CN114606249B - 编码am79 epsps蛋白的核酸分子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及编码AM79EPSPS蛋白的核酸分子及其应用。本发明根据AM79EPSPS不同区域的活性分析及单子叶植物(玉米)基因组特点，对AM79EPSPS的密码子进行了改造，经过密码子优化的AM79EPSPS基因命名为ZMAM79‑1EPSPS。通过对转AM79EPSPS基因及ZMAM79‑1EPSPS基因的作物不同转化试验的分析，本发明发现转ZMAM79‑1EPSPS基因更容易获得高表达量的转基因作物以及显著提高获得耐受高倍(4倍以上)草甘膦的转基因作物的几率。

Description

编码AM79 EPSPS蛋白的核酸分子及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及编码AM79 EPSPS蛋白的核酸分子及其应用。

背景技术

玉米(Zeamays L.)是世界上种植最广泛的农作物之一。大约30％的玉米被直接食用，70％作为饲料。玉米也是我国种植面积最广的农作物。抗除草剂作物的创制是近代农业生物技术中最活跃、最具成效的领域，抗草甘膦作物则是抗除草剂作物中的核心，其中抗草甘膦转基因大豆居于首位。

草甘膦(Glyphosate)为内吸传导型、光谱灭生性除草剂，其作用机制是通过抑制植物内5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSPS)合酶的活性，干扰植物体内芳香族氨基酸的生物合成，导致植物死亡。草甘膦具有廉价、药性温和和对人畜毒性小等优点，是全世界使用量最大的除草剂品种。但是，该除草剂是一种非选择性的除草剂，对农作物有着同样的杀死作用，为了能在作物出苗后使用草甘膦，需培育具有草甘膦抗性或降解性质的农作物。

为了培育抗草甘膦作物，从上世纪80年代，人们开始将来自细菌的外源的抗草甘膦基因导入植物细胞中，并使之在植物细胞中稳定表达，以提高转基因作物对草甘膦的耐受性，其中最成功的例子是美国Monsanto公司将从根癌农杆菌(A.tumefaciens)分离到的CP4 EPSPS基因导入植物细胞中，开发了一系列的抗草甘膦作物。AM79 EPSPS基因编码的蛋白属于5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)，氨基酸序列与报道的Agrobacterium spEPSPS酶的氨基酸序列同源性仅为22％，两者差异性显著。

植物中的内源EPSPS基因编码的EPSPS是植物体内芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)生物合成途径中的一个关键酶，而这些芳香族氨基酸都是构建细胞蛋白最基本的氨基酸。在这一生物合成途径中，EPSPS酶催化莽草酸-3-磷酸转变为3-烯醇式丙酮酸莽草酸-5-磷酸。除草剂草甘膦可以抑制植物内源EPSPS的活性，从而阻断芳香族氨基酸的合成，最终导致细胞死亡。来自于土壤的AM79 EPSPS基因编码产生的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(AM79 EPSPS)蛋白与植物内源EPSPS蛋白相比，对草甘膦的亲合力大大降低，在草甘膦存在的条件下保证了植物对芳香氨基酸的合成，从而使植物免于草甘膦的杀灭作用。

AM79 EPSPS基因是从受草甘膦污染的土壤微生物的宏基因DNA中分离而来，但由于微生物表达系统的密码子偏好性与植物十分不同，从而导致微生物基因的在植物中的表达延迟和表达降低。此前研究表明，将AM79 EPSPS基因的野生型序列直接导入玉米后不能高效表达，达不到该转基因玉米植株对草甘膦高耐受性的效果。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供适合玉米表达的编码AM79EPSPS蛋白的核酸分子及其应用。

本发明提供的编码AM79 EPSPS蛋白的核酸，包括I)～III)中至少一种：

I)、具有如SEQ ID NO:2～4任一项所示核苷酸序列的核酸；

II)、在I)所述的片段中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸；

III)、与I)或II)中任一项部分互补或完全互补的核酸。

本发明按照玉米密码子的偏好性进行优化，其中改造后的核苷酸序列SEQ ID NO：2与原始的AM79 EPSPS同源性为74.22％，而G的含量由原来的25.47％变32.66％；C的含量也由原来的20.22％变为34.23％；T的含量由原来的27.64％变为15.06％；A的含量由原来的26.67％变为18.05％，该核酸更容易获得ZMAM79-1 EPSPS基因高表达量。

本发明还提供了AM79 EPSPS蛋白的表达盒，其包括启动子、豌豆转运信号肽和本发明所述的核酸。

本发明所述的表达盒中，所述启动子为ubiquitinpromoter启动子；所述豌豆转运信号肽是来自于豌豆的叶绿体定位信号肽，其核酸序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明还提供了一种重组载体，其包括骨架载体和本发明所述的表达盒。

本发明所述的重组载体中所述骨架载体为pUC19或pCAMBIA3301。

本发明还提供了一种宿主，其转化或转染有本发明所述的重组载体。

本发明所述的宿主为大肠杆菌、农杆菌或植物细胞。

本发明所述的核酸，本发明所述的表达盒，本发明所述的重组载体或本发明所述的宿主，在构建抗草甘膦玉米中的应用。

本发明还提供了一种抗草甘膦玉米的构建方法，其将本发明提供的编码AM79EPSPS的核酸转入玉米幼胚，经筛选、培养获得抗草甘膦玉米。

本发明所述方法构建获得抗草甘膦玉米的试剂，其包括本发明提供的编码AM79EPSPS的核酸的扩增引物。

本发明提供的编码AM79 EPSPS的核酸如SEQ ID NO:2所示，扩增引物中上下游引物分别为：agtccgacgactcctactgg和gatcacctcgatggacacgg。

本发明提供的编码AM79 EPSPS的核酸如SEQ ID NO:3所示，扩增引物中上下游引物分别为：atccgccgagctgtttatcg和tcaagaatggtatcccgccc；

本发明提供的编码AM79 EPSPS的核酸如SEQ ID NO:4所示，扩增引物中上下游引物分别为：tcaaaatcgaggtggccgaa和taatggcgatgtaggacggc。

本发明根据AM79 EPSPS不同区域的活性分析及单子叶植物(玉米)基因组特点，对AM79 EPSPS的密码子进行了改造，经过密码子优化的AM79EPSPS基因命名为ZMAM79-1EPSPS。通过对转AM79 EPSPS基因及ZMAM79-1 EPSPS基因的作物不同转化试验的分析，本发明发现转ZMAM79-1 EPSPS基因更容易获得高表达量的转基因作物以及显著提高获得耐受高倍(4倍以上)草甘膦的转基因作物的几率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1所示为AM79 EPSPS基因植物表达载体图谱；

图2所示为ZMAM79-1 EPSPS基因植物表达载体图谱；

图3所示为ZMAM79-2 EPSPS基因植物表达载体图谱；

图4所示为ZMAM79-3 EPSPS基因植物表达载体图谱；

图5所示为转ZMAM79-1 EPSPS基因的玉米检测结果；

图6所示为转ZMAM79-2 EPSPS基因的玉米检测结果；

图7所示为转ZMAM79-3 EPSPS基因的玉米检测结果；

图8所示为转AM79 EPSPS基因的玉米检测结果；

图9所示为转AM79 EPSPS基因玉米田间抗性测试结果，其中CK-1:未喷施草甘膦；CK-2:喷施4倍草甘膦；1、2分别为不同的转化事件(WYN17066、WYN17136)喷施4倍浓度草甘膦后的植株；

图10所示为转ZMAM79-1 EPSPS基因玉米田间抗性测试结果，其中CK-1:未喷施草甘膦；CK-2:喷施4倍草甘膦；3、4分别为不同的转化事件(WYN17132、WYN17346)喷施4倍浓度草甘膦后的植株。

具体实施方式

本发明提供了编码AM79 EPSPS蛋白的核酸分子及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

如本文所用，“编码AM79 EPSPS蛋白的核酸”、“AM79 EPSPS基因”、“本发明提供的核酸”、“本发明所述的核酸”“本发明所述的编码AM79 EPSPS的核酸”具有相同的意义，在本文可互换使用。在本发明中，“ZMAM79-3 EPSPS”表示根据玉米密码子偏好性优化的后的抗草甘膦AM79-1 EPSPS基因。

AM79 EPSPS基因是从受草甘膦污染的土壤微生物的宏基因DNA中分离而来，野生型AM79 EPSPS基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，由1338个碱基组成，编码由445个氨基酸残基组成的AM79 EPSPS蛋白。

将野生型AM79 EPSPS基因直接导入玉米，原始基因在植物中不能高效表达，达不到对草甘膦高耐受性的效果。本发明根据AM79 EPSPS不同区域的活性分析及单子叶植物(玉米)基因组特点，对AM79 EPSPS的密码子进行了改造，改造，经过密码子优化的AM79EPSPS基因命名为ZMAM79 EPSPS。通过对转AM79 EPSPS基因及ZAM79-1 EPSPS、ZAM79-2EPSPS、ZAM79-3EPSPS基因的作物不同转化试验的分析，本发明发现转ZMAM79-1 EPSPS基因更容易获得高表达量的转基因作物以及显著提高获得耐受高倍(4倍以上)草甘膦的转基因作物的几率。

本发明中为了进一步提高AM79 EPSPS基因在玉米中的表达量，采用玉米内源ubiquitinpromoter启动子(SEQ ID NO:6所示)启动AM79 EPSPS的表达，并在AM79 EPSPS片段5’端插入豌豆转运信号肽SP序列(SEQ ID NO:5所示)。

本发明还提供了一种获得抗草甘膦转基因作物的方法。所述抗草甘膦转基因作物为转基因玉米。即本发明提供了一种构建转AM79 EPSPS基因的玉米的构建方法。本发明所述的方法包括将本发明所述的编码AM79 EPSPS蛋白的核酸转入作物中。所述转基因方法包括但不限于农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、电击法、花粉管通道法和超声波辅助农杆菌转化方法。在本发明具体实施方式中，本发明以玉米为转基因试验对象，通过农杆菌介导法进行转化。

本发明中，以PUC载体为骨架，构建表达盒。本发明中，所述pUC载体可为pUC18或pUC19。一些具体实施例中，所述骨架载体为pUC19。

本发明中，以pCambia载体为骨架，作为核酸的表达载体。本发明中，所述pCambia载体为pCAMBIA3301载体。

本发明所述的宿主为大肠杆菌，一些实施例中，所述大肠杆菌用于表达盒的构建和保存。例如，利用PUC系列载体为骨架，构建在大肠杆菌中构建获得含有表达盒的质粒载体。另一些实施例中，所述大肠杆菌用于表达载体的构建和保存。例如，利用pCambia系列载体为骨架，构建能够通过农杆菌介导转染植物细胞的表达载体。

本发明所述的宿主为农杆菌，本发明利用农杆菌介导发将本发明提供的编码AM79EPSPS蛋白的核酸转入玉米的幼胚中。

本发明所述的宿主为植物细胞，本发明所述的植物细胞为玉米的悬浮细胞或玉米的幼胚细胞。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：AM79 EPSPS密码子的优化

根据AM79 EPSPS不同区域的活性分析及玉米基因组特点，对野生型AM79 EPSPS(SEQ ID NO：1)的密码子进行了改造，设计了3种改造方案：

方案1改造后的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)与原始的AM79 EPSPS同源性为74.22％，而G的含量由原来的25.47％变为32.66％；C的含量也由原来的20.22％变为34.23％；T的含量由原来的27.64％变为15.06％；A的含量由原来的26.67％变为18.05％。

方案2，改造后的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)与原始的AM79 EPSPS同源性为74.74％，而G的含量由原来的25.47％变为30.60％；C的含量也由原来的20.22％变为32.70％；T的含量由原来的27.64％变为18.40％；A的含量由原来的26.67％变为18.13％。

方案3，改造后的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)与原始的AM79 EPSPS同源性为73.77％，而G的含量由原来的25.47％变为30.80％；C的含量也由原来的20.22％变为30.20％；T的含量由原来的27.64％变为18.50％；A的含量由原来的26.67％变为20.60％。

具体见下表1：

表1方案1～3密码子优化

实施例2：优化后ZMAM79-1 EPSPS、ZMAM79-2 EPSPS、ZMAM79-3EPSPS植物表达载体的构建

按照实施例1的方案分别合成了AM79 EPSPS及密码子优化后的ZMAM79-1 EPSPS、ZMAM79-2 EPSPS、ZMAM79-3 EPSPS，同时合成基因的5’端添加了BamHI的酶切位点，3’端添加了SacI的酶切位点。利用BamH I、Sac I消化合成的DNA，回收目标基因片段，并在序列两端分别引入BamH I、Sac I酶切位点；克隆豌豆转运信号肽SP序列(SEQ ID NO:5所示)，并在序列两端分别引入Pst I和BamHI酶切位点。克隆玉米内源ubiquitin promoter启动子序列(SEQ ID NO:6所示)，并在序列两端分别引入HindIII和Pst I酶切位点。

BamHI+Sac I处理AM79 EPSPS及密码子优化后的ZMAM79-1 EPSPS、ZMAM79-2EPSPS、ZMAM79-3 EPSPS序列和PUC19载体并连接，获得ZMAM79-1 EPSPS-PUC19、ZMAM79-2EPSPS-PUC19、ZMAM79-3EPSPS-PUC19载体和AM79 EPSPS-PUC19载体。PstI+BamHI处理SP序列和ZMAM79-1 EPSPS-PUC19、ZMAM79-2 EPSPS-PUC19、ZMAM79-3EPSPS-PUC19载体及AM79EPSPS-PUC19载体并连接，获得SP-ZMAM79-1EPSPS-PUC19、SP-ZMAM79-2 EPSPS-PUC19、SP-ZMAM79-3EPSPS-PUC19载体和SP-AM79 EPSPS-PUC19。

Hind III+Pst I酶切处理ubiquitinpromoter启动子序列并将其连入用Hind III+Pst I处理的SP-ZMAM79-1 EPSPS-PUC19、SP-ZMAM79-2EPSPS-PUC19、SP-ZMAM79-3 EPSPS-PUC19载体及SP-AM79EPSPS-PUC19，获得UBI-SP-ZMAM79-1 EPSPS-PUC19、UBI-SP-ZMAM79-2EPSPS-PUC19、UBI-SP-ZMAM79-3 EPSPS-PUC19载体和UBI-AM79 EPSPS-PUC19载体。

Ase I+BstE II处理pCAMBIA3301载体和左端为Ase I+Hind III、右端为Sac I+BstE II的DNA片段，连接后获得改造后的pCAMBIA3301载体。

Hind III+Sac I酶切UBI-SP-ZMAM79-1 EPSPS-PUC19、UBI-SP-ZMAM79-2 EPSPS-PUC19、UBI-SP-ZMAM79-3 EPSPS-PUC19载体及UBI-AM79 EPSPS-PUC19载体和改造后的pCAMBIA3301载体，接入pCAMBIA3301载体，获得命名为zmam79-1-pC3301(图2)、zmam79-2-pC3301(图3)、zmam79-3-pC3301(图4)和am79-pC3301(图1)的载体。

实施例3：抗草甘膦基因ZMAM79-1 EPSPS、ZMAM79-2 EPSPS、ZMAM79-3 EPSPS在转基因玉米中的表达

1、转ZMAM79-1 EPSPS、ZMAM79-2 EPSPS、ZMAM79-3 EPSPS抗草甘膦玉米的获得

转基因玉米的获得方法为农杆菌介导的遗传转化方法，具体方法为：

1.1农杆菌感受态的制备：

1)含有辅助Ti质粒的农杆菌单菌落)(2-3mm)接种于5mlYEP培养基中，28℃过夜培养。

2)取1ml过夜培养物与含有100mlYEP的250ml三角瓶中，并在28℃

下，剧烈震荡(250rpm)培养至OD值为0.5-0.6；

3)取50ml培养物置于冰上冷却5min，4℃，5000rpm，离心5min；

4)A：弃去上清液，用1ml冰冷的0.1M CaCl₂溶液重悬沉淀菌体，分装重悬物于Eppendorf小试管内(0.1ml/管)，用于后续试验；

B：弃去上清液，用1ml冰冷的0.1M CaCl₂溶液重悬沉淀菌体，分装重悬物于Eppendorf小试管内(0.1ml/管)，并添加15％的甘油，液氮速冻后，-80℃保存；

1.2质粒的转化(冻融法)：

1)A：直接取分装后的感受态农杆菌，加入1-2ug质粒，轻轻混匀。

B：取-80℃保存的感受态菌株的Eppendorf小试管一支，在冰上溶解后，加入1-2ug质粒，轻轻混匀；

2)冰上放置30min，液氮速冻5min；

3)将小管放于37℃水浴中5min，冻融细胞；

4)加入1ml培养基与试管内，28℃，200rpm，振荡培养2-4h。

5)4℃，5000rpm，离心30s，弃去上清液，再用0.1mlYEP培养基重悬沉淀细胞；

涂布重悬物于含有20ug/ml Rif和50ug/ml kanamycin的YEP平板上，28℃共育。2-3d后转化克隆出现。

1.3农杆菌浸染

(1)农杆菌的培养：取农杆菌划线培养(固体YEP，含卡那霉素50～100mg/L，利福平40mg/L)，挑单菌落接种于10mLYEP液体培养基(含卡那霉素50～100mg/L，利福平40mg/L)中，28℃、200rpm振荡培养过夜，生长至对数生长期，然后按1:50的接种量转接于50mLYEP液体培养基(含卡那霉素50mg～100mg/L，利福平40mg/L)中，继续震荡培养，至OD600值为0.6～0.8左右，离心后用浸染液重新悬浮菌体，调菌液浓度为OD600为0.4～0.6，并加入AS(终浓度100μmol/L)备用；或者用活化后的农杆菌菌液涂固体YEP平板，28℃培养3天，刮下菌体悬浮于浸染液0.5～2h，调菌液浓度为OD600为0.4～0.6，并加入AS(终浓度100μmol/L)备用。

(2)剥胚

授粉后9～13天玉米未成熟雌穗，胚约1～1.5mm大小，70％乙醇中浸泡20分钟，超净台上取出幼胚，幼胚放入装有浸染液的2ml EP管中，每管100个左右。

(3)浸染及共培养

EP管中的幼胚用移液枪吹打清洗一遍，吸干浸染液。用含有目的基因的农杆菌菌液(OD600＝0.4～0.6)侵染10min(上下缓慢颠倒EP管)，倒入共培养基上，用枪头吸干菌液，盾片朝上均匀摆放，暗培养3天(23℃)。同时设置未经农杆菌浸染的幼胚对照。

(4)延迟筛选培养

共培养3d后，挑取生长良好的幼胚，盾片朝上转接到延迟筛选培养基上，28℃暗培养5d。

(5)筛选培养

转至筛选培养基上进行抗性愈伤组织筛选，28℃暗培养进行筛选，每12-14d更换一次培养基，筛选2～3轮。转接过程中淘汰已死亡和严重褐化的愈伤组织，保留质地酥松、颜色淡黄、生长良好的胚性愈伤组织，以及褐化愈伤组织上长出的新愈伤组织。

(6)预分化培养

将在筛选培养基继续增长的幼胚转至预分化培养基，28℃暗培养15～20d。

(7)分化培养

增长明显的抗性愈伤组织转到分化培养基上分化和壮苗，分化培养的条件为28℃、光照14～16h条件下培养至幼苗出现。长势较好的抗性愈伤早期可转接在一个培养瓶中，后期要及时转接出去；若愈伤组织只分化出丛生杂乱的叶片，没有成型的植株，则将丛生苗从靠近根部的地方切掉，再转接至分化培养基重新分化。

(8)生根培养

将分化成型的抗性植株小心取出，切去根部多余组织和部分杂乱根系(注意不要切得过多；若两棵或更多植株生长在一起，不要过度分割，以防将幼苗切散)，转至生根培养基生根。

(9)、移栽

待根系生成后(大概15天，3条以上根系，3cm长)炼苗(在组培间将培养瓶盖拧开，盖在瓶口，3天后瓶苗长出瓶口，植株明显生长，瓶中若有菌落出现及时拿走至温室，加入少量去离子水继续炼苗)、移栽(炼苗3天后植株洗干净培养基，直接移栽，第一次水浇透，放置阴凉通风处或地下温室避免灯光直接照射)、检测(PCR检测抗性植株，及时淘汰阴性植株)。

(10)PCR检测

移栽成活后的幼苗大约在1周左右长出新叶，取一片新叶做检测材料，进行PCR鉴定。根据基因序列，利用Primer 5.0软件分别设计上游引物ZMAM-1-F、ZMAM-2-F、ZMAM-3-F和下游引物ZMAM-1-R、ZMAM-2-R、ZMAM-3-R。引物序列如表2所示:

表2

PCR反应体系为20μL反应体系：基因组DNA1.0μL因组；2×TSINGKE mastermix(杭州擎科生物科技有限公司)10.0μL；ZMAM-F 0.5μL；ZMAM-R0.5μL；ddH2O 8.0μL。

程序为：94℃3min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，30循环后72℃延伸10min。图3-图5表示36个不同ZMAM79-1 EPSPS、ZMAM79-2 EPSPS、ZMAM79-3 EPSPS基因转化植株(表3)均有目标基因的整合。泳道M为DNA分子量标记DL5000，泳道13为质粒DNA阳性对照，泳道14为野生型玉米，泳道15(阴性对照W)为水，泳道1-12为不同的转化事件，ZMAM79-1 EPSPS、ZMAM79-2 EPSPS、ZMAM79-3 EPSPS分别可以扩增437bp、465bp、423bp左右大小特异片段的即为含有目标基因的转基因阳性植株。

转AM79 EPSPS玉米的检测上游引物为：AM-F:5’-gacagcatgtaagggtg cca-3’，下游引物为AM-R:5’-acgcttggtcagacataggc-3’，图4表示12个AM79EPSPS基因不同转化植株(表3)均有目标基因的整合。泳道M为DNA分子量标记DL5000，泳道13为质粒DNA阳性对照，泳道14为野生型玉米，泳道15(阴性对照W)为水，泳道1-12为不同的转化事件，可以扩增出474bp左右大小特异片段的即为含有目标基因的转基因阳性植株。

表3

2、目的基因蛋白表达量检测

通过ELISA检测的方法对喷施草甘膦后的12个AM79 EPSPS基因转化事件和36个ZMAM79-1 EPSPS、ZMAM79-2 EPSPS、ZMAM79-3 EPSPS基因转化事件进行蛋白表达量检测，分别取每个事件从上到下第二片叶及从上到下第二节茎作为样品，每个事件设置3个重复。采用t检验的方法对四个基因不同事件相同组织的蛋白表达量进行差异性分析(P<0.05)，结果如表4密码子优化前后蛋白表达量(ng/g.fwt)分析所示，优化前后蛋白表达量差异显著,密码子优化后其在玉米的叶和茎组织的蛋白表达量分别明显高于优化前，ZMAM79-1EPSPS、ZMAM79-2 EPSPS、ZMAM79-3 EPSPS在叶片中的表达量分别约为优化前的67、49、43倍，在茎组织的表达量约为优化前的88、67、54倍，这说明优化后的EPSPS基因密码子特征更适合在玉米中表达，而优化后的ZMAM79 EPSPS基因更容易获得有效的转化事件，主要取决于优化后的EPSPS基因密码子特征更适合在玉米中表达。

表4密码子优化前后蛋白表达量(ng/g.fwt)分析

注：同行不同字母表示具有极显著差异(P＜0.01)。

3、转基因玉米田间草甘膦抗性测试

于田间控制环境下对获得的12个转AM79 EPSPS基因转化事件和12个转ZAM79EPSPS基因转化事件进行4倍浓度草甘膦(商品化的41％草甘膦异丙胺盐溶剂)，根据中国农业部农业部953号公告-11.1-2007(转基因植物及其产品环境安全检测抗除草剂玉米)判定其药害情况，植株没有药害的条件下表明该转基因植株拥有足够的草甘膦抗性。我们对AM79 EPSPS及ZMAM79-1 EPSPS、ZMAM79-2 EPSPS、ZMAM79-3 EPSPS基因分别构建了植物转化载体并转化了玉米，各获得了12个转化事件(表3)，通过对表达量最好的ZMAM79-1 EPSPS的12个转化事件田间抗性鉴定结果表明：转化AM79 EPSPS基因的12个转化事件在喷施4倍浓度草甘膦后，均有不同的药害产生。

图9示.转AM79 EPSPS基因的玉米田间抗性鉴定结果，CK-1为未喷施草甘膦的野生型植株，CK-2为喷施4倍草甘膦的野生型植株，1、2分别为不同的转化事件(WYN17058、WYN17072)喷施4倍浓度草甘膦后的植株。而转化ZMAM79-1 EPSPS基因的12个转化事件在喷施4倍浓度草甘膦后，12个转化事件生长均没有受到任何程度的影响，图10.转ZAM79 EPSPS基因的玉米田间抗性鉴定结果，CK-1为未喷施草甘膦的野生型植株，CK-2为喷施4倍草甘膦的野生型植株，3、4分别为不同的转化事件(WYN17132、WYN17188)喷施4倍浓度草甘膦后的植株。这说明优化后的ZAM79 EPSPS基因更容易获得有效的转化事件。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江新安化工集团股份有限公司

<120> 编码AM79 EPSPS蛋白的核酸分子及其应用

<130> MP21036232

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcacatt ctacctctag gtccccatgg tccaaggcta ctgagtacca tgaggcactt 60

gtaacaccaa cctcgaacaa gattaacggt gaaatatttg tacctggctc aaagagctat 120

accaatcgag ctctaatcat tgctgcttta gcagagggga cttctacact taagggaata 180

ttaaagagtg atgattccta ctggtgtatt gatgccttaa ggaggcttgg cattaagatc 240

gaggttgccg aagagacggt caccattcat ggctgtggag gaaaatggcc agttcaatct 300

gcagagcttt ttattggggc tgcaggtacc attgcccgct tccttccagg agccttagct 360

gttgcccagc aaggggagtg gatcgtagat ggggttccac aactgcgaga aagaccatta 420

aaacctttag tggatgcctt aactcagctt ggtggtagaa tagagtatct gactgagcat 480

ccgggtctgc ctttacgagt aaagggggca ggtctaagtg gacagcatgt aagggtgcca 540

ggaaatgtct ctagccaatt tttaagtggt ttattaatcg ccagtcctta tgcctcagaa 600

gctgtcagca ttgaggtaat caatggactc gttcaaccgt cttacattgc cattacgatt 660

cagttaatga gagaatttgg tgccaaagtg gagcataatg aggattacag tctctttaag 720

gtttacccta ctggatacca aggtcgtgat accatacttg aggcagatgc ttcaacagcc 780

tgctattttc tatccttagc agcgttaact ggaggtacca tccaggtgaa gaatgttggc 840

tatcattcgt atcagccaga tgctcgtttc attgatgtgt tagagcaaat gggctgtgaa 900

gtgattaaga atgagtcatt cctagaggtt acaggcccaa cccgattaaa gggtggcttc 960

gaggtggata tgaagcctat gtctgaccaa gcgttgacca taggcgcatt agctcctttt 1020

gcagatgcac cgattcgggt aaccaatgtc gctcacatta gggctcatga gtcagaccgg 1080

atagctgtta tttgttcctc gttacagcag atgggagttc aggtagagga gagagaggat 1140

ggctttacta tctatccagg tcagccagtg ggtacaacgc ttaatcctca tgatgatcat 1200

cgtaatgcaa tggtattcgg tttacttgga gtaaaagtac cacatattag aatagtcgat 1260

ccgggttgtg tatctaagac ctgcccagcc tattttgaag agctgcagaa gtttggaata 1320

catgtggagt ataattga 1338

<210> 2

<211> 1341

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtcccact ccacctccag gtccccgtgg tccaaggcca ccgagtacca cgaggccctg 60

gtgacgccga cctccaacaa gatcaacggc gagatcttcg tgccgggctc caagtcctac 120

accaacaggg ccctgatcat cgccgccctg gccgagggca cctccaccct gaagggcatc 180

ctgaagtccg acgactccta ctggtgcatc gacgccctga ggaggctggg catcaagatc 240

gaggtggccg aggagaccgt gaccatccac ggctgcggcg gcaagtggcc ggtgcagtcc 300

gccgagctgt tcatcggcgc cgccggcacc atcgccaggt tcctgccggg cgccctggcc 360

gtggcccagc agggcgagtg gatcgtggac ggcgtgccgc agctgaggga gaggccgctg 420

aagccgctgg tggacgccct gacccagctg ggcggcagga tcgagtacct gaccgagcac 480

ccgggcctgc cgctgagggt gaagggcgcc ggcctgtccg gccagcacgt gagggtgccg 540

ggcaacgtgt cctcccagtt cctgtccggc ctgctgatcg cctccccgta cgcctccgag 600

gccgtgtcca tcgaggtgat caacggcctg gtgcagccgt cctacatcgc catcaccatc 660

cagctgatga gggagttcgg cgccaaggtg gagcacaacg aggactactc cctgttcaag 720

gtgtacccga ccggctacca gggcagggac accatcctgg aggccgacgc ctccaccgcc 780

tgctacttcc tgtccctggc cgccctgacc ggcggcacca tccaggtgaa gaacgtgggc 840

taccactcct accagccgga cgccaggttc atcgacgtgc tggagcagat gggctgcgag 900

gtgatcaaga acgagtcctt cctggaggtg acgggcccga ccaggctgaa gggcggcttc 960

gaggtggaca tgaagccgat gtccgaccag gccctgacca tcggcgccct ggccccgttc 1020

gccgacgccc cgatcagggt gacgaacgtg gcccacatca gggcccacga gtccgacagg 1080

atcgccgtga tctgctcctc cctgcagcag atgggcgtgc aggtggagga gagggaggac 1140

ggcttcacca tctacccggg ccagccggtg ggcaccaccc tgaacccgca cgacgaccac 1200

aggaacgcca tggtgttcgg cctgctgggc gtgaaggtgc cgcacatcag gatcgtggac 1260

ccgggctgcg tgtccaagac ctgcccggcc tacttcgagg agctgcagaa gttcggcatc 1320

cacgtggagt acaactagtg a 1341

<210> 3

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtcccact ccacctcccg ctccccatgg tccaaggcca ccgagtacca cgaggccctc 60

gtgaccccga cctccaacaa gatcaacggc gagatcttcg tgcccggctc caagtcctac 120

accaacaggg ccctcatcat cgccgccctc gcggagggca cgtccacact taagggcatt 180

ttgaagtccg acgactccta ctggtgcatt gacgccctgc gccgcctggg gatcaagatc 240

gaggtggccg aggagaccgt taccattcac ggctgcggcg gcaagtggcc ggtgcaatcc 300

gccgagctgt ttatcggcgc ggccgggaca atcgccaggt ttcttccggg cgccctggcc 360

gtggcccagc agggcgagtg gatcgttgat ggggtgccgc agctgaggga gcggcctctt 420

aagcccctgg tggacgccct gacgcagctg ggcggcagaa tcgagtacct gaccgagcat 480

ccgggcctcc cgcttagggt gaagggcgct ggcctttccg gccagcacgt gagagtgccg 540

ggcaacgtgt cctcccaatt cctctctggg ctgctgatcg cctcccccta cgcatccgag 600

gcggtctcca ttgaggtgat caatgggttg gtgcagccgt cctacattgc cattaccatc 660

cagctgatgc gcgagttcgg cgccaaggtg gagcacaacg aggattactc tctgttcaag 720

gtttacccga ccggctacca ggggcgggat accattcttg aggccgacgc ctccaccgcc 780

tgctacttcc tgtctttggc cgccctgacc ggcggcacca tccaggttaa gaacgtgggg 840

taccactcct accagccgga cgctaggttc atcgacgtcc tggagcagat gggctgcgag 900

gtgatcaaga acgagtcctt tctcgaggtg acgggcccga ccaggctgaa ggggggcttc 960

gaggtggaca tgaagccgat gtccgaccag gccctgacca ttggcgcgtt ggcgccgttc 1020

gccgacgccc caatccgcgt tacgaatgtg gcgcacatca gggcccacga gtctgaccgg 1080

atcgccgtga tctgctcctc cctgcagcag atgggcgtgc aggtggagga gagggaggat 1140

ggcttcacca tctacccggg ccagccggtt ggcaccaccc tcaacccgca cgacgaccac 1200

agaaacgcca tggtcttcgg cctcctcggg gttaaggtcc cgcacattag gatcgtggac 1260

ccgggctgcg tgagcaagac ctgcccggct tacttcgagg agcttcaaaa gttcggcatc 1320

cacgttgagt acaactga 1338

<210> 4

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtcccact ccacctcccg ctccccatgg tccaaggcca ccgagtacca cgaggccctc 60

gtgaccccga cctccaacaa gatcaacggc gagatcttcg tgcccggctc caagtcctac 120

accaacaggg ccctcatcat cgccgccctc gcggaaggca cgtccacctt gaagggcatt 180

ctgaaatccg acgacagcta ctggtgcatc gacgccctgc gcaggctcgg catcaaaatc 240

gaggtggccg aagagaccgt gacgatccat gggtgtggcg gcaagtggcc ggtgcagtcc 300

gccgaattgt ttatcggcgc cgccgggaca atagccaggt tcctcccggg cgctctggcc 360

gttgcccagc aaggagagtg gatcgttgat ggggtgccgc agctgcgcga gaggcctttg 420

aagccgctgg tggacgccct tacgcaactg ggggggagga tcgaatacct gaccgaacat 480

ccgggcctcc cgctgagggt gaagggcgct ggtctgtctg gccagcacgt gcgcgtgccg 540

ggtaacgtgt ccagtcagtt cctctctggg ttgctgatcg cctcccccta cgcctccgaa 600

gcggtctcca tcgaagtgat caatgggctg gtgcagccgt cctacatcgc cattactatt 660

caacttatgc gcgaattcgg cgccaaggtg gagcacaatg aggactactc cctgtttaag 720

gtgtacccga ccggctacca ggggagggat accattctgg aggccgatgc cagcaccgcc 780

tgttacttcc tgtccctggc cgcgttgacc ggcggaacga ttcaggtcaa gaacgtgggg 840

taccacagct accagccgga tgcgaggttc atcgacgtgc tggagcagat gggctgtgag 900

gtgatcaaaa acgaaagttt cctggaggtg acgggcccga caaggctgaa aggggggttc 960

gaggtggaca tgaagccgat gtccgatcag gcgctgacca taggcgcgct ggccccattt 1020

gccgacgcgc caatccgcgt taccaacgtg gcgcacatca gggctcacga gagtgacaga 1080

atcgccgtga tctgctcctc cctgcagcag atgggcgtgc aggttgaaga gagggaggat 1140

gggtttacca tatatccggg ccaaccggtg ggcaccaccc tgaacccgca cgacgaccac 1200

agaaacgcga tggtcttcgg cctcctcggc gtgaaggtcc cgcatattag gattgtggac 1260

ccgggctgcg tgtctaaaac atgcccggcc tactttgaag agctgcagaa atttggcatc 1320

cacgtggagt acaactga 1338

<210> 5

<211> 171

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggcttcta tgatatcctc ttccgctgtg acaacagtca gccgtgcctc tagggggcaa 60

tccgccgcag tggctccatt cggaggcctg aaatccatga ctggattccc agtgaagaag 120

gtcaacactg acattacttc cattacaagc aatggtggaa gagtaaagtg c 171

<210> 6

<211> 1981

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcagcgtga cccggtcgtg cccctctcta gagataatga gcattgcatg tctaagttat 60

aaaaaattac cacatatttt ttttgtcaca cttgtttgaa gtgcagttta tctatcttta 120

tacatatatt taaactttac tctacgaata atataatcta tagtactaca ataatatcag 180

tgttttagag aatcatataa atgaacagtt agacatggtc taaaggacaa ttgagtattt 240

tgacaacagg actctacagt tttatctttt tagtgtgcat gtgttctcct ttttttttgc 300

aaatagcttc acctatataa tacttcatcc attttattag tacatccatt tagggtttag 360

ggttaatggt ttttatagac taattttttt agtacatcta ttttattcta ttttagcctc 420

taaattaaga aaactaaaac tctattttag tttttttatt taataattta gatataaaat 480

agaataaaat aaagtgacta aaaattaaac aaataccctt taagaaatta aaaaaactaa 540

ggaaacattt ttcttgtttc gagtagataa tgccagcctg ttaaacgccg tcgacgagtc 600

taacggacac caaccagcga accagcagcg tcgcgtcggg ccaagcgaag cagacggcac 660

ggcatctctg tcgctgcctc tggacccctc tcgagagttc cgctccaccg ttggacttgc 720

tccgctgtcg gcatccagaa attgcgtggc ggagcggcag acgtgagccg gcacggcagg 780

cggcctcctc ctcctctcac ggcaccggca gctacggggg attcctttcc caccgctcct 840

tcgctttccc ttcctcgccc gccgtaataa atagacaccc cctccacacc ctctttcccc 900

aacctcgtgt tgttcggagc gcacacacac acaaccagat ctcccccaaa tccacccgtc 960

ggcacctccg cttcaaggta cgccgctcgt cctccccccc cccccctctc taccttctct 1020

agatcggcgt tccggtccat ggttagggcc cggtagttct acttctgttc atgtttgtgt 1080

tagatccgtg tttgtgttag atccgtgctg ctagcgttcg tacacggatg cgacctgtac 1140

gtcagacacg ttctgattgc taacttgcca gtgtttctct ttggggaatc ctgggatggc 1200

tctagccgtt ccgcagacgg gatcgatttc atgatttttt ttgtttcgtt gcatagggtt 1260

tggtttgccc ttttccttta tttcaatata tgccgtgcac ttgtttgtcg ggtcatcttt 1320

tcatgctttt ttttgtcttg gttgtgatga tgtggtctgg ttgggcggtc gttctagatc 1380

ggagtagaat tctgtttcaa actacctggt ggatttatta attttggatc tgtatgtgtg 1440

tgccatacat attcatagtt acgaattgaa gatgatggat ggaaatatcg atctaggata 1500

ggtatacatg ttgatgcggg ttttactgat gcatatacag agatgctttt tgttcgcttg 1560

gttgtgatga tgtggtgtgg ttgggcggtc gttcattcgt tctagatcgg agtagaatac 1620

tgtttcaaac tacctggtgt atttattaat tttggaactg tatgtgtgtg tcatacatct 1680

tcatagttac gagtttaaga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat 1740

gtgggtttta ctgatgcata tacatgatgg catatgcagc atctattcat atgctctaac 1800

cttgagtacc tatctattat aataaacaag tatgttttat aattattttg atcttgatat 1860

acttggatga tggcatatgc agcagctata tgtggatttt tttagccctg ccttcatacg 1920

ctatttattt gcttggtact gtttcttttg tcgatgctca ccctgttgtt tggtgttact 1980

t 1981

Claims (10)

1.编码AM79 EPSPS蛋白的核酸，其核酸序列如SEQ ID NO: 2~4任一项所示。

2.AM79 EPSPS蛋白的表达盒，其包括启动子、豌豆转运信号肽和权利要求1所述的核酸。

3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于，所述启动子为ubiquitin promoter启动子；所述豌豆转运信号肽的核酸序列如SEQ ID NO:5所示。

4.重组载体，其包括骨架载体和权利要求2或3所述的表达盒。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述骨架载体为pUC19或pCAMBIA3301。

6.宿主，其转化或转染有权利要求4或5所述的重组载体且不是植物细胞。

7.根据权利要求6所述的宿主，其特征在于，其为大肠杆菌或农杆菌。

8.权利要求1所述的核酸，权利要求2或3所述的表达盒，权利要求4或5所述的重组载体或权利要求6或7所述的宿主，在构建抗草甘膦玉米中的应用。

9.抗草甘膦玉米的构建方法，其特征在于，将权利要求1所述的核酸转入玉米幼胚，经筛选、培养获得抗草甘膦玉米。

10.检测权利要求9所述方法构建获得抗草甘膦玉米的试剂，其特征在于，包括权利要求1所述核酸的扩增引物；

编码AM79 EPSPS的核酸如SEQ ID NO:2所示，则扩增引物中上下游引物分别为：agtccgacgactcctactgg和gatcacctcgatggacacgg；

编码AM79 EPSPS的核酸如SEQ ID NO:3所示，则扩增引物中上下游引物分别为：atccgccgagctgtttatcg和tcaagaatggtatcccgccc；

编码AM79 EPSPS的核酸如SEQ ID NO:4所示，则扩增引物中上下游引物分别为：tcaaaatcgaggtggccgaa和taatggcgatgtaggacggc。