CN102094017B

CN102094017B - BGIos372基因及其用途

Info

Publication number: CN102094017B
Application number: CN201010568943A
Authority: CN
Inventors: 张耕耘; 孙红正; 李宁; 倪雪梅
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Huada Gene Agriculture Holding Co ltd
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2030-11-30
Also published as: CN102094017A

Abstract

本发明涉及BGIos372基因及其用途。本发明的BGIos372基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或其具有促进植物籽粒变大功能的变体。本发明还涉及转化有BGIos372基因或其变体的转基因植物。本发明还涉及所述BGIos372基因或其变体用于促进植物籽粒变大的用途以及促进植物籽粒变大的方法。

Description

BGIos372基因及其用途

技术领域

本发明涉及一种基因，特别是涉及BGIos372基因，及其促进植物、特别是单子叶植物籽粒变大的用途及方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa)是全世界最重要的粮食作物之一，全世界约30多亿人口以稻米为主食(Delseny M et al，2001)。水稻也是我国第一大粮食作物，其面积、单产和总产量均居首位，水稻生产在我国国民经济中具有举足轻重的地位。随着人口增长和人民生活水平的提高，市场对优质稻米有更大需求。粮食生产不但要提高品种的产量潜力，更要注重品质的改良，而水稻粒型(粒长、粒宽和长宽比)和千粒重会影响稻米外观、产量及市场价值。因此，选育大粒优质的水稻新品种已成为水稻育种的一个主要目标，发掘控制水稻粒型和千粒重的主要基因是当前遗传学家和育种家们共同关注的焦点。这对提高稻谷产量和稻米市场的竞争力具有重要意义。

水稻产量主要由千粒重、有效穗数和每穗粒数决定。据国内外研究，在构成水稻产量的三要素中，千粒重也即谷粒重量的遗传比较稳定，其变异系数为40％～60％。菲律宾国际水稻研究所研究认为，增加粒重可提高水稻产量30％以上(姚国新和卢磊，安徽农业科学，2007，35(27)：8468-8478)。从代谢生理和形态学上看，高产必须具备两个条件，即高水平的代谢源和足够大的贮藏库，其中后者表现在粒数多和谷粒大，即对光合产物有较大的容纳力。基于以上分析，想实现水稻产量的进一步飞跃，提高粒重的途径是值得重视的，提高粒重是提高粮食产量的有效途径(熊振民和孔繁林，江苏农业科学4，1981，48：25-30)。

水稻千粒重由谷粒长度、宽度和厚度三者决定，是一个典型的受多基因控制的数量性状遗传。克隆控制粒重的主要基因并加以改造利用是提高粮食产量的有效方法。目前水稻的全基因组测序工作已经完成，在水稻上已经积累了相当详细的资料，为水稻重要性状基因的定位克隆提供了便利。但是关于水稻粒重的基因定位克隆任务依然艰巨(姚国新和卢磊，安徽农业科学，2007，35(27)：8468-8478)。

当前，已经定位的粒重数量性状位点多达89个，分布于水稻的所有12条染色体上(玛丽莲，中国农业科学院，硕士学位论文，2007)。徐建龙等(中国水稻科学，2002，16(3)：6-10)应用292个Lemont/特青的重组自交系(RILs)检测到影响千粒重的11个作物数量性状位点(quantitativetraitlocus，QTL)，分别位于第1、2、3、4、5、10和12染色体上，联合贡献率为53.9％。林荔辉和吴为人(分子植物育种，2003(1)：337-342)利用以两个釉稻品种H 359和Acc8558为亲本杂交建立的重组自交系群体检测到16个与粒重有关的QTL，可解释81.40％的表型变异，分布在8条不同的染色体上，其中有5个分布在第3染色体上。美国康奈尔大学选用热带粳稻品种为轮回亲本，与普通野生稻材料配制组合，构建了353个株系组成的BCZF2：2群体，在千粒重性状上检测到8个QTL，其中位于水稻第3染色体的近中心粒区间的gw3.1表现最稳定，贡献率也较高(Li et al，Genetics 2004，168：2187-2195)。Li et al(Genetics 1997，145：453-465)、Guo LB等(plant breeding 2005，124：127-132)和Ishimaru(Plant Physiology 2003，133：1083-1090)等利用不同的遗传群体也将一个粒重QTL定位在第6染色体上。

虽然已经定位的粒重QTL有89个，但是能够将粒重基因精细定位的很少。根据现有文献，关于粒重基因的精细定位仅有gw3.1(Li et al，Genetics 2004，168：2187-2195)、Lk-4(t)(ZHOU LQ et al，Acta GenetSin，2006，33：72-79)、gw8.1(Xie et al，Theor Appl Genet，2006，113：885-894)、GS3(FAN CC et al，Theor Appl Genel，2006，12(6)：1164-1171)和GW2(XIAN-JUN S et al，Nature Genetic，2007，39：623-630)。克隆的粒重基因仅有GS3粒长(FAN CC et al，Theor Appl Genel，2006，12(6)：1164-1171)和GW2粒宽(XIAN-JUN S et al，Nature Genetic，2007，39：623-630)基因。所以精细定位和克隆更多的粒重基因成为当前提高水稻产量的重要工作。

发明内容

发明人在已完成的水稻全基因组测序的基础上，克隆了517个基因，并分别进行转基因验证其功能，通过与对照组比较，发现转化了BGIos372基因的转基因植株所产谷粒明显比对照组大，即转基因植株的千粒重大大提高了。由此初步验证了BGIos372基因是与控制颗粒大小的数量性状相关的功能基因，完成了本发明。

具体地，本发明包括以下几方面：

本发明的一个方面涉及一种具有促进植物籽粒变大功能的核苷酸序列，所述核苷酸序列含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，即BGIos372基因，所述基因的序列如下：

ATGTCTCTACAGGTGCCAAATGTGCAGGAACTCGCACTGACTTGCAACCGACCTGACCAGCAGATACCTGACAGGTACATCAGGCCGGAGGCTGGCACCGAAGAGGTCATCTGCGGCCAAGGCATCAACACGGCAATCCCGGTCATCGATCTCGCCAAGCTGCTCAACCCGCAGTCATCCCAAGAGGAGTGTGCCAAGCTGCGATCTGCATGTCAGCACTGGGGTTTCTTCCAGGTACGTCAAGATTATGTAATCAAGCTTTTACTTTGATGATTCACAAGGTGATACAACTATTATTAAACTGAATGATCAATAAACCATGTGGGAGAGAATTAAATAGTGTTTTTTTTCAAATTTGGACAAGGTGACACTGATTTAAGTAGGATAAACTGTGATTGATCTCACAAATTAAACTGCAGCTCGTCAACCATGGGGTGCCTGACGATGTGATCAGCGACGTGAGGAGAGACTTAACTGAGTTCTTCAAGCTACCACTTGAAGCCAAGGAGGCGTACGCTAAACCACCAGACAAGTACGAAGGCTATGGCCAGCACTTCGTCGTTTCAGAGAAGCAGAAGCTGGACTGGGGAGACCTGCTACACCTCCGGCTTCGCCCAACCGAGTCCAGGGATTTGAGGTTCTGGCCTGCCCATCCTTCATCTTTCAGGTCTGCCTCACAAACAAAACCACAACTAATCTTTGCATTGATCATGACTATGGGAAATAAGTAGTTTTGAGAAATTTCAACCAAGAAATGAACAATTTTTTTTATTTCCAAGGTTTAGTTTTTCAGTCTGAACGTTCATGGCTTCTCTTGTTCCAATGAGCCATTTTGCTGCATATCACAACACAAATGTTTGACAGGAATTCCATGGAGAGGTACTCCTTGGAGACGGCAAAAGTAGCACGCTGCCTGTTGGAGTTCTTGGCCATGGACATGGGCGTTGATCCGGAGTCTCTCCTGGAGGTATTCAGAGGCCAGCCCCAGAACATGAGGGTGAACTACTACCCGCCGTGCAGGCAAACCGGCAAGGTGCTCGGCCTGTCGCCGCACTGCGACGCGACCAGCCTGACGCTGCTGCTCCATGTGAACGACATGCAGGGCCTCCAGATCAGGAAGGACGGCAAGTGGCTCACCATCGAAGCCCTCGACGGCGCGTTCGTCGTCAACGTCGGCGACATGCTTGAGGTAAAATATTGACCAGGCTTTCACCTGATGCGTCGATCTGAAACCGAAACAGTTTTTCTTTGCTGATCGATGTTGAATTGCTGGTGCACACCAGTACAGAGTTTCTAGCTTAATCATCTACCAACATGGCTGCTGCTTGCAGATTCTGAGCAATGGGAGGTACAGGAGCGTTGAGCACAGGGCCGTGGTGCACCCGGAGAAGGAGCGCATCTCGGCGGCGGTGTTCCACCAGGCGTGCCGGGACGCGACGGTCGGGCCTCTGCCGGAGCTCGTGACGAAGGACGGTGGCAGGCCGGTGTACAAGTCGATGGCCTACGAGGATTTCATGAAGCGCTTCTTCTCGGCCAAACTTGACGGAAGGGCTAACGTCGAGGGCATGA

(SEQ ID NO：1)

本发明还涉及与SEQ ID NO：1所示序列互补的核苷酸序列，或其具有促进植物籽粒变大功能的选自如下的变体：

1)在高等严紧条件下与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，

2)对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，和

3)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。

典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm 5℃)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20-25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。

对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。

为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括：用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5×SSC中杂交过夜；随后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65℃或65-70℃。

在本发明中，所述在高等严紧条件下与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相同或相似的促植物籽粒变大活性。

在本发明中，所述对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不超过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。

在本发明中，所述对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行如上述一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列具有与SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列相同或相似的促植物籽粒变大活性。

通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与SEQID NO：1的参考核苷酸序列至少具95％的“同一性”是指：在SEQ IDNO：1的参考核苷酸序列之每100个核苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外，该多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，参考序列中多达5％的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的5％；或在一些核苷酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的5％。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在这些末端位置之间的任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参考序列中。

在本发明中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如文献中所述或者默认参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。

在本发明中，所述与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：1所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少90％序列同一性、优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。

在本发明中，所述与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相同或相似的促植物籽粒变大活性。

在本发明中，所述的BGIos372基因来源于普通野生稻元江(Oryza.rifupongon Yuanjiang)。

本发明的另一方面涉及一种载体，其特征在于，所述载体含有本发明所述的核苷酸序列，所述载体可以通过例如将上述核苷酸序列插入克隆载体或表达载体而得到，或者可以通过人工合成得到。

本发明的另一方面涉及一种重组载体，其特征在于所述重组载体含有本发明所述的核苷酸序列，所述重组载体可以通过将上述核苷酸序列插入克隆载体或表达载体而得到。

适于构建本发明所述重组载体的克隆载体包括但不限于，例如：pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T SimpleVecter、pMD19-T Simple Vecter等。

适于构建本发明所述的表达载体包括但不限于，例如：pBI121、p13W4、pGEM等。

在本发明的一个实施方案中，所述重组载体为p6+BGIos372重组载体。

本发明的另一方面涉及一种含有本发明所述载体的重组细胞，所述重组细胞可以通过将含有本发明所述的载体转化至宿主细胞而得到。

适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于，例如：根癌农杆菌细胞LBA4404、EHA105、GV3101等。

在本发明的一个实施方案中，所述重组细胞为重组农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105-p6+BGIos372。

本发明的还一方面涉及一种单子叶植物愈伤组织，其特征在于，所述愈伤组织转化有本发明的核苷酸序列和/或载体和/或感染有本发明的重组细胞。

本发明的还一方面涉及一种转基因植物，其特征在于，所述转基因植物转化有本发明的核苷酸序列和/或载体和/或感染本发明的重组细胞。

本发明的还一方面涉及本发明的核苷酸序列和/或载体和/或重组细胞用于促进植物籽粒变大的用途，以及用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。

本发明的还一方面涉及本发明的愈伤组织用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。

本发明的还一方面涉及一种促进植物籽粒变大的方法，所述方法包括将本发明的核苷酸序列和/或载体转化入植物，或用本发明的重组细胞感染植物。

所述方法包括用本发明的核苷酸序列转化单子叶植物的愈伤组织的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物愈伤组织的转化利用了含有本发明的核苷酸序列的重组细胞。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物愈伤组织的转化过程中利用了前述的重组农杆菌EHA105-p6+BGIos372。在本发明的一个具体实施方案中，所述单子叶植物的愈伤组织为水稻愈伤组织，具体地，所述水稻为日本晴。

在本发明中，可采用植物基因转化技术将目的基因插入到植物基因组中，包括农杆菌介导转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。本领域周知，农杆菌介导的基因转化常被用于单子叶植物和双子叶植物的基因转化，但其它转化技术也可用于本发明所述单子叶植物的基因转化。当然，适于本发明的转化单子叶植物的另一种方法是粒子轰击(显微金或钨粒子包覆转化的DNA)胚性愈伤组织或胚胎开发。另外，还可以采用的转化单子叶植物的方法是原生质体转化。基因转化后，采用通用的方法来筛选和再生整合有表达单元的植株。

本发明的还一方面涉及一种产生籽粒变大的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将本发明的核苷酸序列和/或载体转化入植物愈伤组织，或用本发明的重组细胞感染植物愈伤组织；

2)利用所述愈伤组织再生转基因植物。

在本发明中，所述植物优选是单子叶植物，所述单子叶植物包括但不限于水稻、谷子、小麦、高粱、玉米，特别优选为水稻，所述水稻包括但不限于，中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、II优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101(上述水稻品种均可购自安徽徽商农家福有限公司)。在本发明的一个实施方案中，所述水稻为日本晴。

在本发明中，所述籽粒变大是指在饱满程度相当的情况下，籽粒体积变大，千粒重增加。

在本发明的一个实施方案中，发明人从水稻元江中扩增得到基因BGIos372，将该基因重组入新构建的p6载体中得到含有该基因的重组表达载体，转化根癌农杆菌，利用重组农杆菌转化水稻愈伤组织，通过水稻愈伤组织的GUS染色、转基因小苗根、叶GUS染色及转基因水稻籽粒的性状观察，并与未转入BGIos372基因的组织或植物对比，证明BGIos372基因能够促进植物籽粒变大。

发明的有益效果

本发明利用高通量测序技术，通过基因的遗传转化，挖掘出促进籽粒变大的BGIos372基因，所述基因能够大大提高转基因植物的千粒重，证明了BGIos372基因是与控制水稻颗粒大小的数量性状相关的功能基因，这将有利于在分子水平上更深入探讨该性状形成的生理机理和机制，达到对产量和品质的合理调控作用，对水稻的遗传育种产生重大的意义。

关于生物材料保藏的说明

本发明涉及以下生物材料：

普通野生稻元江种子，其于2010年9月6日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC P201011。

附图说明

图1p6载体示意图。

图2经转化的水稻愈伤组织的GUS染色结果。其中，由带有本发明所述BGIos 372基因的重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos372转化的水稻愈伤组织(右)经GUS染色后呈现蓝色；不带有本发明BGIos372基因的重组根癌农杆菌EHA105-p6质粒的水稻愈伤组织(对照，左)经GUS染色后颜色未发生变化。

图3转基因水稻的籽粒观察。其中，经含有p6+BGIos372重组载体的根癌农杆菌介导转化的水稻籽粒(图3右)与阴性对照(图3左)相比，籽粒更大。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1BGIos372基因的PCR扩增和pMD18-T+BGIos372重组载体的构建

PCR扩增

使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目录号：DP320-02)提取普通野生稻元江(Oryza.rifupongonYuanjiang)的基因组DNA，根据该基因在gDNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物(上游引物F1，加限制性酶切位点BamHI和保护碱基，下游引物R1，加限制性酶切位点Xba I和保护碱基)。以上述提取的元江的gDNA为模板，高保真Ex Taq(TaKaRa，DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。如表1所示。

表1目的基因扩增的PCR体系

PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后以94℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸90s，进行35个反应循环，最后72℃延伸7min。

其中，上游引物F1：CGCGGATCCATGTCTCTACAGGTGCCAAATG(SEQ ID NO：2)，含BamHI酶切位点。下游引物R1：TGCTCTAGAAATCTTCATGCCCTCGACGTTAG(SEQ ID NO：3)，含Xba I酶切位点。

PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小为1570bp左右的条带，使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209-03)进行纯化回收。

pMD18-T+BGIos372重组载体的构建

将上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A)，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序，证明准确。

其中，T/A克隆的连接条件如下：

T/A连接体系： 10μl

pMD18-T 1μl

2×solution I 5μl

PCR扩增产物(回收插入片段)10-20ng，根据其浓度定

ddH₂O 补齐至10μl

于16℃在节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接8h以上，得到pMD18-T+BGIos372重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌：

从超低温冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞100μl DH5α(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如：上海生工购得)，冰上融化后，加入10μl如上所得的连接产物，即pMD18-T+BGIos372重组载体，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min，加入600μl4℃预冷的SOC培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃220rpm复苏45min，8000rpm离心30s，去上清，留取150μl，用剩下的150μl上清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹匀，玻璃珠涂布LB(加卡那霉素，Kan)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃倒置培养16-24h。获得含有pMD18-T+BGIos372克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-BGIos372。深圳华大基因科技有限公司对pMD18-T+BGIos372克隆载体中的BGIos372进行测序，测序结果与SEQ ID NO：1一致。表明获得的pMD18-T+BGIos372克隆载体中BGIos372基因序列正确。

实施例2p6重组载体的构建

1)玉米Ubiquitin启动子片段的PCR扩增和pMD18-T+Ubi重组载体的构建

Ubi启动子PCR扩增

使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目录号：DP320-02)提取玉米品种B73(Zea mays mays cv.B73)的基因组DNA(http://www.maizegdb.org/)，根据该启动子在玉米B73gDNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物(上游引物F2：GGCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGT(SEQ ID NO：4)，加限制性酶切位点Pst I和保护碱基，下游引物R2：GGCTGCAGAAGTAACACCAAAC(SEQ ID NO：5)，加限制性酶切位点Pst I和保护碱基)。以上述提取的玉米B73的gDNA为模板，高保真Ex Taq(TaKaRa，DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。如表2所示。

表2Ubi启动子扩增的PCR体系

PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后，使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209-03)纯化回收。

pMD18-T+Ubi重组载体的构建

将上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A)，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆由深圳华大基因科技有限公司测序，证明准确。

其中，T/A克隆的连接条件如下：

T/A连接体系： 10μl

pMD18-T 1μl

2×solution I 5μl

PCR扩增产物 10-20ng，根据其浓度定

ddH₂O 补齐至10μl

于16℃在节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接8h以上，得到pMD18-T+Ubi重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌：

从超低温冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞100μl DH5α(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如：上海生工购得)，冰上融化后，加入10μl如上所得的连接产物，即pMD18-T+Ubi重组载体，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min，加入600μl 4℃预冷的SOC培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃220rpm复苏45min，8000rpm离心30s，去上清，留取150μl，用剩下的150μl上清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹匀，玻璃珠涂布LB(卡那霉素)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃倒置培养16-24h。获得含有pMD18-T+Ubi克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-Ubi。

2)pCAMBIA-1301+Ubi重组载体的构建

按照TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号：DP103-03)的操作手册，从步骤1)构建的转化有启动子Ubi的大肠杆菌DH5α-Ubi中提取带有玉米Ubi启动子序列的克隆载体pMD18-T+Ubi；纯化后用相应的限制性内切酶Pst I(NEB)进行酶切，然后用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209-03)回收相应的启动子片段。

同时用限制性内切酶Pst I酶切pCAMBIA-1301质粒(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如上海国瑞基因科技有限公司购得，该公司的pCAMBIA-1301质粒的原始来源是The CAMBIA Bios(biological open source)Licensee，Australia)并回收。

酶切体系： 50μl

ddH₂O 34.9μl

10*buffer 35μl

Pst I 0.1μl(10U)

克隆载体pMD18-T+Ubi或pCAMBIA-1301质粒 10μl(＜1000ng)

将回收的启动子片段Ubi与回收的载体片段根据T4连接酶(TaKaRa，D2011A)操作说明，按照如下条件进行连接：

连接体系： 10μl

10×T4buffer 1μl

回收的pCAMBIA-1301质粒 1μl(20ng)

回收的启动子Ubi插入片段 10-20ng，根据其浓度定

ddH₂O 补齐至9.5μl

T4ligase(TaKaRa，D2011A)0.5μl

于16℃节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接8h以上。

将100μl氯化钙法制得的感受态细胞DH5α从超低温冰箱取出，冰上融化后，加入10μl上面的连接产物，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min，加600μl 4℃预冷的SOC，37℃下220rpm复苏45min，8000rpm离心30s，去上清，留取150μl，轻轻吹匀，玻璃珠涂布LB(Kan)，37℃倒置培养16-24h。得到重组载体pCAMBIA-1301+Ubi。

分别以F2和R2为引物对所得重组载体pCAMBIA-1301+Ubi进行PCR检测，以确证所得重组载体pCAMBIA-1301+Ubi中含有所需启动子Ubi。

3)NOS终止子的PCR扩增和pMD18-T+NOS重组载体的构建

根据pCAMBIA-1301质粒中NOS终止子的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物(上游引物F3：GGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAA(SEQ ID NO：6)，加限制性酶切位点Sac I和保护碱基，下游引物R3：GGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT(SEQ ID NO：7)，加限制性酶切位点EcoR I和保护碱基)。以上述提取的pCAMBIA-1301质粒为模板，高保真Ex Taq(TaKaRa，DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。如表3所示。

表3NOS终止子扩增的PCR体系

将上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A)，转化大肠杆菌，获得含有pMD18-T+NOS克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-NOS。挑取阳性克隆由深圳华大基因科技有限公司测序，证明准确。

4)pCAMBIA-1301+Ubi+NOS即p6重组载体的构建

按照TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号：DP103-03)的操作手册，提取步骤3)构建的克隆载体pMD18-T+NOS；纯化后用相应的限制性内切酶Sac I(NEB)和EcoR I(NEB)进行酶切，然后用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209-03)回收相应的NOS终止子片段。同时用限制性内切酶Sac I和EcoR I酶切pCAMBIA-1301+Ubi质粒并回收。

酶切体系： 50μl

ddH₂O 34.9μl

10*buffer 15μl

Sac I 0.1μl(10U)

EcoR I 0.1μl(10U)

载体pMD18-T+NOS或pCAMBIA-1301+Ubi质粒 10μl(＜1000ng)

将回收的终止子片段NOS与回收的载体片段用T4连接酶进行连接，转化感受态细胞DH5α得到重组载体pCAMBIA-1301+Ubi+NOS，即p6(参见图1)。

实施例3p6+BGIos372重组载体的构建

提取pMD18-T+BGIos372质粒，并用限制性内切酶BamHI/Xba I酶切后回收BGIos372基因片段，同时提取p6质粒，并用相应的限制性内切酶BamHI/XbaI酶切后回收大片段，将回收产物进行连接，随后转化感受态细胞DH5α得到重组载体p6+BGIos372。筛选阳性克隆进行PCR检测后测序确定。

实施例4重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos372细胞的制备

将如实施例3所述方法构建的p6+BGIos372重组载体质粒，转化按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)中所述氯化钙方法制备的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(已经于2010年9月22日在申请号为200910238992.0，发明名称为一种启动子BgIosP587、其制备方法及用途的专利文献中公开，保藏编号为CCTCC M 209315)感受态细胞，具体方法如下：

将根癌农杆菌感受态细胞EHA105于超低温冰箱中取出，至于冰上解冻。融化后，加入5μl的p6+BGIos372重组载体，轻轻混匀，冰浴10min，放入液氮中冷冻5min，37℃解冻5min，加入800μl常温的LB液体培养基，28℃160rpm复苏3h，8000rpm离心30s，吸去上清，留下200μl吹匀，涂布于加有kan-rif(卡那霉素-利福平)双抗的YM培养基平板上(50mg/l Kan，10mg/l Rif，具体配方参见表4)。28℃倒置培养2-3天。

以F1和R1为引物进行PCR检测和通过BamHI/XbaI酶切筛选转化子。PCR扩增出约1570bp左右条带和酶切出约1570bp左右条带的为重组载体p6+BGIos372的重组根癌农杆菌。

本发明中，按照如上述方法得到的带有重组载体p6+BGIos372的重组农杆菌，命名为重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos372；同时设立带有空载体p6的重组根癌农杆菌，即EHA105-p6作为本发明的阴性对照，用于后续实验。

实施例5水稻愈伤组织的诱导和转化

按照如下步骤诱导水稻愈伤组织，并分别用重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos372转化所述愈伤组织。

1)将水稻日本晴种子(已经于2010年9月22日在申请号为200910238992.0，发明名称为一种启动子BgIosP587、其制备方法及用途的专利文献中公开，保藏编号为CCTCC P200910)去壳，70％乙醇表面消毒30s，然后用有效氯1.5％的次氯酸钠消毒30min，期间剧烈摇动，消毒后用灭菌水清洗5次；将消毒后的种子置于N6D培养基(具体配方参见表4)上，用封口膜封口；29.5℃光照培养3-4周；

2)选取活跃生长的愈伤组织(黄白色，干燥，直径1-3mm)，在新N6D培养基上29.5℃光照培养3天；

3)分别挑取如实施例4所构建的重组根癌农杆菌单菌落(重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos372)，于添加抗生素(50mg/l Kan，10mg/lRif)的YM培养基(具体配方参见表5、表6)上划线培养3天，培养温度28℃；分别刮取上述重组根癌农杆菌置于添加了30μl 100mM的AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)的30ml AAM培养基(具体配方参见表7)中，温和重悬所述重组根癌农杆菌细胞(重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos372)；

4)将继代培养的愈伤组织置于灭菌培养皿中；将如步骤3)制备的重组根癌农杆菌悬液倒入培养皿中，将愈伤组织浸入其中15min；

5)倒掉重组根癌农杆菌悬液，将愈伤组织用灭菌吸水纸吸掉多余的液体；于N6-AS培养基(配方参见表8)上放一张灭菌滤纸，加1ml如上述含AS的AAM培养基，将愈伤组织转移至滤纸上；密封培养皿，28℃暗培养48-60h；

6)将受感染的愈伤组织置于50ml灭菌管中，用灭菌水摇动清洗，直至上清液变澄清；将愈伤组织浸泡于含500mg/l羧苄青霉素(Carb)的无菌水中以杀死重组根癌农杆菌；用灭菌吸水纸除去愈伤组织上多余的水分，然后将其转移至含1mg/l潮霉素B(HmB)和50mg/l Carb的N6-AS培养基上；用封口膜密封培养皿，29.5℃光照培养3-4周。

实施例6水稻愈伤组织中的GUS的表达

为检测经过实施例5所述转化的水稻愈伤组织中目的基因GUS的表达情况，按照Chen S Y等在Journal of Integrative Plant Biology，2008，50(6)：742-751所述的方法，对分别用重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos372转化的水稻愈伤组织进行染色。

GUS染色液的配方(1ml)：610μl 0.2M Na₂HPO₄溶液(pH＝7.0)；390μl 0.2M NaH₂PO₄溶液和10μl 0.1M X-gluc。

将用重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIos372转化的水稻愈伤组织浸泡在GUS染色液中，37℃保温至出现蓝色，拍照记录，结果如图2所示，含有p6+BGIos372重组载体的根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织(图2右)经染色后呈现蓝色，阴性对照(图2左)经GUS染色后颜色未发生变化。结果显示，本发明p6+BGIos372转入水稻愈伤组织。

实施例7：转基因水稻苗中GUS的表达

将实施例5中得到的愈伤组织转移至含50mg/l潮霉素B(HmB)的MS-R分化培养基(具体配方见表9)分化苗；用封口膜密封培养皿，29.5℃光照培养3-4周；待幼苗长至3-4cm时转移到含50mg/l潮霉素B(HmB)的1/2MS生根培养基(具体配方参见表10)进行生根筛选。

转基因水稻苗的GUS染色过程同实施例6中愈伤组织的染色过程。结果显示经含有p6+BGIos372重组载体的根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根和叶经染色后呈现蓝色，阴性对照的根和叶经GUS染色后颜色未发生变化。表明本发明p6+BGIos372转入水稻苗中。

实施例8：转基因水稻籽粒的性状观察

待实施例7的转基因水稻幼苗和对照幼苗在培养基中生长20天后，平行条件移栽入大田，平行条件培养至收获籽粒。转基因水稻和对照分别观察了52株，其中48株转基因水稻的籽粒饱满，且均比对照大(参见图3，其中右侧为含有BGIos372基因的转基因水稻籽粒，左侧为阴性对照)。

本发明实施例中所使用的相关培养基配方说明如下：

以下有关培养基中所称的“常规灭菌”是指如下条件的灭菌：121℃下蒸气灭菌20min。

表4N6D培养基

用1N氢氧化钾调节pH值到5.8，封口后按常规方法灭菌。

N₆macro母液(20X)：硝酸钾56.60g，磷酸二氢钾8.00g，硫酸铵9.26g，硫酸镁3.70g，氯化钙3.32g，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

N₆micro母液(1000X)：碘化钾0.80g，硼酸1.60g，硫酸锰3.33g，硫酸锌1.50g，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)：将3.73g乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78g FeSO₄.7H₂O分别溶解，混合并用。用蒸馏水定容至1000ml，70温浴2h，冷却后4℃保存不超过1个月。

N₆维生素贮存液(1000X)：维生素B₁0.10g，维生素B₆0.05g，烟酸0.05g，甘氨酸0.20g，加蒸馏水定容至100ml，过滤除菌，4℃保存不超过1周。

表5YM液体培养基(含有50mg/L Kan，10mg/L Rif)

表6YM固体培养基(含有50mg/L Kan，10mg/L Rif)

表7AAM培养基

1N氢氧化钾调节pH值至5.2，常规灭菌。

AAM macro(10X)：2.5g七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)，1.5g二水氯化钙(CaCl₂·2H₂O)，1.33g二水磷酸二氢钠(NaH₂PO₄.2H₂O)，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

AAM micro(100X)：0.7g单水硫酸锰(MnSO₄·H₂O)，0.2g七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)，0.075g碘化钾(KI)，0.3g硼酸(H₃BO₃)，25mg二水钼酸钠(Na₂MoO₄.2H₂O)，2.5mg五水硫酸铜(CuSO₄.5H₂O)，2.5mg六水氯化钴(CoCl₂.6H₂O)，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

AAM有机(1000X)：0.75g甘氨酸(Glycine)，0.1g烟酸(Nicotinic acid)，0.1g VB₆(Pyridoxine)，1g VB₁(Thiamine)，蒸馏水定容至100ml，4℃保存备用。

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)：见表2。

表8N6-AS共培养基

调pH至5.2。

N₆macro母液(20X)，N₆micro母液(1000X)，铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)，N₆维生素贮存液(1000X)：均见表2。

表9MS-R分化培养基

调PH值至5.8，常规方式灭菌。

MS macro(20X)：硝酸铵33.0g，硝酸钾38.0g，磷酸二氢钾3.4g，硫酸镁7.4g，氯化钙8.8g逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1L，4℃保存。

MS micro(1000X)：硫酸锰16.90g，硫酸锌8.60g，硼酸6.20g，碘化钾0.83g，钼酸钠0.25g，硫酸铜0.025g，氯化钴0.025g，上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1L，4℃保存。

MS维生素贮存液(1000X)：维生素B₁0.010g，维生素B₆0.050g，烟酸0.050g，甘氨酸0.200g，加蒸馏水定容至100ml，过滤除菌，4℃保存不超过1周。

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)：见表2。

表101/2MS生根培养基

调PH值至5.8。

MS macro(20X)见表9。

MS micro(1000X)MS维生素贮存液(1000X)见表9。

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)：见表4。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。