CN104004777B - 抗草甘膦基因、专用表达载体及其在获得抗草甘膦转基因小麦中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗草甘膦基因、专用表达载体及其在获得抗草甘膦转基因小麦中的应用。本发明提供的一种蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗草甘膦相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明利用小麦密码子偏好性对其进行人工设计，并在N段添加来自小麦RubisCO小亚基的叶绿体导肽，通过人工合成法获得了改造的基因，并将其应用于小麦转化时的作为筛选标记基因，获得了抗草甘膦的转基因小麦，经过研究证明，该转基因小麦的抗性高于优化前小麦的转基因抗性。

Description

抗草甘膦基因、专用表达载体及其在获得抗草甘膦转基因小麦中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及抗草甘膦基因、专用表达载体及其在获得抗草甘膦转基因小麦中的应用。

背景技术

草甘膦是美国Monsanto公司生产的除草剂农达(Roundup)的主要活性成份，具有高效、广谱、低毒、低残留、易于被微生物分解、不破坏土壤环境，对大多数植物具有灭生性等优点。自1976年研制成功以来，在农业领域得到了广泛应用，成为当今世界上生产最大的农药品种。草甘膦是一种内吸传导型除草剂，喷洒于植物茎叶后，即可被植物吸收，并迅速输导到整个植株及其根部，从而杀灭杂草，不仅能杀死地上部分，并且能作用于根部，真正做到斩草除根，可有效防除那些靠根系繁殖的多年生杂草。然而作为一种非选择型除草剂，其杀灭杂草的同时，对农作物同样具有灭生性，一定程度上限制了其使用范围和使用时间。因此，培育具有草甘膦抗性或能降解草甘膦的农作物具有重要意义，不仅可有效防控杂草，而且可减少农业生产费用。

培育抗草甘膦作物最有效的方法是将草甘膦抗性基因导入作物，从而提高转基因作物对草甘膦的抗性，达到田间喷洒控制杂草的目的。1983年Monsanto公司从根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)CP4中分离得到首个草甘膦抗性基因epsps，之后将其转入大豆，成功获得了抗草甘膦大豆，并于1996年开始商业化生产。目前，抗草甘膦转基因作物研究发展迅速，除了大豆，抗草甘膦棉花、玉米、甘蓝型油菜、白菜型油菜、苜蓿、甜菜也已获准商业化生产。另外，利用此基因已经获得抗草甘膦转基因小麦(HuTetal.,2003)。耐草甘膦作物的种植面积也在迅速递增，据ISAAA统计，2011年全球59％的转基因种植面积为耐除草剂作物，种植面积达9390万hm²，其中多数为抗草甘膦转基因作物品种。

EPSPS是细菌、真菌、藻类和高等植物莽草酸途径中芳香族氨基酸合成的一个关键酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸(S3P)合成5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸(EPSP)。草甘膦是PEP的类似物，可以竞争性地与EPSPS结合，抑制其活性，阻断芳香族氨基酸的合成，从而导致下游相关代谢受阻，扰乱植物正常代谢而使其死亡。EPSPS在植物细胞中定位于叶绿体，由细胞核合成后，在N段导肽作用下进入叶绿体，与莽草酸途径中其它酶的共同作用下，完成芳香族氨基酸的合成。因此，草甘膦抗性基因在植物体内的表达需添加叶绿体导肽。

草甘膦抗性基因的来源主要有2种，一是通过筛选抗草甘膦物种，从而克隆获得草甘膦抗性基因。目前，已在微生物Salmonellatyphimurium(Comaietal.,1985)、Agrobacteriumsp.CP4(Comaietal.,1985)、Achromobactersp.LBAA(Barryetal.,1994)、Pseudomonassp.PG2982(KishoreandJacob,1987)、S.pneumoniae(Duetal.,2000)和Staphylococcusaureus(Priestmanetal.,2005)等中发现了具有抗性的epsps基因，其中从Salmonellatyphimurium和Agrobacteriumsp.CP4中分离的epsps抗性基因，在部分作物中已批准商业化生产。二是对epsps基因突变，获得草甘膦抗性突变体。如已商业化生产的抗草甘膦玉米GA21中抗性基因是利用位点突变后克隆获得的；另外，Padgette等(1987)利用位点突变使矮牵牛EPSPS第101位的甘氨酸变为丙氨酸，突变基因表现出对草甘膦的低亲和力。

目前,国内外已克隆多个对草甘膦有一定抗性的突变体基因。新基因的分离和克隆对转基因抗除草剂植物的培育及防止抗除草剂转基因植物产生交叉抗性，具有重要意义。此外，微生物中获得的草甘膦抗性基因，如果直接转化植物，因受不同植物受体密码子使用的偏好性影响，其抗性水平不一定达到生产要求，因此，通过宿主密码子偏好性对外源基因密码子优化和改造，提高其在植物中的表达水平具有重要应用价值。GR79是从极端污染环境草甘膦抗性菌株中，分离获得的一个新型草甘膦抗性基因，此基因表达可表现出很强的草甘膦抗性活性，已申请专利(申请号PCT/CN2007/071071)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种抗草甘膦基因。

本发明提供的DNA分子，为融合基因wCTP:GR79m或其表达盒Ubi-wctp:GR79m-nos表达盒，也为抗草甘膦基因，是如下(1)-(4)中任一种的DNA分子：

(1)编码区为序列表中的序列1所示的DNA分子，其为Ubi-wctp:GR79m-nos表达盒；

(2)编码区为序列表中的序列1自5’末端第2192-3675位所示的DNA分子，为融合基因wctp:GR79m；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且与抗草甘膦相关的蛋白的DNA分子；

(4)与(1)或(2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且与抗草甘膦相关的DNA分子。

上述严格条件为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗。含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体中，得到的重组载体。在本发明中，采用pCS167作为表达载体，重组载体为将序列表中序列1所示的Ubi-wctp:GR79m-nos表达盒插入pCS167载体PacI酶切位点间得到的重组质粒。

表达载体多种，pCS167表达效果最佳，且其具有独立的可插入外源基因的T-DNA，与pCG185-GUS目的基因配合，可以通过后代分离获得无标记转基因植株。

扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物对草甘膦抗性中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述植物为单子叶植物。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将上述DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物抗草甘膦性高于所述目的植物。

上述方法中，所述DNA分子通过上述的重组载体导入目的植物。

上述方法中，所述目的植物为单子叶谷物作物，在实施例中，具体采用单子叶植物小麦。

本发明的实验证明，本发明利用小麦密码子偏好性对其进行人工设计，并在N段添加来自小麦RubisCO小亚基的叶绿体导肽，通过人工合成法获得了改造的基因，并构建了在小麦转化时将改造后的GR79基因用作为筛选标记基因和目的基因的农杆菌转化载体，通过农杆菌介导的转化，获得了抗草甘膦的转基因小麦。

附图说明

图1为pCG185-wCTP:GR79m载体结构示意图及酶切电泳图

图2为pCS167-wCTP:GR79m载体结构示意图及酶切电泳图

图3为转pCG185-wCTP:GR79m/pCS167-wCTP:GR79m的部分T₀代植株PCR检测结果

图4为T₀代部份转基因植株的Southern杂交结果

图5为转基因小麦的wCTP:GR79m表达

图6为转基因小麦的草甘膦抗性测定

图7为优化前后密码子使用度

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pClean-G185(pCG185)记载在如下文献中：TholeV.,WorlandB.,SnapeJW.,VainP.2007.ThepCLEANdualbinaryvectorsystemforAgrobacterium-mediatedplanttransformation.PlantPhysiology145:1211-1219；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

pClean-S167(pCS167)记载在如下文献中：TholeV.WorlandB.SnapeJW.VainP.2007.ThepCLEANdualbinaryvectorsystemforAgrobacterium-mediatedplanttransformation.PlantPhysiology145:1211-1219.公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

pCG185-GUS为将gus表达盒(ubi:gus:nos表达盒，核苷酸序列为序列4)通过gateway重组的LR反应同源重组到pCG185的T-DNA内插入，得到载体pCG185-GUS。

四倍体小麦Sterward，记载在如下文献中：HeY,JonesHD,ChenS,ChenXM,WangDW,LiKX,WangDS,XiaLQ.2010.Agrobacterium-mediatedtransformationofdurumwheat(TriticumturgidumL.var.durumcvStewart)withimprovedefficiency.JournalofExperimentalBotany61:1567-1581.；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

实施例1、GR79基因的优化及合成融合基因wCTP:GR79m

GR79基因从极端污染环境草甘膦抗性菌株中分离，由中国农业科学院生物技术研究所提供。优化时主要考虑以下几个方面：小麦密码子偏好性、GC含量、导肽。本发明的导肽是来自小麦RubisCO小亚基的叶绿体导肽(wCTP)。优化前后基因序列及GC含量特征见。按小麦密码子偏好性优化后的序列与原核苷酸序列同源性为73.62％，优化前后密码子使用度如图7。

优化后的GR79m基因与叶绿体导肽(wCTP)的基因结合的融合基因命名wCTP:GR79m，其核苷酸序列为序列表中的序列1自5’末端第2192-3675位核苷酸，其中序列1自5’末端第2338-3675位核苷酸为GR79m基因，自5’末端第2192-2337位核苷酸为叶绿体导肽基因wCTP。

融合基因wCTP:GR79m编码的蛋白命名为wCTP:GR79m，其氨基酸序列为序列表中的序列2，其中序列2自5’末端第50-494位氨基酸残基为GR79m，自5’末端第1-49位氨基酸残基为叶绿体导肽wCTP。

融合基因wCTP:GR79m可以人工合成。

实施例2、wCTP:GR79m基因在抗草甘膦中的应用

一、pCS167-wCTP:GR79m过表达载体的构建

pCG185-UMN载体具体构建方法为：从pAHC-PSK中扩增约2500bp的Ubi:MCS:Nos片段，引物两端加PacI位点，扩增产物PacI酶切后插入pCG185T-DNA内的PacI位点，得到中间载体pCG185-UMN。

优化后的基因由上海生工合成，并克隆到pUC57载体中，得到载体质粒pUC57-wCTP:GR79。用SpeI酶切pUC57-wCTP:GR79回收1503bpwCTP:GR79m片段，回收片段与SpeI酶切去P的pCG185-UMN载体连接，获得由Ubiqutin启动子驱动的表达载体，命名为pCG185-wCTP:GR79m，构建过程如图1A。

重组质粒pCG185-wCTP:GR79m用SpeI酶切鉴定，结果如图1B所示，正确连接会产生约6.3kb大小的载体条带和1.5kb大小的wCTP:GR79条带，鉴定正确。经测序，序列比对一致且方向正确。

将重组质粒pG185-wCTP:GR79m中用PacI酶切，回收Ubi-wctp:GR79m-nos表达盒，回收片段与PacI酶切去P的pCS167连接，得到pCS167-wCTP:GR79m表达载体，构建过程如图2A。

重组质粒pCS167-wCTP:GR79m用PacI酶切鉴定，结果如图2B所示，可以看出，如正确会产生约10.4kb大小的载体条带和4.0kb大小的Ubip-wCTP:GR79条带，酶切结果正确。

经测序，质粒pCS167-wCTP:GR79m为将序列表中序列1所示的Ubi-wctp:GR79m-nos表达盒插入pCS167载体PacI酶切位点间得到的重组质粒。

序列1所示的Ubi-wctp:GR79m-nos表达盒，其中，自5’末端第123-2162位核苷酸为Ubi启动子，2192-2337位核苷酸为wctp，2338-3675位核苷酸为GR79m，3685-3991位核苷酸为终止子nos。

二、质粒pCS167-wCTP:GR79m转入小麦得到转wCTP:GR79小麦

1、农杆菌的转化

载体pCG185-GUST-DNA内只含有gus基因，作为报告基因。载体pCS167-wCTP:GR79m有3个功能，一是作为pCG185-GUS的辅助质粒，使其在农杆菌中正常复制；另一方面作为标记基因用于植物的筛选；另外gus和wCTP:GR79m分别位于2质粒的独立T-DNA内，可通过后代分离获得无标记转基因植株。

用pCS167-bar(将序列6所示的ubi:bar:nos表达盒插入pCS167的PacI酶切位点间得到的载体)作为对照载体。

将pCG185-GUS和上述二制备的pCS167-wCTP:GR79m质粒1:1混合，参照BIO-DAD电击仪说明书，将此载体组合通过电击法转入根癌农杆菌AGL1中，命名为5G7E-AGL1(提取质粒，测序后验证正确)。

对照载体pCG185-GUS和pCS167-bar按1：1混合，按上述电击转化方法，转入根癌农杆菌AGL1中，命名为5G7B-AGL1。

2、小麦转化

取散粉后12-15天的小麦(小麦为四倍体小麦Sterward)穗子，剥取中部大而饱满的种子，用70％酒精漂洗5min，然后在10％的次氯酸钠中消毒10min，无菌水漂洗3-5次，除去残留的次氯酸钠。在超净台中分离未成熟胚，接种于共培养基上。

将1ml保存的5G7E-AGL1菌液，接种到10mlMGL^-1培养液中(含200mgL^-1Carb、100mgL^-1的Kan、1mgL^-1的Biotin)中，28℃,250rpmmin^-1暗处过夜培养，至菌液浓度OD₆₀₀达到0.5-1.0之间。

将上述菌液离心沉淀后，菌体重悬于8mlCM4C中(200μMAs)，28℃,250rpmmin^-1振荡培养1-3h，使用时每管加入120μl1％silwet(15μlml^-1)，倒入已切好的胚中，避光侵染15-30min，期间轻轻晃动几次，然后吸干菌液，将胚转移至另一培养基中，23℃-25℃暗处共培养2-3天。共培养后将胚转移至诱导培养基中诱导一周，然后转入含0.5mM草甘膦的诱导培养基上2周，之后移至再生培养基上光照培养(含0.1mM草甘膦和0.1mM3AA(其中3AA为：酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸)21天；之后移至含0.02mM草甘膦和0.1mM3AA的再生培养基上继续培养21天；继续在含0.02mM和0.1mM3AA中培养21天；抗性再生苗转移至再生培养基上恢复培养2周。存活苗移入温室土盆中，正常条件管理，得到再生小麦(优化后)。

对照载体5G7B-AGL1转化过程同5G7E-AGL1，对照载体侵染后在含草甘膦的培养基上，不能正常生在，表现为诱导后期，愈伤变黄，再生阶段无再生芽，最终未形成再生苗。

说明用5G7E-AGL1侵染转化后可在含草甘膦的培养基上获得再生苗，而对照载体侵染转化后诱导再生受到抑制，无再生苗形成。

3、转基因小麦的获得

因为gus基因和wCTP:GR79基因分别位于两双元载体的T-DNA内，会出现单独整合和共整合的情况。对存活苗分别进行，gus和wCTP:GR79mPCR检测。

根据其基因序列设计特异引物，以29棵再生小麦(优化后)叶片总DNA为模板，初步检测阳性植株。其中gusPCR检测引物为：上游引物：

5’-AGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAAC-3’，下游引物：

5’-ATCGCCGCTTTGGACATACCATCCGTA-3’；wCTP:GR79mPCR检测引物为，上游引物：

5'-GGCGGAACTATCCAAGTG-3'，下游引物：5'-CGAAATAAGCGGGACAGG-3'。

PCR反应体系为25μl，包括2.5μl10×PCRbuffer、2μl250μMdNTP、0.5μl10μM引物F0.5μl10μM引物R、rTaqDNA聚合酶0.2μl、模板DNA1μl和ddH₂O18.3μl。反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min。wCTP:GR79mPCR检测引物为：上游引物：下游引物:PCR反应体系同gus检测，反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性40s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸10min。以野生型小麦对照。

结果如图3所示，M：MarkerDL2000；P：质粒pCS167-wCTP:GR79m；CK：野生型小麦；1-22：再生小麦(优化后)；可以看出，PCR在22棵植株中可扩增出wCTP:GR79m特异条带，条带大小与预期一致，平均转化效率为2.03％。其中14棵中可同时扩增出与预期大小一致的gus特异条带，为共整合植株。具体为株系2、4、5、6、9、10、14、17、21、22为只整合有wCTP:GR79m的植株，1、3、7、8、11、12、13、15、16、18、19、20为gus和wCTP:GR79m共整合植株。

对初步获得的14棵gus和wCTP:GR79m共整合植株，GUS染色进一步确定，共整合植株叶片可出现蓝色；而只含wCTP:GR79m的植株染色无变化。

对14棵gus和wCTP:GR79m共整合植株进行wCTP:GR79m的Southern分析。用CTAB法提取叶片基因组DNA，约40μgDNA用KpnI酶切，纯化后经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，用碱转移法转到hybond-N+膜上(AmershamBiosciences)，80℃真空固定2h。southern杂交采用RochDNA地高辛标记和检测试剂盒I，随机引物法标记探针，42℃预杂交1-3h后，42℃过夜杂交。按说明书步骤洗膜，染色。杂交的原理如图4的上图所示。

杂交结果如图4下图所示，用500bp的wCTP:GR79m探针杂交。M：λ-HindIIIladder；P：质粒pCS167-wCTP:GR79m；CK：野生型小麦；1-7：gus和wCTP:GR79m共整合植株，表明wCTP:GR79m已稳定整合到小麦基因组，不同株系间拷贝数不同。

上述结果证明，14棵gus和wCTP:GR79m共整合植株为T₀代转wCTP:GR79m小麦(GM)。

三、转基因植株中wCTP:GR79m的表达水平分析

1、RNA的提取

准备工作：RNase-free离心管、RNase-free枪头、研磨棒及研钵200℃烘烤2h。RNase-freeH₂0配制的75％乙醇。具体过程：

取-80℃保存的T₀代转wCTP:GR79m小麦(GM)叶片约50-100mg，置于液氮预冷的研钵中，充分研磨至粉末状；加入1mlTransZolUp(TransGen)，用力吹吸，混匀，移至离心管中；加入200μl氯仿，剧烈震荡30S，室温孵育3min；10000rpm，4℃离心15min；转移上层水相至新离心管中，加入500μl异丙醇，混匀，室温孵育10min；10000rpm，4℃离心10min，管底及管壁出现胶状沉淀；沉淀中加入1ml75％的乙醇，剧烈漩涡使沉淀漂浮。7500rpm，4℃离心5min；弃上清，超净台放置5min，沉淀中加入50μlRNA溶解液，55℃-60℃助溶。-80℃保存。琼脂糖凝胶电泳及分光光度计检测RNA的质量和浓度。

2、cDNA第一链的合成

cDNA第一链用试剂盒合成(TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMixKit,TransGen,Beijing)。合成所用引物为Oligo(dT)₁₈，模版用量1μg。反应体系：

42℃孵育30min。85℃加热5分钟失活IIRT与gDNARemover，得都cDNA。

3、qRT-PCR

qRT-PCR用TranStartGreenqPCRSuperMix(TransGen,Beijing)试剂盒。

将上述获得的cDNA稀释10倍后用作qRT-PCR模版。引物为qE-F：

5-ACCATGGTCTAAGGCAACCG-3，qE-R:5-TTGATGCCAAGCCTCCTCAG-3。所用内参基因为小麦actin，引物序列，actin-F:5-AGGTGCCCTGAGGTGCTGTT-3，actin-R：

5-GATCCAGACACTGTATTTCCTTTCA-3。

反应体系：

反应条件为：94℃30S；94℃5S，58℃20S，72℃10S，40个循环。

根据qRT-PCR获得的wCTP:GR79mCT值和actinCT值，利用2^-△△CT法计算wCTP:GR79m在不同株系的表达水平。以表达水平高的作为对照。

结果如图5所示，wCTP:GR79m在各株系间表达水平存在差异，在株系4中表达量最高；株系2、3、5中的表达量低，分别为株系4表达量的0.05、0.03、0.03倍；株系1、6、7分别为株系4表达量的0.19、0.25、0.23倍。结合Southern结果进一步分析发现，wCTP:GR79m拷贝数与表达量间并不存在对应关系，如株系4有2个拷贝，qRT结果显示其表达量最高，而株系2有3个拷贝，株系3有1个拷贝，其表达量分别为株系4的0.05倍和0.03倍。

四、转wCTP:GR79m小麦对草甘膦抗性鉴定

将T₀代转wCTP:GR79m小麦(GM)株系4和野生型小麦(CK)同时种植温室中培育(15-24℃)，在苗期4-5片叶子时，选取15个单株进行草甘膦抗性鉴定。喷浓度为0.2％(W/V)的商品化农达(含41％草甘膦异丙氨盐),10天后观察其除草剂抗性。叶片出现发黄萎蔫症状为不抗草甘膦，叶片未出现发黄萎蔫症状为抗草甘膦。

10天后检测，结果如图6所示，T₀代转wCTP:GR79m小麦(GM)植株部分可正常生长，表明其抗草甘膦；而野生型小麦(CK)生长受到抑制，叶片不同程度发黄、萎蔫甚至死亡，表明其不抗草甘膦。

经过统计，T₀代转wCTP:GR79m小麦(GM)中57.1％表现为抗草甘膦，可正常生长；

野生型小麦(CK)全部表现为不抗草甘膦，出现发黄萎蔫症状。

上述实验表明人工优化合成的wCTP:GR79m基因对草甘膦具有一定的抗性，可应用于小麦组织培养中作为筛选基因和抗除草剂小麦生产实践。

Claims (12)

1.一种DNA分子，是如序列表中的SEQIDNO：1所示的DNA分子。

2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体。

3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于：

所述重组载体为将权利要求1所述DNA分子插入表达载体中，得到的重组载体。

4.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒。

5.含有权利要求1所述DNA分子的转基因细胞系。

6.含有权利要求1所述DNA分子的重组菌。

7.权利要求1所述DNA分子、权利要求2所述重组载体、权利要求4所述表达盒、权利要求5所述转基因细胞系或权利要求6所述重组菌在调控植物对草甘膦抗性中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物。

9.一种培育转基因植物的方法，为将权利要求1所述DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物抗草甘膦性高于所述目的植物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述DNA分子通过权利要求2所述的重组载体导入目的植物。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述单子叶植物为小麦。