CN109593778A

CN109593778A - 一种植物人工智能雄性不育系及应用

Info

Publication number: CN109593778A
Application number: CN201811324693.4A
Authority: CN
Inventors: 于小星; 张先文; 王东芳; 林朝阳; 沈志成
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-11-08
Filing date: 2018-11-08
Publication date: 2019-04-09

Abstract

本发明公开了一种植物人工智能雄性不育系，所述植物人工智能雄性不育系中导入了一段包含赋予植物除草剂耐受性的蛋白表达框和能够与操纵子结合的阻遏蛋白表达框的DNA片段。本发明植物人工智能雄性不育系不受光温限制，系统更稳定可靠；通过生物技术导入智能雄性不育性状，不受品种局限，可以充分利用各种种植资源；本人工智能雄性不育系可以通过喷施或者不喷施某种特定除草剂表现雄性可育和雄性不育的特性，实现一系两用，用于植物的两系法制种；可以机械化作业，降低生产成本，提高生产效率。

Description

一种植物人工智能雄性不育系及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种植物雄性不育技术，特别涉及一种人工智能雄性不育系的获得及其应用。

(二)背景技术

无论是在原核生物还是真核生物中，蛋白质-DNA互作是一种经典的基因表达调控方式。原核生物中存在一种非常高效的基因表达调控机制，当一种阻遏蛋白与对应的操纵子DNA结合时，就阻止了RNA聚合酶的结合，从而抑制基因的转录(ReznikoffWS and JNAbelson.1980)。上述阻遏蛋白和操纵子互作调控基因表达的系统即为阻遏蛋白-操纵子系统。目前，阻遏蛋白-操纵子系统被广泛用于原核或者真核生物中，用于调控基因的表达。但是，用于创制植物人工智能雄性不育技术，还未见报道或应用。

杂种优势是指2个遗传组成不同的亲本杂交产生的F1代在生活力、生长势、抗逆性、适应性以及产量、品质等方面超过双亲的现象。杂种优势在许多农作物和园艺作物上得到广泛的应用，并获得巨大成功，对推动农业生产做出了重大贡献。

目前利用杂交优势的途径包括人工去雄杂交制种、化学去雄杂交制种、利用自交不亲合性杂交制种、利用雄性不育系。雄性不育系在现代杂交制种应用中极为普遍，一般采用三系两田法，即不育系、恢复系、保持系、亲本繁殖田、杂交制种田。而且制种手续简化，制种产量较高，从而降低了种子生产成本。目前应用的三系制种中的不育系主要是核质互作雄性不育，这种类型的不育性比较容易获得三系。现已在玉米、高梁、小麦、水稻等大田作物的杂交制种中广泛应用。然而，要获得具有应用价值的不育系、保持系及恢复系是一项极其繁琐、艰巨的工作。

两系法具有育性受核基因控制，没有恢保关系，配组自由；种子繁育程序简单，成本低；种植资源利用率高，选育出优良组合机率高等优点。经过二十多年的努力，目前在水稻上建立了光温敏不育系的两系法杂种优势有效利用的新途径，解决了三系法杂交稻的主要限制因素，使水稻杂种优势利用进入一个新阶段。但是，上述光温敏不育系受光、温等环境的影响非常大，在突然变化和极端天气的情况下，容易发生非预期的可育或者不育，从而导致在其自身繁殖和制种过程中存在非常大的风险。因此获得育性稳定，不受光、温限制的不育系对于安全高效的制备杂交种非常必要。

除草剂(herbicide)是指可使杂草彻底地或选择地发生枯死的药剂，又称除莠剂，用以消灭或抑制植物生长的一类物质。根据作用方式可以将除草剂分为内吸性除草剂和触杀型除草剂。内吸性除草剂被根系或叶片、芽鞘或茎部吸收后，传导到植物体内，使植物死亡，草甘膦、啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、扑草净、盖草能、稳杀醚等。触杀型除草剂是指喷到植物的某一叶片，不会被传导到其它叶片，更不会传导到植物的根、花和果部，如除草醚、百草枯、敌稗、果尔、恶草灵等。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种简单可靠的用于制备植物雄性不育系种子的表达框及其制备植物雄性不育系种子的应用，该应用不受光、温等环境因素变化的限制，突破不育系种植资源的制约，简单高效可靠稳定的实现两系杂交法制种。该方法，可以通过对该不育系施用化学物质，特别是施用田间除草所必须的除草剂来实现其雄性不育，控制该不育系的育性；而在不施用上述化学物质时，上述不育系是可育的，可以通过自交获得大量不育系种子。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种植物人工智能雄性不育系，所述植物人工智能雄性不育系中导入了一段包含赋予植物除草剂耐受性的蛋白表达框和能够与操纵子结合的阻遏蛋白表达框的DNA片段。

本发明所述赋予植物除草剂耐受性的蛋白表达框由含终止子的耐除草剂基因以及含有一个或多个操纵子序列的启动子构成；所述操纵子与阻遏蛋白特异性结合，所述操纵子优选与Tet阻遏蛋白特异性结合的操纵子(核苷酸序列如SEQ ID NO.19或SEQ IDNO.20所示)以及与Lac阻遏蛋白特异性结合的操纵子(核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示)；所述启动子可以是原核或真核生物中的天然启动子，也可以是人工合成或者改造的启动子，优选启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；所述含终止子的耐除草剂基因优选为含终止子的耐草甘膦基因G10evo(核苷酸序列SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示)、含终止子的耐草甘膦基因CP4(核苷酸序列SEQ ID NO.8所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示)、含终止子的耐烟嘧磺隆基因CYP81A9(核苷酸序列SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示)、含终止子的耐啶嘧磺隆基因3-X(核苷酸序列SEQ ID NO.12所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.10所示)。

本发明所述能够与操纵子结合的阻遏蛋白表达框由阻遏蛋白基因和雄性生殖组织特异性表达启动子构成；所述阻遏蛋白基因优选Tet(四环素)阻遏蛋白基因TetR(核苷酸序列为SEQ ID NO.15、氨基酸序列SEQ ID NO.18)或Lac(乳糖)阻遏蛋白基因LacR(核苷酸序列为SEQ ID NO.17、氨基酸序列SEQ ID NO.16)。所述雄性生殖组织特异性表达启动子为与操纵子结合的阻遏蛋白的启动子，包括天然启动子(Reema Khurana et al,2012,31(5):359-390)和人工合成启动子，优选人工合成水稻的Osg6B启动子(核苷酸序列如SEQ IDNO.13)和玉米的5126启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO.14)。

本发明所述植物人工智能雄性不育系按如下方法构建：将含终止子的耐除草剂基因以及含有一个或多个操纵子序列的启动子构成赋予植物除草剂耐受性的蛋白表达框，所述操纵子与阻遏蛋白特异性结合；再将阻遏蛋白基因和雄性生殖组织特异性表达启动子构成能够与操纵子结合的阻遏蛋白表达框；然后将赋予植物除草剂耐受性的蛋白表达框克隆至双元载体(优选pCambia1300)，获得过度载体；最后将能够与操纵子结合的阻遏蛋白表达框克隆至过度载体，获得用于筛选植物人工智能雄性不育系的T-DNA质粒，转化植物，获得植物人工智能雄性不育系。

本发明还提供一种所述人工智能雄性不育系在育种中的应用，所述的应用为下列之一：(1)将所述人工智能雄性不育系与其他遗传背景的自交系进行回交转育，获得其他背景的人工智能不育系；(2)将所述人工智能雄性不育系种植，不喷施与转入的基因对应的除草剂(如草甘膦)，让其自花授粉，收获的种子即为人工智能不育系种子，即实现了不育系的扩繁；(3)将本人工智能不育系种植后，在花粉发育之前或花粉发育前期(如玉米的V8和V10期)分别喷施与转入的基因对应的除草剂(如草甘膦)，这样使得人工智能不育系雄性不育，其对应父本给本不育系授粉后，获得杂交种子，即完成了杂交种的制备。

本发明所述植物雄性不育系是在不育系中过表达一种能赋予植物具有耐(1中或多种)除草剂特性的蛋白质，且这种蛋白质在雄性生殖组织中的表达通过阻遏蛋白-操纵子系统(operator-repressor system)所抑制，该蛋白活性的抑制需要施用一种与所述过表达的蛋白质相关的化学物质(即除草剂)从而导致其雄性不育，在不喷施上述化学物质(即除草剂)时可以产生正常的花粉和获得正常的种子。所述的除草剂，优选内吸性除草剂，如草甘膦、啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、扑草净(4,6-双(异丙氨基)-2-甲硫基-1,3,5-三嗪)、吡氟氯禾灵(2[4-(3-氯-5-三氟甲基-2-吡啶氧基)苯氧基]丙酸)。

本发明所述植物是指农作物，包括玉米、大豆、水稻或油菜。

本发明所述赋予植物除草剂耐受性的蛋白优选EPSPS蛋白或细胞色素P450蛋白，其中EPSPS蛋白即含终止子的耐草甘膦基因G10evo编码蛋白(氨基酸序列SEQ ID NO.5，核苷酸序列SEQ ID NO.7)或含终止子的耐草甘膦基因CP4编码蛋白(氨基酸序列SEQ IDNO.6，核苷酸序列SEQ ID NO.8)；细胞色素P450蛋白即含终止子的耐烟嘧磺隆基因CYP81A9编码蛋白(氨基酸序列SEQ ID NO.9，核苷酸序列SEQ ID NO.11)或含终止子的耐啶嘧磺隆基因3-X编码蛋白(氨基酸序列SEQ ID NO.10，核苷酸序列SEQ ID NO.12)。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：(1)本发明植物人工智能雄性不育系不受光温限制，系统更稳定可靠；(2)通过生物技术导入智能雄性不育性状，不受品种局限，可以充分利用各种种植资源；(3)本人工智能雄性不育系可以通过喷施或者不喷施某种特定除草剂表现雄性可育和雄性不育的特性，实现一系两用，用于植物的两系法制种；(4)可以机械化作业，降低生产成本，提高生产效率。

(四)附图说明

图1：赋予植物除草剂耐受性的蛋白质的表达框结构示意图。

图2：与操纵子结合的阻遏蛋白的表达框结构示意图。

图3：不育系的应用示意图。

图4：不育系的转育示意图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、载体的构建

1、耐除草剂表达框的构建

为了构建耐除草剂表达框，人工合成了耐除草剂基因以及对应的终止子序列：耐草甘膦基因G10evo及其终止子序列如SEQ ID NO.7所示；耐草甘膦基因CP4及其终止子序列如SEQ ID NO.8所示；耐烟嘧磺隆基因CYP81A9及其终止子序列如SEQ ID NO.11所示；耐啶嘧磺隆基因3-X及其终止子序列如SEQ ID NO.12所示。上述DNA片段的5’端和3’分别设置了BamHI和KpnI酶切位点。

同时，人工合成了与Tet阻遏蛋白或者Lac阻遏蛋白特异性结合的操纵子序列：与Tet阻遏蛋白特异性结合的操纵子序列如SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20所示，与Lac阻遏蛋白特异性结合的操纵子序列如SEQ ID NO.21所示。包含Lac操纵子的玉米Ubi启动子序列Ubi-LacO如SEQ ID NO.1所示，包含Tet操纵子的玉米Ubi启动子序列Ubi-TetO如SEQ IDNO.2所示；包含Lac操纵子的花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子序列35S-LacO如SEQ IDNO.3所示，包含Tet操纵子的花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子序列35S-TetO如SEQ IDNO.4所示。上述启动子的5’端和3’分别设置了HindIII和BamHI酶切位点。

上述启动子和基因可以随机组合，通过BamHI连接构成可以受阻遏蛋白调控耐除草剂基因表达框。这里作为一个示例，构建了如下4个表达框：Ubi-LacO-G10evo，Ubi-TetO-3-X，35S-LacO-CYP81A9，35S-TetO-CP4。上述表达框的5’端和3’分别为HindIII和KpnI酶切位点。

2、阻遏蛋白表达框构建

为了构建阻遏蛋白特异性表达框，人工合成了阻遏蛋白基因：Tet阻遏蛋白基因TetR和Lac阻遏蛋白基因LacR的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16。上述DNA片段的5’端和3’分别设置了BamHI和XhoI酶切位点。

同时，人工合成雄性生殖组织特异性表达启动子。目前，无论在单子叶植物还是双子叶植物中都已经克隆出来了很多雄性生殖组织特异性表达启动子，这里作为一个示例，人工合成了水稻的Osg6B启动子和玉米的5126启动子，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。上述DNA片段的5’端和3’分别设置了EcoRI和BamHI酶切位点。

上述启动子和基因可以通过BamHI酶切位点连接，构建成如下启动子-阻遏蛋白基因组合：Osg6B-TetR，Osg6B-LacR，5126-TetR，5126-LacR。上述DNA片段的5’端和3’分别为EcoRI和XhoI酶切位点。

3、双元载体构建

为了构架可以用于农杆菌方法转化植物所用的双元载体，用商业化的双元载体pCambia1300为基础，通过HindIII和KpnI酶切位点，把上述耐除草剂表达框Ubi-LacO-G10evo，Ubi-TetO-3-X，35S-LacO-CYP81A9，35S-TetO-CP4分别克隆到pCambia1300载体中，获得四个过度载体分别为1300-Ubi-LacO-G10evo，1300-Ubi-TetO-3-X，1300-35S-LacO-CYP81A9，1300-35S-TetO-CP4。

通过EcoRI和XhoI酶切位点把上述启动子-阻遏蛋白基因组合Osg6B-LacR，5126-TetR，5126-LacR，Osg6B-TetR分别克隆到上述四个过度载体1300-Ubi-LacO-G10evo，1300-Ubi-TetO-3-X，1300-35S-LacO-CYP81A9，1300-35S-TetO-CP4。最终获得以下4个双元载体(即T-DNA质粒)：1300-Ubi-LacO-G10evo-Osg6B-LacR，1300-Ubi-TetO-3-X-5126-TetR，1300-35S-LacO-CYP81A9-5126-LacR，1300-35S-TetO-CP4-Osg6B-TetR。

最后，通过电转的方法把T-DNA质粒转入农杆菌LB4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。

实施例2、玉米转化

玉米的转化方法已经比较成熟，例如Frame等描述了利用农杆菌转化玉米的方法(Frame et al.,(2002)Plant Physiol,129:13-22)。取含实施例1中构建好的农杆菌(即含T-DNA载体的农杆菌)划板，挑单菌落接种，准备转化用农杆菌。取授粉后8-10天的Hi-II玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小为1.0-1.5mm)。将含有T-DNA载体的农杆菌与未成熟胚共培养2-3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(培养基中含有200mg/L的Timentin，用于杀灭农杆菌，参照(Frame et al.,(2002)Plant Physiol,129:13-22))，28℃暗培养10-14天。将所有的愈伤转到带有终浓度2mM草甘膦的筛选培养基上(Frame et al.,(2002)Plant Physiol,129:13-22)，28℃暗培养2-3周。

转移所有的组织到新鲜含终浓度2mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上(Frame et al.,(2002)PlantPhysiol,129:13-22)，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上(Frame et al.,(2002)Plant Physiol,129:13-22)，26℃光照培养直到根发育完全，然后移植到温室中单株培养，检测转基因玉米的抗除草剂能力。用稀释300倍的孟山都的41％的草甘膦水剂喷洒，7天后叶片发黄，枯死的为阴性；和喷清水对照长势一样的为阳性植株。

实施例3、水稻转化

转基因水稻的获得方法是采用现有技术(卢雄斌，龚祖埙(1998)生命科学10：125-131；刘凡等(2003)分子植物育种1：108-115)。选取成熟饱满的“秀水-134”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。取实施例1中构建好农杆菌划板。挑单菌落接种，准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入OD为0.6左右的农杆菌菌液中(农杆菌菌液的制备：将农杆菌接种至培养基，培养至OD为0.6左右；培养基组成：3g/L K₂HPO₄、1g/LNaH₂PO₄、1g/LNH₄Cl、0.3g/L MgSO₄·7H₂O、0.15g/L KCl、0.01g/L CaCl₂、0.0025g/L FeSO₄·7H₂O、5g/L蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮，溶剂为水，pH＝5.8)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养培养基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma7921)+20mg/L乙酰丁香酮)中，共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到筛选培养基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮+2mM草甘膦(Sigma))上，筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基(MS+0.1g/L肌醇+5mg/L ABA+1mg/L NAA+5mg/L 6-BA+20g/L山梨醇+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基上，每天14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基(1/2MS+0.2mg/L NAA+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，选择产量高、种子大或者生物量高等能够提高水稻产量的转基因株系，培育新品种。分别获得含上述转化载体和只含有筛选标记基因G10evo的空载体的转基因水稻植株。

实施例4、油菜转化

油菜的转化技术目前已经成熟。国内外许多学者分别以油菜的子叶、下胚轴、茎段为受体进行基因转化。Moloney等(1989)发现切取带有1-2mm子叶柄末端切口处的细胞易被农杆菌感染和转化。Pua等(1987)建立了茎段再生体系，转化率达10％。Moloney等(1989)以叶柄为受体的转化率为55％。

油菜种子消毒(0.5％升汞消毒10分钟)，无菌水清洗3-4次，接种MS培养基(30g/L蔗糖，6g/L琼脂)，先暗培2天后再置于光照培养箱中(光16h,暗8h)。切取苗龄6-8天无菌苗的下胚轴作为遗传转化的受体。下胚轴接入预培养固体MS培养基(1.0mg/L 2,4-D，1.0mg/L6BA，30g/L蔗糖，6g/L琼脂)中暗培72h。将预培养后的下胚轴浸入农杆菌重悬液中810min，然后用无菌滤纸吸去多余菌液再放入共培养固体MS培养基(1.0mg/L 2,4-D，1.0mg/L 6BA，100μM As，30g/L蔗糖，6g/L琼脂)中，暗培养48h。

共培养后的下胚轴用头孢水(无菌水+500mg/L头孢霉素)清洗后接入抗性愈伤筛选固体MS培养基(1.0mg/L 2,4-D，1.0mg/L 6BA，2mM草甘膦，500mg/L头孢霉素，30g/L蔗糖，8g/L卡那胶)中光照培养14d以上，再继代在分化固体MS培养基(2.0mg/L ZT，4.0mg/L 6BA，5mg/L AgNO₃，12mM草甘膦，500mg/L头孢霉素，30g/L蔗糖，8g/L卡那胶)中光照培养，2周继代一次直至抗性芽产生。抗性芽接入分化茎固体MS培养基(2.0mg/L ZT，3.0mg/L 6BA，5mg/L AgNO₃，2mM草甘膦，500mg/L cef，30g/L蔗糖，8g/L卡那胶)中光照培养，待茎长至1cm，切下置于生根固体MS培养基(0.2mg/L IBA，30g/L蔗糖，8g/L卡那胶)中培养7天即有根长出。

实施例5、玉米人工智能不育系的筛选和应用

1、玉米人工智能不育系的筛选

收获通过实施例2获得的T0代转基因玉米的种子。载体1300-Ubi-LacO-G10evo-Osg6B-LacR，1300-Ubi-TetO-3-X-5126-TetR，1300-35S-TetO-CP4-Osg6B-TetR转化获得的植株分别命名为ULG6B，UT3X，STC6B。将上述玉米种子种植后，在V3期分别对ULG6B和STC6B植株喷施草甘膦，即1:200稀释的农达(孟山都公司)，使用量为100ml/亩。观察植株的生长情况，记录ULG6B和STC6B转基因植株中生长发育没有受到显著影响的品系。接下来对上述生长发育良好的品系的一半植株在V8和V10期喷施1:400稀释的农达(孟山都公司)，使用量为200ml/亩；另一半植株不喷施草甘膦。雄穗开花时通过碘-碘化钾染色法鉴定花粉育性，上述观察和统计结果如表1所示：

表1

在V3期分别对UT3X喷施啶嘧磺隆，即1:3000稀释的绿坊(海正化工)，使用量为14g/亩。观察植株的生长情况，记录UT3X转基因植株中生长发育没有受到显著影响的品系名称。接下来对上述生长发育良好的品系的一半植株在V8和V10期喷施1:6000稀释的绿坊(海正化工)，使用量为7g/亩；另一半植株不喷施啶嘧磺隆。雄穗开花时通过碘-碘化钾染色法鉴定花粉育性，上述观察和统计结果如表2所示：

表2

最终挑选V3期喷施草甘膦或啶嘧磺隆后生长正常，花粉育性也正常，且V8和V10期喷施草甘膦或啶嘧磺隆后花粉完全不育的品系进行分子特征鉴定。最终挑选出单拷贝且分子特征明确的品系作为候选品系，用于后期的安全评价、大田实验和产业化研究及其产业化生产。

挑选出V3期喷施草甘膦(转EPSPS基因玉米)或者啶嘧磺隆(转3-x基因)后植物生长正常且花粉发育正常的，并且在V8和V10期分别喷施草甘膦(转EPSPS基因玉米)或者啶嘧磺隆(转3-x基因)后植物生长生产且雄性不育的转化体用于后续研究和应用。这样的不育系可以在V3期喷施除草剂(草甘膦或者啶嘧磺隆)用于除草，但是不会影响植物的可育性。

最终挑选ULG6B(7、41、59、98、151)，STC6B(11、29、31、92、117)，UT3X(16、36、58、69、138)作为候选品系。

2、玉米人工智能不育系的繁殖

从上述候选品系中挑选一个品系STC6B-29，正常种植后，V8和V10期不喷施草甘膦。这样，后期不育系可以产生正常花粉，自交后，收获种子，即完成了不育系的繁殖(图3)。

3、玉米人工智能不育系的转育

任何适合选育成母本的材料都可以通过与本人工智能不育系进行回交，转育成人工智能不育系。这里以经典的先玉335母本(PH6WC)为例，进行玉米人工智能不育系的转育。种植PH6WC，一周后再种植STC6B-29，并同时再种植一批PH6WC，把STC6B-29的花粉回交到PH6WC植株上，收获种子种植，再用PH6WC植株作为父本进行连续回交，回交6代后，选取遗传背景99％相似的植株进行两代自交，稳定后即获得了PH6WC背景的人工智能不育系(图4)。回交过程中可以通过在V8和V10期喷施草甘膦去雄，也可以通过人工套袋来进行回交转育(图3)。

4、利用玉米人工智能不育系生产杂交种

为了生产杂交种，将STC6B-29不育系与对应的含有耐草甘膦基因的父本以7:3的比例混匀后种植。前期使用选择性除草剂除草，或者在V3期喷施草甘膦除草，或者结合上述两种方法除草。在V8和V10期喷施草甘膦。这样，STC6B-29不育系不产生可育花粉，而耐草甘膦父本可以产生正常花粉，二者杂交后，收获成熟的种子，可育，即可进行后期的售前处理和销售生产(图3)。

实施例6、水稻人工智能不育系的筛选和应用

1、水稻人工智能不育系的筛选

收获通过实施例2获得的T0代转基因水稻的种子。载体1300-Ubi-LacO-G10evo-Osg6B-LacR，1300-35S-LacO-CYP81A9-5126-LacR，1300-35S-TetO-CP4-Osg6B-TetR转化获得的植株分别命名为ULG6B，SLCyp，STC6B。将上述水稻种子种植后，在V3期分别对ULG6B和STC6B植株喷施草甘膦，即1:200稀释的农达(孟山都公司)，使用量为100ml/亩。观察植株的生长情况，记录ULG6B和STC6B转基因植株中生长发育没有受到显著影响的品系名称。接下来对上述生长发育良好的品系的一半植株在V9和V11期喷施1:400稀释的农达(孟山都公司)，使用量为200ml/亩；另一半植株不喷施草甘膦。雄穗开花时通过碘-碘化钾染色法鉴定花粉育性，上述观察和统计结果如表3所示：

表3

在V3期分别对SLCyp喷施烟嘧磺隆，即1:300稀释的烟嘧磺隆(中保)，使用量为150ml/亩。观察植株的生长情况，记录UT3X转基因植株中生长发育没有受到显著影响的品系名称。接下来对上述生长发育良好的品系的一半植株在V8和V10期喷施1:600稀释的绿坊(海正化工)，使用量为75ml/亩；另一半植株不喷施啶嘧磺隆。雄穗开花时通过碘-碘化钾染色法鉴定花粉育性，上述观察和统计结果如表4所示：

表4

最终挑选V3期喷施草甘膦或啶嘧磺隆后生长正常，花粉育性也正常，且V9和V11期喷施草甘膦或啶嘧磺隆后花粉完全不育的品系进行分子特征鉴定。最终挑选出单拷贝且分子特征明确的品系作为候选品系，用于后期的安全评价、大田实验和产业化研究及其产业化生产。最终挑选ULG6B(19、36、68、162、202)，STC6B(41、66、78、171、185)，SLCyp(11、116、135、197、209)作为候选品系。

2、水稻人工智能不育系的繁殖

从上述候选品系中挑选一个品系STC6B-78，正常种植后，前期使用选择性除草剂除草，或者在V3期喷施草甘膦除草，或者结合上述两种方法除草。这样，后期不育系可以产生正常花粉，自交后，收获种子，即完成了不育系的繁殖(图3)。

2、水稻人工智能不育系的转育

任何适合选育成母本的材料都可以通过与本人工智能不育系进行回交，转育成人工智能不育系。这里以经典的自交系9311为例，进行水稻人工智能不育系的转育。播种9311，一周后再播种STC6B-78，并同时再播种一批9311，把STC6B-78的花粉回交到PH6WC植株上，收获种子种植，再用9311植株作为父本进行连续回交，回交6代后，选取遗传背景99％相似的植株进行两代自交，稳定后即获得了9311背景的人工智能不育系(图4)。回交过程中可以通过在V9和V11期喷施草甘膦去雄，也可以通过人工去雄来进行回交转育(图3)。

3、利用水稻人工智能不育系生产杂交种

为了生产杂交种，将STC6B-78不育系与对应的含有耐草甘膦基因的父本以6:4的行比种植。前期使用选择性除草剂除草，或者在V3期喷施草甘膦除草，或者结合上述两种方法除草。在V9和V11期喷施草甘膦。这样，STC6B-78不育系不产生可育花粉，而耐草甘膦父本可以产生正常花粉，二者杂交后，收获成熟的种子，即可进行后期的售前处理和销售生产(图3)。

实施例7、油菜人工智能不育系的筛选和应用

1、油菜人工智能不育系的筛选

收获通过实施例2获得的T0代转基因油菜的种子。载体1300-Ubi-LacO-G10evo-Osg6B-LacR，1300-Ubi-TetO-3-X-5126-TetR，1300-35S-TetO-CP4-Osg6B-TetR转化获得的植株分别命名为ULG6B，UT3X，STC6B。将上述油菜种子种植后，在播种后20天分别对ULG6B和STC6B植株喷施草甘膦，即1:200稀释的农达(孟山都公司)，使用量为100ml/亩。观察植株的生长情况，记录ULG6B和STC6B转基因植株中生长发育没有受到显著影响的品系名称。接下来对上述生长发育良好的品系的一半植株在播种后100天和120天喷施1:400稀释的农达(孟山都公司)，使用量为200ml/亩；另一半植株不喷施草甘膦。雄穗开花时通过碘-碘化钾染色法鉴定花粉育性，上述观察和统计结果如表5所示：

表5

播种后20天对UT3X喷施啶嘧磺隆，即1:3000稀释的绿坊(海正化工)，使用量为14g/亩。观察植株的生长情况，记录UT3X转基因植株中生长发育没有受到显著影响的品系名称。接下来对上述生长发育良好的品系的一半植株在播种后100和120天分别喷施1:6000稀释的绿坊(海正化工)，使用量为7g/亩；另一半植株不喷施啶嘧磺隆。雄穗开花时通过碘-碘化钾染色法鉴定花粉育性，上述观察和统计结果如表6所示：

表6

最终挑选播种后20天喷施草甘膦或啶嘧磺隆后生长正常，花粉育性也正常，且播种后100和120天分别喷施草甘膦或啶嘧磺隆后花粉完全不育的品系进行分子特征鉴定。最终挑选出单拷贝且分子特征明确的品系作为候选品系，用于后期的安全评价、大田实验和产业化研究及其产业化生产。最终挑选ULG6B(10、36、42、66、99)，STC6B(1、23、31、78、92)，UT3X(14、22、71、91、155)作为候选品系。

2、油菜人工智能不育系的繁殖

从上述候选品系中挑选一个品系STC6B-92，正常种植后，前期使用选择性除草剂除草，或者在播种后20天喷施草甘膦除草，或者结合上述两种方法除草。这样，后期不育系可以产生正常花粉，自交后，收获种子，即完成了不育系的繁殖(图3)。

3、油菜人工智能不育系的转育

任何适合选育成母本的材料都可以通过与本人工智能不育系进行回交，转育成人工智能不育系。这里以中油杂200母本(86A)为例，进行油菜人工智能不育系的转育。种植86A，一周后再种植STC6B-92，并同时再种植一批86A，把STC6B-92的花粉回交到86A植株上，收获种子种植，再用86A植株作为父本进行连续回交，回交6代后，选取遗传背景99％相似的植株进行两代自交，稳定后即获得了86A背景的人工智能不育系(图4)。回交过程中可以通过在播种后100和120天喷施草甘膦去雄，也可以通过人工套袋来进行回交转育(图3)。

4、利用油菜人工智能不育系生产杂交种

为了生产杂交种，将STC6B-92不育系与对应的含有耐草甘膦基因的父本以7:3的比例混匀后种植。前期使用选择性除草剂除草，或者在播种后20天喷施草甘膦除草，或者结合上述两种方法除草。在播种后100和120天喷施草甘膦。这样，STC6B-92不育系不产生可育花粉，而耐草甘膦父本可以产生正常花粉，二者杂交后，收获成熟的种子，即可进行后期的售前处理和销售生产(图3)。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种植物人工智能雄性不育系及应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2065

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

aagcttgtta accgcccggg cgtgcagcgt gacccggtcg tgcccctctc tagagataat 60

gagcattgca tgtctaagtt ataaaaaatt accacatatt ttttttgtca cacttgtttg 120

aagtgcagtt tatctatctt tatacatata tttaaacttt actctacgaa taatataatc 180

tatagtacta caataatatc agtgttttag agaatcatat aaatgaacag ttagacatgg 240

tctaaaggac aattgagtat tttgacaaca ggactctaca gttttatctt tttagtgtgc 300

atgtgttctc cttttttttt gcaaatagct tcacctatat aatacttcat ccattttatt 360

agtacatcca tttagggttt agggttaatg gtttttatag actaattttt ttagtacatc 420

tattttattc tattttagcc tctaaattaa gaaaactaaa actctatttt agttttttta 480

tttaataatt tagatataaa atagaataaa ataaagtgac taaaaattaa acaaataccc 540

tttaagaaat taaaaaaact aaggaaacat ttttcttgtt tcgagtagat aatgccagcc 600

tgttaaacgc cgtcgacgag tctaacggac accaaccagc gaaccagcag cgtcgcgtcg 660

ggccaagcga agcagacggc acggcatctc tgtcgctgcc tctggacccc tctcgagagt 720

tccgctccac cgttggactt gctccgctgt cggcatccag aaattgcgtg gcggagcggc 780

agacgtgagc cggcacggca ggcggcctcc tcctcctctc acggcacggc agctacgggg 840

gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgattgt gagcgctcac 900

aattaataaa tagacacatt gtgagcgctc acaatttccc caacctcgat tgtgagcgct 960

cacaattgtt gttcggagcg cacacacaca caaccagatc tcccccaaat ccacccgtcg 1020

gcacctccgc ttcaaggtac gccgctcgtc ctcccccccc ccccctctct accttctcta 1080

gatcggcgtt ccggtccatg gttagggccc ggtagttcta cttctgttca tgtttgtgtt 1140

agatccgtgt ttgtgttaga tccgtgctgc tagcgttcgt acacggatgc gacctgtacg 1200

tcagacacgt tctgattgct aacttgccag tgtttctctt tggggaatcc tgggatggct 1260

ctagccgttc cgcagacggg atcgatttca tgattttttt tgtttcgttg catagggttt 1320

ggtttgccct tttcctttat ttcaatatat gccgtgcact tgtttgtcgg gtcatctttt 1380

catgcttttt tttgtcttgg ttgtgatgat gtggtctggt tgggcggtcg ttctagatcg 1440

gagtagaatt gctgtttcaa actacctggt ggatttatta attttggatc tgtatgtgtg 1500

tgccatacat attcatagtt acgaattgaa gatgatggat ggaaatatcg atctaggata 1560

ggtatacatg ttgatgcggg ttttactgat gcatatacag agatgctttt tgttcgcttg 1620

gttgtgatga tgtggtgtgg ttgggcggtc gttcattcgt tctagatcgg agtagaatac 1680

tgtttcaaac tacctggtgt atttattaat tttggaactg tatgtgtgtg tcatacatct 1740

tcatagttac gagtttaaga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat 1800

gtgggtttta ctgatgcata tacatgatgg catatgcagc atctattcat atgctctaac 1860

cttgagtacc tatctattat aataaacaag tatgttttat aattattttg atcttgatat 1920

acttggatga tggcatatgc agcagctata tgtggatttt tttagccctg ccttcatacg 1980

ctatttattt gcttggtact gtttcttttg tcgatgctca ccctgttgtt tggtgttact 2040

tctgcaggtc gactctagag gatcc 2065

<210> 2

<211> 2068

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

aagcttgtta accgcccggg cgtgcagcgt gacccggtcg tgcccctctc tagagataat 60

gagcattgca tgtctaagtt ataaaaaatt accacatatt ttttttgtca cacttgtttg 120

aagtgcagtt tatctatctt tatacatata tttaaacttt actctacgaa taatataatc 180

tatagtacta caataatatc agtgttttag agaatcatat aaatgaacag ttagacatgg 240

tctaaaggac aattgagtat tttgacaaca ggactctaca gttttatctt tttagtgtgc 300

atgtgttctc cttttttttt gcaaatagct tcacctatat aatacttcat ccattttatt 360

agtacatcca tttagggttt agggttaatg gtttttatag actaattttt ttagtacatc 420

tattttattc tattttagcc tctaaattaa gaaaactaaa actctatttt agttttttta 480

tttaataatt tagatataaa atagaataaa ataaagtgac taaaaattaa acaaataccc 540

tttaagaaat taaaaaaact aaggaaacat ttttcttgtt tcgagtagat aatgccagcc 600

tgttaaacgc cgtcgacgag tctaacggac accaaccagc gaaccagcag cgtcgcgtcg 660

ggccaagcga agcagacggc acggcatctc tgtcgctgcc tctggacccc tctcgagagt 720

tccgctccac cgttggactt gctccgctgt cggcatccag aaattgcgtg gcggagcggc 780

agacgtgagc cggcacggca ggcggcctcc tcctcctctc acggcacggc agctacgggg 840

gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtctct atcactgata 900

gagataataa atagacacac tctatcactg atagagtttc cccaacctcg tctctatcac 960

tgatagagat gttgttcgga gcgcacacac acacaaccag atctccccca aatccacccg 1020

tcggcacctc cgcttcaagg tacgccgctc gtcctccccc cccccccctc tctaccttct 1080

ctagatcggc gttccggtcc atggttaggg cccggtagtt ctacttctgt tcatgtttgt 1140

gttagatccg tgtttgtgtt agatccgtgc tgctagcgtt cgtacacgga tgcgacctgt 1200

acgtcagaca cgttctgatt gctaacttgc cagtgtttct ctttggggaa tcctgggatg 1260

gctctagccg ttccgcagac gggatcgatt tcatgatttt ttttgtttcg ttgcataggg 1320

tttggtttgc ccttttcctt tatttcaata tatgccgtgc acttgtttgt cgggtcatct 1380

tttcatgctt ttttttgtct tggttgtgat gatgtggtct ggttgggcgg tcgttctaga 1440

tcggagtaga attgctgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt 1500

gtgtgccata catattcata gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg 1560

ataggtatac atgttgatgc gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc 1620

ttggttgtga tgatgtggtg tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa 1680

tactgtttca aactacctgg tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca 1740

tcttcatagt tacgagttta agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt 1800

gatgtgggtt ttactgatgc atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct 1860

aaccttgagt acctatctat tataataaac aagtatgttt tataattatt ttgatcttga 1920

tatacttgga tgatggcata tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat 1980

acgctattta tttgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt 2040

acttctgcag gtcgactcta gaggatcc 2068

<210> 3

<211> 827

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

aagctttggt ggagcacgac actctcgtct actccaagaa tatcaaagat acagtctcag 60

aagaccaaag ggctattgag acttttcaac aaagggtaat atcgggaaac ctcctcggat 120

tccattgccc agctatctgt cacttcatca aaaggacagt agaaaaggaa ggtggcacct 180

acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg ctatcgttca agatgcctct gccgacagtg 240

gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca 300

cgtcttcaaa gcaagtggat tgatgtgata acatggtgga gcacgacact ctcgtctact 360

ccaagaatat caaagataca gtctcagaag accaaagggc tattgagact tttcaacaaa 420

gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac ttcatcaaaa 480

ggacagtaga aaaggaaggt ggcacctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcta 540

tcgttcaaga tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca 600

tcgtggaaaa agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgatatct 660

ccactgacgt aaggattgtg agcgctcaca atgatgacgc acaatcccac tatccttcgc 720

aagaccttcc tctatataag gaagattgtg agcgctcaca atacacgctg aaatattgtg 780

agcgctcaca atcaccagtc tctctctaca aatctatctc tggatcc 827

<210> 4

<211> 829

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

aagcttcatg gtggagcacg acactctcgt ctactccaag aatatcaaag atacagtctc 60

agaagaccaa agggctattg agacttttca acaaagggta atatcgggaa acctcctcgg 120

attccattgc ccagctatct gtcacttcat caaaaggaca gtagaaaagg aaggtggcac 180

ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcgtt caagatgcct ctgccgacag 240

tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 300

cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca ctctcgtcta 360

ctccaagaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca 420

aagggtaata tcgggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc acttcatcaa 480

aaggacagta gaaaaggaag gtggcaccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc 540

tatcgttcaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 600

catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat 660

ctccactgac gtaaggattg tgagcgctca caatgatgac gcacaatccc actatccttc 720

gcaagacctt cctctatata aggaagattg tgagcgctca caatacacgc tgaaatattg 780

tgagcgctca caatcaccag tctctctcta caaatctatc tctggatcc 829

<210> 5

<211> 504

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

Met Ala Ala Thr Met Ala Ser Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser

1 5 10 15

Leu Asp Gln Ala Val Ala Ala Ser Ala Ala Phe Ser Ser Arg Lys Gln

20 25 30

Leu Arg Leu Pro Ala Ala Ala Arg Gly Gly Met Arg Val Arg Val Arg

35 40 45

Ala Arg Gly Arg Arg Glu Ala Val Val Val Ala Ser Ala Ser Ser Ser

50 55 60

Ser Gly Ser Asp Ala Leu Pro Ala Thr Phe Asp Val Ile Val His Pro

65 70 75 80

Ala Arg Glu Leu Arg Gly Glu Leu Arg Ala Gln Pro Ser Lys Asn Tyr

85 90 95

Thr Thr Arg Tyr Leu Leu Ala Ala Ala Leu Ala Glu Gly Glu Thr Arg

100 105 110

Val Val Gly Val Ala Thr Ser Glu Asp Ala Glu Ala Met Leu Arg Cys

115 120 125

Leu Arg Asp Trp Gly Ala Gly Val Glu Leu Val Gly Asp Asp Ala Val

130 135 140

Ile Arg Gly Phe Gly Ala Arg Pro Gln Ala Gly Val Thr Leu Asn Pro

145 150 155 160

Gly Asn Ala Gly Ala Val Ala Arg Phe Leu Met Gly Val Ala Ala Leu

165 170 175

Thr Ser Gly Thr Thr Phe Val Thr Asp Tyr Pro Asp Ser Leu Gly Lys

180 185 190

Arg Pro Gln Gly Asp Leu Leu Glu Ala Leu Glu Arg Leu Gly Ala Trp

195 200 205

Val Ser Ser Asn Asp Gly Arg Leu Pro Ile Ser Val Ser Gly Pro Val

210 215 220

Arg Gly Gly Thr Val Glu Val Ser Ala Glu Arg Ser Ser Gln Tyr Ala

225 230 235 240

Ser Ala Leu Met Phe Leu Gly Pro Leu Leu Pro Asp Gly Leu Glu Leu

245 250 255

Arg Leu Thr Gly Asp Ile Lys Ser His Ala Pro Leu Arg Gln Thr Leu

260 265 270

Asp Thr Leu Ser Asp Phe Gly Val Arg Ala Thr Ala Ser Asp Asp Leu

275 280 285

Arg Arg Ile Ser Ile Pro Gly Gly Gln Lys Tyr Arg Pro Gly Arg Val

290 295 300

Leu Val Pro Gly Asp Tyr Pro Gly Ser Ala Ala Ile Leu Thr Ala Ala

305 310 315 320

Ala Leu Leu Pro Gly Glu Val Arg Leu Ser Asn Leu Arg Glu His Asp

325 330 335

Leu Gln Gly Glu Lys Glu Ala Val Asn Val Leu Arg Glu Met Gly Ala

340 345 350

Asp Ile Val Arg Glu Gly Asp Thr Leu Thr Val Arg Gly Gly Arg Pro

355 360 365

Leu His Ala Val Thr Arg Asp Gly Asp Ser Phe Thr Asp Ala Val Gln

370 375 380

Ala Leu Thr Ala Ala Ala Ala Phe Ala Glu Gly Asp Thr Thr Trp Glu

385 390 395 400

Asn Val Ala Thr Leu Arg Leu Lys Glu Cys Asp Arg Ile Ser Asp Thr

405 410 415

Arg Ala Glu Leu Glu Arg Leu Gly Leu Arg Ala Arg Glu Thr Ala Asp

420 425 430

Ser Leu Ser Val Thr Gly Ser Ala His Leu Ala Gly Gly Ile Thr Ala

435 440 445

Asp Gly His Gly Asp His Arg Met Ile Met Leu Leu Thr Leu Leu Gly

450 455 460

Leu Arg Ala Asp Ala Pro Leu Arg Ile Thr Gly Ala His His Ile Arg

465 470 475 480

Lys Ser Tyr Pro Gln Phe Phe Ala His Leu Glu Ala Leu Gly Ala Arg

485 490 495

Phe Glu Tyr Ala Glu Ala Thr Ala

500

<210> 6

<211> 529

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

Met Ala Ala Thr Met Ala Ser Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser

1 5 10 15

Leu Asp Gln Ala Val Ala Ala Ser Ala Ala Phe Ser Ser Arg Lys Gln

20 25 30

Leu Arg Leu Pro Ala Ala Ala Arg Gly Gly Met Arg Val Arg Val Arg

35 40 45

Ala Arg Gly Arg Arg Glu Ala Val Val Val Ala Ser Ala Ser Ser Ser

50 55 60

Ser Val Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Glu Met Leu His Gly Ala Ser

65 70 75 80

Ser Arg Pro Ala Thr Ala Arg Lys Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Val

85 90 95

Arg Ile Pro Gly Asp Lys Ser Ile Ser His Arg Ser Phe Met Phe Gly

100 105 110

Gly Leu Ala Ser Gly Glu Thr Arg Ile Thr Gly Leu Leu Glu Gly Glu

115 120 125

Asp Val Ile Asn Thr Gly Lys Ala Met Gln Ala Met Gly Ala Arg Ile

130 135 140

Arg Lys Glu Gly Asp Thr Trp Ile Ile Asp Gly Val Gly Asn Gly Gly

145 150 155 160

Leu Leu Ala Pro Glu Ala Pro Leu Asp Phe Gly Asn Ala Ala Thr Gly

165 170 175

Cys Arg Leu Thr Met Gly Leu Val Gly Val Tyr Asp Phe Asp Ser Thr

180 185 190

Phe Ile Gly Asp Ala Ser Leu Thr Lys Arg Pro Met Gly Arg Val Leu

195 200 205

Asn Pro Leu Arg Glu Met Gly Val Gln Val Lys Ser Glu Asp Gly Asp

210 215 220

Arg Leu Pro Val Thr Leu Arg Gly Pro Lys Thr Pro Thr Pro Ile Thr

225 230 235 240

Tyr Arg Val Pro Met Ala Ser Ala Gln Val Lys Ser Ala Val Leu Leu

245 250 255

Ala Gly Leu Asn Thr Pro Gly Ile Thr Thr Val Ile Glu Pro Ile Met

260 265 270

Thr Arg Asp His Thr Glu Lys Met Leu Gln Gly Phe Gly Ala Asn Leu

275 280 285

Thr Val Glu Thr Asp Ala Asp Gly Val Arg Thr Ile Arg Leu Glu Gly

290 295 300

Arg Gly Lys Leu Thr Gly Gln Val Ile Asp Val Pro Gly Asp Pro Ser

305 310 315 320

Ser Thr Ala Phe Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Val Pro Gly Ser Asp

325 330 335

Val Thr Ile Leu Asn Val Leu Met Asn Pro Thr Arg Thr Gly Leu Ile

340 345 350

Leu Thr Leu Gln Glu Met Gly Ala Asp Ile Glu Val Ile Asn Pro Arg

355 360 365

Leu Ala Gly Gly Glu Asp Val Ala Asp Leu Arg Val Arg Ser Ser Thr

370 375 380

Leu Lys Gly Val Thr Val Pro Glu Asp Arg Ala Pro Ser Met Ile Asp

385 390 395 400

Glu Tyr Pro Ile Leu Ala Val Ala Ala Ala Phe Ala Glu Gly Ala Thr

405 410 415

Val Met Asn Gly Leu Glu Glu Leu Arg Val Lys Glu Ser Asp Arg Leu

420 425 430

Ser Ala Val Ala Asn Gly Leu Lys Leu Asn Gly Val Asp Cys Asp Glu

435 440 445

Gly Glu Thr Ser Leu Val Val Arg Gly Arg Pro Asp Gly Lys Gly Leu

450 455 460

Gly Asn Ala Ser Gly Ala Ala Val Ala Thr His Leu Asp His Arg Ile

465 470 475 480

Ala Met Ser Phe Leu Val Met Gly Leu Val Ser Glu Asn Pro Val Thr

485 490 495

Val Asp Asp Ala Thr Met Ile Ala Thr Ser Phe Pro Glu Phe Met Asp

500 505 510

Leu Met Ala Gly Leu Gly Ala Lys Ile Glu Leu Ser Asp Thr Lys Ala

515 520 525

Ala

<210> 7

<211> 1725

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

ggatccaaca atggccgcca cgatggccag caacgccgcc gccgccgccg ccgtgagcct 60

ggaccaggcc gtggccgcca gcgccgcctt cagcagcagg aagcagctga ggctgccggc 120

cgccgccagg ggcggcatga gggtgagggt gagggccagg ggcaggaggg aggccgtggt 180

ggtggccagc gccagcagca gcagcggcag cgacgccctg ccggccacct tcgacgtgat 240

cgtccacccg gccagggagc tgaggggcga gctgagggcc cagccgagca agaactacac 300

cacccgctac ctgctggccg ccgccctggc cgagggcgag accagggtgg tgggcgtggc 360

caccagcgag gacgccgagg ccatgctgag gtgcctgagg gactggggcg ccggcgtgga 420

gctggtgggc gacgacgccg tgatcagggg cttcggcgcc aggccgcagg ccggcgtgac 480

cctgaacccg ggcaacgccg gcgccgtggc caggttcctg atgggcgtgg ccgccctgac 540

cagcggcacc accttcgtga ccgactaccc ggacagcctg ggcaagaggc cgcagggcga 600

cctgctggag gccctggaga ggctgggcgc ctgggtgagc agcaacgacg gcaggctgcc 660

gatcagcgtg agcggcccgg tgaggggcgg caccgtggag gtgagcgccg agaggagcag 720

ccagtacgcc agcgccctga tgttcctggg cccgctgctg ccggacggcc tggagctgag 780

gctgaccggc gacatcaaga gccacgcccc gctgaggcag accctggaca ccctgagcga 840

cttcggcgtg agggccaccg ccagcgacga cctgaggagg atcagcatcc cgggcggcca 900

gaagtacagg ccgggcaggg tgctggtgcc gggcgactac ccgggcagcg ccgccatcct 960

gaccgccgcc gccctgctgc cgggcgaggt gaggctgagc aacctgaggg agcacgacct 1020

gcagggcgag aaggaggccg tgaacgtgct gagggagatg ggcgccgaca tcgtgaggga 1080

gggcgacacc ctgaccgtga ggggcggcag gccgctgcac gccgtgacca gggacggcga 1140

cagcttcacc gacgccgtgc aggccctgac cgccgccgcc gccttcgccg agggcgacac 1200

cacctgggag aacgtggcca ccctgaggct gaaggagtgc gacaggatca gcgacaccag 1260

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cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact tctatcaata aaatttctaa ttcctaaaac 1680

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<210> 8

<211> 1800

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

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catgatcgac gagtacccga tcctggccgt ggccgccgcc ttcgccgagg gcgccaccgt 1260

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cggcctgaag ctgaacggcg tggactgcga cgagggcgag accagcctgg tggtgagggg 1380

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<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

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Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Leu Phe Leu

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Leu His Tyr Leu Leu Gly Arg Arg Ala Gly Gly Glu Gly Lys Ala Lys

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Ala Lys Gly Ser Arg Arg Arg Leu Pro Pro Ser Pro Pro Ala Ile Pro

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Phe Leu Gly His Leu His Leu Val Lys Ala Pro Phe His Gly Ala Leu

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Ala Arg Leu Ala Ala Arg His Gly Pro Val Phe Ser Met Arg Leu Gly

65 70 75 80

Thr Arg Arg Ala Val Val Val Ser Ser Pro Asp Cys Ala Arg Glu Cys

85 90 95

Phe Thr Glu His Asp Val Asn Phe Ala Asn Arg Pro Leu Phe Pro Ser

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Met Arg Leu Ala Ser Phe Asp Gly Ala Met Leu Ser Val Ser Ser Tyr

115 120 125

Gly Pro Tyr Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Ala Val Gln Leu Leu

130 135 140

Ser Ala His Arg Val Gly Cys Met Ala Pro Ala Ile Glu Ala Gln Val

145 150 155 160

Arg Ala Met Val Arg Arg Met Asp Arg Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly

165 170 175

Gly Val Ala Arg Val Gln Leu Lys Arg Arg Leu Phe Glu Leu Ser Leu

180 185 190

Ser Val Leu Met Glu Thr Ile Ala His Thr Lys Thr Ser Arg Ala Glu

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Ala Asp Ala Asp Ser Asp Met Ser Thr Glu Ala His Glu Phe Lys Gln

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Ile Val Asp Glu Leu Val Pro Tyr Ile Gly Thr Ala Asn Arg Trp Asp

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Tyr Leu Pro Val Leu Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Asn Lys

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Ile Leu Asp Ala Val Gly Arg Arg Asp Ala Phe Leu Gly Arg Leu Ile

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Asp Gly Glu Arg Arg Arg Leu Asp Ala Gly Asp Glu Ser Glu Ser Lys

275 280 285

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Tyr Thr Asp Thr Val Ile Thr Ala Leu Cys Ala Asn Leu Phe Gly Ala

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Gly Thr Glu Thr Thr Ser Thr Thr Thr Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu

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Leu Asn His Arg Glu Ala Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Ala

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Ala Pro Leu Leu Leu Pro His Glu Ser Ala Ala Asp Cys Thr Val Gly

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Glu Arg Phe Glu Gly Ala Gly Gly Lys Ala Glu Gly Arg Leu Leu Met

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Pro Phe Gly Met Gly Arg Arg Lys Cys Pro Gly Glu Thr Leu Ala Leu

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Arg Thr Val Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu Gln Cys Phe Asp Trp

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Asp Thr Val Asp Gly Ala Gln Val Asp Met Lys Ala Ser Gly Gly Leu

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<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

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Met Asp Lys Ala Tyr Val Ala Leu Leu Ser Phe Ala Ser Leu Phe Leu

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Leu His Tyr Leu Val Ser Arg Arg Asn Gly Thr Gly Lys Gly Ser Lys

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Ala Lys Gly Ala Leu Pro Pro Ser Pro Pro Ser Val Pro Phe Leu Gly

35 40 45

His Leu His Leu Val Lys Thr Pro Phe His Ala Ala Leu Ala Arg Leu

50 55 60

Ala Asp Cys His Gly Pro Val Phe Ser Leu Arg Met Gly Ala Arg Pro

65 70 75 80

Ala Val Val Val Ser Ser Pro Glu His Ala Lys Glu Cys Phe Thr Glu

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His Asp Val Ala Phe Ala Asn Arg Pro Arg Phe Pro Ser Gln Gln Leu

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Ala Ser Phe Asn Gly Ala Ala Leu Gly Ser Ala Ser Tyr Gly Pro Tyr

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Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Thr Val His Leu Leu Ser Ala His

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Arg Val Ala Cys Met Thr Gly Thr Ile Ala Ala Glu Val Arg Ala Met

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Val Arg Arg Met Asn Arg Ala Ala Gln Val Ala Ser Gly Gly Ala Ala

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Arg Ile Glu Leu Lys Arg Arg Leu Phe Glu Val Ser Leu Ser Val Leu

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Met Glu Thr Ile Ala Arg Thr Lys Thr Ser Arg Thr Glu Ala Asp Asp

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Asp Thr Asp Met Ser Pro Glu Ala Arg Glu Phe Lys Gln Ile Val Asp

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Val Leu Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Lys Lys Ile Val Ser

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Arg Thr Arg Leu Asp Asp Gly Asn Asp Ala Gly Glu Lys Lys Ser Ile

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Ile Ala Met Leu Leu Thr Leu Gln Lys Ser Glu Pro Asp Val Tyr Ser

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Asp Thr Met Ile Met Ala Leu Cys Gly Asn Leu Phe Gly Ala Gly Thr

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Glu Thr Thr Ser Thr Thr Thr Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu Leu Asn

325 330 335

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Gly Thr Ser Arg Leu Leu Thr Ala Asp Asp Met Pro Arg Leu Thr Tyr

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Leu Arg Cys Ile Ile Asp Glu Thr Met Arg Leu Tyr Pro Ala Ala Pro

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Leu Leu Leu Pro His Glu Ser Ser Thr His Cys Lys Val Gly Gly Tyr

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Phe Glu Asp Gly Lys Ala Glu Gly Arg Leu Leu Met Pro Phe Gly Met

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Gly Arg Arg Lys Cys Pro Gly Glu Thr Leu Ala Leu Arg Thr Ile Gly

450 455 460

Leu Val Leu Gly Thr Leu Ile Gln Cys Phe Asp Trp Asp Arg Val Asp

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Gly Leu Glu Val Asp Met Thr Glu Ser Gly Gly Leu Thr Ile Pro Arg

485 490 495

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<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

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<210> 12

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<212> DNA

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gaattccata tgatttagaa taatatacaa atatattaca taaaaaatat attaattgaa 60

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Met Ala Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu

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Leu Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala

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Gln Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn

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Lys Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His

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Arg Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp

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Gly Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu

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Thr Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu

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Glu Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly

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Cys Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu

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Thr Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu

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Met Lys Pro Val Thr Leu Tyr Asp Val Ala Glu Tyr Ala Gly Val Ser

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Tyr Gln Thr Val Ser Arg Val Val Asn Gln Ala Ser His Val Ser Ala

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Lys Thr Arg Glu Lys Val Glu Ala Ala Met Ala Gln Leu Asn Tyr Ile

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Ser Met Val Glu Arg Ser Ser Val Glu Ala Cys Lys Ala Ala Val His

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Asn Leu Leu Ala Gln Arg Val Ser Gly Leu Ile Ile Asn Tyr Pro Leu

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Asp Asp Glu Asp Ala Ile Ala Val Glu Ala Ala Cys Ala Asn Val Pro

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Phe Ser His Glu Asp Gly Thr Arg Leu Gly Val Glu His Leu Ile Ala

165 170 175

Leu Gly His Gln Gln Ile Ala Leu Leu Ala Gly Pro Leu Ser Ser Val

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Ser Ala Arg Leu Arg Leu Ala Asp Trp His Lys Tyr Leu Thr Arg Asn

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Gly Phe Gln Gln Thr Met Gln Met Leu Asn Glu Gly Ile Val Pro Thr

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Ala Met Leu Val Ala Asn Asp Gln Met Ala Leu Gly Ala Met Arg Ala

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Ile Thr Glu Ser Gly Leu Arg Val Gly Ala Asp Ile Ser Val Val Gly

260 265 270

Tyr Asp Asp Thr Glu Asp Ser Ser Cys Tyr Ile Pro Pro Leu Thr Thr

275 280 285

Ile Lys Gln Asp Phe Arg Leu Leu Gly Lys Thr Ser Val Glu Arg Leu

290 295 300

Leu Lys Leu Ser Gln Gly Gln Ala Val Lys Ser Asn Gln Leu Leu Pro

305 310 315 320

Val Ser Leu Val Lys Arg Lys Thr Thr Leu Ala Pro Asn Lys Gln Thr

325 330 335

Thr Ser Pro Arg Thr Leu Ala Asp Ser Leu Met Gln Leu Ala Arg Gln

340 345 350

Val Ser Arg Leu Glu Ser Gly Gln

355 360

<210> 17

<211> 1099

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 17

ggatccaaca atgaagccgg tgaccctgta cgacgtggcc gagtacgccg gcgtgagcta 60

ccagaccgtg agcagggtgg tgaaccaggc cagccacgtg agcgccaaga ccagggagaa 120

ggtggaggcc gcgatggccc agctgaacta catcccgaac agggtggccc agcagctggc 180

cggcaagcag agcctgctga tcggcgtggc caccagcagc ctggccctgc acgccccgag 240

ccagatcgtg gccgccatca agagcagggc cgaccagctg ggcgccagcg tggtggtgag 300

catggtggag aggagcagcg tggaggcctg caaggccgcc gtgcacaacc tgctggccca 360

gagggtgagc ggcctgatca tcaactaccc gctggacgac gaggacgcca tcgccgtgga 420

ggccgcctgc gccaacgtgc cggccctgtt cctggacgtg agcgaccaga ccccgatcaa 480

cagcatcatc ttcagccacg aggacggcac caggctgggc gtggagcacc tgatcgccct 540

gggccaccag cagatcgccc tgctggccgg cccgctgagc agcgtgagcg ccaggctgag 600

gctggccgac tggcacaagt acctgaccag gaaccagatc cacccgatcg ccgagaggga 660

gggcgactgg agcgccatga gcggcttcca gcagaccatg cagatgctga acgagggcat 720

cgtgccgacc gccatgctgg tggccaacga ccagatggcc ctgggcgcca tgagggccat 780

caccgagagc ggcctgaggg tgggcgccga catcagcgtg gtgggctacg acgacaccga 840

ggacagcagc tgctacatcc cgccgctgac caccatcaag caggacttca ggctgctggg 900

caagaccagc gtggagaggc tgctgaagct gagccagggc caggccgtga agagcaacca 960

gctgctgccg gtgagcctgg tgaagaggaa gaccaccctg gccccgaaca agcagaccac 1020

cagcccgagg accctggccg acagcctgat gcagctggcc aggcaggtga gcaggctgga 1080

gagcggccag tagctcgag 1099

<210> 18

<211> 643

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 18

ggatccaaca atggctagca ggctggacaa gagcaaggtg atcaacagcg ccctggagct 60

gctgaacgag gtgggcatcg agggcctgac caccaggaag ctggcccaga agctgggcgt 120

ggagcagccg accctgtact ggcacgtgaa gaacaagagg gccctgctgg acgccctggc 180

catcgagatg ctggacaggc accacaccca cttctgcccg ctggagggcg agagctggca 240

ggacttcctg aggaacaacg ccaagagctt caggtgcgcc ctgctgagcc acagggacgg 300

cgccaaggtg cacctgggca ccaggccgac cgagaagcag tacgagaccc tggagaacca 360

gctggccttc ctgtgccagc agggcttcag cctggagaac gccctgtacg ccctgagcgc 420

cgtgggccac ttcaccctgg gctgcgtgct ggaggaccag gagcaccagg tggccaagga 480

ggagagggag accccgacca ccgacagcat gccgccgctg ctgaggcagg ccatcgagct 540

gttcgaccac cagggcgccg agccggcctt cctgttcggc ctggagctga tcatctgcgg 600

cctggagaag cagctgaagt gcgagagcgg cagctgactc gag 643

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 19

tctctatcac tgatagaga 19

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 20

actctatcac tgatagagt 19

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 21

attgtgagcg ctcacaat 18

Claims

1.一种植物人工智能雄性不育系，其特征在于所述的植物人工智能雄性不育系中插入了一段包括赋予植物除草剂耐受性的蛋白表达框和能够与操纵子结合的阻遏蛋白表达框的DNA片段；所述赋予植物除草剂耐受性的蛋白表达框由含终止子的耐除草剂基因以及含有操纵子序列的启动子构成，所述操纵子与阻遏蛋白特异性结合；所述能够与操纵子结合的阻遏蛋白表达框由阻遏蛋白基因和雄性生殖组织特异性表达启动子构成。

2.如权利要求1所述表达框，其特征在于所述操纵子序列为SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.20或SEQ ID NO.21所示。

3.如权利要求2所述表达框，其特征在于所述含有操纵子序列的启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

4.如权利要求1所述表达框，其特征在于所述耐除草剂基因包括耐草甘膦基因G10evo、耐草甘膦基因CP4、耐烟嘧磺隆基因CYP81A9或耐啶嘧磺隆基因3-X。

5.如权利要求4所述表达框，其特征在于所述含终止子的耐除草剂基因核苷酸序列为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示。

6.如权利要求1所述表达框，其特征在于所述雄性生殖组织特异性表达启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示。

7.如权利要求1所述表达框，其特征在于所述表达框按如下方法构建：将含终止子的耐除草剂基因以及含有操纵子序列的启动子构成赋予植物除草剂耐受性的蛋白表达框；再将阻遏蛋白基因和雄性生殖组织特异性表达启动子构成能够与操纵子结合的阻遏蛋白表达框；然后将赋予植物除草剂耐受性的蛋白表达框克隆至双元载体，获得过度载体；最后将能够与操纵子结合的阻遏蛋白表达框克隆至过度载体，获得用于筛选植物不育系表达框的T-DNA质粒。

8.一种权利要求1所述人工智能雄性不育系在育种中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的应用为下列之一：(1)将所述人工智能雄性不育系与其他遗传背景的自交系进行回交转育，获得其他背景的人工智能不育系；(2)将所述人工智能雄性不育系种植，不喷施与转入的基因对应的除草剂，让其自花授粉，收获的种子即为人工智能不育系种子，即实现了不育系的扩繁；(3)将所述人工智能雄性不育系种植后，在花粉发育之前或花粉发育前期分别喷施与转入的基因对应的除草剂，使得人工智能不育系雄性不育，其对应父本给本不育系授粉后，获得杂交种子，即完成了杂交种的制备。