa aatgacagaa gaaggataag gtaatctgaa 2100

tgagaaaata tacaagtgtt ttagaaggtg caggaattaa ccaaaaatga tttgcataga 2160

gaagggtggt taatggtata cttcaatact gcagcgatac tgtgatagtg atccacctct 2220

aacattgttt ctactttatt caggttcttc tgagcaggtt gcggcttttc ctaagtcctg 2280

gatatcctta cgaagaaata ctgagaacat ttcacaacca aacagacaat gttatgtgct 2340

cgtatctgcc gatgtacaat tcattcaact ttaccaaagg tcggtgctgt tccccctttg 2400

cctctctttt tttctctcta gccacaaatg gaagttaaac aatgggaggt ttacaggagg 2460

aatgatacag ctcaaccacg gaaggcctca gccacttcag tatgttgtca atgcggcttt 2520

ccttgcctct ctatacagcg attacctgga tgctgcagat acacctgggt ggtattgtgg 2580

acctactttc tacactacag aagtcctccg caaatttgca aggtcacagg taaggttttg 2640

ttgcccatgc tcttgaagta gtcaaagcta cattagcaca gttcggtgaa tttgacaccc 2700

aaaacccttc aatttgcagc tcgattatgt cctaggtaag aacccactga agatgagcta 2760

cgttgtgggt tttggaaaca agtaccccaa gcgcgctcat cacagaggtg catcaatccc 2820

tcataatggt gtcaaatatg gatgcaaagg aggctttaaa tggagggaga ctaagaagcc 2880

aaatcctaat atccttattg gagcactggt tgctggccct gataggcatg atggcttcaa 2940

aaatgtccgt acaaactaca attacacgga gcctactctt gcagcaaatg ctggcctggt 3000

ggcagccttg atttccctaa ctaacattca cgtcaaaagt ggaatcgata agaacaccat 3060

cttctctgca gttcctccga tgtttccaac tcccccacct ccaccgtcag cttggaaacc 3120

atgaagagtc agatcgctga atatttcttg agcatcaaac ggagggaacg acagatgttt 3180

gtttggtaca gcaaaggaca catacagaaa gcagacaaca taagcttaca gagcctctat 3240

tttctgtatc agtatgacag atcggtataa attcatctgt cgacaataga ccgggatgtt 3300

gtgtgcacct tgtgaaacta atttttgggg tccttgttgt tattcgttca gagctcatgt 3360

gtgaagttct ttttgtagaa atggaacctt tataaaccgt tttataggag tgactttatc 3420

atcatactaa aggatttgtg taacctttat acagctttct tgattccatt tttatctctt 3480

tgccttacat ttcagccaca cttcaggggc atgttcac 3518

<210> 2

<211> 619

<212> PRT

<213> 水稻突变体(Oryza sativa L.)

<400> 2

Met Phe Gly Arg Asp Pro Trp Gly Gly Pro Leu Glu Ile Ser Asn Ala

1 5 10 15

Asp Ser Ala Thr Asp Asp Asp Arg Ser Arg Asp Leu Asp Arg Gly Ala

20 25 30

Leu Met Arg Gln Leu Asp Glu Thr Gln Gln Ser Trp Leu Leu Ala Gly

35 40 45

Pro Gly Asp Gln Ala Gly Lys Lys Lys Lys Lys Tyr Val Asp Leu Gly

50 55 60

Cys Met Val Leu Asp Arg Lys Ile Phe Met Trp Thr Val Gly Thr Ile

65 70 75 80

Leu Gly Val Gly Leu Phe Ile Gly Phe Val Met Met Ile Val Lys Leu

85 90 95

Val Pro His Lys Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Gln Tyr Thr Gln

100 105 110

Ala Leu His Lys Ala Leu Met Phe Phe Asn Ala Gln Arg Ser Gly Pro

115 120 125

Leu Pro Lys His Asn Gly Val Ser Trp Arg Gly Asn Ser Cys Met Lys

130 135 140

Asp Gly Leu Ser Asp Ser Thr Val Arg Lys Ser Leu Val Gly Gly Phe

145 150 155 160

Tyr Asp Ala Gly Asp Ala Ile Lys Phe Asn Tyr Pro Met Ala Trp Ser

165 170 175

Met Thr Met Leu Ser Trp Ser Val Ile Glu Tyr Lys Ala Lys Tyr Glu

180 185 190

Ala Ile Gly Glu Leu Asp His Val Lys Glu Leu Ile Lys Trp Gly Thr

195 200 205

Asp Tyr Leu Leu Lys Thr Phe Asn Ser Ser Ala Asp Thr Ile Asp Arg

210 215 220

Ile Val Ala Gln Val Gly Val Gly Asp Thr Ser Lys Gly Gly Ala Gln

225 230 235 240

Pro Asn Asp His Tyr Cys Trp Met Arg Pro Glu Asp Ile Asp Tyr Pro

245 250 255

Arg Pro Val Thr Glu Cys His Ser Cys Ser Asp Leu Ala Ser Glu Met

260 265 270

Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ser Ile Val Phe Lys Asp Ser Lys Thr

275 280 285

Tyr Ser Asp Lys Leu Val Arg Gly Ala Lys Ala Leu Tyr Lys Phe Gly

290 295 300

Arg Leu Gln Arg Gly Arg Tyr Ser Pro Asn Gly Ser Asp Gln Ala Ile

305 310 315 320

Phe Tyr Asn Ser Thr Ser Tyr Trp Asp Glu Phe Val Trp Gly Gly Ala

325 330 335

Trp Met Tyr Phe Ala Thr Gly Asn Asn Thr Tyr Leu Ser Val Ala Thr

340 345 350

Ala Pro Gly Met Ala Lys His Ala Gly Ala Tyr Trp Leu Asp Ser Pro

355 360 365

Asn Tyr Gly Val Phe Thr Trp Asp Asp Lys Leu Pro Gly Ala Gln Val

370 375 380

Leu Leu Ser Arg Leu Arg Leu Phe Leu Ser Pro Gly Tyr Pro Tyr Glu

385 390 395 400

Glu Ile Leu Arg Thr Phe His Asn Gln Thr Asp Asn Val Met Cys Ser

405 410 415

Tyr Leu Pro Met Tyr Asn Ser Phe Asn Phe Thr Lys Gly Gly Met Ile

420 425 430

Gln Leu Asn His Gly Arg Pro Gln Pro Leu Gln Tyr Val Val Asn Ala

435 440 445

Ala Phe Leu Ala Ser Leu Tyr Ser Asp Tyr Leu Asp Ala Ala Asp Thr

450 455 460

Pro Gly Trp Tyr Cys Gly Pro Thr Phe Tyr Thr Thr Glu Val Leu Arg

465 470 475 480

Lys Phe Ala Arg Ser Gln Leu Asp Tyr Val Leu Gly Lys Asn Pro Leu

485 490 495

Lys Met Ser Tyr Val Val Gly Phe Gly Asn Lys Tyr Pro Lys Arg Ala

500 505 510

His His Arg Gly Ala Ser Ile Pro His Asn Gly Val Lys Tyr Gly Cys

515 520 525

Lys Gly Gly Phe Lys Trp Arg Glu Thr Lys Lys Pro Asn Pro Asn Ile

530 535 540

Leu Ile Gly Ala Leu Val Ala Gly Pro Asp Arg His Asp Gly Phe Lys

545 550 555 560

Asn Arg Thr Asn Tyr Asn Tyr Thr Glu Pro Thr Leu Ala Ala Asn Ala

565 570 575

Gly Leu Val Ala Ala Leu Ile Ser Leu Thr Asn Ile His Val Lys Ser

580 585 590

Gly Ile Asp Lys Asn Thr Ile Phe Ser Ala Val Pro Pro Met Phe Pro

595 600 605

Thr Pro Pro Pro Pro Pro Ser Ala Trp Lys Pro

610 615

Claims

1.水稻脆杆调控基因DBC2,其特征在于，所述水稻脆杆调控基因DBC2为LOC_Os03g52630基因在第6外显子上发生了一个G至A的碱基替换，第561位编码氨基酸由天冬氨酸Asp变为了天冬酰胺Asn。

2.根据权利要求1所述的水稻脆杆调控基因DBC2,其特征在于，所述水稻脆杆调控基因DBC2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白为氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的糖苷水解酶OsGH9A3。

3.根据权利要求1所述的水稻脆杆调控基因DBC2,其特征在于，所述水稻脆杆调控基因DBC2通过直接或间接影响纤维素和木质素合成基因以及次生细胞壁生长相关转录因子基因的表达量来调控水稻脆杆性状和矮化性状。

4.根据权利要求1所述的水稻脆杆调控基因DBC2,其特征在于，所述水稻脆杆调控基因DBC2调控脆杆性状表达还受温度调控，在35℃及以上时调控水稻表现为脆杆。

5.含有权利要求1至4任一项所述水稻脆杆调控基因DBC2的表达载体。

6.含有权利要求5所述表达载体的宿主。

7.权利要求1至4任意一项所述水稻脆杆调控基因DBC2或权利要求5所述表达载体在水稻株型改良中的应用。