CN113122567B

CN113122567B - 一种利用除草剂控制玉米雄性不育的方法

Info

Publication number: CN113122567B
Application number: CN201911405988.9A
Authority: CN
Inventors: 沈志成; 林朝阳; 王东芳
Original assignee: Hangzhou Ruifeng Bio Tech Co ltd
Current assignee: Hangzhou Ruifeng Bio Tech Co ltd
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2023-08-01
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN113122567A

Abstract

本发明公开了一种利用除草剂控制玉米雄性不育的方法，通过基因编辑技术，在玉米除草剂解毒酶基因表达框中导入雄花组织特异性siRNA结合片段，使玉米雄穗中除草剂解毒酶mRNA被特异性降解不能够正常表达，从而雄穗中不能合成除草剂解毒酶，导致雄穗对除草剂高度敏感，在玉米花期前喷施除草剂控制玉米雄花发育，实现雄性不育。本发明提供的雄性不育技术可以实现一系两用，制种时在花期前喷施除草剂导致雄性不育，作为不育系。只要不使用除草剂，就可作为保持系自交繁殖，利用除草剂进行雄性育性控制，不会受温度日照等因素影响育性，在制种时没有雄性育性恢复的风险。

Description

一种利用除草剂控制玉米雄性不育的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种玉米雄性不育的新方法，该方法通过调节玉米除草剂解毒酶的表达特异性，利用玉米田选择性除草剂实现对玉米的雄性不育，属于植物遗传育种及种子生产领域。

(二)背景技术

杂交产生优势是生物界普遍存在的现象，杂交后代一般表现出产量提高、品质优良、生长势增强和抗逆性增强等优点。推广杂交品种是应用杂交优势最为直接的方式，目前国内水稻种植面积中有55％以上是杂交水稻，推广种植的玉米基本上全是杂交品种。玉米是杂种优势利用最为成功的作物，主要是因为玉米是雌雄同株异花作物，可以通过人工或机械去除母本自交系的雄花，以父本自交系的花粉进行授粉，获得杂交种子。但是，人工或机械去雄存在成本高、制种纯度不稳定和容易受环境影响等问题。近年来发展的玉米核雄性不育材料可以避免人工或机械去雄存在的问题，但是缺乏不育材料的有效保持和繁殖技术，因而在玉米制种中应用也非常有限。

近年来，分子生物技术的快速发展为创制玉米新型雄性不育提供了新的技术手段。目前已经研发出了一系列玉米雄性不育新技术，如杜邦先锋公司的SPT技术、孟山都的玉米草甘膦雄性不育技术、玉米雄性不育系标记技术和玉米多控不育技术等，但是这些技术都尚未能广泛应用于玉米杂交制种。现在生产上最成功的雄性不育应用主要是在水稻上，主要有两类：一种是基于核质互作的“三系法”，一种是光温敏核不育的两系法。“三系法”需要雄性不育系、雄性不育保持系和雄性不育恢复系三个材料。不育系不产生花粉，作为杂交种子的母本，雄性不育系本身不能产生种子，必须借助保持系来繁殖和保持不育系的不育性。恢复系作为制种时的父本，给不育系授粉来生产雄性恢复且有优势的杂交种。“三系法”存在育种程序复杂、组合选配受“恢保关系”的制约、种子生产成本高、需要有专门的保持系来维持不育系的繁殖等缺点。“两系法”杂交稻是利用光温敏不育系水稻为基本材料培育，光温敏不育系水稻在夏季，长日照、高温下，表现为雄性不育，生产杂交种子，这个种子就是两系杂交水稻的种子。在秋季、短日照、低温下又变成了正常的水稻，完成种子繁殖。两系法受自然温光影响，不育系的繁殖产量不稳定、杂交制种期间存在低温诱导不育系自交结实导致杂交种子纯度不达标的风险。雄性不育系是规模化杂交制种的关键，现有的雄性不育系存在着繁殖和育性稳定性的问题。因此发展能够简单繁殖、容易严格控制雄性育性的雄性不育系在规模化制种上具有重要应用价值。常规玉米对硝磺草酮、苯达松和磺酰脲类的除草剂具有良好抗性，生产上经常使用烟嘧磺隆、砜嘧磺隆和硝磺草酮进行玉米苗后除草。研究显示玉米能够耐受这些除草剂是因为体内的细胞色素P450酶系具有强大的代谢和解毒能力。近年来的研究证明细胞色素P450氧化酶CYP81A9是玉米体内降解除草剂作用的关键酶，缺失CYP81A9表达的玉米对烟嘧磺隆和硝磺草酮等除草剂敏感。本发明通过控制玉米中除草剂解毒酶信使RNA的适时适地降解来改变玉米对除草剂的抗性，使玉米雄穗对除草剂敏感，通过喷施除草剂实现对玉米的雄性不育控制。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种利用除草剂控制玉米雄性不育的方法，具体为抑制玉米雄穗中除草剂解毒酶基因的表达，通过喷施除草剂，抑制玉米雄穗发育，实现雄性不育。在玉米制种的时候通过喷施除草剂实现雄性不育，比现有通过光温敏调控雄性不育更可靠，不使用除草剂的情况下保持育性，能够自交繁种，不需要通过保持系来维持不育系的繁殖。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种利用除草剂控制玉米雄性不育的方法，所述方法为：通过基因编辑技术，在玉米除草剂解毒酶基因表达框中导入雄花组织特异性siRNA结合片段，使玉米雄穗中除草剂解毒酶mRNA被特异性降解不能够正常表达，从而雄穗中不能合成除草剂解毒酶，导致雄穗对除草剂高度敏感，在玉米花期前喷施除草剂控制玉米雄花发育，实现雄性不育。

进一步，所述除草剂解毒酶基因为CYP81A9，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述雄花组织特异性siRNA结合片段，核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。

进一步，所述雄花组织特异性siRNA结合片段导入玉米除草剂解毒酶基因表达框中的方法：利用基因枪方法，将含雄花组织特异性siRNA结合片段的重组供体片段和含标记基因的基因编辑载体导入玉米幼胚，去除含标记基因的植株，筛选获得插入siRNA结合片段的转基因玉米，获得所述的基因编辑玉米；所述重组供体片段核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示，所述基因编辑载体核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。

进一步，所述基因编辑载体包含如下元件：Cas9基因表达盒、上游sgRNA1的编码序列和下游sgRNA2的编码序列，具体按如下方法构建：在除草剂解毒酶基因(优选CYP81A9)终止子区域设计一个sgRNA靶标，命名为sgRNA1，序列为：aagaggctctgaaaacctca，在靶标插入位点下游设计一个sgRNA靶标，命名为sgRNA2，序列为gaattgctggcatcgtctga；以pCambia1300(GenBank:AF234296.1)为植物转化载体框架，以抗草甘膦基因表达框为标记基因，根据Yongwei Sun等(Molecular Plant,2016,9:628-631)描述的方法合成Cas表达框和靶标识别表达框，构建含有标记基因的基因编辑质粒，优选为基因编辑质粒P-G10-sgRNA1-cas9-sgRNA2，核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。

进一步，所述重组供体片段按如下方法构建：根据除草剂解毒酶基因CYP81A9终止子区域上游序列设计上游同源臂，核苷酸序列为SEQ ID NO.4，根据下游序列设计下游重组同源臂，核苷酸序列为SEQ ID NO.5；按照从5’端到3’端的顺序将上游重组同源臂，siRNA结合片段和下游重组同源臂序列按顺序连接，构建重组供体片段，重组供体片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.6。

本发明所述开花前期为V6-V10期；所述选择性除草剂为玉米田常用除草剂，烟嘧磺隆、硝磺草酮、砜嘧磺隆或苯达松。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明提供的雄性不育技术可以实现一系两用，制种时在花期前喷施除草剂导致雄性不育，作为不育系。只要不使用除草剂，就可作为保持系自交繁殖。与现在常用的“三系法”的雄性不育系相比，本发明提供的雄性不育系在不使用除草剂的情况下可以自交繁种，不需要通过保持系完成繁种。利用除草剂进行雄性育性控制，不会受温度日照等因素影响育性，在制种时没有育性恢复的风险。还可以通过回交转育的方法将本发明提供的基因编辑后的性状导入到所有玉米母本中，扩大雄性不育系的应用范围。本发明使用的除草剂为玉米常用选择性除草剂，在制种时，喷施对父本不产生影响，容易操作。完全不需要人工去雄，降低人工制种成本。

(四)附图说明

图1为基因编辑载体图。

图2为siRNA插入结果测序(*代表碱基丢失)。

图3为CYP81A9基因转录水平分析，CK：亲本对照；MS29：基因编辑玉米；ZmAct：内参照基因。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：制备基因编辑质粒和重组供体序列

(1)基因编辑质粒

在除草剂解毒酶基因(CYP81A9，核苷酸序列为SEQ ID NO.1)终止子区域设计一个sgRNA靶标，命名为sgRNA1，序列为：aagaggctctgaaaacctca，在靶标插入位点下游设计一个sgRNA靶标，命名为sgRNA2；gaattgctggcatcgtctga。

以pCambia1300(GenBank:AF234296.1)为植物转化载体框架，委托上海生物有限公司合成标记基因抗草甘膦基因表达框，根据Yongwei Sun等(Molecular Plant,2016,9:628-631)描述的方法合成Cas表达框和靶标识别表达框，构建基因编辑质粒P-G10-sgRNA1-cas9-sgRNA2，全序列如SEQ ID NO.7所示，载体结构示意图如图1所示，SEQ ID NO.7中第1-3741位碱基为抗草甘膦基因表达框，作为转基因玉米的筛选标记基因；第3741-3832位碱基为T-DNA左臂序列，3833-10065位碱基为载体框架序列，10066-10091位碱基为T-DNA右臂序列，第10066-10836位碱基为水稻U3启动子，第10837-10856位碱基编码sgRNA-1，靶标识别序列；第10857--17417位碱基为Cas9表达框，基因编辑酶；第17418-17923位碱基为水稻U3启动子；第17924-17943位碱基编码sgRNA-2，靶标识别序列，17944-18041位碱基为CMV35S终止子序列。

(2)重组供体序列

根据CYP81A9基因终止密码上游序列设计上游同源臂，核苷酸序列为SEQ IDNO.4，根据插入位点下游序列设计下游重组同源臂，核苷酸序列为SEQ ID NO.5；按照从5’端到3’端的顺序将上游重组同源臂，雄花组织特异性siRNA结合片段(核苷酸序列为SEQ IDNO.3)和下游重组同源臂序列按顺序连接，构建重组供体片段，核苷酸序列为SEQ ID NO.6，其中第1-90位碱基为上游同源臂，第91-291位碱基为雄穗组织特异性siRNA，第291-381位碱基为下游同源臂。

实施例2：基因编辑玉米的获得

采用基因枪轰击法，将实施例1构建的基因编辑质粒和重组供体片段打入玉米幼胚中。操作方法、步骤和培养基配方如Joshi等描述，唯一不同的是筛选培养基中使用浓度为2mM的草甘膦替代草丁膦(J Microbiol Biotechnol Food Sci，2016,5:335-340)。选取自交授粉后10-12天，生长良好的玉米自交系B104果穗，收集幼胚(大小为1.0-1.5mm)在诱导培养基上培养3-4天。基因枪轰击前，将幼胚组织转入到高渗培养基中(含有36.4g/L甘露醇和36.4g/L山梨醇)，集中放置于培养皿中部，直径约2.5厘米，渗透处理4小时。

将基因编辑质粒和重组供体片段按照1:20的摩尔比与金粉混合，金粉浓度为1.0mmol/L，轰击压力1100psi，轰击距离为6厘米，每个培养皿轰击1次，真空度调节为24-27inchHg，将基因编辑质粒和重组供体片段打入玉米幼胚。

玉米幼胚轰击后，转至诱导培养基上暗培养16小时，然后转至含有2mM草甘膦的筛选培养基上，筛选2-3轮。挑选活力好的抗性愈伤转移到分化培养基上进行分化，然后将分化成苗的玉米转移至生根培养基上，光照培养直到根发育完全，移植到温室中，用于分子检测调控序列是否插入。

实施例3：基因编辑玉米的鉴定

提取待测玉米基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物TestF(CCCGTTGGAGGCCATGTGCA)和引物TestR(GCTCGGAACTCGGAAGCTAC)进行PCR扩增，没有插入siRNA结合片段的玉米不产生条带，成功插入siRNA结合序列的基因编辑玉米产生大小约为320bp的特异性条带，获得3个含有插入序列的转化体，分别命名为MS-29，MS-96和MS-201。对获得的特异性条带进行回收测序鉴定，部分测序结果如图2所示，siRNA结合序列插入到目标位置，插入位点周围有个别碱基丢失。

实施例4：基因编辑玉米标记基因分离

以实施例3获得的MS-29，MS-96和MS-201为父本，玉米自交系B104为母本，开花后将基因编辑的玉米花粉授到B104雌穗上，成熟后收获种子、晒干、播种，筛选不含筛选标记基因的基因编辑玉米。利用G10基因检测试纸条(佑隆生物公司)对回交后代植株叶片进行检测，去除含有抗草甘膦G10基因的植株，对剩余的玉米进行PCR分子检测，采用引物TestF(CCCGTTGGAGGCCATGTGCA)和引物Test2R(CAACTAGTACAAGGCAAGTG)进行PCR扩增，对PCR产物大于350bp的特异性条带进行回收测序，获得的基因编辑玉米用于后期测试。

实施例5：CYP81A9转录水平分析

利用RT-PCR方法对实施例4获得的基因编辑玉米进行除草剂解毒酶转录水平检测。分别将玉米叶片和雄花总RNA，反转录合成cDNA：20μl反应液中含10xPCR扩增缓冲液2μl；四种dNTP(10mmol/L)2μl；RNA酶抑制剂20U；mRNA，l～2μg(或RNA 5-10μg)；AMV，20U；引物，1μl；最后用灭菌水补至20μl。以上溶液充分混匀后，于42℃反应60min，反应完毕后将反应管在95℃下加热5min，使反转录酶失活和RNA-cDNA杂合物变性。以cDNA为模板，进行PCR扩增。

CYP81A9基因的RT-PCR引物为：NSF1F：5’CGCAACCTGCGCCGCGTCGC，NSF1R：5’GGACTTCTGCAGAGTGAGCA。PCR产物预期大小为500bp。

内参基因ZmAct的RT-PCR引物为：ZmAct-F：5’GGTGATGATGCGCCAAGAGC，ZmAct-R：5’GAACTAGGGACGTGATCTCC。PCR产物预期大小为900bp。

RT-PCR的反应条件为：95℃预变性2min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，32个循环；72℃延伸10min。

RT-PCR结果(图3)显示，CYP81A9在常规玉米叶片和雄穗上都能转录，在基因编辑玉米MS29叶片上能够正常转录，但是雄穗上不能检测到CYP81A9基因的表达。

实施例6：除草剂杀雄效果分析

在玉米V6、V8和V10期分别以4克/亩的使用剂量喷施烟嘧磺隆(商品名：玉农乐，日本石原产业株式会社)，或10克/亩的使用剂量喷施硝磺草酮(商品名：耕杰，先正达)，各不同处理期分别设置喷施清水的对照，记为V6-CK、V8-CK和V10-CK，抽雄后采集雄穗用I₂-KI法分析花粉活性。I₂-KI染色液(取2g KI溶于5～10ml蒸馏水中，加入1g I₂，待完全溶解后，再加蒸镏水300ml)，采集待测玉米的花粉，用毛笔蘸取花粉于载玻片上，加1～2滴I₂-KI溶液，盖上盖玻片，在显微镜下观察。凡是被染成蓝色的为含有淀粉的活力较强的花粉粒，呈黄褐色的为发育不良的花粉粒。观察片子，每片取多个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的育性。观察结果显示施用过烟嘧磺隆和硝磺草酮的玉米花粉数量极少，完全没有活性。

表1花粉染色情况统计

序列表

<110> 杭州瑞丰生物科技有限公司

<120> 一种利用除草剂控制玉米雄性不育的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1566

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

atggataagg cctacatcgc cgccctctcc gccgccgccc tcttcttgct ccactacctc 60

ctgggccgcc gggccggcgg cgagggcaag gccaaggcca agggctcgcg gcggcggctc 120

ccgccgagcc ctccggcgat cccgttcctg ggccacctcc acctcgtcaa ggccccgttc 180

cacggggcgc tggcccgcct cgcggcgcgc cacggcccgg tgttctccat gcgcctgggg 240

acccggcgcg ccgtggtcgt gtcgtcgccg gactgcgcca gggagtgctt cacggagcac 300

gacgtgaact tcgcgaaccg gccgctgttc ccgtcgatgc ggctggcgtc cttcgacggc 360

gccatgctct ccgtgtccag ctacggcccg tactggcgca acctgcgccg cgtcgccgcc 420

gtgcagctcc tctccgcgca ccgcgtcggg tgcatggccc ccgccatcga agcgcaggtg 480

cgcgccatgg tgcggaggat ggaccgcgcc gccgcggccg gcggcggcgg cgtcgcgcgc 540

gtccagctca agcggcggct gttcgagctc tccctcagcg tgctcatgga gaccatcgcg 600

cacaccaaga cgtcccgcgc cgaggccgac gccgactcgg acatgtcgac cgaggcccac 660

gagttcaagc agatcgtcga cgagctcgtg ccgtacatcg gcacggccaa ccgctgggac 720

tacctgccgg tgctgcgctg gttcgacgtg ttcggcgtga ggaacaagat cctcgacgcc 780

gtgggcagaa gggacgcgtt cctggggcgg ctcatcgacg gggagcggcg gaggctggac 840

gctggcgacg agagcgaaag taagagcatg attgcggtgc tgctcactct gcagaagtcc 900

gagccagagg tctacactga cactgtgatc actgctcttt gcgcgaacct attcggcgcc 960

ggaacggaga ccacgtccac cacgacggaa tgggccatgt cactgctgct gaaccaccgg 1020

gaggcgctca agaaggcgca ggccgagatc gacgcggcgg tgggcacctc ccgcctggtg 1080

accgcggacg acgtgcccca cctcacctac ctgcagtgca tcgtcgacga gacgctgcgc 1140

ctgcacccgg ccgcgccgct gctgctgccg cacgagtccg ccgcggactg cacggtcggc 1200

ggctacgacg tgccgcgcgg cacgatgctg ctggtcaacg tgcacgcggt ccacagggac 1260

cccgcggtgt gggaggaccc ggacaggttc gtgccggagc ggttcgaggg cgccggcggc 1320

aaggccgagg ggcgcctgct gatgccgttc gggatggggc ggcgcaagtg ccccggggag 1380

acgctcgcgc tgcggaccgt cgggctggtg ctcgccacgc tgctccagtg cttcgactgg 1440

gacacggttg atggagctca ggttgacatg aaggctagcg gcgggctgac catgccccgg 1500

gccgtcccgt tggaggccat gtgcaggccg cgtacagcta tgcgtggtgt tcttaagagg 1560

ctctga 1566

<210> 2

<211> 521

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Leu Phe Leu

1 5 10 15

Leu His Tyr Leu Leu Gly Arg Arg Ala Gly Gly Glu Gly Lys Ala Lys

20 25 30

Ala Lys Gly Ser Arg Arg Arg Leu Pro Pro Ser Pro Pro Ala Ile Pro

35 40 45

Phe Leu Gly His Leu His Leu Val Lys Ala Pro Phe His Gly Ala Leu

50 55 60

Ala Arg Leu Ala Ala Arg His Gly Pro Val Phe Ser Met Arg Leu Gly

65 70 75 80

Thr Arg Arg Ala Val Val Val Ser Ser Pro Asp Cys Ala Arg Glu Cys

85 90 95

Phe Thr Glu His Asp Val Asn Phe Ala Asn Arg Pro Leu Phe Pro Ser

100 105 110

Met Arg Leu Ala Ser Phe Asp Gly Ala Met Leu Ser Val Ser Ser Tyr

115 120 125

Gly Pro Tyr Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Ala Val Gln Leu Leu

130 135 140

Ser Ala His Arg Val Gly Cys Met Ala Pro Ala Ile Glu Ala Gln Val

145 150 155 160

Arg Ala Met Val Arg Arg Met Asp Arg Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly

165 170 175

Gly Val Ala Arg Val Gln Leu Lys Arg Arg Leu Phe Glu Leu Ser Leu

180 185 190

Ser Val Leu Met Glu Thr Ile Ala His Thr Lys Thr Ser Arg Ala Glu

195 200 205

Ala Asp Ala Asp Ser Asp Met Ser Thr Glu Ala His Glu Phe Lys Gln

210 215 220

Ile Val Asp Glu Leu Val Pro Tyr Ile Gly Thr Ala Asn Arg Trp Asp

225 230 235 240

Tyr Leu Pro Val Leu Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Asn Lys

245 250 255

Ile Leu Asp Ala Val Gly Arg Arg Asp Ala Phe Leu Gly Arg Leu Ile

260 265 270

Asp Gly Glu Arg Arg Arg Leu Asp Ala Gly Asp Glu Ser Glu Ser Lys

275 280 285

Ser Met Ile Ala Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Ser Glu Pro Glu Val

290 295 300

Tyr Thr Asp Thr Val Ile Thr Ala Leu Cys Ala Asn Leu Phe Gly Ala

305 310 315 320

Gly Thr Glu Thr Thr Ser Thr Thr Thr Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu

325 330 335

Leu Asn His Arg Glu Ala Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Ala

340 345 350

Ala Val Gly Thr Ser Arg Leu Val Thr Ala Asp Asp Val Pro His Leu

355 360 365

Thr Tyr Leu Gln Cys Ile Val Asp Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Ala

370 375 380

Ala Pro Leu Leu Leu Pro His Glu Ser Ala Ala Asp Cys Thr Val Gly

385 390 395 400

Gly Tyr Asp Val Pro Arg Gly Thr Met Leu Leu Val Asn Val His Ala

405 410 415

Val His Arg Asp Pro Ala Val Trp Glu Asp Pro Asp Arg Phe Val Pro

420 425 430

Glu Arg Phe Glu Gly Ala Gly Gly Lys Ala Glu Gly Arg Leu Leu Met

435 440 445

Pro Phe Gly Met Gly Arg Arg Lys Cys Pro Gly Glu Thr Leu Ala Leu

450 455 460

Arg Thr Val Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu Gln Cys Phe Asp Trp

465 470 475 480

Asp Thr Val Asp Gly Ala Gln Val Asp Met Lys Ala Ser Gly Gly Leu

485 490 495

Thr Met Pro Arg Ala Val Pro Leu Glu Ala Met Cys Arg Pro Arg Thr

500 505 510

Ala Met Arg Gly Val Leu Lys Arg Leu

515 520

<210> 3

<211> 201

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

agacgacgac cgtgcatggt gatgaatcac agacgacgaa cacgcatgtc gcatcgccgt 60

cctctttgta tcacacagca tcaccttctt cgctctacta ctcccccgag caatcaccga 120

ccaataacac caaccatcaa cctcccccgt cgccgccgcc ttcaccgtcc tcccctcaca 180

ccatagaact gcaaatgtcc g 201

<210> 4

<211> 90

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

accatgcccc gggccgtccc gttggaggcc atgtgcaggc cgcgtacagc tatgcgtggt 60

gttcttaagc ggttctaaaa acctcatgga 90

<210> 5

<211> 90

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

tcgaattgct ggcatcctct gaacggtgta tgacgtagct tccgagttcc gagcatatat 60

attcacttgc cttgtactag ttgattttcg 90

<210> 6

<211> 381

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

accatgcccc gggccgtccc gttggaggcc atgtgcaggc cgcgtacagc tatgcgtggt 60

gttcttaagc ggttctaaaa acctcatgga agacgacgac cgtgcatggt gatgaatcac 120

agacgacgaa cacgcatgtc gcatcgccgt cctctttgta tcacacagca tcaccttctt 180

cgctctacta ctcccccgag caatcaccga ccaataacac caaccatcaa cctcccccgt 240

cgccgccgcc ttcaccgtcc tcccctcaca ccatagaact gcaaatgtcc gtcgaattgc 300

tggcatcctc tgaacggtgt atgacgtagc ttccgagttc cgagcatata tattcacttg 360

ccttgtacta gttgattttc g 381

<210> 7

<211> 18041

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

ctcgacgcat gcctacagtg cagcgtgacc cggtcgtgcc cctctctaga gataatgagc 60

attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact tgtttgaagt 120

gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat ataatctata 180

gtactacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag acatggtcta 240

aaggacaatt gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta gtgtgcatgt 300

gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat tttattagta 360

catccattta gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag tacatctatt 420

ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt tttttattta 480

ataatttaga tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa atacccttta 540

agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg ccagcctgtt 600

aaacgccgtc gacgagtcta acggacacca accagcgaac cagcagcgtc gcgtcgggcc 660

aagcgaagca gacggcacgg catctctgtc gctgcctctg gacccctctc gagagttccg 720

ctccaccgtt ggacttgctc cgctgtcggc atccagaaat tgcgtggcgg agcggcagac 780

gtgagccggc acggcaggcg gcctcctcct cctctcacgg cacggcagct acgggggatt 840

cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct 900

ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca accagatctc 960

ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc 1020

ccctctctac cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact 1080

tctgttcatg tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac 1140

acggatgcga cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg 1200

gggaatcctg ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg 1260

tttcgttgca tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg 1320

tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg 1380

ggcggtcgtt ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt 1440

ttggatctgt atgtgtgtgc catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga 1500

aatatcgatc taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga 1560

tgctttttgt tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct 1620

agatcggagt agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat 1680

gtgtgtgtca tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga 1740

taggtataca tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc 1800

tattcatatg ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat 1860

tattttgatc ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt 1920

agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc 1980

tgttgtttgg tgttacttct gcaggtcgac tctagaggat ctaccatggc caccgccgcc 2040

gccgcgtcta ccgcgctcac tggcgccact accgctgcgc ccaaggcgag gcgccgggcg 2100

cacctcctgg ccacccgccg cgccctcgcc gcgcccatca ggtgctcagc ggcgtcaccc 2160

gccatgccga tggctccccc ggccaccccg ctccggccgt ggggccccac cgatccccgc 2220

aagggatccg acgccctgcc cgccaccttc gacgtgatcg tgcatccagc tcgcgaactc 2280

cgcggcgagc ttcgcgctca gccatccaag aactacacca ctcgctacct cctcgccgct 2340

gccctcgctg agggcgagac ccgcgtggtg ggcgtggcta cctctgagga cgccgaggcc 2400

atgctccgct gcctccgcga ctggggcgct ggcgtggagc ttgtgggcga tgacgccgtg 2460

atccgcggtt tcggcgctcg cccacaggcc ggtgtgaccc tcaacccagg caacgctgcc 2520

gcggtggccc gcctcctcat gggcgtggcc gctctcacct ctggcaccac tttcgtgacc 2580

gactacccgg actccctcgg caagcgccct cagggcgacc tccttgaggc cctcgaacgc 2640

ctcggtgcct gggtgtcctc caacgacggt cgcctcccga tctccgtgtc cggcccagtg 2700

cgcggtggca ccgtggaggt gtccgccgag cgctcctccc agtacgcctc cgccctcatg 2760

ttcctcggcc ctctcctccc ggacggactc gaactccgcc tcaccggcga catcaagtcc 2820

cacgctccgc tccgccagac actcgacacc ctctctgact tcggcgtgcg cgccactgcc 2880

tccgacgacc tccgccgcat ctccatcccg ggtggccaga agtaccgccc aggccgcgtg 2940

ctcgtgccgg gcgactaccc gggctccgct gccatcctca ccgccgctgc cctcctccca 3000

ggcgaggtgc gcctctctaa cctccgcgag cacgacctcc agggcgagaa ggaggccgtg 3060

aacgtgctcc gcgagatggg cgctgacatc gtgcgcgagg gcgataccct caccgtgcgc 3120

ggtggccgcc ctctccacgc cgtgactcgc gacggcgatt ccttcaccga cgccgtgcaa 3180

gccctcaccg ccgctgctgc cttcgccgag ggcgacacca cctgggagaa cgtggccact 3240

ctccgcctca aggagtgcga ccgcatctct gacacccgcg ctgagcttga gcgcctcggc 3300

ctccgcgcac gcgagaccgc cgactctctc tccgtgactg gctctgctca cctcgctggt 3360

ggcatcaccg ccgacggcca cggcgaccac cgcatgatca tgctcctcac cctcctcggc 3420

ctccgcgcag acgctccact ccgcatcacc ggcgcacacc acatccgcaa gtcctaccct 3480

cagttcttcg ctcacctcga agccctcggc gctcgcttcg agtacgctga ggccaccgcc 3540

taataggagc tcgagtttct ccataataat gtgtgagtag ttcccagata agggaattag 3600

ggttcctata gggtttcgct catgtgttga gcatataaga aacccttagt atgtatttgt 3660

atttgtaaaa tacttctatc aataaaattt ctaattccta aaaccaaaat ccagtactaa 3720

aatccagatc ccccgaatta attcggcgtt aattcagtac attaaaaacg tccgcaatgt 3780

gttattaagt tgtctaagcg tcaatttgtt tacaccacaa tatatcctgc caccagccag 3840

ccaacagctc cccgaccggc agctcggcac aaaatcacca ctcgatacag gcagcccatc 3900

agtccgggac ggcgtcagcg ggagagccgt tgtaaggcgg cagactttgc tcatgttacc 3960

gatgctattc ggaagaacgg caactaagct gccgggtttg aaacacggat gatctcgcgg 4020

agggtagcat gttgattgta acgatgacag agcgttgctg cctgtgatca ccgcggtttc 4080

aaaatcggct ccgtcgatac tatgttatac gccaactttg aaaacaactt tgaaaaagct 4140

gttttctggt atttaaggtt ttagaatgca aggaacagtg aattggagtt cgtcttgtta 4200

taattagctt cttggggtat ctttaaatac tgtagaaaag aggaaggaaa taataaatgg 4260

ctaaaatgag aatatcaccg gaattgaaaa aactgatcga aaaataccgc tgcgtaaaag 4320

atacggaagg aatgtctcct gctaaggtat ataagctggt gggagaaaat gaaaacctat 4380

atttaaaaat gacggacagc cggtataaag ggaccaccta tgatgtggaa cgggaaaagg 4440

acatgatgct atggctggaa ggaaagctgc ctgttccaaa ggtcctgcac tttgaacggc 4500

atgatggctg gagcaatctg ctcatgagtg aggccgatgg cgtcctttgc tcggaagagt 4560

atgaagatga acaaagccct gaaaagatta tcgagctgta tgcggagtgc atcaggctct 4620

ttcactccat cgacatatcg gattgtccct atacgaatag cttagacagc cgcttagccg 4680

aattggatta cttactgaat aacgatctgg ccgatgtgga ttgcgaaaac tgggaagaag 4740

acactccatt taaagatccg cgcgagctgt atgatttttt aaagacggaa aagcccgaag 4800

aggaacttgt cttttcccac ggcgacctgg gagacagcaa catctttgtg aaagatggca 4860

aagtaagtgg ctttattgat cttgggagaa gcggcagggc ggacaagtgg tatgacattg 4920

ccttctgcgt ccggtcgatc agggaggata tcggggaaga acagtatgtc gagctatttt 4980

ttgacttact ggggatcaag cctgattggg agaaaataaa atattatatt ttactggatg 5040

aattgtttta gtacctagaa tgcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 5100

gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 5160

taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 5220

aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 5280

ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 5340

catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 5400

ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 5460

ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 5520

agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 5580

taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 5640

atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 5700

cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 5760

ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 5820

accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 5880

gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 5940

tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat 6000

agttaagcca gtatacactc cgctatcgct acgtgactgg gtcatggctg cgccccgaca 6060

cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag 6120

acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa 6180

acgcgcgagg cagggtgcct tgatgtgggc gccggcggtc gagtggcgac ggcgcggctt 6240

gtccgcgccc tggtagattg cctggccgta ggccagccat ttttgagcgg ccagcggccg 6300

cgataggccg acgcgaagcg gcggggcgta gggagcgcag cgaccgaagg gtaggcgctt 6360

tttgcagctc ttcggctgtg cgctggccag acagttatgc acaggccagg cgggttttaa 6420

gagttttaat aagttttaaa gagttttagg cggaaaaatc gccttttttc tcttttatat 6480

cagtcactta catgtgtgac cggttcccaa tgtacggctt tgggttccca atgtacgggt 6540

tccggttccc aatgtacggc tttgggttcc caatgtacgt gctatccaca ggaaagagac 6600

cttttcgacc tttttcccct gctagggcaa tttgccctag catctgctcc gtacattagg 6660

aaccggcgga tgcttcgccc tcgatcaggt tgcggtagcg catgactagg atcgggccag 6720

cctgccccgc ctcctccttc aaatcgtact ccggcaggtc atttgacccg atcagcttgc 6780

gcacggtgaa acagaacttc ttgaactctc cggcgctgcc actgcgttcg tagatcgtct 6840

tgaacaacca tctggcttct gccttgcctg cggcgcggcg tgccaggcgg tagagaaaac 6900

ggccgatgcc gggatcgatc aaaaagtaat cggggtgaac cgtcagcacg tccgggttct 6960

tgccttctgt gatctcgcgg tacatccaat cagctagctc gatctcgatg tactccggcc 7020

gcccggtttc gctctttacg atcttgtagc ggctaatcaa ggcttcaccc tcggataccg 7080

tcaccaggcg gccgttcttg gccttcttcg tacgctgcat ggcaacgtgc gtggtgttta 7140

accgaatgca ggtttctacc aggtcgtctt tctgctttcc gccatcggct cgccggcaga 7200

acttgagtac gtccgcaacg tgtggacgga acacgcggcc gggcttgtct cccttccctt 7260

cccggtatcg gttcatggat tcggttagat gggaaaccgc catcagtacc aggtcgtaat 7320

cccacacact ggccatgccg gccggccctg cggaaacctc tacgtgcccg tctggaagct 7380

cgtagcggat cacctcgcca gctcgtcggt cacgcttcga cagacggaaa acggccacgt 7440

ccatgatgct gcgactatcg cgggtgccca cgtcatagag catcggaacg aaaaaatctg 7500

gttgctcgtc gcccttgggc ggcttcctaa tcgacggcgc accggctgcc ggcggttgcc 7560

gggattcttt gcggattcga tcagcggccg cttgccacga ttcaccgggg cgtgcttctg 7620

cctcgatgcg ttgccgctgg gcggcctgcg cggccttcaa cttctccacc aggtcatcac 7680

ccagcgccgc gccgatttgt accgggccgg atggtttgcg accgtcacgc cgattcctcg 7740

ggcttggggg ttccagtgcc attgcagggc cggcagacaa cccagccgct tacgcctggc 7800

caaccgcccg ttcctccaca catggggcat tccacggcgt cggtgcctgg ttgttcttga 7860

ttttccatgc cgcctccttt agccgctaaa attcatctac tcatttattc atttgctcat 7920

ttactctggt agctgcgcga tgtattcaga tagcagctcg gtaatggtct tgccttggcg 7980

taccgcgtac atcttcagct tggtgtgatc ctccgccggc aactgaaagt tgacccgctt 8040

catggctggc gtgtctgcca ggctggccaa cgttgcagcc ttgctgctgc gtgcgctcgg 8100

acggccggca cttagcgtgt ttgtgctttt gctcattttc tctttacctc attaactcaa 8160

atgagttttg atttaatttc agcggccagc gcctggacct cgcgggcagc gtcgccctcg 8220

ggttctgatt caagaacggt tgtgccggcg gcggcagtgc ctgggtagct cacgcgctgc 8280

gtgatacggg actcaagaat gggcagctcg tacccggcca gcgcctcggc aacctcaccg 8340

ccgatgcgcg tgcctttgat cgcccgcgac acgacaaagg ccgcttgtag ccttccatcc 8400

gtgacctcaa tgcgctgctt aaccagctcc accaggtcgg cggtggccca tatgtcgtaa 8460

gggcttggct gcaccggaat cagcacgaag tcggctgcct tgatcgcgga cacagccaag 8520

tccgccgcct ggggcgctcc gtcgatcact acgaagtcgc gccggccgat ggccttcacg 8580

tcgcggtcaa tcgtcgggcg gtcgatgccg acaacggtta gcggttgatc ttcccgcacg 8640

gccgcccaat cgcgggcact gccctgggga tcggaatcga ctaacagaac atcggccccg 8700

gcgagttgca gggcgcgggc tagatgggtt gcgatggtcg tcttgcctga cccgcctttc 8760

tggttaagta cagcgataac cttcatgcgt tccccttgcg tatttgttta tttactcatc 8820

gcatcatata cgcagcgacc gcatgacgca agctgtttta ctcaaataca catcaccttt 8880

ttagacggcg gcgctcggtt tcttcagcgg ccaagctggc cggccaggcc gccagcttgg 8940

catcagacaa accggccagg atttcatgca gccgcacggt tgagacgtgc gcgggcggct 9000

cgaacacgta cccggccgcg atcatctccg cctcgatctc ttcggtaatg aaaaacggtt 9060

cgtcctggcc gtcctggtgc ggtttcatgc ttgttcctct tggcgttcat tctcggcggc 9120

cgccagggcg tcggcctcgg tcaatgcgtc ctcacggaag gcaccgcgcc gcctggcctc 9180

ggtgggcgtc acttcctcgc tgcgctcaag tgcgcggtac agggtcgagc gatgcacgcc 9240

aagcagtgca gccgcctctt tcacggtgcg gccttcctgg tcgatcagct cgcgggcgtg 9300

cgcgatctgt gccggggtga gggtagggcg ggggccaaac ttcacgcctc gggccttggc 9360

ggcctcgcgc ccgctccggg tgcggtcgat gattagggaa cgctcgaact cggcaatgcc 9420

ggcgaacacg gtcaacacca tgcggccggc cggcgtggtg gtgtcggccc acggctctgc 9480

caggctacgc aggcccgcgc cggcctcctg gatgcgctcg gcaatgtcca gtaggtcgcg 9540

ggtgctgcgg gccaggcggt ctagcctggt cactgtcaca acgtcgccag ggcgtaggtg 9600

gtcaagcatc ctggccagct ccgggcggtc gcgcctggtg ccggtgatct tctcggaaaa 9660

cagcttggtg cagccggccg cgtgcagttc ggcccgttgg ttggtcaagt cctggtcgtc 9720

ggtgctgacg cgggcatagc ccagcaggcc agcggcggcg ctcttgttca tggcgtaatg 9780

tctccggttc tagtcgcaag tattctactt tatgcgacta aaacacgcga caagaaaacg 9840

ccaggaaaag ggcagggcgg cagcctgtcg cgtaacttag gacttgtgcg acatgtcgtt 9900

ttcagaagac ggctgcactg aacgtcagaa gccgactgca ctatagcagc ggaggggttg 9960

gatcaaagta ctttgatccc gaggggaacc ctgtggttgg catgcacata caaatggacg 10020

aacggataaa ccttttcacg cccttttaaa tatccgttat tctaataaac gctcttttct 10080

cttaggttta cccgccaata tatcctgtca aacactgata gtttaaactg aaggcgggaa 10140

acgacaatct gatccaagct caagctgctc tagcattcgc cattcaggct gcgcaactgt 10200

tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 10260

gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 10320

acggccagtg ccaagcttcc cctgaatttc agtctctcta gctagtggct aaggccatct 10380

cttatttggt tcagatgaca gtaattcatc caggtctcca agttctagga ttttcagaac 10440

tgcaacttat tttatcaagg aatctttaaa catacgaaca gatcacttaa agttcttctg 10500

aagcaactta aagttatcag gcatgcatgg atcttggagg aatcagatgt gcagtcaggg 10560

accatagcac aagacaggcg tcttctactg gtgctaccag caaatgctgg aagccgggaa 10620

cactgggtac gttggaaacc acgtgatgtg aagaagtaag ataaactgta ggagaaaagc 10680

atttcgtagt gggccatgaa gcctttcagg acatgtattg cagtatgggc cggcccatta 10740

cgcaattgga cgacaacaaa gactagtatt agtaccacct cggctatcca catagatcaa 10800

agctgattta aaagagttgt gcagatgatc cgtggcaaga ggctctgaaa acctcatttt 10860

agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac 10920

cgagtcggtg ctttttttca agcttgccta cagtgcagcg tgacccggtc gtgcccctct 10980

ctagagataa tgagcattgc atgtctaagt tataaaaaat taccacatat tttttttgtc 11040

acacttgttt gaagtgcagt ttatctatct ttatacatat atttaaactt tactctacga 11100

ataatataat ctatagtact acaataatat cagtgtttta gagaatcata taaatgaaca 11160

gttagacatg gtctaaagga caattgagta ttttgacaac aggactctac agttttatct 11220

ttttagtgtg catgtgttct cctttttttt tgcaaatagc ttcacctata taatacttca 11280

tccattttat tagtacatcc atttagggtt tagggttaat ggtttttata gactaatttt 11340

tttagtacat ctattttatt ctattttagc ctctaaatta agaaaactaa aactctattt 11400

tagttttttt atttaataat ttagatataa aatagaataa aataaagtga ctaaaaatta 11460

aacaaatacc ctttaagaaa ttaaaaaaac taaggaaaca tttttcttgt ttcgagtaga 11520

taatgccagc ctgttaaacg ccgtcgacga gtctaacgga caccaaccag cgaaccagca 11580

gcgtcgcgtc gggccaagcg aagcagacgg cacggcatct ctgtcgctgc ctctggaccc 11640

ctctcgagag ttccgctcca ccgttggact tgctccgctg tcggcatcca gaaattgcgt 11700

ggcggagcgg cagacgtgag ccggcacggc aggcggcctc ctcctcctct cacggcacgg 11760

cagctacggg ggattccttt cccaccgctc cttcgctttc ccttcctcgc ccgccgtaat 11820

aaatagacac cccctccaca ccctctttcc ccaacctcgt gttgttcgga gcgcacacac 11880

acacaaccag atctccccca aatccacccg tcggcacctc cgcttcaagg tacgccgctc 11940

gtcctccccc cccccccctc tctaccttct ctagatcggc gttccggtcc atggttaggg 12000

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cagtgtttct ctttggggaa tcctgggatg gctctagccg ttccgcagac gggatcgatt 12180

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tcgttcattc gttctagatc ggagtagaat actgtttcaa actacctggt gtatttatta 12600

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tatgtggatt tttttagccc tgccttcata cgctatttat ttgctatgga ctacaaggac 12900

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gtgccgagca agaagttcaa ggtgctgggc aacaccgaca ggcacagcat caagaagaac 13140

ctgatcggcg ccctgctgtt cgacagcggc gagaccgccg aggccaccag gctgaagagg 13200

accgccagga ggaggtacac caggaggaag aacaggatct gctacctgca ggagatcttc 13260

agcaacgaga tggccaaggt ggacgacagc ttcttccaca ggctggagga gagcttcctg 13320

gtggaggagg acaagaagca cgagaggcac ccgatcttcg gcaacatcgt ggacgaggtg 13380

gcctaccacg agaagtaccc gaccatctac cacctgagga agaagctggt ggacagcacc 13440

gacaaggccg acctgaggct gatctacctg gccctggccc acatgatcaa gttcaggggc 13500

cacttcctga tcgagggcga cctgaacccg gacaacagcg acgtggacaa gctgttcatc 13560

cagctggtgc agacctacaa ccagctgttc gaggagaacc cgatcaacgc cagcggcgtg 13620

gacgccaagg ccatcctgag cgccaggctg agcaagagca ggaggctgga gaacctgatc 13680

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ggcctgaccc cgaacttcaa gagcaacttc gacctggccg aggacgccaa gctgcagctg 13800

agcaaggaca cctacgacga cgacctggac aacctgctgg cccagatcgg cgaccagtac 13860

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gagcaccacc aggacctgac cctgctgaag gccctggtga ggcagcagct gccggagaag 14040

tacaaggaga tcttcttcga ccagagcaag aacggctacg ccggctacat cgacggcggc 14100

gccagccagg aggagttcta caagttcatc aagccgatcc tggagaagat ggacggcacc 14160

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gaggacttct acccgttcct gaaggacaac agggagaaga tcgagaagat cctgaccttc 14340

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aggaagagcg aggagaccat caccccgtgg aacttcgagg aggtggtgga caagggcgcc 14460

agcgcccaga gcttcatcga gaggatgacc aacttcgaca agaacctgcc gaacgagaag 14520

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gactacttca agaagatcga gtgcttcgac agcgtggaga tcagcggcgt ggaggacagg 14760

ttcaacgcca gcctgggcac ctaccacgac ctgctgaaga tcatcaagga caaggacttc 14820

ctggacaacg aggagaacga ggacatcctg gaggacatcg tgctgaccct gaccctgttc 14880

gaggacaggg agatgatcga ggagaggctg aagacctacg cccacctgtt cgacgacaag 14940

gtgatgaagc agctgaagag gaggaggtac accggctggg gcaggctgag caggaagctg 15000

atcaacggca tcagggacaa gcagagcggc aagaccatcc tggacttcct gaagagcgac 15060

ggcttcgcca acaggaactt catgcagctg atccacgacg acagcctgac cttcaaggag 15120

gacatccaga aggcccaggt gagcggccag ggcgacagcc tgcacgagca catcgccaac 15180

ctggccggca gcccggccat caagaagggc atcctgcaga ccgtgaaggt ggtggacgag 15240

ctggtgaagg tgatgggcag gcacaagccg gagaacatcg tgatcgagat ggccagggag 15300

aaccagacca cccagaaggg ccagaagaac agcagggaga ggatgaagag gatcgaggag 15360

ggcatcaagg agctgggcag ccagatcctg aaggagcacc cggtggagaa cacccagctg 15420

cagaacgaga agctgtacct gtactacctg cagaacggca gggacatgta cgtggaccag 15480

gagctggaca tcaacaggct gagcgactac gacgtggacc acatcgtgcc gcagagcttc 15540

ctgaaggacg acagcatcga caacaaggtg ctgaccagga gcgacaagaa caggggcaag 15600

agcgacaacg tgccgagcga ggaggtggtg aagaagatga agaactactg gaggcagctg 15660

ctgaacgcca agctgatcac ccagaggaag ttcgacaacc tgaccaaggc cgagaggggc 15720

ggcctgagcg agctggacaa ggccggcttc atcaagaggc agctggtgga gaccaggcag 15780

atcaccaagc acgtggccca gatcctggac agcaggatga acaccaagta cgacgagaac 15840

gacaagctga tcagggaggt gaaggtgatc accctgaaga gcaagctggt gagcgacttc 15900

aggaaggact tccagttcta caaggtgagg gagatcaaca actaccacca cgcccacgac 15960

gcctacctga acgccgtggt gggcaccgcc ctgatcaaga agtacccgaa gctggagagc 16020

gagttcgtgt acggcgacta caaggtgtac gacgtgagga agatgatcgc caagagcgag 16080

caggagatcg gcaaggccac cgccaagtac ttcttctaca gcaacatcat gaacttcttc 16140

aagaccgaga tcaccctggc caacggcgag atcaggaaga ggccgctgat cgagaccaac 16200

ggcgagaccg gcgagatcgt gtgggacaag ggcagggact tcgccaccgt gaggaaggtg 16260

ctgagcatgc cgcaggtgaa catcgtgaag aagaccgagg tgcagaccgg cggcttcagc 16320

aaggagagca tcctgccgaa gaggaacagc gacaagctga tcgccaggaa gaaggactgg 16380

gacccgaaga agtacggcgg cttcgacagc ccgaccgtgg cctacagcgt gctggtggtg 16440

gccaaggtgg agaagggcaa gagcaagaag ctgaagagcg tgaaggagct gctgggcatc 16500

accatcatgg agaggagcag cttcgagaag aacccgatcg acttcctgga ggccaagggc 16560

tacaaggagg tgaagaagga cctgatcatc aagctgccga agtacagcct gttcgagctg 16620

gagaacggca ggaagaggat gctggccagc gccggcgagc tgcagaaggg caacgagctg 16680

gccctgccga gcaagtacgt gaacttcctg tacctggcca gccactacga gaagctgaag 16740

ggcagcccgg aggacaacga gcagaagcag ctgttcgtgg agcagcacaa gcactacctg 16800

gacgagatca tcgagcagat cagcgagttc agcaagaggg tgatcctggc cgacgccaac 16860

ctggacaagg tgctgagcgc ctacaacaag cacagggaca agccgatcag ggagcaggcc 16920

gagaacatca tccacctgtt caccctgacc aacctgggcg ccccggccgc cttcaagtac 16980

ttcgacacca ccatcgacag gaagaggtac accagcacca aggaggtgct ggacgccacc 17040

ctgatccacc agagcatcac cggcctgtac gagaccagga tcgacctgag ccagctgggc 17100

ggcgacaggc cgaagaagaa gaggaaggtg ggcggctaac cgatcgttca aacatttggc 17160

aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc 17220

tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat 17280

gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat 17340

agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gatcgggaat 17400

tgatcccccc tcgacagggt acctgcccct gaatttcagt ctctctagct agtggctaag 17460

gccatctctt atttggttca gatgacagta attcatccag gtctccaagt tctaggattt 17520

tcagaactgc aacttatttt atcaaggaat ctttaaacat acgaacagat cacttaaagt 17580

tcttctgaag caacttaaag ttatcaggca tgcatggatc ttggaggaat cagatgtgca 17640

gtcagggacc atagcacaag acaggcgtct tctactggtg ctaccagcaa atgctggaag 17700

ccgggaacac tgggtacgtt ggaaaccacg tgatgtgaag aagtaagata aactgtagga 17760

gaaaagcatt tcgtagtggg ccatgaagcc tttcaggaca tgtattgcag tatgggccgg 17820

cccattacgc aattggacga caacaaagac tagtattagt accacctcgg ctatccacat 17880

agatcaaagc tgatttaaaa gagttgtgca gatgatccgt ggcgaattgc tggcatcgtc 17940

tgattttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa 18000

gtggcaccga gtcggtgctt ttttggtacc gagctcgaat t 18041

Claims

1.一种利用除草剂控制玉米雄性不育的方法，其特征在于所述方法为：在玉米除草剂解毒酶基因表达框中导入雄花组织特异性siRNA结合片段，在玉米花期前喷施除草剂控制玉米雄花发育，实现雄性不育；所述雄花组织特异性siRNA结合片段核苷酸序列为SEQ IDNO.3所示；

所述除草剂解毒酶基因为玉米内源性基因CYP81A9，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；

所述雄花组织特异性siRNA结合片段导入玉米除草剂解毒酶基因表达框中的方法为：利用基因枪方法，将含雄花组织特异性siRNA结合片段的重组供体片段和含标记基因的基因编辑载体导入玉米幼胚，筛选插入siRNA结合片段的转基因玉米，获得所述的基因编辑玉米；

所述基因编辑载体按如下方法构建：在除草剂解毒酶基因终止子区域设计一个sgRNA靶标，命名为sgRNA1，序列为：aagaggctctgaaaacctca，在靶标插入位点下游设计一个sgRNA靶标，命名为sgRNA2，序列为gaattgctggcatcgtctga；以pCambia1300为载体框架，以抗草甘膦基因表达框为标记基因，合成Cas表达框和靶标识别表达框，构建含有标记基因的基因编辑质粒；所述基因编辑质粒核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示；

所述重组供体片段按如下方法构建：根据除草剂解毒酶基因终止子区域上游序列设计上游同源臂，核苷酸序列为SEQ ID NO.4，根据下游序列设计下游重组同源臂，核苷酸序列为SEQ ID NO.5；按照从5’端到3’端的顺序将上游重组同源臂，siRNA结合片段和下游重组同源臂序列按顺序连接，构建重组供体片段，所述重组供体片段核苷酸序列为SEQ IDNO.6。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于所述玉米花期前为V6-V10期。

3.如权利要求1所述方法，其特征在于所述除草剂为硝磺草酮、砜嘧磺隆或苯达松。