CN111134006A - 一种转基因玉米核雄性不育保持系及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转基因玉米核雄性不育保持系及应用，所述保持系是将外源T‑DNA载体导入玉米基因组构建而成，导入的外源T‑DNA中除了雄性核不育的育性恢复基因以外，还包含如下3种功能片段中至少2个功能片段：1)在种子胚乳中表达一种荧光蛋白质的表达框；2)一种可以抑制玉米抗除草剂基因CYP81A9表达的DNA片段；3)一种可以抑制玉米胚乳特异表达的细胞壁转化酶InCW2表达的DNA片段。本发明同时利用上述三种区分转基因与非转基因方法中至少2种方法，进一步降低仅仅依靠一种区分(或选择)方法可能导致的错误。

Description

一种转基因玉米核雄性不育保持系及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种转基因玉米核雄性不育保持系及其应用。

(二)背景技术

杂交优势的利用给粮食的增产最重要的技术之一。玉米生产中通常通过2个自交系杂交制备杂交种子。杂交种子比较自交种子在生产上更加具有产量、抗性等方面的优势。在生产上目前大部分的杂交种子的生产仍然通过人工或者机械去雄的方法，成本高，工作量大。而且在生产杂交种的过程中由于环境的变化可能导致去雄完成后植株又雄穗化，或去雄不完全，从而导致母本自交授粉，影响杂交种子纯度。

雄性不育系统提供了简单高效的制备杂交玉米种子的手段。比较成熟的杂交技术体系是基于核-质互作雄性不育(CMS)自交系的三系杂交制种体系。该技术包括3个主要材料：1)不育系：雄性不育材料；2)保持系：可以为不育系提供花粉，使不育系的后代仍为不育系；3)恢复系：可以恢复不育系的育性。不育系与恢复系杂交产生F1，即用于农业生产的杂交种。更具体的说，核-质互作不育型，表现为核-质互作遗传。不但需要细胞质有不育基因S，而且需要细胞核里有纯合的不育基因(rf/rf)，二者同时存在，方能使植株表现为雄性不育。CMS三系杂交制种体系存在恢复系比较难找、技术体系复杂等缺陷，在玉米制种上推广面积仍然比较小。

利用核基因隐性不育基因是玉米杂交制种的另外一个可能的技术路线。控制雄性不育的核基因隐性纯合(ms/ms)植株才会表现为雄性不育，由于雄性不育植株无法自交，因此只能通过杂合植株(Ms/ms)与其杂交，才会得到雄性不育植株(ms/ms)。但是在同一果穗上雄性不育籽粒(ms/ms)与可育的杂合籽粒(Ms/ms)同时存在，无法简单通过物理方法分辨。

目前一种利用隐性核不育基因制备杂交玉米种子的新方法已经报道(Wu et al.,Plant Biotechnology,14:1046-1054；An et al.,Molecular Plant 12,343-359；Wu etal.,Shukla et al.,Molecular Biotechnology 59,445-457；美国专利7,612,251)。这种方法利用转基因的不育保持系制备非转基因的核雄性不育玉米种子。这个方法的技术要点是：转基因玉米保持系是在一个隐性核不育纯合系(如ms45/ms45)中导入了包含如下表达框的外源DNA：1)一个正常野生型的雄性育性基因(例如，Ms45)，其功能是互补导致雄性核不育基因(如ms45)从而挽救育性；2)一个种子颜色的标记基因(荧光蛋白质基因)；3)一个在花粉中表达的α-淀粉酶基因，导致转基因花粉因为没有淀粉而不能萌发。这个技术体系中纯合隐性不育基因(如ms45/ms45)被转基因导入的野生型基因(如MS45)互补而表现为雄性可育。同时由于转基因的花粉因其表达的α-淀粉酶而不能萌发，因此外源基因是不能纯合的。不带外源DNA的50％花粉(非转基因)能够成功授粉于纯合的核性不育(如ms45/ms45)的雌配子，从而获得雄性不育玉米种子。这些种子可以作为玉米杂交制种的母本。由于导入的外源DNA包含一个在胚乳中表达的荧光蛋白质基因，包含有外源DNA并且可育的种子因此可以与不包含外源DNA的雄性不育种子可以利用荧光特征而区分。这种技术可以简化玉米杂交制种的程序，降低成本。

中国发明专利CN102960234B披露了另外一种利用转基因的不育保持系制备非转基因的核不育玉米的方法。该方法的特点是利用种子大小而不是种子荧光蛋白质的荧光区分雄性不育种子和雄性可育种子。其技术方案是构建了干扰玉米胚乳特异表达的细胞壁转化酶(endosperm-specific cell wall invertase，InCW2)基因(Cheng et al.Plant Cell8:971–983)的干扰表达框，将该基因沉默。InCW2沉默后玉米籽粒变小。这种技术区别雄性不育种子和雄性可育种子的方法非常简单。

但是无论是利用表达荧光蛋白质还是利用玉米籽粒大小作为区分雄性不育和雄性可育的种子的方法仍然可能在一定程度存在不足。区分雄性不育和可育种子的错误都可以导致杂交种子的纯度降低，并且将转基因玉米传播到食物链(雄性不育玉米是非转基因玉米)。为了提高制种纯度，本发明提供了同时利用2种选择性状，通过2次筛选以获得纯度更高的雄性不育种子的技术路线。本发明的方法比现有的方法更加能够提高雄性不育系玉米的纯度并且防止转基因恢复系进入大田生产体系。特别是，本发明创造性地将转基因玉米的选择性杀灭技术应用于提高雄性不育系玉米的纯度。在玉米中通过RNA干扰抑制耐除草剂基因CYP81A9的表达可以导致转基因玉米对烟嘧磺隆等除草剂敏感。这些转基因玉米可以被被烟嘧磺隆等除草剂选择性杀灭(Li,Jing,et al.，2013，Plos One 8(12):e81645)。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种转基因玉米核雄性不育保持系的构建与应用。这种转基因保持系的种子的特点是利用2种或多种与雄性不育系种子区别的标记，能够进一步降低和防止转基因保持系种子混入商业杂交种的风险。本发明综合利用了包括种子荧光颜色标记、种子形状大小标记技术以及除草剂敏感性标记(转基因玉米可以被选择性杀灭)，而以前的技术仅仅利用一个标记，如荧光蛋白质标记(Wu et al.,Plant Biotechnology,14:1046-1054；美国专利7,612,251),或者控制种子大小的标记(中国专利CN102960234B)。

本发明需要利用雄性核不育玉米材料，表1例举了部分目前已经报道的雄性核不育玉米材料，它们控制的基因已经被克隆或可以被克隆。已知不育基因的雄性不育材料也可以通过基因编辑的方法获得核雄性不育的玉米材料。例如，通过基因编辑的方法可以获得ms45和ms26的雄性不育突变体(Svitashev et al.,Nature Communications 7,13274)。本发明以表1中的一个雄性不育突变体ms45为例，提供一种利用隐性核不育玉米制备杂交种子的方法。下文通过说明和阐述提供了更为详细的描述，但这并非意欲对本发明的范围加以限制。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种转基因玉米核雄性不育保持系，所述转基因玉米保持系是将外源T-DNA载体导入玉米基因组构建而成，所述外源T-DNA载体中除了雄性核不育的育性恢复基因Ms45表达框(即不育系育性恢复表达框)以外，还包含如下3种功能片段中至少2个：1)在种子胚乳中表达荧光蛋白的表达框(即使得保持系种子与不育系种子相比具有肉眼可见的颜色上的显著差异的表达框)；2)一种可以抑制玉米抗除草剂基因CYP81A9(nsf1)表达的功能片段(即植物内源抗除草剂基因的沉默或敲除表达框)，3)一种可以抑制玉米胚乳特异表达的细胞壁转化酶(endosperm-specific cell wall invertase/InCW2)表达的功能片段(即使得保持系种子与不育系种子相比具有肉眼可见的形状上的显著差异的表达框)。

进一步，优选所述外源T-DNA载体中除了雄性核不育的育性恢复基因以外，还包含如下2个表达框：1)在种子胚乳中表达一种荧光蛋白质的表达框；2)一种可以抑制玉米抗除草剂基因CYP81A9表达的功能片段。

进一步，优选所述外源T-DNA载体中除了雄性核不育的育性恢复基因以外，还包含至少如下2个表达框：1)在种子胚乳中表达一种荧光蛋白质的表达框；2)一种可以抑制玉米胚乳特异表达的细胞壁转化酶(InCW2)的功能片段。

进一步，优选所述外源T-DNA载体中除了雄性核不育的育性恢复基因以外，还包含至少如下2个表达框：1)一种可以抑制玉米抗除草剂基因CYP81A9表达的功能片段；2)一种可以抑制玉米胚乳特异表达的细胞壁转化酶(InCW2)的功能片段。

本发明所述雄性核不育的育性恢复基因表达框由启动子、育性恢复基因、终止子功能性连接组成，该表达框所表达的功能蛋白质回补了核不育玉米中突变失去的雄性育性功能基因，从而可以恢复核不育玉米的雄性育性。本发明优选能够恢复ms45核不育玉米(ms45/ms45)育性的基因表达框，即Ms45基因表达框。Ms45基因需要与能够启动其适当表达的启动子和终止子功能性连接，这些启动子和终止子可以有多重选择，比较优先的选择是这些基因的天然启动子和终止子。能够驱动在植物中适当表达的启动子和终止子已经有大量文献资料。根据需要可以选择表达水平和表达时空合适的启动子。例如，美国专利5,689,049披露的启动子5126可以驱动花药(anther)特异表达，是启动Ms45基因的优选启动子之一。

表1：由核基因引起的雄性不育突变体

本发明所述在种子胚乳中表达荧光蛋白质的表达框是由启动子、荧光蛋白质基因和终止子功能性连接而成。这个表达框的荧光蛋白质基因可以是红色荧光蛋白质(redfluorescent gene)、青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein gene)、黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein gene)、绿色荧光蛋白(green fluorescent proteingene)、花青素p1基因(anthocyanin p1 gene)等。这些荧光蛋白基因在胚乳中的表达，使获得的转基因种子可以通过简单的物理方法与没有表达这些基因的种子区分开来。这个表达框的启动子是能够驱动在玉米胚乳中高表达的启动子。优选的启动子是玉米或水稻的胚乳储存蛋白质的启动子。例如水稻的GluA-1、GluA-2、GluA-3、GluB-3、GluB-5和GluC启动子(Qu et al.,J Exp Bot.59:2417–2424；Xu et al.,Plant Cell,Tissue and OrganCulture,128:125–132)，玉米的α-zein启动子(Joshi et al.,Physiol Mol Biol Plants21:35–42)等。一些组成型启动子也可以启动基因在胚乳中较高地表达。水稻或者玉米的胚乳储存蛋白质的信号肽可以用来与这些荧光蛋白质融合，使这些蛋白质表达以后能够适当存储和积累。这些启动子、编码带有信号肽的荧光蛋白质的核苷酸序列以及终止子的核苷酸序列，通过功能性连接而形成完整的荧光蛋白质的表达框。用于构建表达框的终止子可以是CaMV的35S终止子，也可以是其它在玉米中具有功能的终止子。例如，SEQ ID No.5的序列是一个能够在胚乳中表达红色荧光蛋白质的表达框。

本发明所述抑制玉米胚乳特异表达的细胞壁转化酶(endosperm-specific cellwall invertase，InCW2)基因表达的功能片段可以通过不同的原理构建。本发明优选以双链RNA干扰InCW2表达的方法。抑制表达框的具体构建方法如下：1)构建一个DNA片段，其二端是分别来自InCW2的一个DNA片段以及这个片段的反向重复序列片段。在这二个DNA片段中间加入一个其他任何DNA片段，优选是InCW2基因的部分内含子序列。由于这个片段中存在2个反向重复InCW2基因序列片段，转录这个DNA片段获得的RNA就可以形成发夹结构的双链RNA(dsRNA)。这个反向重复序列片段的5’端与一个启动子功能性连接，3’端与一个终止子功能性连接，形成一个DNA功能片段。这个功能片段的启动子可以是能够启动组成型表达的启动子或者启动胚乳中特异性表达的启动子，优选启动子是InCW2基因的天然启动子；终止子可以是在玉米中具有终止子功能的不同种类的终止子，包括InCW2基因的天然终止子。构建这个抑制表达片段使用的DNA序列来自InCW2(SEQ ID NO:8)，其长度和位置可以不同，抑制效果可以通过实验测定，选择抑制效率比较高的构建片段。SEQ ID No.6(其中第7bp-950bp为InCW2启动子；第977bp-1930bp为能够形成靶向InCW2基因的双链RNA功能片段；第1931bp-2150bp为CaMV的35S终止子)提供了一种能够干扰InCW2表达的功能片段的核苷酸序列，这个功能片段能够导致玉米种子变小。

基因沉默技术是一个成熟的技术(Agrawal et al.,Microbiol Mol BiolRev.67:657–685)，抑制InCW2基因表达的方法还有：1)反义RNA方法，这个方法是让转基因植物产生一个靶标基因的反义RNA以抑制对应基因的表达；2)人工miRNA方法，这个方法设计一个能够抑制靶标基因表达的人工miRNA(Schwab et al.Plant Cell 18,1121–1133)。

本发明所述抑制玉米抗除草剂基因CYP78A9表达的功能片段可以通过不同的原理构建。以双链RNA干扰CYP78A9表达的方法为例，通过沉默植物内源耐除草剂基因来实现，由“组成型启动子-发夹RNA-终止子”构成。CYP81A9基因RNA干扰功能片段具体构建方法如下：1)构建一个DNA片段，其二端是分别来自CYP78A9的一个DNA片段以及这个片段的反向重复序列片段。在这二个DNA片段中间加入一个其他任何DNA片段，优选是来自CYP78A9基因的内含子序列。由于这个片段中存在2个反向重复CYP78A9基因序列片段，转录这个DNA片段获得的RNA就可以形成发夹结构的双链RNA(dsRNA)。这个反向重复序列片段的5’端与一个启动子功能性连接，3’端与一个终止子功能性连接，形成一个DNA功能片段。这个功能片段的启动子可以是能够启动组成型表达的启动子，如CaMV的35S启动子；终止子可以是在玉米中转基因研究中常用的终止子，如CaMV的35S终止子。构建这个抑制表达片段使用的CYP78A9基因序列来自SEQ ID NO:9。这个片段转录获得的dsRNA的长度和序列可以不同，其抑制效果可以通过实验进行测定，选择抑制效率比较高的构建片段。

抑制玉米抗除草剂基因CYP78A91表达的方法还可以：1)反义RNA方法，这个方法是让转基因植物产生靶标基因CYP78A9的反义RNA以抑制CYP78A9基因的表达；2)人工miRNA方法(Schwab et al.Plant Cell 18,1121–1133)。利用这个方法可以设计一个能够抑制靶标基因CYP78A9表达的人工miRNA功能片段。

转基因玉米中包含抑制玉米抗除草剂基因CYP78A9表达的功能片段可以导致转基因玉米对除草剂烟嘧磺隆、苯达松等除草剂敏感，从而这些转基因玉米可以被除草剂选择性地杀灭。

本发明所述转基因玉米核雄性不育保持系的外源T-DNA质粒中还可以同时包括以下的表达框：

1)在花粉中表达的α-淀粉酶的表达框(即导致含有上述表达框的花粉不育的表达框)。通过导入一个使花粉失活的基因来实现，由“启动子-α-淀粉酶-终止子”构成，优选表达框核苷酸序列为SEQ ID.NO：4(其中第13bp-2053bp为pPg47启动子；第2054bp-2278bp为BRITTLE1(BT1)基因的淀粉体的信号肽序列；第2279bp-3838bp为淀粉酶基因编码区；第3839bp-4039bp为终止子)所示。这个表达框的启动子可以是PG47和ZM13启动子(Hamiltonet al.,Plant Mol.Biol.38:663-669)。这个表达框的α-淀粉酶可以是Bacillusstearothermophilus的α-淀粉酶(gb：A24549)，或者玉米的淀粉酶基因(gb:ADH43281.1)，也可以是其它来源的α-淀粉酶。将α-淀粉酶的信号肽切除，然后用来自BRITTLE1(BT1)基因的淀粉体的信号肽(Sullivan et al,Plant Cell 3:1337–1348)替换。这个表达框所表达的产物可以导致玉米花粉缺乏淀粉而不能萌发，进而导致雄性不育。这样就可以实现转基因玉米的外源DNA保持是杂合状态，而不是纯合状态。

2)选择标记表达框(即除草剂抗性基因表达框)。赋予保持系一种或多种除草剂抗性，通过导入一个耐除草剂基因来实现，由“启动子-抗除草剂基因-终止子”构成。优选除草剂抗性基因表达框为草铵膦耐受基因bar表达框，序列如SEQ ID No.2(其中第1bp-2002bp为pUbi启动子；第2052bp-2600bp为bar基因编码区；第2610bp-2947bp为rbcs终止子)所示。抗草甘膦基因表达框或者抗草铵膦表达框是常用的选择标记表达框。例如利用草甘膦作为筛选化合物的方法已有详细描述(Howe et al.,Molecular Breeding 10:153–164；Zhouet al.,Plant Cell Reports 15,159-163)。采用的启动子优选组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子p35S(Odell,Joan T.,Ferenc Nagy,and Nam-Hai Chua,1985,Nature,810-812)、水稻的Actin1启动子pAct1(McElroy D,Zhang W,Cao J,et al.,1990,The Plant Cell,2:163-171.)、玉米Ubiquitin启动子pUbi(Christensen A H,Sharrock RA,Quail P H,1992,Plant molecular biology,18:675-689)及其具有类似表达模式的启动子；抗除草剂基因可以是抗草甘膦基因CP4-EPSPS(孟山都公司)、G10(中国专利：2011100093290)，抗草铵膦基因bar(Thompson C J,Movva N R,Tizard R,et al,1987，TheEMBO journal,6(9):2519.)及其具有类似功能的基因。

进一步，本发明所述外源T-DNA载体包含如下表达框：1)Ms45表达框；2)红色荧光蛋白质表达框；3)CYP78A9基因抑制表达功能片段；4)花粉中表达的α-淀粉酶的表达框；5)选择标记表达框。

另一种T-DNA可以是包含如下表达框：1)Ms45表达框；2)InCW2抑制表达功能片段；3)CYP78A9基因抑制表达功能片段；4)花粉中表达的α-淀粉酶的表达框；5)选择标记表达框。

还有一种T-DNA可以是包含如下表达框：1)Ms45表达框；2)红色荧光蛋白质表达框；3)InCW2抑制表达功能片段；4)花粉中表达的α-淀粉酶的表达框；5)抗草铵膦基因表达框。

能够实现本发明目的的包含这些表达框和功能片段的其它T-DNA同样可以通过一般分子生物学方法构建。并且，这些表达框和功能片段的方向和次序的不同并不能影响实现本发明的目的。

本发明还提供一种含所述转基因玉米核雄性不育保持系中T-DNA载体的植物细胞。

将包含上述几个表达框的DNA构建体通过农杆菌介导的方法或者其它方法导入到玉米。玉米的遗传转化是成熟的技术，这个领域的一般技术人员就可以实现。相关转化方法已经多次公开发表，例如Yadava et al.,Front.Plant Sci.7:1949。转化获得的转化体需要进一步选择以获得实现本发明目的所需要的转化体。

导入了本发明提供的外源基因的玉米转化体可以通过回交转育将外源基因整合到核雄性不育的玉米基因组中。利用雄性不育杂合基因型Ms45/ms45植株与筛选获得的转化体植株进行多次回交，从而将包含外源MS45恢复基因导入到雄性纯合不育突变体ms45中，获得基因型Ms45/-,ms45/ms45的植株。由于导入的外源基因中野生型MS45基因的存在，转基因植株(Ms45/-,ms45/ms45)表现为可育。

当转基因杂合体植株(基因型Ms45/-,ms45/ms45)自交时，会产生两种后代，一种为不含有外源转基因序列的雄性不育籽粒(ms45/ms45)，该不育籽粒可以被任意一种野生型植株(Ms45/Ms45)恢复育性，在制种过程中可作为不育系(母本)；另一种为籽粒雄性育性被恢复(Ms45/-,ms45/ms45)，可以作为恢复系制备下一季不育系种子。

本发明的主要技术目的是确保雄性不育玉米(ms45/ms45)中没有混杂包含外源基因的雄性育性被恢复的转基因玉米(Ms45/-,ms45/ms45)。而本发明的关键技术措施是采用了至少二种清除转基因玉米的方法，大幅度降低雄性不育玉米中混杂雄性育性被恢复的转基因玉米(Ms45/-,ms45/ms45)的可能性。

本发明提供一种所述转基因玉米核雄性不育保持系在制备非转基因核不育种子中的应用，所述应用的方法为：将转基因玉米核雄性不育保持系与纯合隐性不育系间隔种植，通过下列方法之一筛选非转基因核不育种子：

(1)当导入的外源基因包含荧光蛋白质和抑制CYP78A9表达功能片段的转基因玉米时：通过荧光识别去除绝大部分的转基因雄性可育籽粒，获得的雄性不育种子在制种过程中，在雄性不育母本生长到2-8叶时期进一步喷洒足够剂量的烟嘧磺隆和/或苯达松杀灭混杂的转基因玉米。这样就进一步排除了转基因雄性可育的玉米株，进一步提高杂交玉米的纯度。

(2)当导入的外源基因包含荧光蛋白质和抑制InCW2表达功能片段的转基因玉米时：通过荧光识别就可以去除绝大部分的转基因雄性可育籽粒，获得的雄性不育种子进一步去除籽粒比较小(如，至少比平均重量小30％以上)的种子。可能混杂的转基因种子(雄性可育)就可以被进一步去除。这样通过2个性状的选择，进一步排除了雄性可育的玉米株，提高杂交玉米的纯度。

(3)当导入的外源基因包含抑制CYP78A9表达功能片段和抑制InCW2表达功能片段的转基因玉米时：通过去除小种子(至少比平均重量小30％以上)排除绝大部分的转基因雄性可育籽粒，获得的雄性不育种子在制种过程中，在雄性不育母本生长到2-8叶时期进一步喷洒足够剂量的烟嘧磺隆和/或苯达松杀灭混杂的转基因玉米。

与现有的技术相比，本发明的优点要体现在：本发明同时利用上述三种区分转基因与非转基因方法中至少2种方法，进一步降低仅仅依靠一种区分(或选择)方法可能导致的错误。

(四)附图说明

图1.含有雄性生育力恢复基因Ms45及籽粒选择基因的三种T-DNA结构示意图(TWS-HC，TWS-HS和TWS-CS)。LB：T-DNA左边界；RB：T-DNA右边界；pPg47-Amy：在花粉中表达的α-淀粉酶基因表达框；p5126-MS45：Ms45(野生型)基因表达框；pGt1-red：在胚乳中特异性表达的红色荧光蛋白质表达框；CYP81A9-RNAi:产生dsRNA抑制CYP81A9基因表达的功能片段；InCW2-RNAi：产生dsRNA抑制InCW2基因的表达的功能片段；pUbi-Bar：抗草铵膦基因表达框；bar：抗草铵膦基因编码序列。抗草铵膦基因作为玉米转化的选择基因。p35S：CaMV的35S启动子；35sT：CaMV的35S终止子。箭头方向是5’到3’，即启动子、基因和终止子的顺序。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

在不背离本发明的精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换均属于本发明的范围。本文使用的DNA及其载体的构建方法是分子生物学一般的方法。大部分DNA片段可以根据提供的核苷酸序列人工合成，简化构建过程。

实施例1、T-DNA载体构建

1、为了构建转化玉米的T-DNA载体，分别合成或者构建以下DNA片段：

(1)合成包含来自CYP81A9(nsf1)的反向重复DNA序列片段(核苷酸序列如SEQ IDNo.1)。该片段转录为RNA时能够形成双链RNA(dsRNA)，能够干扰CYP81A9的表达。序列两边都设置了限制性内切酶位点XhoI。这个片段的3’端与CaMV的35S启动子连接，5’端与CaMV的35S终止子连接，形成一个可以抑制抗除草剂基因CYP81A9表达的功能片段，核苷酸序列如SEQ ID No:10所示(其中第1bp-781bp为CaMV的35S启动子；第788bp-2428bp为能够形成靶向CYP81A9基因的双链RNA功能片段；第2436bp-2619bp为CaMV的35S终止子)，命名为nsf1-RNAi(p35S-CYP81A9-RNAi-35sT)。

(2)合成抗草铵膦基因编码序列，序列如SEQ ID No.7所示，命名bar，序列两端分别设置XhoI限制性酶切位点。

(3)合成草铵膦耐受基因bar表达框(即除草剂抗性基因表达框)DNA片段。核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，命名为pUbi-Bar，包含了启动子，bar基因和终止子(其中第1bp-2002bp为pUbi启动子；第2052bp-2600bp为bar基因编码区；第2610bp-2947bp为rbcs终止子)。序列5’端依次设置EcoRI和HpaI限制性酶切位点，3’端设置EcoRI限制性酶切位点。

(3)育性恢复基因Ms45的表达框(即不育系育性恢复表达框)，序列如SEQ ID No.3所示(其中第7bp-511bp为p5126启动子；第512bp-2059bp为Ms45基因编码区；第2060bp-2462bp为Ms45终止子)，命名p5126-Ms45。这个序列包括了启动子、Ms45编码序列和终止子，序列两端分别设置HpaI限制性酶切位点。序列5’端设置HpaI限制性酶切位点，3’端依次设置KpnI和HpaI限制性酶切位点。

(4)花粉中特异表达的淀粉酶表达框(即导致含有上述表达框的花粉不育的表达框)，序列如SEQ ID No.4所示，命名pPg47-Amy，包括了启动子、淀粉酶蛋白质编码序列和终止子(其中第13bp-2053bp为pPg47启动子；第2054bp-2278bp为BRITTLE1(BT1)基因的淀粉体的信号肽序列；第2279bp-3838bp为淀粉酶基因编码区；第3839bp-4039bp为终止子)。序列5’端依次设置KpnI和HpaI限制性酶切位点，3’端设置HindIII限制性酶切位点。

(5)玉米种子特异表达的红色荧光蛋白基因表达框(即使保持系种子与不育系种子相比具有物理性状显著差异的表达框)。序列如SEQ ID No.5(其中第7bp-845bp为Gt1启动子；第846bp-917bp为Gt1蛋白信号肽；第918bp-1622bp为红色荧光蛋白基因基因编码区；第1639bp-1825bp为终止子)所示，命名pGt1-Red，包括了启动子、蛋白质编码序列和终止子。序列两端分别设置HindIII限制性酶切位点。

(6)抑制InCW2基因表达的RNA干扰功能片段(即使得保持系种子与不育系种子相比具有肉眼可见的显著差异的功能片段)。序列如SEQ ID No.6所示，命名为InCW2-RNAi，序列两端分别设置HindIII位点。

2、构建包含pGt1-Red和nsf1-RNAi功能片段的T-DNA载体

以双元载体pCambia1300为基础，利用XhoI酶切位点，把pCambia1300载体中自带的的抗潮霉素基因hptII置换为CYP81A9基因RNAi片段(SEQ ID No.1)，获得载体pCambia1300-nsf 1-RNAi。然后利用酶切位点EcoRI把人工合成的pUbi-Bar(SEQ ID No.2)克隆到pCambia1300-nsf1-RNAi中，获得载体pCambia1300-nsf1-RNAi-pUbi-bar。再利用酶切位点HpaI把p5126-Ms45片段(SEQ ID No.3)连入载体pCambia1300-nsf1-RNAinsf1-RNAi-pUbi-bar中，获得载体pCambia1300-nsf1-RNAi-pUbi-bar-p5126-Ms45。然后，利用KpnI和HindIII，把pPg47-Amy片段(SEQ ID No.4)连入载体pCambia1300-nsf1-RNAi-pUbi-bar-p5126-Ms45中，获得载体pCambia1300-nsf1-RNAi-pUbi-bar-p5126-Ms45-pPg47-Amy载体。最后，通过HindII，把人工合成的pGt1-red(SEQ ID No.5)连入载体pCambia1300-nsf1-RNAi-pUbi-bar-p5126-Ms45-pPg47-Amy中，获得载体pCambia1300-nsf1-RNAi-pUbi-bar-p5126-Ms45-pPg47-Amy-pGt1-red，这个载体命名为：TWS-HC，该载体中的T-DNA序列的结构如图1所示。

3、构建包含nsf1-RNAi和InCW2-RNAi功能片段的T-DNA载体

将载体pCambia1300-nsf1-RNAi-pUbi-bar-p5126-Ms45-pPg47-Amy-pGt1-red中的pGt1-red片段替换成人工合成的InCW2-RNAi片段(SEQ ID No.6)即可。最终获得载体pCambia1300-nsf1-RNAi-pUbi-bar-p5126-Ms45-pPg47-Amy-InCW2-RNAi，这个载体命名为TWS-HS，该载体中的T-DNA序列的结构如图1所示。

4、构建包含InCW2 RNAi和pGt1-Red功能片段的T-DNA载体

以双元载体pCambia1300为基础，利用XhoI酶切位点，把其中自带的抗潮霉素基因hptII置换为bar基因(SEQ ID No.7)片段，获得pCambia1300-p35S-bar的载体。利用KpnI和HindIII，把pPg47-Amy片段(SEQ ID No.4)连入载体pCambia1300-p35S-bar，获得pCambia1300-p35S-bar-pPg47-Amy载体。然后，再利用酶切位点HpaI把p5126-Ms45片段(SEQ ID No.3)连入载体pCambia1300-p35S-bar--pPg47-Amy中，获得载体pCambia1300-p35S-bar-p5126-Ms45-pPg47-Amy。最后，通过HindIII，把人工合成的pGt1-red(SEQ IDNo.5)和InCW2-RNAi(SEQ ID No.6)连入载体pCambia1300-p35S-bar-pPg47-Amy-p5126-Ms45中，获得载体pCambia1300-p35S-bar-pPg47-Amylase-p5126-Ms45-pGt1-red-InCW2-RNAi，这个载体命名为：TWS-CS，该载体中的T-DNA序列的结构如图1所示。

最后，通过电转的方法把上述T-DNA质粒转入农杆菌LB4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。

实施例2、玉米转化

玉米的转化方法已经比较成熟，例如Frame等描述了利用农杆菌转化玉米的方法(Frame et al.,(2002)Plant Physiol,129:13-22)或(Yadava et al.,Front.PlantSci.7:1949)。分别取含载体TWS-HC、TWS-HS和TWS-CS的农杆菌(即含T-DNA载体的农杆菌)划板，挑单菌落接种，准备转化用农杆菌。玉米转化中所用受体为自交系HiIIA和HiIIB的杂交F1代。取授粉后8-12天的玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小为1.0-1.5mm)。将含有T-DNA载体的农杆菌与未成熟胚共培养2-3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(培养基中含有200mg/L的Timentin，用于杀灭农杆菌)，28℃暗培养10-14天。将所有的愈伤转到带有终浓度2mM草铵膦的筛选培养基上(Frame et al.,(2002)Plant Physiol,129:13-22)，28℃暗培养2-3周。转移所有的组织到新鲜含终浓度2mM草铵膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上，26℃光照培养直到根发育完全，然后移植到温室中单株培养，检测转基因玉米的抗除草剂能力。用稀释200倍的拜耳的18％的草铵膦水剂喷洒，7天后叶片发黄，枯死的为阴性；和喷清水对照长势一样的为阳性植株，分别获得用载体TWS-HC、TWS-HS和TWS-CS转化获得的转基因玉米品系。

实施例3转化体选择

对来自实施例2的转基因植株进行评估，选择同时满足如下3个条件的转化体：1)能够挽救纯合不育背景下(ms45/ms45)玉米的育性；2)目的基因控制的种子荧光、大小或除草剂敏感性等性状显著；3)转基因的花粉不能萌发。

首先，选择的转化体都必须在纯合的ms45不育背景下(ms45/ms45)表现为雄性可育，即转化体具有雄性不育的恢复能力。方法是：将雄性不育杂合子(ms45/Ms45,表现为可育)的花粉受到转基因植株的玉米棒子上，在后代中选择背景是Ms45/ms45的转基因玉米(Ms45(外源)/-,ms45/Ms45)，自交。从自交后代中选择背景是ms45/ms45的转基因玉米(Ms45(外源)/-,ms45/ms45)，检测花粉的活性。如果花粉的活性正常，说明该转化体基因能够恢复雄性的育性能力。选择转基因玉米可以通过喷洒草甘膦(1倍大田建议剂量)实现，只有转基因玉米株才能成活。选择ms45的基因型可以通过分子标记技术实现。

其次，根据转化的T-DNA特征选择性状优良的转化体。

利用载体TWS-HC获得的转化体，选择的主要依据是同时满足：1)转基因种子具有明显的红色荧光；2)该转基因玉米可以被大田使用剂量1倍的烟嘧磺隆杀灭。

利用载体TWS-CS获得的转化体，选择的主要依据是同时满足：1)转基因种子具有明显的红色荧光；2)转基因玉米籽粒比同样遗传背景的不含有外源基因的籽粒显著小。优选小50％或以上的转化体。

利用载体TWS-HS获得的转化体，选择的主要依据是同时满足：1)转基因玉米籽粒比同样遗传背景的不含有外源基因的籽粒显著小，并优选小50％或以上的转化体；2)该转基因玉米可以被大田使用剂量1倍的烟嘧磺隆杀灭。

最后，通过花粉管萌发试验，选择大约50％的花粉管萌发困难的转化体。

实施例4将野生型自交系(Ms45Ms45)转变为纯合隐性自交系(ms45/ms45)

以ms45纯合隐性突变体为母本，与不同的优良自交系，如郑58，杂交。获得的F1继续与郑58回交，对获得的BC1群体进行基因型分析，鉴定Ms45位点为杂合的植株继续与郑58回交。如此回交5代后，利用分子标记筛选Ms45位点为杂合，其他位点均为郑58的单株进行自交，从而获得ms45纯合隐性自交系郑58(ms45/ms45)，该自交系即可作为不育系。

实施例5将外源基因导入ms45纯合隐性自交系

将实施例4中的回交5次的后代郑58(杂合子ms45/Ms45)与实施例3中选择获得的转基因植株杂交，选择带有隐性ms45和外源基因的后代，然后再以实施例4中回交5次的郑58后代(杂合子ms45/Ms45)作为轮回亲本进行5代回交，选择遗传背景与郑58相似、带有隐性ms45和外源基因的单株。如此5代回交以后，选择选择遗传背景与郑58高度相似、带有隐性ms45和外源基因的单株进行自交，并从自交后代中选择含ms45隐性纯合基因的转基因自交系(Ms45/-,ms45/ms45)。

实施例6提高雄性不育种子的纯度

利用载体TWS-HC获得的转基因雄性不育保持系制备的不育母本，通过荧光识别就可以去除绝大部分的转基因雄性可育籽粒，在雄性不育母本生长到2-8叶时期，进一步喷洒1倍的烟嘧磺隆大田建议使用剂量，可能混杂的转基因植株(雄性可育)就可以被杀灭而去除。这样就进一步排除了雄性可育的玉米株，进一步提高杂交玉米的纯度。

利用载体TWS-CS获得的转基因雄性不育保持系制备的不育母本，通过荧光识别就可以去除绝大部分的转基因雄性可育籽粒。获得的雄性不育种子进一步去除籽粒比较小(比雄性不育种子平均重量小30％以上)的种子。可能混杂的转基因种子(雄性可育)就可以被进一步去除。这样就进一步排除了雄性可育的玉米株，进一步提高杂交玉米的纯度。

利用载体TWS-HS获得的转基因雄性不育保持系制备的不育母本，通过去除小种子(至少比雄性不育种子平均重量小30％以上)排除绝大部分的转基因雄性可育籽粒。获得的雄性不育种子在制种过程中，在不育母本生长到2-8叶时期进一步喷洒1倍的大田建议烟嘧磺隆使用剂量。可能混杂的转基因植株(雄性可育)就可以被杀灭而去除。这样就进一步排除了雄性可育的转基因玉米株，进一步提高杂交玉米的纯度。

实施例7利用雄性不育保持系大规模扩繁雄性不育自交系(ms45/ms45)

以郑58自交系为例，将实施例5中的雄性不育保持系郑58(Ms45/-,ms45/ms45)与雄性不育系郑58(ms45/ms45)间隔种植，每一行雄性不育保持系郑58(Ms45/-,ms45/ms45)，种5行雄性不育系郑58(ms45/ms45)。由于提供花粉的雄性不育保持系郑58产生的活性花粉都是非转基因花粉(转基因花粉不能够萌发)，从获得雄性不育系郑58(ms45/ms45)植株上获得的种子仍然都是非转基因的雄性不育种子。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种转基因玉米核雄性不育保持系及应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1653

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

ctcgagttct ccatgcgcct ggggacccgg cgcgccgtgg tcgtgtcgtc gccggactgc 60

gccagggagt gcttcacgga gcacgacgtg aacttcgcga accggccgct gttcccgtcg 120

atgcggctgg cgtccttcga cggcgccatg ctctccgtgt ccagctacgg cccgtactgg 180

cgcaacctgc gccgcgtcgc cgccgtgcag ctcctctccg cgcaccgcgt cgggtgcatg 240

gcccccgcca tcgaagcgca ggtgcgcgcc atggtgcgga ggatggaccg cgccgccgcg 300

gccggcggcg gcggcgtcgc gcgcgtccag ctcaagcggc ggctgttcga gctctccctc 360

agcgtgctca tggagaccat cgcgcacacc aagacgtccc gcgccgaggc cgacgccgac 420

tcggacatgt cgaccgaggc ccacgagttc aagcagatcg tcgacgagct cgtgccgtac 480

atcggcacgg ccaaccgctg ggactacctg ccggtgctgc gctggttcga cgtgttcggc 540

gtgaggaaca agatcctcga cgccgtgggc agaagggacg cgttcctggg gcggctcatc 600

gacggggagc ggcggaggct ggacgctggc gacgagagcg aaagtaagag catgattgcg 660

gtgctgctca ctctgcagaa gtccgagcca gaggtctaca ctgacactgt gatcactgag 720

atctacagac tatgtcaaca taaagcacaa caaattcaat atctaatttt agtattaaaa 780

aagacaccta aatttttagc gaatcctata ctttggcgga tagtagagtc cggagtgttg 840

acgactaaac tgagaaaacg ggcaactttt tttgtatttt gtgaggataa gagagtgacg 900

tatggtagaa gaagaagcac tcaccgcgca aagagcagtg atcacagtgt cagtgtagac 960

ctctggctcg gacttctgca gagtgagcag caccgcaatc atgctcttac tttcgctctc 1020

gtcgccagcg tccagcctcc gccgctcccc gtcgatgagc cgccccagga acgcgtccct 1080

tctgcccacg gcgtcgagga tcttgttcct cacgccgaac acgtcgaacc agcgcagcac 1140

cggcaggtag tcccagcggt tggccgtgcc gatgtacggc acgagctcgt cgacgatctg 1200

cttgaactcg tgggcctcgg tcgacatgtc cgagtcggcg tcggcctcgg cgcgggacgt 1260

cttggtgtgc gcgatggtct ccatgagcac gctgagggag agctcgaaca gccgccgctt 1320

gagctggacg cgcgcgacgc cgccgccgcc ggccgcggcg gcgcggtcca tcctccgcac 1380

catggcgcgc acctgcgctt cgatggcggg ggccatgcac ccgacgcggt gcgcggagag 1440

gagctgcacg gcggcgacgc ggcgcaggtt gcgccagtac gggccgtagc tggacacgga 1500

gagcatggcg ccgtcgaagg acgccagccg catcgacggg aacagcggcc ggttcgcgaa 1560

gttcacgtcg tgctccgtga agcactccct ggcgcagtcc ggcgacgaca cgaccacggc 1620

gcgccgggtc cccaggcgca tggagaactc gag 1653

<210> 2

<211> 2953

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

gaattcgtta accgcccggg cgtgcagcgt gacccggtcg tgcccctctc tagagataat 60

gagcattgca tgtctaagtt ataaaaaatt accacatatt ttttttgtca cacttgtttg 120

aagtgcagtt tatctatctt tatacatata tttaaacttt actctacgaa taatataatc 180

tatagtacta caataatatc agtgttttag agaatcatat aaatgaacag ttagacatgg 240

tctaaaggac aattgagtat tttgacaaca ggactctaca gttttatctt tttagtgtgc 300

atgtgttctc cttttttttt gcaaatagct tcacctatat aatacttcat ccattttatt 360

agtacatcca tttagggttt agggttaatg gtttttatag actaattttt ttagtacatc 420

tattttattc tattttagcc tctaaattaa gaaaactaaa actctatttt agttttttta 480

tttaataatt tagatataaa atagaataaa ataaagtgac taaaaattaa acaaataccc 540

tttaagaaat taaaaaaact aaggaaacat ttttcttgtt tcgagtagat aatgccagcc 600

tgttaaacgc cgtcgacgag tctaacggac accaaccagc gaaccagcag cgtcgcgtcg 660

ggccaagcga agcagacggc acggcatctc tgtcgctgcc tctggacccc tctcgagagt 720

tccgctccac cgttggactt gctccgctgt cggcatccag aaattgcgtg gcggagcggc 780

agacgtgagc cggcacggca ggcggcctcc tcctcctctc acggcacggc agctacgggg 840

gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc 900

ccctccacac cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga 960

tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc 1020

ccccccctct ctaccttctc tagatcggcg ttccggtcca tggttagggc ccggtagttc 1080

tacttctgtt catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct gctagcgttc 1140

gtacacggat gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc 1200

tttggggaat cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt catgattttt 1260

tttgtttcgt tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat atgccgtgca 1320

cttgtttgtc gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg 1380

gttgggcggt cgttctagat cggagtagaa ttgctgtttc aaactacctg gtggatttat 1440

taattttgga tctgtatgtg tgtgccatac atattcatag ttacgaattg aagatgatgg 1500

atggaaatat cgatctagga taggtataca tgttgatgcg ggttttactg atgcatatac 1560

agagatgctt tttgttcgct tggttgtgat gatgtggtgt ggttgggcgg tcgttcattc 1620

gttctagatc ggagtagaat actgtttcaa actacctggt gtatttatta attttggaac 1680

tgtatgtgtg tgtcatacat cttcatagtt acgagtttaa gatggatgga aatatcgatc 1740

taggataggt atacatgttg atgtgggttt tactgatgca tatacatgat ggcatatgca 1800

gcatctattc atatgctcta accttgagta cctatctatt ataataaaca agtatgtttt 1860

ataattattt tgatcttgat atacttggat gatggcatat gcagcagcta tatgtggatt 1920

tttttagccc tgccttcata cgctatttat ttgcttggta ctgtttcttt tgtcgatgct 1980

caccctgttg tttggtgtta cttctgcagg tcgactctag aggatcctaa agcaagcaag 2040

agcaataaac aatgagccca gaacgacgcc cggccgacat ccgccgtgcc accgaggcgg 2100

acatgccggc ggtctgcacc atcgtcaacc actacatcga gacaagcacg gtcaacttcc 2160

gtaccgagcc gcaggaaccg caggagtgga cggacgacct cgtccgtctg cgggagcggt 2220

atccctggct cgtcgccgag gtggacggcg aggtcgccgg catcgcctac gcgggcccct 2280

ggaaggcacg caacgcctac gactggacgg ccgagtcgac cgtgtacgtc tccccccgcc 2340

accagcggac gggactgggc tccacgctct acacccacct gctgaagtcc ctggaggcac 2400

agggcttcaa gagcgtggtc gctgtcatcg ggctgcccaa cgacccgagc gtgcgcatgc 2460

acgaggcgct cggatatgcc ccccgcggca tgctgcgggc ggccggcttc aagcacggga 2520

actggcatga cgtgggtttc tggcagctgg acttcagcct gcccgtaccg ccccgtccgg 2580

tcctgcccgt caccgagatt tgactcgagc tgcgaggagt ctggtggcaa ctaagccgtc 2640

atcgtcatat atagcctcgt ttaattgttc atctctgatt cgatgatgtc tcccaccttg 2700

tttcgtgtgt tcccagtttg ttcatcgtct tttgatttta ccggccgtgc tctgcttttg 2760

tttttgtttc acctgatctc tctctgactt gatgtaagag tggtatctgc tacgactata 2820

tgttgttggg tgaggcatat gtgaatgaaa tctatgaaag ctccggctat atatatttat 2880

acaaagggta tgagatggat gtgaatccta gagcatatgt gtccaacaat caattcgtcg 2940

agggggagaa ttc 2953

<210> 3

<211> 2474

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

gttaacccta tgatttagaa taatatacaa atatattaca taaaaaatat attaattgaa 60

ttagtgttgt ctaatttata attattagaa tgtaattcaa ttccaacgaa acaacggggc 120

cttaggttta atatcttcct tacactgcga aaatgttgtt acacttgcca aaaaaaatca 180

atcgcatatt taccttacaa ggacatattt tagcaaaatg ctatagacat gaatccaacg 240

taatcaatag agtgagattt actggtaaac taccaattgc tcatctgctc cgtaccaacc 300

agcctttcct attaccatgc acatgttgcc tctcaactgc agcatctttc aagccgtgag 360

cagacatgtt gcagatcgaa gtaaggtata tatgtgcata gtctcctaat tcttcatctt 420

caacctctag ctgattgatc tctggtattt accactcttt ccttccttcc ttccttcaat 480

tctaaatacc acaaatcaaa gttgctttgc catggagaag aggaacctgc agtggcggcg 540

agggcgtgat ggcatcgtgc agtaccctca cctcttcttc gcggccctgg cgctggccct 600

cctagtcgcg gacccgttcg gcctcagtcc gctggccgag gtcgactacc ggccggtgaa 660

gcacgagctc gcgccgtacg gggaggtcat gggcagctgg cccagagaca atgccagccg 720

gctcaggcgc gggaggctgg agttcgtcgg cgaggtgttc gggccggagt ctatcgagtt 780

cgatctccag ggccgcgggc cgtacgccgg cctcgccgac ggccgcgtcg tgcggtggat 840

gggcgaggag gccgggtggg agacgttcgc cgtcatgaat cctgactggt aagtgctcga 900

tatcgctccg gcgtccactc gttacatgct ataatatagt agtactaaga tattttgatc 960

tgattttttg cattcttggg agaaacgtca tgcaaaattt gttgtttctt ggcaaaggtc 1020

agaagaagtc tgtgccaatg gagtgaactc aacgacgagg aagcagcacg agaaggagga 1080

gttctgcggc cggccgctcg gcctgaggtt ccacggggag accggcgagc tctacgtcgc 1140

cgacgcgtac tacggtctca tggtcgttgg ccagagcggc ggcgtggcgt cctccgtcgc 1200

gagggaagcc gacggggacc ccatccggtt cgcgaacgac ctcgatgtgc acaggaatgg 1260

atccgtattc ttcactgaca cgagcatgag atacagcaga aagtgagcaa agcgacgtaa 1320

caatccggct tctcattttc aaacgcctct gtattctctg ctgaaagagt agctcaccag 1380

acaagagctg aatttgcagg gaccatctga acatcctgtt agaaggagaa ggcaccggga 1440

ggctgctcag gtatgatcca gaaacaagcg gtgtccatgt cgtgctcaag gggctggtgt 1500

tcccaaacgg cgtgcagatc tcagaggacc atcagtttct tctcttctcc gagacaacaa 1560

actgcaggta acaaaaatac tatctgacga tgctcatgat tctaccgtat ccatagtcat 1620

gaacacaaac cacacgaatc tggccttgac caggataatg aggtactggc tggaaggccc 1680

aagagcgggc gaggtagagg tgttcgcgaa cctgccgggc ttccccgaca acgtgcgctc 1740

caacggcagg ggccagttct gggtggcgat cgactgctgc cggacgccgg cgcaggaggt 1800

gttcgccaag aggccgtggc tccggaccct gtacttcaag ttcccgctgt cgctcaaggt 1860

gctcacttgg aaggccgcca ggaggatgca cacggtgctc gcgctcctcg acggcgaagg 1920

gcgcgtcgtg gaggtgctcg aggaccgggg ccacgaggtg atgaagctgg tgagcgaggt 1980

gcgggaggtg ggccgcaagc tgtggatcgg aaccgtggcg cacaaccaca tcgccaccat 2040

cccctaccct ttagaggact aaccatgatc tatgctgttt caatgcctcc taatctgtgt 2100

acgtctataa atgtctaatg cagtcactgg ttgtaatctt gtttgtgttt ggcaaattgg 2160

cataataatg gacagattca atgggcattg gtgctgtagt cgcatcacac taattgaatg 2220

ggatcatgtt gagctctcac tttgctacaa tttgctccag cttgtacggt tgtaccctct 2280

tgctcgtcta tagtaagggc catctaaaaa aaactcaaat tagatctgca atacaagtat 2340

gattgggccg aatttggatt gtcacgggtc cgcgaccgcg aattgggctc ggtttgattt 2400

agccgacata gtagtgaccg acccgagccg gcggcgagcc aaaccgagcg gacgccgcca 2460

tgggtaccgt taac 2474

<210> 4

<211> 4045

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

ggtaccgtta accataccaa tttaaaaaat ttcaaaaagt ggtggtgcgg tccttttgct 60

ttgggcttaa tatttctccc cctttggcat taatcgccaa aaacggagac tttgtgagcc 120

atttatactt tctccccatt ggtaaatgaa atatgagtga aagattatac caaatttgga 180

cagtgatgcg gagtgacggc gaaggataaa cgataccgtt agagtggagt ggaagccttg 240

tcttcgccga agactccatt tccctttcaa tctacgactt agcatagaaa tacacttgaa 300

aacacattag tcgtagccac gaaagagata tgatcaaagg tatacaaatg agctatgtgt 360

gtaatgtttc aatcaaagtt tcgagaatca agaatattta gctcattcct aagtttgcta 420

aaggttttat catctaatgg tttggtaaag atatcgacta attgttcttt ggtgctaaca 480

taagcaatct cgatatcacc cctttgttgg tgatccctca aaaagtgata ccgaatgtct 540

atgtgcttag tgcggctgtg ttcaacggga ttatccgcca tgcagatagc actctcattg 600

tcacatagga gagggacttt gctcaatttg tagccatagt ccctaaggtt ttgcctcatc 660

caaagtaatt gcacacaaca atgtcctgcg gcaatatact tggcttcggc ggtagaaaga 720

gctattgagt tttgtttctt tgaagtccaa gacaccaggg atctccctag aaactgacaa 780

gtccctgatg tgctcttcct atcaatttta caccctgccc aatcggcatc tgaatatcct 840

attaaatcaa aggtggatcc cttgggctac caaagaccaa atttaggagt gtaaactaaa 900

tatctcatga ttcttttcac ggccctaagg tgaacttcct taggatcggc ttggaatctt 960

gcacacatgc atatagaaag catactatct ggtcgagatg cacataaata gagtaaagat 1020

cctatcatcg accggtatac cttttggtct acggatttac ctcccgtgtc gaggtcgaga 1080

tgcccattag ttcccatggg tgtcctgatg ggcttggcat ccttcattcc aaacttgttg 1140

agtatgtctt gaatgtactt tgtttggctg atgaaggtgc catcttggag ttgcttgact 1200

tgaaatccta gaaaatattt caacttcccc atcatagaca tctcgaattt cggaatcatg 1260

atcctactaa actcttcaca agtagatttg ttagtagacc caaatataat atcatcaaca 1320

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

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ccatggcgcg cacctgcgct tcgatggcgg gggccatgca cccgacgcgg tgcgcggaga 2220

ggagctgcac ggcggcgacg cggcgcaggt tgcgccagta cgggccgtag ctggacacgg 2280

agagcatggc gccgtcgaag gacgccagcc gcatcgacgg gaacagcggc cggttcgcga 2340

agttcacgtc gtgctccgtg aagcactccc tggcgcagtc cggcgacgac acgaccacgg 2400

cgcgccgggt ccccaggcgc atggagaact cgagtttctc cataataatg tgtgagtagt 2460

tcccagataa gggaattagg gttcctatag ggtttcgctc atgtgttgag catataagaa 2520

acccttagta tgtatttgta tttgtaaaat acttctatca ataaaatttc taattcctaa 2580

aaccaaaatc cagtactaaa atccagatcc cccgaatta 2619

Claims (10)

1.一种转基因玉米核雄性不育保持系，其特征在于所述保持系是将外源T-DNA载体导入玉米基因组构建而成，导入的外源T-DNA中除了雄性核不育的育性恢复基因以外，还包含如下3种功能片段中至少2个功能片段：1)在种子胚乳中表达一种荧光蛋白质的表达框；2)一种可以抑制玉米抗除草剂基因CYP81A9表达的DNA片段；3)一种可以抑制玉米胚乳特异表达的细胞壁转化酶InCW2表达的DNA片段。

2.如权利要求1所述转基因玉米核雄性不育保持系，其特征在于外源T-DNA中除了雄性核不育的育性恢复基因以外，还包含如下2个DNA功能片段：1)在种子胚乳中表达一种荧光蛋白质的表达框；2)一种可以抑制玉米抗除草剂基因CYP81A9表达的DNA片段。

3.如权利要求1所述转基因玉米核雄性不育保持系，其特征在于外源T-DNA中除了雄性核不育的育性恢复基因以外，还包含至少如下2个DNA功能片段：1)在种子胚乳中表达一种荧光蛋白质的表达框；2)一种可以抑制玉米胚乳特异表达的细胞壁转化酶InCW2的DNA片段。

4.如权利要求1所述转基因玉米核雄性不育保持系，其特征在于外源T-DNA中除了雄性核不育的育性恢复基因以外，还包含至少如下2个DNA功能片段：1)一种可以抑制玉米抗除草剂基因CYP81A9表达的DNA片段；2)一种可以抑制玉米胚乳特异表达的细胞壁转化酶InCW2的DNA片段。

5.如权利要求1所述转基因玉米核雄性不育保持系，其特征在于雄性核不育的育性恢复基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，在种子胚乳中表达一种荧光蛋白质的表达框核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示；所述可以抑制玉米抗除草剂基因CYP81A9表达的DNA片段核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示；所述可以抑制玉米胚乳特异表达的细胞壁转化酶InCW2表达的DNA片段核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示。

6.如权利要求1所述转基因玉米核雄性不育保持系，其特征在于所述保持系还包含选择标记表达框和/或在花粉中表达的α-淀粉酶的表达框，所述选择标记表达框为草铵膦耐受基因表达框。

7.如权利要求6所述转基因玉米核雄性不育保持系，其特征在于在花粉中表达的α-淀粉酶的表达框核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述草铵膦耐受基因的核苷酸序列如SEQID No.7示。

8.如权利要求6所述转基因玉米核雄性不育保持系，其特征在于外源T-DNA载体由下列之一表达框构成：(1)抑制玉米抗除草剂基因CYP81A9表达的DNA片段、草铵膦耐受基因表达框、雄性核不育的育性恢复基因表达框、在花粉中表达的α-淀粉酶的表达框、在种子胚乳中表达一种荧光蛋白质的表达框；(2)抑制玉米抗除草剂基因CYP81A9表达的DNA片段、草铵膦耐受基因表达框、雄性核不育的育性恢复基因表达框、在花粉中表达的α-淀粉酶的表达框、抑制玉米胚乳特异表达的细胞壁转化酶InCW2表达的DNA片段；(3)雄性核不育的育性恢复基因表达框、在花粉中表达的α-淀粉酶的表达框、在种子胚乳中表达一种荧光蛋白质的表达框、抑制玉米胚乳特异表达的细胞壁转化酶InCW2表达的DNA片段、草铵膦耐受基因表达框。

9.一种含权利要求1或6所述转基因玉米核雄性不育保持系中T-DNA载体的植物细胞。

10.一种权利要求1所述转基因玉米核雄性不育保持系在制备非转基因核不育种子中的应用，其特征在于所述应用的方法为：将转基因玉米核雄性不育保持系与纯合隐性不育系间隔种植，通过下列方法之一筛选非转基因核不育种子：(1)当保持系T-DNA载体包含在种子胚乳中表达一种荧光蛋白质的表达框和可以抑制玉米抗除草剂基因CYP81A9表达的DNA片段时，首先利用荧光识别方法去除荧光种子，然后在出苗以后喷洒烟磺隆和/或苯达松进一步杀灭仍然混杂的转基因苗；(2)当保持系T-DNA载体包含在种子胚乳中表达一种荧光蛋白质的表达框和可以抑制玉米胚乳特异表达的细胞壁转化酶InCW2的DNA片段时，同时采用荧光和籽粒显著小的特征清除转基因种子；(3)当保持系T-DNA载体包含可以抑制玉米抗除草剂基因CYP81A9表达的DNA片段和可以抑制玉米胚乳特异表达的细胞壁转化酶InCW2的DNA片段时，首先清除籽粒显著小的种子，然后在出苗以后喷洒烟磺隆和/或苯达松进一步杀灭仍然混杂的转基因苗。

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