JPH0997A - 繊維特性の改善したワタ繊維の製造方法 - Google Patents
繊維特性の改善したワタ繊維の製造方法Info
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- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
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- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ゴシピウム属に属するワタ植物をブラシ
ノステロイドで処理し、該植物よりワタ繊維を採取する
ワタ繊維の製造方法。 【効果】 ワタ繊維の特性の改善および収量の向上を行
うことができる。
ノステロイドで処理し、該植物よりワタ繊維を採取する
ワタ繊維の製造方法。 【効果】 ワタ繊維の特性の改善および収量の向上を行
うことができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は増加した繊維長、繊
度およびより高い繊維強度などの繊維特性を改善したワ
タ繊維の製造方法に関する。
度およびより高い繊維強度などの繊維特性を改善したワ
タ繊維の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】通常、ワタ繊維はゴシピウム属に属する
ワタ植物を栽培し、ワタ植物上に得られたさく果（コッ
トンボール）より採取することにより製造する。ワタ植
物には種々の品種があり、それぞれ異なった繊維特性を
有するワタ繊維が得られ、その繊維特性に応じて各種用
途に使い分けられている。ワタ繊維は種々の特性値によ
って特徴つけられるが、その中でも、特に重要なものと
して繊維長、繊度、強度が挙げられる。従来より、ワタ
繊維の特性を改善するため多大な努力がなされてきた
が、その繊維特性を改善する中心は、繊維長と繊度であ
った。その中でも、特により長く細い繊維が望まれてき
た。このような繊維特性を有する品種としては、海島綿
が有名であるが、しかし、この品種は生産性が低く、大
変高価である。もし、海島綿と同等以上の繊維特性を有
するワタ繊維をより高い生産性で得ることができれば、
産業上非常に有益である。
ワタ植物を栽培し、ワタ植物上に得られたさく果（コッ
トンボール）より採取することにより製造する。ワタ植
物には種々の品種があり、それぞれ異なった繊維特性を
有するワタ繊維が得られ、その繊維特性に応じて各種用
途に使い分けられている。ワタ繊維は種々の特性値によ
って特徴つけられるが、その中でも、特に重要なものと
して繊維長、繊度、強度が挙げられる。従来より、ワタ
繊維の特性を改善するため多大な努力がなされてきた
が、その繊維特性を改善する中心は、繊維長と繊度であ
った。その中でも、特により長く細い繊維が望まれてき
た。このような繊維特性を有する品種としては、海島綿
が有名であるが、しかし、この品種は生産性が低く、大
変高価である。もし、海島綿と同等以上の繊維特性を有
するワタ繊維をより高い生産性で得ることができれば、
産業上非常に有益である。
【０００３】ワタ繊維の繊維特性あるいは収量を改善さ
せる方法としては、大きく分けて３つの方法がある。 １．交配育種による品種改良 この方法は、従来より最もよく利用されてきた方法であ
る。現在、ワタ植物の栽培品種として利用されているも
のは、ほとんど、この方法により育種されたものであ
る。しかしながら、該方法は長い時間を要する上、品種
を改善できるレベルに限度があり、繊維特性の改良およ
び生産性に飛躍的な向上はあまり期待できない。
せる方法としては、大きく分けて３つの方法がある。 １．交配育種による品種改良 この方法は、従来より最もよく利用されてきた方法であ
る。現在、ワタ植物の栽培品種として利用されているも
のは、ほとんど、この方法により育種されたものであ
る。しかしながら、該方法は長い時間を要する上、品種
を改善できるレベルに限度があり、繊維特性の改良およ
び生産性に飛躍的な向上はあまり期待できない。
【０００４】２．植物ホルモンによる処理 オーキシン、ジベレリン、サイトカイニンおよびエチレ
ン等の植物ホルモンは、農作物や園芸分野において幅広
く実用化されている。ワタ植物の繊維生成、特に繊維伸
長メカニズムに対する植物ホルモンの影響は、これまで
数多く報告されている。ジベレリンやオーキシンは繊維
の伸長を誘導し、アブシジン酸は、逆に繊維伸長を抑制
すると考えられている（Bhardwaj and Sharma, 1971; S
ingh andSing, 1975; Baert et al., 1975; Dhindsa et
al., 1976; Kosmidou, 1976; Babaev and Agakishiev,
1977; Bazanova, 1977; DeLanghe et al., 1978)。ま
た、ＢｅａｓｌｅｙとＴｉｎｇ〔Amer. J. Bot. 60(2):
130-139. 1973〕は、胚珠培養（in vitro）で、ジベレ
リンは繊維伸長に対して促進効果を示し、カイネチンと
アブシジン酸は繊維伸長の抑制効果を示したと報告して
いる。圃場試験（in vivo)では、不受精（non-fertiliz
ed）の開花直後の花に、ジベレリンを行ったところ、あ
る程度の繊維伸長に促進効果が見られたと報告してい
る。しかし、受粉（fertilized）の花では、ジベレリン
（ＧＡ3）処理による有意な伸長促進効果は起こらなか
った（The Cotton Founsation Reference Book Series
Number 1, Cotton Physiology, 369, The Cotton Found
ation, 1986 ）。
ン等の植物ホルモンは、農作物や園芸分野において幅広
く実用化されている。ワタ植物の繊維生成、特に繊維伸
長メカニズムに対する植物ホルモンの影響は、これまで
数多く報告されている。ジベレリンやオーキシンは繊維
の伸長を誘導し、アブシジン酸は、逆に繊維伸長を抑制
すると考えられている（Bhardwaj and Sharma, 1971; S
ingh andSing, 1975; Baert et al., 1975; Dhindsa et
al., 1976; Kosmidou, 1976; Babaev and Agakishiev,
1977; Bazanova, 1977; DeLanghe et al., 1978)。ま
た、ＢｅａｓｌｅｙとＴｉｎｇ〔Amer. J. Bot. 60(2):
130-139. 1973〕は、胚珠培養（in vitro）で、ジベレ
リンは繊維伸長に対して促進効果を示し、カイネチンと
アブシジン酸は繊維伸長の抑制効果を示したと報告して
いる。圃場試験（in vivo)では、不受精（non-fertiliz
ed）の開花直後の花に、ジベレリンを行ったところ、あ
る程度の繊維伸長に促進効果が見られたと報告してい
る。しかし、受粉（fertilized）の花では、ジベレリン
（ＧＡ3）処理による有意な伸長促進効果は起こらなか
った（The Cotton Founsation Reference Book Series
Number 1, Cotton Physiology, 369, The Cotton Found
ation, 1986 ）。
【０００５】ワタ繊維の繊維収量に対する植物ホルモン
の影響については、ＭｃＣａｒｔｙとＨｅｄｉｎは、１
９８６年〜１９９２年の期間にわたって、商業用植物調
節剤（commercial plant growth regulators）の圃場試
験を行ったところ、１９９２年の圃場試験のみ、サイト
カイニンを含む植物調節剤 Foliar Trigger (Westbridg
e Chemical Co.製) と、サイトカイニン、インドール酢
酸、ジベレリンを含む植物調節剤ＦＰＧ−５ (Baldbrid
ge Bio-Research Inc., 製) で、繊維収量の増加が観察
されたと報告している。しかし、他の年については有意
な収量増加は観察されなかった〔J. Agric. Food Chem.
42: 1355-1357, (1994)〕。
の影響については、ＭｃＣａｒｔｙとＨｅｄｉｎは、１
９８６年〜１９９２年の期間にわたって、商業用植物調
節剤（commercial plant growth regulators）の圃場試
験を行ったところ、１９９２年の圃場試験のみ、サイト
カイニンを含む植物調節剤 Foliar Trigger (Westbridg
e Chemical Co.製) と、サイトカイニン、インドール酢
酸、ジベレリンを含む植物調節剤ＦＰＧ−５ (Baldbrid
ge Bio-Research Inc., 製) で、繊維収量の増加が観察
されたと報告している。しかし、他の年については有意
な収量増加は観察されなかった〔J. Agric. Food Chem.
42: 1355-1357, (1994)〕。
【０００６】以上のように、ワタ繊維の繊維特性や生産
性の向上を目指して、オーキシン、ジベレリン、サイト
カイニンおよびアブシジン酸などの従来の植物ホルモン
については数多く研究、報告されているが、その効果が
十分確認されたとはいえず、実用的なものとはいえな
い。
性の向上を目指して、オーキシン、ジベレリン、サイト
カイニンおよびアブシジン酸などの従来の植物ホルモン
については数多く研究、報告されているが、その効果が
十分確認されたとはいえず、実用的なものとはいえな
い。
【０００７】近年、新しい植物ホルモンの１つとしてブ
ラシノステロイドが注目されており、各種植物に対す
る、これらのホルモンの作用が研究されている。最初、
ミッチェル、マンダーバらがセイヨウアブラナの花粉の
中から、ブラシノステロイドの１種であるブラシライド
を発見し [Mitchell, J. W., N. Mandava, et al, Natu
re, 225, 1065, (1970)]、インゲンマメの若芽に使用す
ることにより、きわめて顕著な細胞伸長作用があること
が確認された。ブラシノライドは上記したように、複雑
な構造を有するステロイド化合物の１種であり、その
後、種々の植物から類似の構造をもつ植物ホルモンが発
見されている。
ラシノステロイドが注目されており、各種植物に対す
る、これらのホルモンの作用が研究されている。最初、
ミッチェル、マンダーバらがセイヨウアブラナの花粉の
中から、ブラシノステロイドの１種であるブラシライド
を発見し [Mitchell, J. W., N. Mandava, et al, Natu
re, 225, 1065, (1970)]、インゲンマメの若芽に使用す
ることにより、きわめて顕著な細胞伸長作用があること
が確認された。ブラシノライドは上記したように、複雑
な構造を有するステロイド化合物の１種であり、その
後、種々の植物から類似の構造をもつ植物ホルモンが発
見されている。
【０００８】ブラシノステロイドをワタ植物に適用した
例としては、圃場試験（in vivo)でＬｕｏら（Plant Ph
ysiology Communications, 5, 31-34, 1988)は、０．０
１ｐｐｍと１ｐｐｍのブラシノライドを果梗に処理する
と、子房の落果が抑制されたと報告している。しかし、
これまでのところブラシノステロイドによって繊維特性
や生産性が向上した例は報告されていない。
例としては、圃場試験（in vivo)でＬｕｏら（Plant Ph
ysiology Communications, 5, 31-34, 1988)は、０．０
１ｐｐｍと１ｐｐｍのブラシノライドを果梗に処理する
と、子房の落果が抑制されたと報告している。しかし、
これまでのところブラシノステロイドによって繊維特性
や生産性が向上した例は報告されていない。
【０００９】カルス培養（in vitro）においては、Ｗａ
ｎｇら [Plant Physiology Communications, 28(1), 15
-18, 1992]は、０．０１ｐｐｍのブラシノライドをＭＳ
培地に添加することによって、ワタ植物においてカルス
形成と胚形成が誘導されたと報告している。しかし、胚
珠培養によるワタ繊維の製造においては、培地中にブラ
シノステロイドを添加することにより、ワタ繊維の繊維
特性、収量が改善されたという例は報告されていない。
ｎｇら [Plant Physiology Communications, 28(1), 15
-18, 1992]は、０．０１ｐｐｍのブラシノライドをＭＳ
培地に添加することによって、ワタ植物においてカルス
形成と胚形成が誘導されたと報告している。しかし、胚
珠培養によるワタ繊維の製造においては、培地中にブラ
シノステロイドを添加することにより、ワタ繊維の繊維
特性、収量が改善されたという例は報告されていない。
【００１０】３．遺伝子組換え技術を利用した品種改良 近年の遺伝子組換え技術の発達はめざましいものがあ
り、ある種の植物（例えばトマト、ダイズなど）では、
これらの植物中へ特定の遺伝子を導入、発現させること
により目的の形質への品種改良に成功した、いくつかの
例が報告されている。もし、ワタ植物にワタの繊維形成
及び伸長に関与している遺伝子を導入し、大量発現させ
ることができれば、ワタ繊維の繊維特性或いは生産性を
飛躍的に改善することが可能となる。しかしながら、現
在のところ、ワタ植物に関するものでは、以下のような
研究しか行なわれていない。ＢＴ毒素（Bacillus thuri
ngiensis 産生殺虫性蛋白毒素）をコードする遺伝子を
導入し、耐虫性の向上を目的としたもの、５−エノール
ピルビルシキミ酸３−リン酸合成酵素をコードする遺伝
子を導入し、除草剤（グリホセート）耐性の向上を目的
としたものが研究されている。これらの試みは結果的に
単位面積当たりの生産性の向上には寄与するが、ワタ植
物１株当たりのワタ繊維の生産性の向上には寄与しな
い。ワタ植物におけるワタ繊維の形成及び伸長の機構に
ついては今なお十分に解明されておらず、関与する遺伝
子についてもほとんどわかっていないのが現状である。
り、ある種の植物（例えばトマト、ダイズなど）では、
これらの植物中へ特定の遺伝子を導入、発現させること
により目的の形質への品種改良に成功した、いくつかの
例が報告されている。もし、ワタ植物にワタの繊維形成
及び伸長に関与している遺伝子を導入し、大量発現させ
ることができれば、ワタ繊維の繊維特性或いは生産性を
飛躍的に改善することが可能となる。しかしながら、現
在のところ、ワタ植物に関するものでは、以下のような
研究しか行なわれていない。ＢＴ毒素（Bacillus thuri
ngiensis 産生殺虫性蛋白毒素）をコードする遺伝子を
導入し、耐虫性の向上を目的としたもの、５−エノール
ピルビルシキミ酸３−リン酸合成酵素をコードする遺伝
子を導入し、除草剤（グリホセート）耐性の向上を目的
としたものが研究されている。これらの試みは結果的に
単位面積当たりの生産性の向上には寄与するが、ワタ植
物１株当たりのワタ繊維の生産性の向上には寄与しな
い。ワタ植物におけるワタ繊維の形成及び伸長の機構に
ついては今なお十分に解明されておらず、関与する遺伝
子についてもほとんどわかっていないのが現状である。
【００１１】本発明者らは、このような状況下に、ワタ
繊維の繊維特性を改善あるいは生産性を向上させるため
に鋭意研究した。その結果、この問題はブラシノステロ
イドで処理することによって解決されることを見いだ
し、さらにワタ繊維の形成および伸長に関与する遺伝子
を見い出し、本発明を完成するに至った。
繊維の繊維特性を改善あるいは生産性を向上させるため
に鋭意研究した。その結果、この問題はブラシノステロ
イドで処理することによって解決されることを見いだ
し、さらにワタ繊維の形成および伸長に関与する遺伝子
を見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】すなわち、本発明は改良された繊維特性を
有するウタ繊維を生産する方法ならびにこれらの方法に
よって生産されたワタ繊維を提供するものである。１つ
の方法はゴシピウム(Gossypium) 属に属するワタ植物を
種子形態において、または生育過程において、ブラシノ
ステロイドで処理し、ワタ植物を生長させてワタ朔果を
得、さらに該植物の該ワタ朔果からワタ繊維を採取する
ことを特徴とする改良された繊維特性を有するワタ繊維
の製造方法である。他の方法は、ブラシノステロイド含
有液体培地中でゴシピウム(Gossypium) 属に属するワタ
植物の胚珠を培養し、培養された胚珠からワタ繊維を採
取することを特徴とする改良された繊維特性を有するワ
タ繊維の製造法である。
有するウタ繊維を生産する方法ならびにこれらの方法に
よって生産されたワタ繊維を提供するものである。１つ
の方法はゴシピウム(Gossypium) 属に属するワタ植物を
種子形態において、または生育過程において、ブラシノ
ステロイドで処理し、ワタ植物を生長させてワタ朔果を
得、さらに該植物の該ワタ朔果からワタ繊維を採取する
ことを特徴とする改良された繊維特性を有するワタ繊維
の製造方法である。他の方法は、ブラシノステロイド含
有液体培地中でゴシピウム(Gossypium) 属に属するワタ
植物の胚珠を培養し、培養された胚珠からワタ繊維を採
取することを特徴とする改良された繊維特性を有するワ
タ繊維の製造法である。
【００１３】本発明は、また、ワタ植物を種子形態にお
いて、または生育過程において、ブラシノステロイドで
処理することを特徴とするワタ植物中で特定の遺伝子を
発現させて、改良された繊維特性を有するワタ繊維を生
産する方法である。また、該方法で得られたワタ植物お
よび該方法で得られたワタ種子である。なお、本発明に
おいて「改良された繊維特性を有するワタ繊維」とは、
例えば、繊維長、繊維繊度、繊維強度等の点において、
従来のワタ繊維よりも優れているワタ繊維をいう。
いて、または生育過程において、ブラシノステロイドで
処理することを特徴とするワタ植物中で特定の遺伝子を
発現させて、改良された繊維特性を有するワタ繊維を生
産する方法である。また、該方法で得られたワタ植物お
よび該方法で得られたワタ種子である。なお、本発明に
おいて「改良された繊維特性を有するワタ繊維」とは、
例えば、繊維長、繊維繊度、繊維強度等の点において、
従来のワタ繊維よりも優れているワタ繊維をいう。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明によるワタ繊維を生産する
方法は、ワタ植物をブラシノステロイドによって、ワタ
繊維の特性および生産性が改良されるとの新規な知見に
基づくものである。本発明の方法は、ワタ植物の種々の
品種、例えばゴシピウム・ヒルスツム(G.hirsutum)、ゴ
シピウム・バルバデンセ(G.barbadense)、ゴシピウム・
アルボレウム(G.arboreum)、ゴシピウム・アノマルム
(G.anomalum)、ゴシピウム・アルムリアヌム(G.armouri
anum) 、ゴシピウム・クロッツキアヌム(G.klotzchianu
m)、およびゴシピウム・レモンデイ(G.raimondii) から
なる群から選ばれたものなどに適用される。
方法は、ワタ植物をブラシノステロイドによって、ワタ
繊維の特性および生産性が改良されるとの新規な知見に
基づくものである。本発明の方法は、ワタ植物の種々の
品種、例えばゴシピウム・ヒルスツム(G.hirsutum)、ゴ
シピウム・バルバデンセ(G.barbadense)、ゴシピウム・
アルボレウム(G.arboreum)、ゴシピウム・アノマルム
(G.anomalum)、ゴシピウム・アルムリアヌム(G.armouri
anum) 、ゴシピウム・クロッツキアヌム(G.klotzchianu
m)、およびゴシピウム・レモンデイ(G.raimondii) から
なる群から選ばれたものなどに適用される。
【００１５】本発明の方法によって処理されるワタ植物
は、種子形態、または生育過程にあるものである。生育
中のワタ植物は全体に、あるいは部分的に処理される。
ブラシノステロイドを含有する組成物で処理することの
できる部位としては、特に限定されないが、好ましくは
ワタ植物の全樹、蕾、花、胚珠、子房、苞、葉、茎、
根、果梗、未成熟の朔果などである。処理することので
きる生育過程としては、特に限定されないが、好ましく
は開花後、さらに好ましくは開花２日後から２０日後が
挙げられる。
は、種子形態、または生育過程にあるものである。生育
中のワタ植物は全体に、あるいは部分的に処理される。
ブラシノステロイドを含有する組成物で処理することの
できる部位としては、特に限定されないが、好ましくは
ワタ植物の全樹、蕾、花、胚珠、子房、苞、葉、茎、
根、果梗、未成熟の朔果などである。処理することので
きる生育過程としては、特に限定されないが、好ましく
は開花後、さらに好ましくは開花２日後から２０日後が
挙げられる。
【００１６】本発明の方法にて使用するブラシノステロ
イドは、以下のように異なったステロイド骨格を有する
種々の化合物を含む。ブラシノライド（２α，３α，２
２Ｒ，２３Ｒ−テトラヒドロキシ−２４Ｓ−メチル−Ｂ
−ホモ−７−オキサ−５α−コレスタン−６−オン）、
ドリコライド、ホモドリコライド、２４−エピブラシノ
ライド、２８−ノルブラシノライドなどの第１タイプの
化合物は、下記式のステロイド骨格を有する。
イドは、以下のように異なったステロイド骨格を有する
種々の化合物を含む。ブラシノライド（２α，３α，２
２Ｒ，２３Ｒ−テトラヒドロキシ−２４Ｓ−メチル−Ｂ
−ホモ−７−オキサ−５α−コレスタン−６−オン）、
ドリコライド、ホモドリコライド、２４−エピブラシノ
ライド、２８−ノルブラシノライドなどの第１タイプの
化合物は、下記式のステロイド骨格を有する。
【００１７】
【化１】
【００１８】例えばブラシノライドは下記化学構造式で
示される。
示される。
【００１９】
【化２】
【００２０】例えば、カスタステロン、ドリコステロ
ン、ホモドリコステロン、ホモカスタステロン、２８−
ノルカスタステロン、ティファステロール、テアステロ
ール、２４−エピカスタステロン、２−エピカスタステ
ロン、３−エピカスタステロン、３，２４−ジエピカス
タステロン、２５−メチルドリコステロン、２−エピ−
２５−メチルドリコステロン、２，３−ジエピ−２５−
メチルドリコステロンなどの第２タイプの化合物は、下
記式のステロイド骨格を有する。
ン、ホモドリコステロン、ホモカスタステロン、２８−
ノルカスタステロン、ティファステロール、テアステロ
ール、２４−エピカスタステロン、２−エピカスタステ
ロン、３−エピカスタステロン、３，２４−ジエピカス
タステロン、２５−メチルドリコステロン、２−エピ−
２５−メチルドリコステロン、２，３−ジエピ−２５−
メチルドリコステロンなどの第２タイプの化合物は、下
記式のステロイド骨格を有する。
【００２１】
【化３】
【００２２】例えば、６−デオキソカスタステロン、６
−デオキソドリコステロンおよび６−デオキシホモドリ
コステロンなどの第３タイプの化合物は、下記式のステ
ロイド骨格を有する。
−デオキソドリコステロンおよび６−デオキシホモドリ
コステロンなどの第３タイプの化合物は、下記式のステ
ロイド骨格を有する。
【００２３】
【化４】
【００２４】これらブラシノステロイドを含む組成物の
形態は、特に限定されないが、好ましくは液状、粒状、
粉末状、ペースト状で用いることができる。また、該組
成物中のブラシノステロイドの含有率は、低濃度であれ
ば特に制限はなく、通常１×１０-8〜１００ｐｐｍ、好
ましくは１×１０-6〜５０ｐｐｍ、さらに好ましくは１
×１０-4〜１０ｐｐｍである。
形態は、特に限定されないが、好ましくは液状、粒状、
粉末状、ペースト状で用いることができる。また、該組
成物中のブラシノステロイドの含有率は、低濃度であれ
ば特に制限はなく、通常１×１０-8〜１００ｐｐｍ、好
ましくは１×１０-6〜５０ｐｐｍ、さらに好ましくは１
×１０-4〜１０ｐｐｍである。
【００２５】さらに、該ブラシノステロイド含有組成物
に、オーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、アブシ
ジン酸などの植物ホルモンを添加してもよい。また、必
要に応じて界面活性剤、乳化剤、展着剤、賦形剤などを
添加してもよい。
に、オーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、アブシ
ジン酸などの植物ホルモンを添加してもよい。また、必
要に応じて界面活性剤、乳化剤、展着剤、賦形剤などを
添加してもよい。
【００２６】組成物が液状の場合、ブラシノステロイド
を所定量、水に溶解または分散させたものを用いてもよ
いが、安定して効果を発現させるため通常、水以外に乳
化剤、展着剤、希釈剤などを添加して用いる。また、一
般的には濃厚液を調製し、使用前にこれを所定の濃度ま
で水で希釈して使用する。
を所定量、水に溶解または分散させたものを用いてもよ
いが、安定して効果を発現させるため通常、水以外に乳
化剤、展着剤、希釈剤などを添加して用いる。また、一
般的には濃厚液を調製し、使用前にこれを所定の濃度ま
で水で希釈して使用する。
【００２７】例えば濃厚液の調製例を以下に示す。 （１）メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ
ｓｏ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノ
ール、ｓｅｃ−ブタノール等の低級脂肪族アルコールを
５０〜９８重量％、好ましくは６０〜９５重量％ （２）ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピ
ロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ
Ａ）等のアミド系極性溶媒およびジメチルスルホキシド
を１〜２５重量％、好ましくは２〜２０重量％ （３）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピ
レングリコール、ポリブチレングリコールの如きポリア
ルキレングリコール、およびポリビニルピロリドン、ポ
リビニルアルコールあるいはこれらの共重合体等から選
ばれる水溶性ポリマーを１〜２５重量％、好ましくは２
〜２０重量％ （４）ポリオキシエチレンジアルキルエーテル、ポリオ
キシエチレンアルキルアリルエーテル、ポリオキシエチ
レンジアリルエーテルの如きポリオキシアルキレンエー
テル系；ポリオキシエチレンジアルキルエステル、ポリ
オキシエチレンアルキルアリルエステル、ポリオキシエ
チレンジアリルエステルの如きポリオキシアルキレンジ
エステル系；ジナフチルメタンスルホン酸ナトリウム、
リグニンスルホン酸カルシウムジアルキルスルホサクシ
ネートの如きスルホン酸塩等から選ばれる展着剤を水以
外の成分の重量にして、上記（１）、（２）および
（３）からなる組成物１重量部に対して０．００３〜
１．８重量部、好ましくは０．１〜１．７重量部
ｓｏ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノ
ール、ｓｅｃ−ブタノール等の低級脂肪族アルコールを
５０〜９８重量％、好ましくは６０〜９５重量％ （２）ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピ
ロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ
Ａ）等のアミド系極性溶媒およびジメチルスルホキシド
を１〜２５重量％、好ましくは２〜２０重量％ （３）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピ
レングリコール、ポリブチレングリコールの如きポリア
ルキレングリコール、およびポリビニルピロリドン、ポ
リビニルアルコールあるいはこれらの共重合体等から選
ばれる水溶性ポリマーを１〜２５重量％、好ましくは２
〜２０重量％ （４）ポリオキシエチレンジアルキルエーテル、ポリオ
キシエチレンアルキルアリルエーテル、ポリオキシエチ
レンジアリルエーテルの如きポリオキシアルキレンエー
テル系；ポリオキシエチレンジアルキルエステル、ポリ
オキシエチレンアルキルアリルエステル、ポリオキシエ
チレンジアリルエステルの如きポリオキシアルキレンジ
エステル系；ジナフチルメタンスルホン酸ナトリウム、
リグニンスルホン酸カルシウムジアルキルスルホサクシ
ネートの如きスルホン酸塩等から選ばれる展着剤を水以
外の成分の重量にして、上記（１）、（２）および
（３）からなる組成物１重量部に対して０．００３〜
１．８重量部、好ましくは０．１〜１．７重量部
【００２８】組成物がペースト状品の場合、前述の液状
品にラノリン、ワセリン等のペースト剤を混合すること
により調製できる。
品にラノリン、ワセリン等のペースト剤を混合すること
により調製できる。
【００２９】組成物が粉末状品の場合は、ブラシノステ
ロイドを適当量のクレー、カオリン、タルク、珪藻土、
シリカ、炭酸カルシウム、モンモリナイト、ベントナイ
ト、長石、石英、アルミナ、おがくずなどの固体担体を
混合することにより調製することができる。
ロイドを適当量のクレー、カオリン、タルク、珪藻土、
シリカ、炭酸カルシウム、モンモリナイト、ベントナイ
ト、長石、石英、アルミナ、おがくずなどの固体担体を
混合することにより調製することができる。
【００３０】また、組成物が顆粒状品の場合は、上述の
粉末状品を定法に従い造粒し、調製することができる。
粉末状品を定法に従い造粒し、調製することができる。
【００３１】本発明では、ワタ植物の種子形態および生
育過程において、ブラシノステロイドの処理を施すに
は、ブラシノステロイド含有組成物を、ワタ植物の全
樹、蕾、花、胚珠、子房、苞、葉、茎、根、果梗、未成
熟の朔果への散布、塗布、浸漬等の手段により実施す
る。ブラシノステロイドの効果を持続させるため、ブラ
シノステロイドをラノリン等に混ぜ合わしたペーストを
果梗、子房に塗布するようにしてもよい。また、短時間
に、操作上より簡便に処理する方法として、有機溶剤中
にブラシノステロイドを溶解または分散させたものに、
ワタの種子を浸漬するようにしてもよい。一般には全面
散布するのが好ましい。特に好ましいのは、繊維伸長時
期である開花２日後から開花２０日後の子房に集中的に
散布すると一層効果的である。
育過程において、ブラシノステロイドの処理を施すに
は、ブラシノステロイド含有組成物を、ワタ植物の全
樹、蕾、花、胚珠、子房、苞、葉、茎、根、果梗、未成
熟の朔果への散布、塗布、浸漬等の手段により実施す
る。ブラシノステロイドの効果を持続させるため、ブラ
シノステロイドをラノリン等に混ぜ合わしたペーストを
果梗、子房に塗布するようにしてもよい。また、短時間
に、操作上より簡便に処理する方法として、有機溶剤中
にブラシノステロイドを溶解または分散させたものに、
ワタの種子を浸漬するようにしてもよい。一般には全面
散布するのが好ましい。特に好ましいのは、繊維伸長時
期である開花２日後から開花２０日後の子房に集中的に
散布すると一層効果的である。
【００３２】このように処理されたワタ植物は、成長し
てワタ朔果を形成し、さらに該植物の該ワタ朔果から改
良されたワタ繊維特性を有するワタ繊維を採取する。改
良された繊維特性を有するワタ繊維は、また、ブラシノ
ステロイド含有液体培地中でワタ植物の胚珠から得るこ
とができる。該胚珠培養は下記方法で行なわれる。
てワタ朔果を形成し、さらに該植物の該ワタ朔果から改
良されたワタ繊維特性を有するワタ繊維を採取する。改
良された繊維特性を有するワタ繊維は、また、ブラシノ
ステロイド含有液体培地中でワタ植物の胚珠から得るこ
とができる。該胚珠培養は下記方法で行なわれる。
【００３３】本発明方法において用いることのできる液
体培地としては、ワタ植物の胚珠が生育できるものであ
れば何でもよいが、好ましくは、ムラシゲ・アンド・ス
クーグ（ＭＳ）、ギャンボーグ（Ｂ５）、シェンク・ア
ンド・ヒルデブラント（ＳＨ）、ホワイト（Ｗ）、リン
ズマイヤー・アンド・スクーグ（ＬＳ）およびビスレイ
・アンド・チンク（ＢＴ）培地からなる群から選ばれた
培地であり、これらの培地にブラシノステロイドを添加
したものを用いることができる。特に好ましいのはビス
レイ・アンド・チンク（ＢＴ）の培地である。
体培地としては、ワタ植物の胚珠が生育できるものであ
れば何でもよいが、好ましくは、ムラシゲ・アンド・ス
クーグ（ＭＳ）、ギャンボーグ（Ｂ５）、シェンク・ア
ンド・ヒルデブラント（ＳＨ）、ホワイト（Ｗ）、リン
ズマイヤー・アンド・スクーグ（ＬＳ）およびビスレイ
・アンド・チンク（ＢＴ）培地からなる群から選ばれた
培地であり、これらの培地にブラシノステロイドを添加
したものを用いることができる。特に好ましいのはビス
レイ・アンド・チンク（ＢＴ）の培地である。
【００３４】ブラシノステロイドの添加量は、胚珠培養
（in vitro培養系）の培地に対して、低濃度であればよ
く、一般に１×１０-8ｐｐｍ〜１００ｐｐｍ、好ましく
は１×１０-6ｐｐｍ〜５０ｐｐｍ、特に好ましくは１×
１０-4ｐｐｍ〜１０ｐｐｍである。
（in vitro培養系）の培地に対して、低濃度であればよ
く、一般に１×１０-8ｐｐｍ〜１００ｐｐｍ、好ましく
は１×１０-6ｐｐｍ〜５０ｐｐｍ、特に好ましくは１×
１０-4ｐｐｍ〜１０ｐｐｍである。
【００３５】さらに、ブラシノステロイドの他に、糖
類、ビタミン類、植物ホルモン等を添加するのが好まし
い。添加することのできる植物ホルモンとしては、イン
ドール酢酸（ＩＡＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、イ
ンドール酪酸（ＩＢＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ
酢酸（２，４−Ｄ）等のオーキシン類や、ＧＡ3等のジ
ベレリン、カイネチン等のサイトカイニン、アブシジン
酸が挙げられこれらは単独で、または適宜組み合わせて
使用される。その添加濃度は通常、０．００５μＭ〜１
００．０μＭの範囲である。好ましくは、０．０５μＭ
〜５０μＭの範囲である。
類、ビタミン類、植物ホルモン等を添加するのが好まし
い。添加することのできる植物ホルモンとしては、イン
ドール酢酸（ＩＡＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、イ
ンドール酪酸（ＩＢＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ
酢酸（２，４−Ｄ）等のオーキシン類や、ＧＡ3等のジ
ベレリン、カイネチン等のサイトカイニン、アブシジン
酸が挙げられこれらは単独で、または適宜組み合わせて
使用される。その添加濃度は通常、０．００５μＭ〜１
００．０μＭの範囲である。好ましくは、０．０５μＭ
〜５０μＭの範囲である。
【００３６】ブラシノステロイドを培地に添加するにあ
たっては、水に難溶であるため、有機溶媒中に溶解させ
た後、水と混合して培地に添加する。かかる有機溶媒と
しては、メタノール、エタノール、プロパノールの如き
低級脂肪族アルコール類；メチルエチルケトン、メチル
イソブチルケトンの如き低級脂肪族ケトン類；ジメチル
エーテル、ジエチルエーテルの如き低級脂肪族エーテル
類を挙げることができる。
たっては、水に難溶であるため、有機溶媒中に溶解させ
た後、水と混合して培地に添加する。かかる有機溶媒と
しては、メタノール、エタノール、プロパノールの如き
低級脂肪族アルコール類；メチルエチルケトン、メチル
イソブチルケトンの如き低級脂肪族ケトン類；ジメチル
エーテル、ジエチルエーテルの如き低級脂肪族エーテル
類を挙げることができる。
【００３７】本発明方法によるワタの胚珠培養は、上記
の如きブラシノステロイド添加培地を用いるほかは、常
法に従って行うことができる。例えば、ワタ植物の胚珠
を次亜塩素酸ナトリウム溶液等で殺菌した後、これを無
菌的にブラシノステロイド添加液体培地上に設置し、静
置培養することができる。培養温度は通常２０〜４０
℃、好ましくは２５〜３５℃である。改良された特性を
有するワタ繊維はこのように培養した胚珠から収集す
る。
の如きブラシノステロイド添加培地を用いるほかは、常
法に従って行うことができる。例えば、ワタ植物の胚珠
を次亜塩素酸ナトリウム溶液等で殺菌した後、これを無
菌的にブラシノステロイド添加液体培地上に設置し、静
置培養することができる。培養温度は通常２０〜４０
℃、好ましくは２５〜３５℃である。改良された特性を
有するワタ繊維はこのように培養した胚珠から収集す
る。
【００３８】本発明では、上記した方法によって種子の
形態でまたはワタ植物生育過程に、ブラシノステロイド
処理を行うことによって、繊維長が増大するなどの繊維
特性の向上が観察された。この事実から見て、ワタ植物
の遺伝子群の中で特定の遺伝子の発現量が顕著に変化
し、これらの遺伝子がワタ繊維の形成及び伸長に関与し
ていることが推察できる。
形態でまたはワタ植物生育過程に、ブラシノステロイド
処理を行うことによって、繊維長が増大するなどの繊維
特性の向上が観察された。この事実から見て、ワタ植物
の遺伝子群の中で特定の遺伝子の発現量が顕著に変化
し、これらの遺伝子がワタ繊維の形成及び伸長に関与し
ていることが推察できる。
【００３９】上記方法で生育させたワタ植物より、その
発現量が変化した遺伝子の単離方法としては、ディファ
レンシャルスクリーニング法、サブトラクション法、デ
ィファレンシャルディスプレイ法等を用いることができ
る。
発現量が変化した遺伝子の単離方法としては、ディファ
レンシャルスクリーニング法、サブトラクション法、デ
ィファレンシャルディスプレイ法等を用いることができ
る。
【００４０】以下に、ディファレンシャルスクリーニン
グ法での単離法について、詳しく説明するが、本発明は
これに限定されるものではない。 （１）ワタ繊維の形成及び伸長に関与する遺伝子の単離 １．ｃＤＮＡライブラリーの構築 まず、繊維伸長期のワタ植物の胚珠からワタ繊維を分離
し、分離したワタ繊維から常法に従い、ｐｏｌｙ（Ａ）
+ＲＮＡを抽出した。単離したｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを
鋳型として、オリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素を
用いて１本鎖のｃＤＮＡを合成し、この１本鎖ｃＤＮＡ
をポリメラーゼ反応によって２本鎖化する。 2本鎖ｃＤ
ＮＡを適当なベクターに挿入し、大腸菌等の宿主細胞を
に形質転換することにより、ｃＤＮＡライブラリーを作
製する。ｐｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡ
の合成は、市販されているｃＤＮＡクローニングキット
を使用してもよい。また、ｃＤＮＡライブラリーの作製
に用いるベクターは、多数種市販されており、これらを
使用することもできる。
グ法での単離法について、詳しく説明するが、本発明は
これに限定されるものではない。 （１）ワタ繊維の形成及び伸長に関与する遺伝子の単離 １．ｃＤＮＡライブラリーの構築 まず、繊維伸長期のワタ植物の胚珠からワタ繊維を分離
し、分離したワタ繊維から常法に従い、ｐｏｌｙ（Ａ）
+ＲＮＡを抽出した。単離したｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを
鋳型として、オリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素を
用いて１本鎖のｃＤＮＡを合成し、この１本鎖ｃＤＮＡ
をポリメラーゼ反応によって２本鎖化する。 2本鎖ｃＤ
ＮＡを適当なベクターに挿入し、大腸菌等の宿主細胞を
に形質転換することにより、ｃＤＮＡライブラリーを作
製する。ｐｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡ
の合成は、市販されているｃＤＮＡクローニングキット
を使用してもよい。また、ｃＤＮＡライブラリーの作製
に用いるベクターは、多数種市販されており、これらを
使用することもできる。
【００４１】２．ｃＤＮＡライブラリーから目的遺伝子
のスクリーニング 目的遺伝子は次のディファレンシャルスクリーニング法
によって得ることができる。上記方法で作製したｃＤＮ
Ａライブラリーのファージプラークからレプリカした２
枚のフィルターに、繊維伸長期のワタ繊維（処理区）か
ら同様な方法で調製したｃＤＮＡと、繊維伸長停止期の
ワタ繊維（対照区）から調製したｃＤＮＡを、放射性同
位元素である32Ｐで標識したものを各々プローブとして
ハイブリダイズさせ、処理区ｃＤＮＡから調製したプロ
ーブのみからの陽性を示すハイブリダイゼーション・シ
グナルを検出することにより、目的遺伝子のｃＤＮＡを
選抜することができる。
のスクリーニング 目的遺伝子は次のディファレンシャルスクリーニング法
によって得ることができる。上記方法で作製したｃＤＮ
Ａライブラリーのファージプラークからレプリカした２
枚のフィルターに、繊維伸長期のワタ繊維（処理区）か
ら同様な方法で調製したｃＤＮＡと、繊維伸長停止期の
ワタ繊維（対照区）から調製したｃＤＮＡを、放射性同
位元素である32Ｐで標識したものを各々プローブとして
ハイブリダイズさせ、処理区ｃＤＮＡから調製したプロ
ーブのみからの陽性を示すハイブリダイゼーション・シ
グナルを検出することにより、目的遺伝子のｃＤＮＡを
選抜することができる。
【００４２】ＲＮＡの単離、ｃＤＮＡの合成、ＤＮＡの
切断、連結、形質転換、ハイブリダイゼーションおよび
他の一般の遺伝子組換えに必要な方法は、各操作に使用
する市販の酵素等に添付されている説明書や、種々の教
科書、（例えばMolecular cloning, Maniatis ら編集、
Cold Spring Harbor,1989 あるいはCurrent Protocols
in Molecular Biology, F. M. Ausubel ら編集、John W
iley & Sons, Inc., 1987)に記載されている。
切断、連結、形質転換、ハイブリダイゼーションおよび
他の一般の遺伝子組換えに必要な方法は、各操作に使用
する市販の酵素等に添付されている説明書や、種々の教
科書、（例えばMolecular cloning, Maniatis ら編集、
Cold Spring Harbor,1989 あるいはCurrent Protocols
in Molecular Biology, F. M. Ausubel ら編集、John W
iley & Sons, Inc., 1987)に記載されている。
【００４３】クローン化されたｃＤＮＡの塩基配列の決
定は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法あるいは、ダイデ
オキシ・チェーンターミネーション法等により決定でき
る。いずれの方法も市販されているキットを用いて行う
ことができる。核酸配列決定は、また自動的に行うオー
トシーケンサーを使用してもよい。
定は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法あるいは、ダイデ
オキシ・チェーンターミネーション法等により決定でき
る。いずれの方法も市販されているキットを用いて行う
ことができる。核酸配列決定は、また自動的に行うオー
トシーケンサーを使用してもよい。
【００４４】もし決定されたｃＤＮＡクローンが完全長
のタンパクをコードする遺伝子でない場合は、常法にし
たがって再度、他のプラークハイブリダイゼーション、
又はＲＡＣＥ法などにより完全長のタンパクをコードす
る遺伝子を有する所望のｃＤＮＡクローンを得ることが
できる。
のタンパクをコードする遺伝子でない場合は、常法にし
たがって再度、他のプラークハイブリダイゼーション、
又はＲＡＣＥ法などにより完全長のタンパクをコードす
る遺伝子を有する所望のｃＤＮＡクローンを得ることが
できる。
【００４５】このようにして、ワタ繊維から得られた遺
伝子の１つについて、塩基配列を配列番号１、該塩基配
列から推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。な
お、この遺伝子には、細胞壁に効果的に移行する能力を
有するシグナルペプチドをコードする配列も包含されて
いる。
伝子の１つについて、塩基配列を配列番号１、該塩基配
列から推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。な
お、この遺伝子には、細胞壁に効果的に移行する能力を
有するシグナルペプチドをコードする配列も包含されて
いる。
【００４６】（２）ワタ繊維の形成及び伸長に関する遺
伝子の利用 上記した方法により得た遺伝子を、ワタ又はワタ以外の
植物において、繊維の形成及び伸長に関与するタンパク
の大量生産に利用することができる。さらにシグナルペ
プチドをコードするＤＮＡ配列は、細胞壁での各種タン
パクの発現による細胞壁成分の改変に利用され、このよ
うな技術は耐病性等を付与した新規植物の育種にも応用
できる。例えば、繊維の形成及び伸長に関与する遺伝子
を適当なプロモーターに接続して、ワタあるいは他の植
物に導入すると、目的タンパクの含量を増大させること
ができる。これに対し、前記遺伝子のアンチセンス鎖
（コード配列に相補的な配列）の少なくとも一部を逆向
きに適当なプロモータに接続したものを植物に導入し、
いわゆるアンチセンスＲＮＡを発現させると、目的タン
パク含量を低下させることができる。また、シグナルペ
プチドをコードするＤＮＡ配列に、他の遺伝子を接続し
たものを植物に導入すると、その遺伝子産物を細胞壁に
効率よく移行させることができる。
伝子の利用 上記した方法により得た遺伝子を、ワタ又はワタ以外の
植物において、繊維の形成及び伸長に関与するタンパク
の大量生産に利用することができる。さらにシグナルペ
プチドをコードするＤＮＡ配列は、細胞壁での各種タン
パクの発現による細胞壁成分の改変に利用され、このよ
うな技術は耐病性等を付与した新規植物の育種にも応用
できる。例えば、繊維の形成及び伸長に関与する遺伝子
を適当なプロモーターに接続して、ワタあるいは他の植
物に導入すると、目的タンパクの含量を増大させること
ができる。これに対し、前記遺伝子のアンチセンス鎖
（コード配列に相補的な配列）の少なくとも一部を逆向
きに適当なプロモータに接続したものを植物に導入し、
いわゆるアンチセンスＲＮＡを発現させると、目的タン
パク含量を低下させることができる。また、シグナルペ
プチドをコードするＤＮＡ配列に、他の遺伝子を接続し
たものを植物に導入すると、その遺伝子産物を細胞壁に
効率よく移行させることができる。
【００４７】植物の形質転換方法としては、プロトプラ
ストに電気パルス処理してプラスミドを導入するエレク
トロポレーション法や、小細胞、細胞、リソソーム等と
プロトプラストとの融合法、マイクロインジェクション
法、ポリエチレングリコール法、あるいは、パーティク
ルガン法等の方法を挙げることができる。
ストに電気パルス処理してプラスミドを導入するエレク
トロポレーション法や、小細胞、細胞、リソソーム等と
プロトプラストとの融合法、マイクロインジェクション
法、ポリエチレングリコール法、あるいは、パーティク
ルガン法等の方法を挙げることができる。
【００４８】また、植物ウイルスをベクターとして利用
することによって、目的遺伝子を植物体に導入すること
ができる。利用する植物ウイルスとしては、例えばカリ
フラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）を用いることが
できる。例えば目的遺伝子の導入は次の方法に従う。す
なわち、まずウイルスゲノムを一旦、大腸菌等由来のベ
クターに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲ
ノム中にこれらの目的遺伝子を挿入する。このようにし
て修飾されたウイルスゲノムを制限酵素により、該組換
え体から切り出し、植物に接種することによって、目的
遺伝子を植物体に挿入することができる〔ホーン（Hoh
n）ら、モレキュラー バイオロジー オブ プラント
チューモアーズ（Molecular Biology of Plant Tumor
s）、アカデミック プレス、ニューヨーク（Academic
Press、New York）、第549 〜560頁（1982）、米国特許
第4,407,956 号〕。
することによって、目的遺伝子を植物体に導入すること
ができる。利用する植物ウイルスとしては、例えばカリ
フラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）を用いることが
できる。例えば目的遺伝子の導入は次の方法に従う。す
なわち、まずウイルスゲノムを一旦、大腸菌等由来のベ
クターに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲ
ノム中にこれらの目的遺伝子を挿入する。このようにし
て修飾されたウイルスゲノムを制限酵素により、該組換
え体から切り出し、植物に接種することによって、目的
遺伝子を植物体に挿入することができる〔ホーン（Hoh
n）ら、モレキュラー バイオロジー オブ プラント
チューモアーズ（Molecular Biology of Plant Tumor
s）、アカデミック プレス、ニューヨーク（Academic
Press、New York）、第549 〜560頁（1982）、米国特許
第4,407,956 号〕。
【００４９】さらに、アグロバクテリウムのＴｉプラス
ミドを利用する方法がある。アグロバクテリウム属に属
する細菌が植物に感染すると、それが持っているプラス
ミドＤＮＡの一部を植物ゲノム中に移行させる。このよ
うな性質を利用して、これらの目的遺伝子を植物体に導
入することもできる。アグロバクテリウム属に属する細
菌のうち、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Ag
robacterium tumefaciens）は植物に感染してクラウン
ゴールと呼ばれる腫瘍を、アグロバクテリウムリゾゲネ
ス（Agrobacteriumu rhizogenes）は植物に感染して毛
状根を引き起こす。これらの細菌はＴ−ＤＮＡ(Transfe
rred DNA) とｖｉｒ領域を有するＴｉプラスミド、また
はＲｉプラスミドと呼ばれる、プラスミドを有する。腫
瘍形成はＴ−ＤＮＡ領域（Transferred DNA)が植物ゲノ
ム中に移行し、植物細胞中のＴ−ＤＮＡに存在する腫瘍
形成遺伝子の複写および翻訳されることに起因する。ｖ
ｉｒ領域自身は、植物細胞中に移行されることはない
が、Ｔ−ＤＮＡの移行には必須である。また、このｖｉ
ｒ領域はＴ−ＤＮＡ領域を含むプラスミドと異なった他
のプラスミド上にあっても機能しうる〔Nature, 303, 1
79, (1983)〕。
ミドを利用する方法がある。アグロバクテリウム属に属
する細菌が植物に感染すると、それが持っているプラス
ミドＤＮＡの一部を植物ゲノム中に移行させる。このよ
うな性質を利用して、これらの目的遺伝子を植物体に導
入することもできる。アグロバクテリウム属に属する細
菌のうち、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Ag
robacterium tumefaciens）は植物に感染してクラウン
ゴールと呼ばれる腫瘍を、アグロバクテリウムリゾゲネ
ス（Agrobacteriumu rhizogenes）は植物に感染して毛
状根を引き起こす。これらの細菌はＴ−ＤＮＡ(Transfe
rred DNA) とｖｉｒ領域を有するＴｉプラスミド、また
はＲｉプラスミドと呼ばれる、プラスミドを有する。腫
瘍形成はＴ−ＤＮＡ領域（Transferred DNA)が植物ゲノ
ム中に移行し、植物細胞中のＴ−ＤＮＡに存在する腫瘍
形成遺伝子の複写および翻訳されることに起因する。ｖ
ｉｒ領域自身は、植物細胞中に移行されることはない
が、Ｔ−ＤＮＡの移行には必須である。また、このｖｉ
ｒ領域はＴ−ＤＮＡ領域を含むプラスミドと異なった他
のプラスミド上にあっても機能しうる〔Nature, 303, 1
79, (1983)〕。
【００５０】Ｔｉ又はＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領
域中に、植物ゲノム中に組込みたい目的ＤＮＡを挿入し
ておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物体に感染
する際に目的とするＤＮＡを植物ゲノム中に組込むこと
ができる。また、Ｔｉ又はＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ
中のクラウンゴール、又は毛状根を引き起こす部分を、
目的とする移行機能を損なうことなく取り除き、得られ
たプラスミドをベクターとして使用することもできる。
域中に、植物ゲノム中に組込みたい目的ＤＮＡを挿入し
ておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物体に感染
する際に目的とするＤＮＡを植物ゲノム中に組込むこと
ができる。また、Ｔｉ又はＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ
中のクラウンゴール、又は毛状根を引き起こす部分を、
目的とする移行機能を損なうことなく取り除き、得られ
たプラスミドをベクターとして使用することもできる。
【００５１】本発明においてはこの様な種々のベクター
を用いることができる。例えば、バイナリーベクターと
呼ばれるｐＢＩ１２１（クロンテック社）等のベクター
に、適当なプロモーターに繊維の形成及び伸長に関与す
る遺伝子をセンス方向に接続したもの、または該遺伝子
をアンチセンス方向に接続したものを挿入して、これら
を植物体に導入することができる。なお、これらのバイ
ナリーベクターは前出のｖｉｒ領域を有しておらず、該
ベクターを導入して用いるアグロバクテリウム属の細菌
は、ｖｉｒ領域を有している他のプラスミドを含有して
いる必要がある。
を用いることができる。例えば、バイナリーベクターと
呼ばれるｐＢＩ１２１（クロンテック社）等のベクター
に、適当なプロモーターに繊維の形成及び伸長に関与す
る遺伝子をセンス方向に接続したもの、または該遺伝子
をアンチセンス方向に接続したものを挿入して、これら
を植物体に導入することができる。なお、これらのバイ
ナリーベクターは前出のｖｉｒ領域を有しておらず、該
ベクターを導入して用いるアグロバクテリウム属の細菌
は、ｖｉｒ領域を有している他のプラスミドを含有して
いる必要がある。
【００５２】また、これらのベクターはアグロバクテリ
ウム属の細菌だけではなく、大腸菌中でも増幅すること
ができるシャトルベクターとしても使用できる。したが
って、Ｔｉプラスミドの組換え操作は、大腸菌を用いて
行うことができる。更に、これらのベクターは、抗生物
質耐性遺伝子を含んでおり、大腸菌、アグロバクテリウ
ム属の細菌、及び植物体等を形質転換する際に、形質転
換体を容易に選別することができる。また、これらのベ
クターには、さらにＣａＭＶの３５Ｓプロモーターが存
在しており、これらのベクターに挿入された遺伝子を植
物ゲノム中に組み込んだ後、非調節的に発現させること
が可能となる。
ウム属の細菌だけではなく、大腸菌中でも増幅すること
ができるシャトルベクターとしても使用できる。したが
って、Ｔｉプラスミドの組換え操作は、大腸菌を用いて
行うことができる。更に、これらのベクターは、抗生物
質耐性遺伝子を含んでおり、大腸菌、アグロバクテリウ
ム属の細菌、及び植物体等を形質転換する際に、形質転
換体を容易に選別することができる。また、これらのベ
クターには、さらにＣａＭＶの３５Ｓプロモーターが存
在しており、これらのベクターに挿入された遺伝子を植
物ゲノム中に組み込んだ後、非調節的に発現させること
が可能となる。
【００５３】以下に、シロイヌナズナにおける、アグロ
バクテリウムによる目的遺伝子の植物体への導入、及び
形質転換細胞の植物体への再生法を例示する。シロイヌ
ナズナの種子を常法に従って、ＭＳＯプレート（ムラシ
ゲ−スクーグ無機塩類４．６ｇ、ショ糖１０ｇ、１００
０×ビタミンストック液１ml／リットル、ｐＨ６．２）
に播種し、無菌的に栽培する。発根した根の切片を用い
てＣＩＭプレート（ＭＳＯプレートに２，４−ジクロロ
フェノキシ酢酸を終濃度０．５μg／ml、カイネチンを
０．０５μg／mlとなるように加えたもの）上で、カル
ス培養を行う。プロモーターに目的遺伝子を接続し、カ
ナマイシン及びハイグロマイシン耐性遺伝子を有するプ
ラスミドに挿入する。このプラスミドにより形質転換し
たアグロバクテリウムを培養し、希釈したものをチュー
ブに分注する。カルス化した根の切片をこれらのチュー
ブ中に浸し、数日間、ＣＩＭプレート上で共存培養す
る。菌株が肉眼で観察できるまで十分に増殖したら、根
の切片に除菌操作を行ない、ＳＩＭＣプレート（ＭＳＯ
プレートに、２−ｉｐを終濃度５μg／ml、インドール
酢酸を終濃度０．１５μg／ml、クラフォランを終濃度
５００μg／mlとなるように加えたもの）上で数日間培
養を行う。これらの切片を最終的にＳＩＭＣＳプレート
（カナマイシン及びハイグロマイシンＢを含有するプレ
ート）上で培養し、１週間ごとに新しいプレートに移植
を繰り返す。
バクテリウムによる目的遺伝子の植物体への導入、及び
形質転換細胞の植物体への再生法を例示する。シロイヌ
ナズナの種子を常法に従って、ＭＳＯプレート（ムラシ
ゲ−スクーグ無機塩類４．６ｇ、ショ糖１０ｇ、１００
０×ビタミンストック液１ml／リットル、ｐＨ６．２）
に播種し、無菌的に栽培する。発根した根の切片を用い
てＣＩＭプレート（ＭＳＯプレートに２，４−ジクロロ
フェノキシ酢酸を終濃度０．５μg／ml、カイネチンを
０．０５μg／mlとなるように加えたもの）上で、カル
ス培養を行う。プロモーターに目的遺伝子を接続し、カ
ナマイシン及びハイグロマイシン耐性遺伝子を有するプ
ラスミドに挿入する。このプラスミドにより形質転換し
たアグロバクテリウムを培養し、希釈したものをチュー
ブに分注する。カルス化した根の切片をこれらのチュー
ブ中に浸し、数日間、ＣＩＭプレート上で共存培養す
る。菌株が肉眼で観察できるまで十分に増殖したら、根
の切片に除菌操作を行ない、ＳＩＭＣプレート（ＭＳＯ
プレートに、２−ｉｐを終濃度５μg／ml、インドール
酢酸を終濃度０．１５μg／ml、クラフォランを終濃度
５００μg／mlとなるように加えたもの）上で数日間培
養を行う。これらの切片を最終的にＳＩＭＣＳプレート
（カナマイシン及びハイグロマイシンＢを含有するプレ
ート）上で培養し、１週間ごとに新しいプレートに移植
を繰り返す。
【００５４】形質転換した切片は増殖を続け、カルスが
現れてくる。抗生物質で選択しているため、非形質転換
切片は褐変する。形質転換体が約５ｍｍ程度の大きさに
なり、シュート葉を形成するまで培養を続ける。完全な
ロゼットの形状を示すようになったら、形質転換体の根
元をカルス部分を含まないようにメスで切り取り、ＲＩ
Ｍプレート（ＭＳＯプレートにインドール酢酸を終濃度
０．５μg／mlとなるように加えたもの）に移植する。
もし形質転換体から切り取った部分に大きなカルスが付
いていると、たとえ発根してもカルスを介して根が出て
いて、シュートとは維管束がつながっていないことが多
い。約８〜１０日後、無機塩類培地〔５ｍＭ ＫＮ
Ｏ3、２．５ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、
２ｍＭ ＭｇＳＯ4、２ｍＭ Ｃａ（ＮＯ3）2、５０μ
Ｍ Ｆｅ−ＥＤＴＡ、１０００×微量要素（７０ｍＭ
Ｈ3ＢＯ3、１４ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．５ｍＭ ＣｕＳ
Ｏ4、１ｍＭ ＺｎＳＯ4、０．２ｍＭ ＮａＭｏＯ4、
１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１ｍＭ ＣｏＣｌ2）１ml
／リットル〕に浸したロックウール上にこれらの部分を
定植する。
現れてくる。抗生物質で選択しているため、非形質転換
切片は褐変する。形質転換体が約５ｍｍ程度の大きさに
なり、シュート葉を形成するまで培養を続ける。完全な
ロゼットの形状を示すようになったら、形質転換体の根
元をカルス部分を含まないようにメスで切り取り、ＲＩ
Ｍプレート（ＭＳＯプレートにインドール酢酸を終濃度
０．５μg／mlとなるように加えたもの）に移植する。
もし形質転換体から切り取った部分に大きなカルスが付
いていると、たとえ発根してもカルスを介して根が出て
いて、シュートとは維管束がつながっていないことが多
い。約８〜１０日後、無機塩類培地〔５ｍＭ ＫＮ
Ｏ3、２．５ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、
２ｍＭ ＭｇＳＯ4、２ｍＭ Ｃａ（ＮＯ3）2、５０μ
Ｍ Ｆｅ−ＥＤＴＡ、１０００×微量要素（７０ｍＭ
Ｈ3ＢＯ3、１４ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．５ｍＭ ＣｕＳ
Ｏ4、１ｍＭ ＺｎＳＯ4、０．２ｍＭ ＮａＭｏＯ4、
１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１ｍＭ ＣｏＣｌ2）１ml
／リットル〕に浸したロックウール上にこれらの部分を
定植する。
【００５５】開花し、莢を形成した植物体は無機塩類培
地に浸した土に移植し、種子を得ることができる。この
種子を滅菌処理し、ＭＳＨ（ＭＳＯプレートのハイグロ
マイシンＢを終濃度５Ｕ／mlとなるように加えたもの）
に播種して、発芽させることにより形質転換植物を得る
ことができる。
地に浸した土に移植し、種子を得ることができる。この
種子を滅菌処理し、ＭＳＨ（ＭＳＯプレートのハイグロ
マイシンＢを終濃度５Ｕ／mlとなるように加えたもの）
に播種して、発芽させることにより形質転換植物を得る
ことができる。
【００５６】この形質転換植物より、常法に従ってＤＮ
Ａを抽出し、このＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、繊
維の形成及び伸長に関与する遺伝子をプローブに用いて
サザンハイブリダイゼーションを行ない、植物において
生じた形質転換の有無を確認することができる。
Ａを抽出し、このＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、繊
維の形成及び伸長に関与する遺伝子をプローブに用いて
サザンハイブリダイゼーションを行ない、植物において
生じた形質転換の有無を確認することができる。
【００５７】また、形質転換体や、非形質転換体より、
常法に従ってＲＮＡを抽出し、繊維の形成及び伸長に関
与する遺伝子のセンス、若しくはアンチセンス配列を有
するプローブを作成し、これらのプローブを用いてノザ
ンハイブリザイゼーションを行ない、目的遺伝子の発現
の状態を調べることができる。
常法に従ってＲＮＡを抽出し、繊維の形成及び伸長に関
与する遺伝子のセンス、若しくはアンチセンス配列を有
するプローブを作成し、これらのプローブを用いてノザ
ンハイブリザイゼーションを行ない、目的遺伝子の発現
の状態を調べることができる。
【００５８】繊維の形成及び伸長に関与する遺伝子はワ
タ繊維細胞において、ワタ繊維形成過程で特異的に発現
し、繊維伸長に関与する。したがって、もし、この遺伝
子の塩基配列をワタ繊維伸長のマーカーとして利用すれ
ば、繊維伸長のメカニズムの解明およびそれを調節する
遺伝子の単離を可能にするものである。
タ繊維細胞において、ワタ繊維形成過程で特異的に発現
し、繊維伸長に関与する。したがって、もし、この遺伝
子の塩基配列をワタ繊維伸長のマーカーとして利用すれ
ば、繊維伸長のメカニズムの解明およびそれを調節する
遺伝子の単離を可能にするものである。
【００５９】繊維の形成及び伸長のマーカーであり、繊
維の形成及び伸長に必要である目的タンパクを用いれ
ば、繊維の形成及び伸長を誘導する技術の確立および繊
維の形成及び伸長のメカニズムの解明およびそれを調節
する遺伝子の単離に利用することができる。したがっ
て、本発明は細胞形成及び伸長の技術分野においてもき
わめて有用である。
維の形成及び伸長に必要である目的タンパクを用いれ
ば、繊維の形成及び伸長を誘導する技術の確立および繊
維の形成及び伸長のメカニズムの解明およびそれを調節
する遺伝子の単離に利用することができる。したがっ
て、本発明は細胞形成及び伸長の技術分野においてもき
わめて有用である。
【００６０】さらに、繊維の形成及び伸長に関与するタ
ンパクをコードしている塩基配列は、インビトロの転写
系などの人工的な手法、あるいは大腸菌などの微生物を
用いて遺伝子の発現を行うことによって、繊維の形成及
び伸長に関与するタンパクを大量に、かつ純粋な形で得
ることができる。このようにして得られたタンパクは繊
維の形成及び伸長に関与するタンパクであることから、
植物細胞壁の構造を変化させることができ、さらに工業
分野で用いられる植物原料の加工に有用である。
ンパクをコードしている塩基配列は、インビトロの転写
系などの人工的な手法、あるいは大腸菌などの微生物を
用いて遺伝子の発現を行うことによって、繊維の形成及
び伸長に関与するタンパクを大量に、かつ純粋な形で得
ることができる。このようにして得られたタンパクは繊
維の形成及び伸長に関与するタンパクであることから、
植物細胞壁の構造を変化させることができ、さらに工業
分野で用いられる植物原料の加工に有用である。
【００６１】本発明の該遺伝子は、繊維の形成及び伸長
に関与する遺伝子であることから、植物細胞生長過程に
関与する基幹遺伝子であると考えられる。したがって、
例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３
５Ｓプロモーターを用いることによって、植物の器官全
体に生活環の全過程を通して形態変化をもたらすことが
できる。光、熱あるいは傷害などの調節性のプロモータ
ーを用いれば、生育環境に応じてその形態が変化しうる
植物体を作製することができる。また、器官又は組織特
異的なプロモーターを用いれば、特定の器官、又は組織
だけに形態変化を生じさせることができる。例えば、繊
維形成時にだけ転写を起こさせ得るプロモーターを用い
ることによって、繊維の形成を制御し、繊維特性の変化
をもたらすことができる。
に関与する遺伝子であることから、植物細胞生長過程に
関与する基幹遺伝子であると考えられる。したがって、
例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３
５Ｓプロモーターを用いることによって、植物の器官全
体に生活環の全過程を通して形態変化をもたらすことが
できる。光、熱あるいは傷害などの調節性のプロモータ
ーを用いれば、生育環境に応じてその形態が変化しうる
植物体を作製することができる。また、器官又は組織特
異的なプロモーターを用いれば、特定の器官、又は組織
だけに形態変化を生じさせることができる。例えば、繊
維形成時にだけ転写を起こさせ得るプロモーターを用い
ることによって、繊維の形成を制御し、繊維特性の変化
をもたらすことができる。
【００６２】
【発明の効果】本発明により、ワタ繊維の特性（繊維
長、繊度、強度等）の改善および収量の向上を行うこと
ができる、さらに本発明の遺伝子を利用することによ
り、より優れた繊維特性を有し、且つ生産性の高い、遺
伝的に固定されたワタ植物の新品種を作出することがで
きる。
長、繊度、強度等）の改善および収量の向上を行うこと
ができる、さらに本発明の遺伝子を利用することによ
り、より優れた繊維特性を有し、且つ生産性の高い、遺
伝的に固定されたワタ植物の新品種を作出することがで
きる。
【００６３】
【実施例】以下、この発明の実施例を詳細に説明する。
これらは本発明の範囲を限定するものではない。実施例１ 圃場栽培での繊維特性に対するブラシノライ
ドの効果 〔１〕ブラシノライド含有液体組成物の調製 （１）ブラシノライド０．０１ｐｐｍ含有水溶液 ブラシノライド（富士薬品工業社製）０．１mgに数mlの
エタノールを加え溶解し、溶解後、１０リットルの水を
加えて、ブラシノライド含有量が０．０１ｐｐｍである
ブラシノライド水溶液を調製した。 （２）ブラシノライド０．１ｐｐｍ含有水溶液 ブラシノライド（富士薬品工業社製）１mgに数mlのエタ
ノールを加え溶解し、溶解後、１０リットルの水を加え
て、ブラシノライド含有量が０．１ｐｐｍであるブラシ
ノライド水溶液を調製した。 （３）ブラシノライド０．５ｐｐｍ含有水溶液 ブラシノライド（富士薬品工業社製）５mgに数mlのエタ
ノールを加え溶解し、溶解後、１０リットルの水を加え
て、ブラシノライド含有率が０．５ｐｐｍであるブラシ
ノライド水溶液を調製した。
これらは本発明の範囲を限定するものではない。実施例１ 圃場栽培での繊維特性に対するブラシノライ
ドの効果 〔１〕ブラシノライド含有液体組成物の調製 （１）ブラシノライド０．０１ｐｐｍ含有水溶液 ブラシノライド（富士薬品工業社製）０．１mgに数mlの
エタノールを加え溶解し、溶解後、１０リットルの水を
加えて、ブラシノライド含有量が０．０１ｐｐｍである
ブラシノライド水溶液を調製した。 （２）ブラシノライド０．１ｐｐｍ含有水溶液 ブラシノライド（富士薬品工業社製）１mgに数mlのエタ
ノールを加え溶解し、溶解後、１０リットルの水を加え
て、ブラシノライド含有量が０．１ｐｐｍであるブラシ
ノライド水溶液を調製した。 （３）ブラシノライド０．５ｐｐｍ含有水溶液 ブラシノライド（富士薬品工業社製）５mgに数mlのエタ
ノールを加え溶解し、溶解後、１０リットルの水を加え
て、ブラシノライド含有率が０．５ｐｐｍであるブラシ
ノライド水溶液を調製した。
【００６４】〔２〕生育試験（１９９４年５月〜１１月
に実施） ２種のワタ植物、すなわちスーピマ（G.barbadense）
と、ワタ繊維の形成がほとんど見られないワタ植物の突
然変異体品種であるリガン・リントレス２(G.hirsutum)
(ＵＳＤＡ−ＡＲＳ，Southern Crops Res. Lab.のＫｏ
ｈｅｌ博士より提供）を供試材料として用いた。１９９
４年５月１１日に両植物の種子を苗床に播種し、発芽２
週間後に苗を圃場に移植した。１９９４年７月１５日か
ら、これらのワタ植物は開花を始め、開花２日目から散
布処理を開始した。散布処理は子房付近全体に繊維伸長
期である開花２０日目まで、毎日、上記ブラシノライド
含有水溶液をハンドスプレーを用いて散布することによ
って行なった。
に実施） ２種のワタ植物、すなわちスーピマ（G.barbadense）
と、ワタ繊維の形成がほとんど見られないワタ植物の突
然変異体品種であるリガン・リントレス２(G.hirsutum)
(ＵＳＤＡ−ＡＲＳ，Southern Crops Res. Lab.のＫｏ
ｈｅｌ博士より提供）を供試材料として用いた。１９９
４年５月１１日に両植物の種子を苗床に播種し、発芽２
週間後に苗を圃場に移植した。１９９４年７月１５日か
ら、これらのワタ植物は開花を始め、開花２日目から散
布処理を開始した。散布処理は子房付近全体に繊維伸長
期である開花２０日目まで、毎日、上記ブラシノライド
含有水溶液をハンドスプレーを用いて散布することによ
って行なった。
【００６５】開花５０〜６０日目に子房（さく果）が開
絮し、乾燥後、胚珠を収穫し繊維を種子から分離し、繊
維特性の評価を行った。スーピマの繊維特性の評価につ
いては、(1) ９００ＨＶＩシステム (Spinlab 社製) に
よる、繊維長、繊維強度、繊維繊度、(2) ソーター法に
よる繊維長、プレスレーによる繊維強度について測定
し、その結果を下記表 1および表 2に示した。
絮し、乾燥後、胚珠を収穫し繊維を種子から分離し、繊
維特性の評価を行った。スーピマの繊維特性の評価につ
いては、(1) ９００ＨＶＩシステム (Spinlab 社製) に
よる、繊維長、繊維強度、繊維繊度、(2) ソーター法に
よる繊維長、プレスレーによる繊維強度について測定
し、その結果を下記表 1および表 2に示した。
【００６６】
【表１】
【００６７】
【表２】
【００６８】表１および表２の結果より、ワタ植物にブ
ラシノライド水溶液を散布処理することによって、ワタ
繊維の繊維長、繊維強度、繊維繊度のいずれも顕著に増
大することが明らかとなった。さらにワタ繊維の収量に
ついても若干の増大が観察された。一方、リガン・リン
トレス２のワタ繊維の評価は、肉眼による観察を行い、
その結果を図１（胚珠）および図２（分割した胚珠）に
示す。図１および２から明らかなように、ワタ繊維の収
量は、ワタ繊維の形成がほとんど見られないワタ植物の
突然変異体品種であるリガン・リントレス２においてさ
えも増大した。
ラシノライド水溶液を散布処理することによって、ワタ
繊維の繊維長、繊維強度、繊維繊度のいずれも顕著に増
大することが明らかとなった。さらにワタ繊維の収量に
ついても若干の増大が観察された。一方、リガン・リン
トレス２のワタ繊維の評価は、肉眼による観察を行い、
その結果を図１（胚珠）および図２（分割した胚珠）に
示す。図１および２から明らかなように、ワタ繊維の収
量は、ワタ繊維の形成がほとんど見られないワタ植物の
突然変異体品種であるリガン・リントレス２においてさ
えも増大した。
【００６９】実施例２ 〔１〕ブラシノステロイド含有液体組成物の調製 各液体組成液の組成において、略号はそれぞれ下記のも
のを意味する。 ＢＲ：ブラシノライド ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド ＰＥＧ１０００：ポリエチレングリコール（分子量１０
００） ＥｔＯＨ：エタノール ネオエステリン（クミアイ化学社製）
のを意味する。 ＢＲ：ブラシノライド ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド ＰＥＧ１０００：ポリエチレングリコール（分子量１０
００） ＥｔＯＨ：エタノール ネオエステリン（クミアイ化学社製）
【００７０】下記組成よりなる処理液Ａ、ＢおよびＣを
調製した。 （１）混合液Ａ（ブランク）
調製した。 （１）混合液Ａ（ブランク）
【００７１】（２）混合液Ｂ（ＢＲ：０．０５ｐｐｍ）
【００７２】（３）混合液Ｃ（ＢＲ：０．３ｐｐｍ）
【００７３】〔２〕使用したブラシノライド含有組成物 上記各混合液を用いて、下記の異なった濃度のブラシノ
ライド含有液状組成物を調製した。 （１）ブラシノライド無添加の処理液 混合液Ａを５００倍の水に希釈し、この希釈液をて使用
した。 （２）ブラシノライド濃度０．０５ｐｐｍの処理液 混合液Ｂを５００倍の水に希釈して使用した。 （３）ブラシノライド濃度０．３ｐｐｍの処理液 混合液Ｃを５００倍の水に希釈して、この希釈液を使用
した。
ライド含有液状組成物を調製した。 （１）ブラシノライド無添加の処理液 混合液Ａを５００倍の水に希釈し、この希釈液をて使用
した。 （２）ブラシノライド濃度０．０５ｐｐｍの処理液 混合液Ｂを５００倍の水に希釈して使用した。 （３）ブラシノライド濃度０．３ｐｐｍの処理液 混合液Ｃを５００倍の水に希釈して、この希釈液を使用
した。
【００７４】〔３〕生育試験（１９９４年５月〜１１月
に実施） 実験例１と同様にして試験区及び試験樹を別個に設け
て、生育試験を行った。異なったブラシノライド含有組
成物によるワタ植物の散布処理方法についても実施例１
と同様な方法に従って行った。
に実施） 実験例１と同様にして試験区及び試験樹を別個に設け
て、生育試験を行った。異なったブラシノライド含有組
成物によるワタ植物の散布処理方法についても実施例１
と同様な方法に従って行った。
【００７５】開花５０〜６０日目に子房（さく果）が開
絮し、乾燥後、胚珠を収穫し、ワタ繊維を種子から分離
し、繊維特性の評価を行なった。その結果を下記表３に
示した。
絮し、乾燥後、胚珠を収穫し、ワタ繊維を種子から分離
し、繊維特性の評価を行なった。その結果を下記表３に
示した。
【００７６】
【表３】
【００７７】表３の結果より、ワタ植物に界面活性剤や
展着剤を含むブラシノライド含有液体組成物を散布する
ことによって、ワタ繊維の繊維長、繊維強度および繊維
繊度がいずれも顕著に増大することが明らかになった。
展着剤を含むブラシノライド含有液体組成物を散布する
ことによって、ワタ繊維の繊維長、繊維強度および繊維
繊度がいずれも顕著に増大することが明らかになった。
【００７８】実施例３ 〔１〕ブラシノステロイド含有ペースト状組成物の調製 下記略号はそれぞれ下記のものを意味する。 ＢＲ：ブラシノライド ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン ＥｔＯＨ：エタノール
【００７９】下記組成よりなるラノリンペーストＡまた
はＢを調製した。 （１）ラノリンペーストＡ（ブランク）
はＢを調製した。 （１）ラノリンペーストＡ（ブランク）
【００８０】（２）ラノリンペーストＢ（ＢＲ：０．１
ｐｐｍ）
ｐｐｍ）
【００８１】〔２〕生育試験（１９９４年５月〜１１
月） 実験例１と同様にして、試験区及び試験区を別個の設け
て生育試験を行った。ワタ植物の処理方法については上
記のラノリンペーストを開花２日目からワタ植物の果梗
に塗布し始めた。開花５０〜６０日目に子房（さく果）
が開絮し、乾燥後、胚珠を収穫し、繊維を種子から分離
し、繊維特性の評価を行った。その結果を下記表４に示
した。
月） 実験例１と同様にして、試験区及び試験区を別個の設け
て生育試験を行った。ワタ植物の処理方法については上
記のラノリンペーストを開花２日目からワタ植物の果梗
に塗布し始めた。開花５０〜６０日目に子房（さく果）
が開絮し、乾燥後、胚珠を収穫し、繊維を種子から分離
し、繊維特性の評価を行った。その結果を下記表４に示
した。
【００８２】
【表４】
【００８３】表４から、ワタ繊維の繊維長、繊維強度お
よび繊度がブラシノライド含有ペーストでワタ植物を処
理することによって、著しく増加したことが明らかであ
る。
よび繊度がブラシノライド含有ペーストでワタ植物を処
理することによって、著しく増加したことが明らかであ
る。
【００８４】実施例４ 胚珠培養での繊維長に対するブ
ラシノライドの効果 ワタ植物の２品種、すなわちリガン・リントレス２(Gos
sypium hirstum）及びコーカー３１２(Gossypium hirst
um）を圃場で栽培した。開花後、２日目の子房を集め、
萼片、包葉および花弁を取り除き、７０％エタノールに
３０秒間漬け殺菌した。さらに１０重量％の次亜塩素酸
ナトリウムと０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含む水
溶液に２０分間浸漬して殺菌した。滅菌したピンセット
を用い、子房より無菌的に胚珠を取り出した。あらかじ
め下記表５の液体培地５０ｍｌを入れ、オートクレーブ
殺菌した三角フラスコ内に入れ、３２℃で浮遊培養し
た。
ラシノライドの効果 ワタ植物の２品種、すなわちリガン・リントレス２(Gos
sypium hirstum）及びコーカー３１２(Gossypium hirst
um）を圃場で栽培した。開花後、２日目の子房を集め、
萼片、包葉および花弁を取り除き、７０％エタノールに
３０秒間漬け殺菌した。さらに１０重量％の次亜塩素酸
ナトリウムと０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含む水
溶液に２０分間浸漬して殺菌した。滅菌したピンセット
を用い、子房より無菌的に胚珠を取り出した。あらかじ
め下記表５の液体培地５０ｍｌを入れ、オートクレーブ
殺菌した三角フラスコ内に入れ、３２℃で浮遊培養し
た。
【００８５】
【表５】
【００８６】組成１の培地（ブラシノライド添加）で培
養した胚珠を処理区、一方、組成２の培地（ブラシノラ
イド無添加）で培養したものを対照区とした。
養した胚珠を処理区、一方、組成２の培地（ブラシノラ
イド無添加）で培養したものを対照区とした。
【００８７】〔１〕リガンリントレス２(Gossypium hir
stum) ３０日間培養後、リガン・リントレス２ワタ繊維の繊維
長を測定した。繊維長の測定方法は、次のとおりで行っ
た。まず、極細のピンセットで胚珠より繊維を取り出
し、取り出した繊維は絡み合った単繊維なので、各々単
繊維に分離した。単繊維の確認は顕微鏡で行ない、繊維
長は定規で両処理区とも１００本ずつ測定した。処理区
の胚珠の繊維長は、１．９８±０．２７ｃｍ、対照区の
胚珠の繊維長は，１．７０±０．１９ｃｍであった。さ
らに、培養３０日目の胚珠を室温条件下で十分乾燥後、
胚珠からワタ繊維を取出し、胚珠一つ当たりの繊維重量
を測定した。処理区では８．８５ｍｇ、対照区では７．
０２ｍｇであった。
stum) ３０日間培養後、リガン・リントレス２ワタ繊維の繊維
長を測定した。繊維長の測定方法は、次のとおりで行っ
た。まず、極細のピンセットで胚珠より繊維を取り出
し、取り出した繊維は絡み合った単繊維なので、各々単
繊維に分離した。単繊維の確認は顕微鏡で行ない、繊維
長は定規で両処理区とも１００本ずつ測定した。処理区
の胚珠の繊維長は、１．９８±０．２７ｃｍ、対照区の
胚珠の繊維長は，１．７０±０．１９ｃｍであった。さ
らに、培養３０日目の胚珠を室温条件下で十分乾燥後、
胚珠からワタ繊維を取出し、胚珠一つ当たりの繊維重量
を測定した。処理区では８．８５ｍｇ、対照区では７．
０２ｍｇであった。
【００８８】〔２〕コーカー３１２(Gossypium hirstu
m) コーカー３１２についてもブラシノライドの効果を調べ
た。両処理区からのフラスコから培養１４日目の胚珠を
取出し、互いに比較したところ、肉眼で明らかにワタ繊
維収量が増大しているのが観察された。その結果を図３
に示す。
m) コーカー３１２についてもブラシノライドの効果を調べ
た。両処理区からのフラスコから培養１４日目の胚珠を
取出し、互いに比較したところ、肉眼で明らかにワタ繊
維収量が増大しているのが観察された。その結果を図３
に示す。
【００８９】次に培養３０日目の胚珠を、両処理区から
１６個づつ取出し、ワタ繊維を分離後、繊維長を測定し
た。処理区では３．６０±０．３６ｃｍ、対照区では
２．６０±０．２８ｃｍであり、処理区の方が対照区よ
り２５％程長かった。再度、同様な実験を行なったとこ
ろ、処理区では４．１０±０．５ｃｍ、対照区では２．
８０±０．５ｃｍであり、処理区の単繊維方が対照区の
ものより３０％程長かった。以上の結果より、ワタ植物
の胚珠培養時に培地中にブラシノライドを添加すること
によって、繊維長、繊維収量のいずれも増大することが
明らかとなった。
１６個づつ取出し、ワタ繊維を分離後、繊維長を測定し
た。処理区では３．６０±０．３６ｃｍ、対照区では
２．６０±０．２８ｃｍであり、処理区の方が対照区よ
り２５％程長かった。再度、同様な実験を行なったとこ
ろ、処理区では４．１０±０．５ｃｍ、対照区では２．
８０±０．５ｃｍであり、処理区の単繊維方が対照区の
ものより３０％程長かった。以上の結果より、ワタ植物
の胚珠培養時に培地中にブラシノライドを添加すること
によって、繊維長、繊維収量のいずれも増大することが
明らかとなった。
【００９０】実施例５ ワタ繊維形成に関与する遺伝子
のクローニング １．ポリ（Ａ）+ＲＮＡの調製 圃場に栽培しているスーピマ(G.barbadense)を供試材料
に用いた。開花５日目〜１５日目の胚珠（繊維伸長期）
と開花後２５日〜３０日（繊維伸長停止期）の胚珠を採
取し、それぞれの種子から繊維を分離した。得られたワ
タ繊維約５ｇを直ちに液体窒素中で凍結し、液体窒素存
在下、乳鉢で細かく粉砕した。その後、１０mlの抽出用
０．２Ｍトリス酢酸緩衝液〔５Ｍグアニジンチオシアネ
ート、０．７％β−メルカプトメタノール、１％ポリビ
ニルピロリドン（M.W.360,000）、０．６２％Ｎ−ラウ
ロイルサルコシン酸ナトリウム含有、ｐＨ８．５）を加
え、ポリトロンホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ
社製）を用い、氷冷下２分間粉砕した。ただし、β−メ
ルカプトエタノールとポリビニルピロリドンは使用する
直前に添加した。その後、粉砕液を１７，０００×ｇで
２０分間遠心分離し、上清を回収した。
のクローニング １．ポリ（Ａ）+ＲＮＡの調製 圃場に栽培しているスーピマ(G.barbadense)を供試材料
に用いた。開花５日目〜１５日目の胚珠（繊維伸長期）
と開花後２５日〜３０日（繊維伸長停止期）の胚珠を採
取し、それぞれの種子から繊維を分離した。得られたワ
タ繊維約５ｇを直ちに液体窒素中で凍結し、液体窒素存
在下、乳鉢で細かく粉砕した。その後、１０mlの抽出用
０．２Ｍトリス酢酸緩衝液〔５Ｍグアニジンチオシアネ
ート、０．７％β−メルカプトメタノール、１％ポリビ
ニルピロリドン（M.W.360,000）、０．６２％Ｎ−ラウ
ロイルサルコシン酸ナトリウム含有、ｐＨ８．５）を加
え、ポリトロンホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ
社製）を用い、氷冷下２分間粉砕した。ただし、β−メ
ルカプトエタノールとポリビニルピロリドンは使用する
直前に添加した。その後、粉砕液を１７，０００×ｇで
２０分間遠心分離し、上清を回収した。
【００９１】この上清をミラクロスに濾過し、その濾液
を遠心管に入れた５．７Ｍ塩化セシウム溶液１．５mlに
静かに重層し、１５５，０００×ｇ、２０℃で２０時間
遠心した後、上清を捨て、ＲＮＡの沈殿を回収した。こ
の沈殿を３mlの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ８．０（ＴＥ緩衝液と呼
ぶ）に溶解し、さらに等量のフェノール：クロロホル
ム：イソアミルアルコール（容積比、２５：２４：１）
を加え良く混合した後、遠心分離を行って上層の水層を
回収した。得られた水層に、１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナ
トリウム（氷酢酸でｐＨ６．２に調製）と、２．５倍量
のエタノールを添加して良く混合し、−２０℃で一晩静
置した。その後、１７，０００×ｇで２０分間遠心分離
し、得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄して、減圧
乾燥した。
を遠心管に入れた５．７Ｍ塩化セシウム溶液１．５mlに
静かに重層し、１５５，０００×ｇ、２０℃で２０時間
遠心した後、上清を捨て、ＲＮＡの沈殿を回収した。こ
の沈殿を３mlの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ８．０（ＴＥ緩衝液と呼
ぶ）に溶解し、さらに等量のフェノール：クロロホル
ム：イソアミルアルコール（容積比、２５：２４：１）
を加え良く混合した後、遠心分離を行って上層の水層を
回収した。得られた水層に、１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナ
トリウム（氷酢酸でｐＨ６．２に調製）と、２．５倍量
のエタノールを添加して良く混合し、−２０℃で一晩静
置した。その後、１７，０００×ｇで２０分間遠心分離
し、得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄して、減圧
乾燥した。
【００９２】この乾燥標品を５００μlの前述のＴＥ緩
衝液に溶解し、全ＲＮＡ溶液を得た。このＲＮＡ溶液を
６５℃で５分間インキュベートした後、氷上で急冷し
た。これに２×結合緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．
５％ ＳＤＳ、ｐＨ７．５）を等量になるようにＲＮＡ
溶液に加え、平衡化緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、
０．５％ ＳＤＳ、ｐＨ７．５）で予め平衡化したオリ
ゴｄＴセルロースカラム（クロンテック社製）に重層し
た。次いで、カラムを約１０倍量の前述の平衡化緩衝液
で洗浄した後、溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ７．５）でｐｏｌ
ｙ（Ａ）+ＲＮＡを溶出した。
衝液に溶解し、全ＲＮＡ溶液を得た。このＲＮＡ溶液を
６５℃で５分間インキュベートした後、氷上で急冷し
た。これに２×結合緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．
５％ ＳＤＳ、ｐＨ７．５）を等量になるようにＲＮＡ
溶液に加え、平衡化緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、
０．５％ ＳＤＳ、ｐＨ７．５）で予め平衡化したオリ
ゴｄＴセルロースカラム（クロンテック社製）に重層し
た。次いで、カラムを約１０倍量の前述の平衡化緩衝液
で洗浄した後、溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ７．５）でｐｏｌ
ｙ（Ａ）+ＲＮＡを溶出した。
【００９３】得られた溶出液に、１／１０倍量の前述の
３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と２．５倍量のエタノールを
加え混合し、−７０℃で静置した。その後、１０，００
０×ｇで遠心分離を行ない、得られた沈殿を７０％エタ
ノールで洗浄して減圧乾燥した。この乾燥標品を再度５
００μlのＴＥ緩衝液に溶解し、オリゴｄＴセルロース
カラム精製を繰り返し行った。得られたｐｏｌｙ（Ａ）
+ＲＮＡのうち、繊維伸長期由来のｐｏｌｙ（Ａ）+ Ｒ
ＮＡについてはｃＤＮＡライブラリーと、ディファレン
シャルスクリーニングに用いるｃＤＮＡプローブの作製
に用い、繊維伸長停止期由来のｐｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡ
についてはディファレンシャルスクリーニングに用いる
ｃＤＮＡプローブの作製に用いた。
３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と２．５倍量のエタノールを
加え混合し、−７０℃で静置した。その後、１０，００
０×ｇで遠心分離を行ない、得られた沈殿を７０％エタ
ノールで洗浄して減圧乾燥した。この乾燥標品を再度５
００μlのＴＥ緩衝液に溶解し、オリゴｄＴセルロース
カラム精製を繰り返し行った。得られたｐｏｌｙ（Ａ）
+ＲＮＡのうち、繊維伸長期由来のｐｏｌｙ（Ａ）+ Ｒ
ＮＡについてはｃＤＮＡライブラリーと、ディファレン
シャルスクリーニングに用いるｃＤＮＡプローブの作製
に用い、繊維伸長停止期由来のｐｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡ
についてはディファレンシャルスクリーニングに用いる
ｃＤＮＡプローブの作製に用いた。
【００９４】２．繊維伸長期特異的ｃＤＮＡライブラリ
ーの作製 ｃＤＮＡライブラリーの作製はＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Stratagene社製）を使用し
た。上記１．で得られた繊維伸長期由来のｐｏｌｙ
（Ａ）+ＲＮＡを鋳型として、オリゴ（ｄＴ）プライマ
ーと逆転写酵素を用い、ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎ
らの方法〔Gene,25,263-269(1983)〕に従い、２本鎖ｃ
ＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡの両末端にＥｃｏ
ＲＩアダプター（内部にＸｈｏＩとＳｐｅＩサイトを持
つ）を連結し、連結したＤＮＡをＸｈｏＩで消化した
後、それをλファージベクター、λＺＡＰIIアームのＥ
ｃｏＲＩとＸｈｏＩ部位に連結後、インビトロ パッケ
ージングキット（Stratagene社製、GIGAPACK Gold ）を
用い、該ベクターのパッケージングを行ない、大腸菌Ｓ
ＵＲＥ株（ＯＤ660＝０．５）に感染させることにより
多数の組換えλファージを得た。これをワタ繊維伸長期
に特異的なｃＤＮＡライブラリーとした。このライブラ
リーのサイズは５．０×１０6であった。
ーの作製 ｃＤＮＡライブラリーの作製はＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Stratagene社製）を使用し
た。上記１．で得られた繊維伸長期由来のｐｏｌｙ
（Ａ）+ＲＮＡを鋳型として、オリゴ（ｄＴ）プライマ
ーと逆転写酵素を用い、ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎ
らの方法〔Gene,25,263-269(1983)〕に従い、２本鎖ｃ
ＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡの両末端にＥｃｏ
ＲＩアダプター（内部にＸｈｏＩとＳｐｅＩサイトを持
つ）を連結し、連結したＤＮＡをＸｈｏＩで消化した
後、それをλファージベクター、λＺＡＰIIアームのＥ
ｃｏＲＩとＸｈｏＩ部位に連結後、インビトロ パッケ
ージングキット（Stratagene社製、GIGAPACK Gold ）を
用い、該ベクターのパッケージングを行ない、大腸菌Ｓ
ＵＲＥ株（ＯＤ660＝０．５）に感染させることにより
多数の組換えλファージを得た。これをワタ繊維伸長期
に特異的なｃＤＮＡライブラリーとした。このライブラ
リーのサイズは５．０×１０6であった。
【００９５】３．プローブの作製 繊維伸長期（５日目〜１５日目）と繊維伸長停止期（２
５日目〜３０日目）の繊維からそれぞれ調製したｐｏｌ
ｙ（Ａ）+ＲＮＡを鋳型として、オリゴ（ｄＴ）プライ
マーと逆転写酵素Ｍ−ＭＬＶ（東洋紡社製）を用いてｃ
ＤＮＡを合成した。合成後、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを
取り除くためにアルカリ加水分解処理を行ない、得られ
たｃＤＮＡを鋳型として、Random Primed DNA Labeling
Kit（ＵＳＢ社製）を用いて、32Ｐ標識プローブを作製
した。得られた32Ｐ標識ｃＤＮＡをディファレンシャル
スクリーニングのプローブに用いた。繊維伸長期のｃＤ
ＮＡより調製したものをポジティブプローブ、繊維伸長
停止期のｃＤＮＡより調製したものをネガティブプロー
ブにしてディファレンシャルスクリーニングを行なっ
た。
５日目〜３０日目）の繊維からそれぞれ調製したｐｏｌ
ｙ（Ａ）+ＲＮＡを鋳型として、オリゴ（ｄＴ）プライ
マーと逆転写酵素Ｍ−ＭＬＶ（東洋紡社製）を用いてｃ
ＤＮＡを合成した。合成後、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを
取り除くためにアルカリ加水分解処理を行ない、得られ
たｃＤＮＡを鋳型として、Random Primed DNA Labeling
Kit（ＵＳＢ社製）を用いて、32Ｐ標識プローブを作製
した。得られた32Ｐ標識ｃＤＮＡをディファレンシャル
スクリーニングのプローブに用いた。繊維伸長期のｃＤ
ＮＡより調製したものをポジティブプローブ、繊維伸長
停止期のｃＤＮＡより調製したものをネガティブプロー
ブにしてディファレンシャルスクリーニングを行なっ
た。
【００９６】４．繊維の形成及び伸長に関与する遺伝子
のスクリーニング 繊維伸長期のｃＤＮＡライブラリーを構成する上記ファ
ージを大腸菌に感染させてＬＢ寒天培地上で増殖させ、
約５０，０００個のファージＤＮＡをそれぞれ２枚のナ
イロンメンブレン（ハイボンド−Ｎ、アマシャム社製）
に写し取った。
のスクリーニング 繊維伸長期のｃＤＮＡライブラリーを構成する上記ファ
ージを大腸菌に感染させてＬＢ寒天培地上で増殖させ、
約５０，０００個のファージＤＮＡをそれぞれ２枚のナ
イロンメンブレン（ハイボンド−Ｎ、アマシャム社製）
に写し取った。
【００９７】ファージＤＮＡを写し取ったナイロンメン
ブレンをアルカリ変性液（０．５ＭＮａＯＨ、１．５Ｍ
ＮａＣｌ）を含んだ濾紙上に移し、４分間放置し、次
に中和液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、ｐＨ８．０）を含んだ濾紙上に移し、ナイロン
メンブレンを５分間放置した。２×ＳＳＣ（０．３Ｍ
ＮａＣｌ、０．０３Ｍ クエン酸三ナトリウム）で洗浄
した後、メンブレンをストラタリンカー（Stratagene社
製）を用い、ＤＮＡの固定を行なった。固定処理を行な
ったナイロンメンブレンをハイブリダイゼーション溶液
〔５０％ホルムアミド、０．５％ＳＤＳ、６×ＳＳＰＥ
（３Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4、２０ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ７．４）、５×デンハルト溶
液（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリド
ン、０．１％ウシ血清アルブミン）、５０μg／ml変性
サケ精子ＤＮＡを含有〕中において、４２℃で３時間プ
レハイブリさせ、上記３．で作製したｃＤＮＡプローブ
をそれぞれのメンブレンに加え、４２℃で２０時間ハイ
ブリダイズさせた。その後、メンブレンを取り出し、２
×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣおよび０．１％
ＳＤＳを含有する溶液を用いて、４２℃で１時間〜２時
間洗浄した。これらのメンブレンを乾燥した後、Ｘ線フ
ィルムを密着させて一晩感光させた。
ブレンをアルカリ変性液（０．５ＭＮａＯＨ、１．５Ｍ
ＮａＣｌ）を含んだ濾紙上に移し、４分間放置し、次
に中和液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、ｐＨ８．０）を含んだ濾紙上に移し、ナイロン
メンブレンを５分間放置した。２×ＳＳＣ（０．３Ｍ
ＮａＣｌ、０．０３Ｍ クエン酸三ナトリウム）で洗浄
した後、メンブレンをストラタリンカー（Stratagene社
製）を用い、ＤＮＡの固定を行なった。固定処理を行な
ったナイロンメンブレンをハイブリダイゼーション溶液
〔５０％ホルムアミド、０．５％ＳＤＳ、６×ＳＳＰＥ
（３Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4、２０ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ７．４）、５×デンハルト溶
液（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリド
ン、０．１％ウシ血清アルブミン）、５０μg／ml変性
サケ精子ＤＮＡを含有〕中において、４２℃で３時間プ
レハイブリさせ、上記３．で作製したｃＤＮＡプローブ
をそれぞれのメンブレンに加え、４２℃で２０時間ハイ
ブリダイズさせた。その後、メンブレンを取り出し、２
×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣおよび０．１％
ＳＤＳを含有する溶液を用いて、４２℃で１時間〜２時
間洗浄した。これらのメンブレンを乾燥した後、Ｘ線フ
ィルムを密着させて一晩感光させた。
【００９８】その結果、伸長停止区（ネガティブ）よ
り、伸長区（ポジティブ）から得たプローブで強くハイ
ブリダイズした陽性クローンを３４個選抜することがで
きた。そのうち、ＫＣ２２と命名したクローンについて
解析を進めた。ＫＣ２２は、ダイズのブラシノステロイ
ドによって発現が誘導される遺伝子（ＢＲＵ１）〔D.M.
Zurek and S.D.Clouse,Plant Physiol(ROCKV)102.132.
(1993)〕、アズキ、ダイズ等のキシログルカントランス
フェラーゼ〔西谷ら．J.Biol.Chem.268,25364-25368,(1
993)〕やアラビドプシスの頂端分裂組織に特異的に発現
するｍｅｒｉ−５遺伝子〔Medford, J.I., Elmer, J.
S.,and Klee, H.J., PlantCell, 3, 359-370, (1991)〕
と部分的に相同性がある。このキシログルカントランス
フェラーゼは、植物細胞壁の主要成分である、キシログ
ルカンの架橋の繋ぎ換えを触媒する酵素であり、細胞壁
伸展に関与する基幹酵素の一つであると考えられてい
る。
り、伸長区（ポジティブ）から得たプローブで強くハイ
ブリダイズした陽性クローンを３４個選抜することがで
きた。そのうち、ＫＣ２２と命名したクローンについて
解析を進めた。ＫＣ２２は、ダイズのブラシノステロイ
ドによって発現が誘導される遺伝子（ＢＲＵ１）〔D.M.
Zurek and S.D.Clouse,Plant Physiol(ROCKV)102.132.
(1993)〕、アズキ、ダイズ等のキシログルカントランス
フェラーゼ〔西谷ら．J.Biol.Chem.268,25364-25368,(1
993)〕やアラビドプシスの頂端分裂組織に特異的に発現
するｍｅｒｉ−５遺伝子〔Medford, J.I., Elmer, J.
S.,and Klee, H.J., PlantCell, 3, 359-370, (1991)〕
と部分的に相同性がある。このキシログルカントランス
フェラーゼは、植物細胞壁の主要成分である、キシログ
ルカンの架橋の繋ぎ換えを触媒する酵素であり、細胞壁
伸展に関与する基幹酵素の一つであると考えられてい
る。
【００９９】さらに、ＫＣ２２についてブラシノライド
処理区と対照区から単離されたＲＮＡを用いてノーザン
解析を行なったところ、ＫＣ２２はブラシノライドによ
って調節されていることが明らかとなった。
処理区と対照区から単離されたＲＮＡを用いてノーザン
解析を行なったところ、ＫＣ２２はブラシノライドによ
って調節されていることが明らかとなった。
【０１００】ＫＣ２２のファージＤＮＡから、インビボ
・エクシジョン法によりｃＤＮＡインサートを持つプラ
スミドクローンｐＫＣ２２を調製した。インビボ・エク
シジョン法は、ZAP-cDNA Synthesis Kit (Staratagene
社製）の方法に従った。まず、ＫＣ２２を含むファージ
液２００μl、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ懸濁液２００μ
l、ヘルパーファージＲ４０８懸濁液１μlを混ぜ、３７
℃で１５分間インキュベートした後、３mlの２×ＹＴ培
地を加え、３７℃で２時間振蘯培養し、７０℃で２０分
間処理し、遠心分離（４，０００×ｇ、１０分間）して
上清を回収した。得られた上清３０μlと大腸菌ＳＯＬ
Ｒ懸濁液３０μlを混ぜ、混合物を３７℃で１５分間イ
ンキュベートした後、アンピシリンを５０ｐｐｍ含むＬ
Ｂ寒天培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。コロニー
を形成した大腸菌は、ｃＤＮＡインサートを持つプラス
ミドクローンｐＫＣ２２を含んでいる。
・エクシジョン法によりｃＤＮＡインサートを持つプラ
スミドクローンｐＫＣ２２を調製した。インビボ・エク
シジョン法は、ZAP-cDNA Synthesis Kit (Staratagene
社製）の方法に従った。まず、ＫＣ２２を含むファージ
液２００μl、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ懸濁液２００μ
l、ヘルパーファージＲ４０８懸濁液１μlを混ぜ、３７
℃で１５分間インキュベートした後、３mlの２×ＹＴ培
地を加え、３７℃で２時間振蘯培養し、７０℃で２０分
間処理し、遠心分離（４，０００×ｇ、１０分間）して
上清を回収した。得られた上清３０μlと大腸菌ＳＯＬ
Ｒ懸濁液３０μlを混ぜ、混合物を３７℃で１５分間イ
ンキュベートした後、アンピシリンを５０ｐｐｍ含むＬ
Ｂ寒天培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。コロニー
を形成した大腸菌は、ｃＤＮＡインサートを持つプラス
ミドクローンｐＫＣ２２を含んでいる。
【０１０１】このプラスミドｐＫＣ２２中のＤＮＡ挿入
配列の塩基配列決定を、ダイデオキシ法〔Messing, Met
hods in Enzymol., 101, 20-78(1983)〕により行なっ
た。得られた塩基配列を配列番号１、及びこの配列から
推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、両
者を配列番号３に示す。これらの配列は、繊維の形成お
よび伸長時に発現量が変化しうる遺伝子のｃＤＮＡの塩
基配列、及びアミノ酸配列を示すものである。
配列の塩基配列決定を、ダイデオキシ法〔Messing, Met
hods in Enzymol., 101, 20-78(1983)〕により行なっ
た。得られた塩基配列を配列番号１、及びこの配列から
推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、両
者を配列番号３に示す。これらの配列は、繊維の形成お
よび伸長時に発現量が変化しうる遺伝子のｃＤＮＡの塩
基配列、及びアミノ酸配列を示すものである。
【０１０２】５．大腸菌による目的遺伝子の発現 上記にて得られた形質転換体を１００μg／mlのアンピ
シリンを含むＬＢ培地５０mlに懸濁し、３７℃で振蘯培
養した。培養液の濁度がＯＤ660＝０．２となったとこ
ろで、終濃度１０ｍＭとなるようにイソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピレノシド（ＩＰＴＧ）を加え、３７
℃で、濁度がＯＤ660＝１．０に達するまで振蘯培養し
た。培養終了後、１，６００×ｇ、１５分間遠心し、菌
体を回収した。回収した菌体を４倍量のLysis buffer
〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ、１μＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチ
ルスルフォニルフルオリド）、１０％シュクロース〕に
懸濁し、さらに、リソチーム（シグマ社製）を終濃度１
mg／mlになるように加え、１０分間氷上に静置した。１
０分後、Nonidet Ｐ−４０（シグマ社製）を終濃度１％
になるように加え、さらに１０分間氷上に静置し、その
後、４８，０００×ｇで１時間遠心した。得られた上清
に等量の２×Laemli sample buffer〔０．１２５Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２０％グリセロール、
１０％β- メルカプトエタノール、６％ＳＤＳ、０．１
％ブロモフェノール・ブルー〕を加え、２分間ボイルし
た後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）を行なった。電気泳動終了後、ゲルをク
マシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）により染色し、７
％酢酸、２５％メタノール液にて脱色を行なった。目的
とする分子量３９ｋＤａ付近にバンドが見られ、目的遺
伝子の発現を確認した。
シリンを含むＬＢ培地５０mlに懸濁し、３７℃で振蘯培
養した。培養液の濁度がＯＤ660＝０．２となったとこ
ろで、終濃度１０ｍＭとなるようにイソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピレノシド（ＩＰＴＧ）を加え、３７
℃で、濁度がＯＤ660＝１．０に達するまで振蘯培養し
た。培養終了後、１，６００×ｇ、１５分間遠心し、菌
体を回収した。回収した菌体を４倍量のLysis buffer
〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ、１μＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチ
ルスルフォニルフルオリド）、１０％シュクロース〕に
懸濁し、さらに、リソチーム（シグマ社製）を終濃度１
mg／mlになるように加え、１０分間氷上に静置した。１
０分後、Nonidet Ｐ−４０（シグマ社製）を終濃度１％
になるように加え、さらに１０分間氷上に静置し、その
後、４８，０００×ｇで１時間遠心した。得られた上清
に等量の２×Laemli sample buffer〔０．１２５Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２０％グリセロール、
１０％β- メルカプトエタノール、６％ＳＤＳ、０．１
％ブロモフェノール・ブルー〕を加え、２分間ボイルし
た後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）を行なった。電気泳動終了後、ゲルをク
マシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）により染色し、７
％酢酸、２５％メタノール液にて脱色を行なった。目的
とする分子量３９ｋＤａ付近にバンドが見られ、目的遺
伝子の発現を確認した。
【０１０３】６．シロイヌナズナの形質転換体の作製 （１）プラスミドの構築 配列番号１に示したＫＣ２２の塩基配列よりオープンリ
ーディングフレームをすべて含むように、ＤｒａＩで切
断した。このＤｒａＩ断片をｐＵＣ１９のＳｍａＩサイ
トにサブクローニングした。このプラスミドをＳａｌＩ
およびＨｉｎｄIII で切断し、３５ＳプロモーターのＨ
ｉｎｄIII −ＸｈｏＩ断片をサブクローニングした。つ
ぎにこのクローンをＨｉｎｄIII およびＳａｃＩで切断
し、バイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２のＨｉｎ
ｄIII とＳａｃＩの間にサブクローニングした。このプ
ラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−２２と命名した。このプラス
ミドの構築を図４に示す。なお、形質転換された大腸菌
ＪＭ１０９を、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−２２
と命名した。
ーディングフレームをすべて含むように、ＤｒａＩで切
断した。このＤｒａＩ断片をｐＵＣ１９のＳｍａＩサイ
トにサブクローニングした。このプラスミドをＳａｌＩ
およびＨｉｎｄIII で切断し、３５ＳプロモーターのＨ
ｉｎｄIII −ＸｈｏＩ断片をサブクローニングした。つ
ぎにこのクローンをＨｉｎｄIII およびＳａｃＩで切断
し、バイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２のＨｉｎ
ｄIII とＳａｃＩの間にサブクローニングした。このプ
ラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−２２と命名した。このプラス
ミドの構築を図４に示す。なお、形質転換された大腸菌
ＪＭ１０９を、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−２２
と命名した。
【０１０４】（２）プラスミドのアグロバクテリウムへ
の導入 上記６-(1)で得られた大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−２２とヘル
パープラスミドｐＲＫ２０１３を持つ大腸菌ＨＢ１０１
株を、それぞれ５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ
培地で３７℃で１晩、アグロバクテリウムＥＨＡ１０１
株を５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７
Cで２晩培養した。各培養液１．５ｍｌをエッペンドル
フチューブに取り、集菌したのち、ＬＢ培地で洗浄し
た。これらの菌体を１ｍｌのＬＢ培地に懸濁後、３種の
菌を１００μｌずつ混合し、ＬＢ培地寒天培地にまき、
２８℃で培養して、プラスミドをアグロバクテリウムに
接合伝達させた。１〜２日後に培地の一部を白金耳でか
きとり、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、２０ｍｇ／ｌハイ
グロマイシンＢ、２５ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを
含むＬＢ寒天培地上に塗布した。２８Cで２日間培養し
た後、単一コロニーを選択した。得られた形質転換体を
ＥＨＡ１０１／ｐＢＩ３５Ｓ−２２と命名した。
の導入 上記６-(1)で得られた大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−２２とヘル
パープラスミドｐＲＫ２０１３を持つ大腸菌ＨＢ１０１
株を、それぞれ５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ
培地で３７℃で１晩、アグロバクテリウムＥＨＡ１０１
株を５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７
Cで２晩培養した。各培養液１．５ｍｌをエッペンドル
フチューブに取り、集菌したのち、ＬＢ培地で洗浄し
た。これらの菌体を１ｍｌのＬＢ培地に懸濁後、３種の
菌を１００μｌずつ混合し、ＬＢ培地寒天培地にまき、
２８℃で培養して、プラスミドをアグロバクテリウムに
接合伝達させた。１〜２日後に培地の一部を白金耳でか
きとり、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、２０ｍｇ／ｌハイ
グロマイシンＢ、２５ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを
含むＬＢ寒天培地上に塗布した。２８Cで２日間培養し
た後、単一コロニーを選択した。得られた形質転換体を
ＥＨＡ１０１／ｐＢＩ３５Ｓ−２２と命名した。
【０１０５】（３）無菌シロイヌナズナの栽培 シロイヌナズナ、Ｗａｓｓｉｌｅｗｓｋｉｊａ株（以
下、ＷＳ株と称す）の種子（大阪大学、新名惇彦博士よ
り提供）数１０粒を１．５mlチューブに入れ、７０％エ
タノール１mlを加え３分間放置した。続いて滅菌液（５
％次亜塩素酸ナトリウム、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００）に３分間浸し、滅菌水で５回洗浄した後に、Ｍ
ＳＯプレート（ムラシゲ−スクーグ無機塩類４．６ｇ、
ショ糖１０ｇ、１０００×ビタミンストック液１ml／リ
ットル、ｐＨ６．２）に置床した。このプレートを４℃
に２日間放置して低温処理を行い、続いて植物インキュ
ベーター（サンヨー製、ＭＬＲ−３５０ＨＴ）中に２２
℃、光強度６０００ルクス、長日条件下（明期１６時
間、暗期８時間）にて、１０日間培養した。
下、ＷＳ株と称す）の種子（大阪大学、新名惇彦博士よ
り提供）数１０粒を１．５mlチューブに入れ、７０％エ
タノール１mlを加え３分間放置した。続いて滅菌液（５
％次亜塩素酸ナトリウム、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００）に３分間浸し、滅菌水で５回洗浄した後に、Ｍ
ＳＯプレート（ムラシゲ−スクーグ無機塩類４．６ｇ、
ショ糖１０ｇ、１０００×ビタミンストック液１ml／リ
ットル、ｐＨ６．２）に置床した。このプレートを４℃
に２日間放置して低温処理を行い、続いて植物インキュ
ベーター（サンヨー製、ＭＬＲ−３５０ＨＴ）中に２２
℃、光強度６０００ルクス、長日条件下（明期１６時
間、暗期８時間）にて、１０日間培養した。
【０１０６】（４）アグロバクテリウムの感染 前記（３）で１０日間培養した上記ＷＳ株の根を数株ず
つそろえて、メスで１．５〜２．０ｃｍ程度に切りそろ
え、ＣＩＭプレート（ＭＳＯプレートに２，４−ジクロ
ロフェノキシ酢酸を終濃度０．５μg／ml、カイネチン
を０．０５μg／mlとなるように加えたもの）に置き並
べた。光強度３０００ルクス、長日条件下（１６時間明
期、８時間暗期）で２日間培養し、ＭＳ希釈液（ムラシ
ゲ−スクーグ無機塩類６．４ｇ／ｌ、ｐＨ６．３）で３
倍に希釈したものをそれぞれ１mlずつチューブに分注
し、この中にカルス化した根の切片を１０分間浸した。
これらの切片を２枚重ねた滅菌ろ紙上に並べ、余分な水
分を除き、新しいＣＩＭプレートに各々置き換えた。同
条件にて２日間共存培養した。
つそろえて、メスで１．５〜２．０ｃｍ程度に切りそろ
え、ＣＩＭプレート（ＭＳＯプレートに２，４−ジクロ
ロフェノキシ酢酸を終濃度０．５μg／ml、カイネチン
を０．０５μg／mlとなるように加えたもの）に置き並
べた。光強度３０００ルクス、長日条件下（１６時間明
期、８時間暗期）で２日間培養し、ＭＳ希釈液（ムラシ
ゲ−スクーグ無機塩類６．４ｇ／ｌ、ｐＨ６．３）で３
倍に希釈したものをそれぞれ１mlずつチューブに分注
し、この中にカルス化した根の切片を１０分間浸した。
これらの切片を２枚重ねた滅菌ろ紙上に並べ、余分な水
分を除き、新しいＣＩＭプレートに各々置き換えた。同
条件にて２日間共存培養した。
【０１０７】（５）除菌 各々の菌株が肉眼で観察できるまで十分に増殖した切片
を除菌液（ＭＳ希釈液にクラフォランを終濃度２００μ
g／mlになるように加えたもの）に移し、ゆっくり振蘯
させて６０分間洗浄した。この操作を５回繰り返した
後、これらの切片から滅菌ろ紙上で水分を取り除き、Ｓ
ＩＭＣプレート（ＭＳＯプレートに、２−ｉｐを終濃度
５μg／ml、ＩＡＡを終濃度０．１５μg／ml、クラフォ
ランを終濃度５００μg／mlとなるように加えたもの）
に置き並べ、光強度６０００ルクス、長日条件下（１６
時間明期、８時間暗期）で２日間培養した。
を除菌液（ＭＳ希釈液にクラフォランを終濃度２００μ
g／mlになるように加えたもの）に移し、ゆっくり振蘯
させて６０分間洗浄した。この操作を５回繰り返した
後、これらの切片から滅菌ろ紙上で水分を取り除き、Ｓ
ＩＭＣプレート（ＭＳＯプレートに、２−ｉｐを終濃度
５μg／ml、ＩＡＡを終濃度０．１５μg／ml、クラフォ
ランを終濃度５００μg／mlとなるように加えたもの）
に置き並べ、光強度６０００ルクス、長日条件下（１６
時間明期、８時間暗期）で２日間培養した。
【０１０８】（６）形質転換植物の選択 ２日間培養した上記切片をＳＩＭＣＳプレート（ＳＩＭ
ＣプレートにハイグロマイシンＢを終濃度４．６Ｕ／ml
となるように加えたもの）に移植し、光強度６０００ル
クス、長日条件下（１６時間明期、８時間暗期）で培養
した。以後、これらの切片を１週間毎に新しいＳＩＭＣ
Ｓプレートに移植した。形質転換した切片は増殖を続
け、ドーム状に盛り上がったカルスとなるが、非形質転
換体は褐変した。形質転換体は約２週間後、カルスが緑
色を呈し、約１カ月後、シュートが形成された。
ＣプレートにハイグロマイシンＢを終濃度４．６Ｕ／ml
となるように加えたもの）に移植し、光強度６０００ル
クス、長日条件下（１６時間明期、８時間暗期）で培養
した。以後、これらの切片を１週間毎に新しいＳＩＭＣ
Ｓプレートに移植した。形質転換した切片は増殖を続
け、ドーム状に盛り上がったカルスとなるが、非形質転
換体は褐変した。形質転換体は約２週間後、カルスが緑
色を呈し、約１カ月後、シュートが形成された。
【０１０９】（７）形質転換植物の再生 シュートとなった植物体の根本を、カルス部分を含まな
いように剃刃もしくはメスで切り取り、ＲＩＭプレート
に軽く乗せるように挿した。８〜１０日後、１〜２ｃｍ
程度の根が数本形成した植物をピンセットで、無機塩類
培地〔５ｍＭＫＮＯ3、２．５ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液
（ｐＨ５．５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ4、２ｍＭ Ｃａ
（ＮＯ3）2、５０μＭ Ｆｅ−ＥＤＴＡ、１０００×微
量要素（７０ｍＭ Ｈ3ＢＯ3、１４ｍＭ ＭｎＣｌ2、
０．５ｍＭ ＣｕＳＯ4、１ｍＭ ＺｎＳＯ4、０．２ｍ
Ｍ ＮａＭｏＯ4、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１ｍＭ
ＣｏＣｌ2）１ml／リットル〕に浸したロックウール
ミニポット（日東紡績社製）に定植し、培養した。開花
し、さや形成後は、パーライトとバーキュライト（ＴＥ
Ｓ社製）を１：１に混合し、無機塩類混合培地に浸して
調製した土壌に植え換えた。約１カ月後、１株につき数
百粒の種子が得られた。これを以後、Ｔ１種子と称す。
いように剃刃もしくはメスで切り取り、ＲＩＭプレート
に軽く乗せるように挿した。８〜１０日後、１〜２ｃｍ
程度の根が数本形成した植物をピンセットで、無機塩類
培地〔５ｍＭＫＮＯ3、２．５ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液
（ｐＨ５．５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ4、２ｍＭ Ｃａ
（ＮＯ3）2、５０μＭ Ｆｅ−ＥＤＴＡ、１０００×微
量要素（７０ｍＭ Ｈ3ＢＯ3、１４ｍＭ ＭｎＣｌ2、
０．５ｍＭ ＣｕＳＯ4、１ｍＭ ＺｎＳＯ4、０．２ｍ
Ｍ ＮａＭｏＯ4、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１ｍＭ
ＣｏＣｌ2）１ml／リットル〕に浸したロックウール
ミニポット（日東紡績社製）に定植し、培養した。開花
し、さや形成後は、パーライトとバーキュライト（ＴＥ
Ｓ社製）を１：１に混合し、無機塩類混合培地に浸して
調製した土壌に植え換えた。約１カ月後、１株につき数
百粒の種子が得られた。これを以後、Ｔ１種子と称す。
【０１１０】（８）抗生物質耐性株の取得 Ｔ１種子約１００粒を上記（３）と同様の方法で滅菌
し、ＭＳＨプレートに播種した。ほぼ３：１の割合でハ
イグロマイシンＢ耐性株が発芽した。
し、ＭＳＨプレートに播種した。ほぼ３：１の割合でハ
イグロマイシンＢ耐性株が発芽した。
【０１１１】７．ＤＮＡ抽出とサザンハイブリダイゼー
ション 発芽した上記Ｔ１種子を、無機塩類培地に浸したロック
ウールミニポットにピンセットで移植し、光強度６００
０ルクス、長日条件下（１６時間明期、８時間暗期）、
２２℃の条件下で培養した。２週間後、ロックウールの
表面をナイフで撫でるようにメスで植物の地上部を切り
取り、直ちに液体窒素で凍結した。凍結した地上部を液
体窒素存在下、乳鉢で細かく粉砕し、１ｇ当たり、３ml
のＤＮＡ抽出用緩衝液〔２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ、１％
Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、１００μg／m
lプロテナーゼＫ〕を加え、十分攪拌した。６０℃１時
間インキュベート後、遠心（１０，０００×ｇ、１０分
間）し、上清をミラクロスで濾過し、濾液を新しいチュ
ーブに移した。フェノール：クロロフォルム：イソアミ
ルアルコール（２５：２４：１）の混合液で抽出を３回
行なった後、エタノール沈殿を行った。沈殿をＴＥ緩衝
液に溶解した。それぞれ植物体約２．０ｇから、２０μ
gずつのゲノムＤＮＡが得られた。このうち、１μgのゲ
ノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII で
切断し、１％アガロース電気泳動及びサザンハイブリダ
イゼーションに供した。
ション 発芽した上記Ｔ１種子を、無機塩類培地に浸したロック
ウールミニポットにピンセットで移植し、光強度６００
０ルクス、長日条件下（１６時間明期、８時間暗期）、
２２℃の条件下で培養した。２週間後、ロックウールの
表面をナイフで撫でるようにメスで植物の地上部を切り
取り、直ちに液体窒素で凍結した。凍結した地上部を液
体窒素存在下、乳鉢で細かく粉砕し、１ｇ当たり、３ml
のＤＮＡ抽出用緩衝液〔２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ、１％
Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、１００μg／m
lプロテナーゼＫ〕を加え、十分攪拌した。６０℃１時
間インキュベート後、遠心（１０，０００×ｇ、１０分
間）し、上清をミラクロスで濾過し、濾液を新しいチュ
ーブに移した。フェノール：クロロフォルム：イソアミ
ルアルコール（２５：２４：１）の混合液で抽出を３回
行なった後、エタノール沈殿を行った。沈殿をＴＥ緩衝
液に溶解した。それぞれ植物体約２．０ｇから、２０μ
gずつのゲノムＤＮＡが得られた。このうち、１μgのゲ
ノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII で
切断し、１％アガロース電気泳動及びサザンハイブリダ
イゼーションに供した。
【０１１２】また、同様に形質転換を行っていないＷＳ
株の種子を発芽、生育させ、植物体より、同様にＤＮＡ
を抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII によ
る消化を行ない、１％アガロースゲル電気泳動及びサザ
ンハイブリダイゼーションに供した。ハイブリダイゼー
ション用プローブはｐＫＣ２２を用いた。サザンハイブ
リダイゼーションは、モレキュラー クローニング、ア
ラボラトリー マニュアル（Molecular Cloning, A L
boratory Manual ）、第９章、第３１〜５８頁〔コール
ド スプリング ハーバー（Cold Spring Harber）社、
１９８９年刊〕に記載の方法に従って行った。すなわ
ち、それぞれのＤＮＡ試料について１％アガロースゲル
電気泳動を行ない、電気泳動後、アルカリ変性を行ない
ナイロンメンブレン（ハイボンド−Ｎ、アマシャム社
製）上に一晩サザンブロットした。該メンブレンに紫外
線トランスイルミネーター（２５４ｎｍ）を３分間照射
させ、ＤＮＡを固定した。このメンブレンをプレハイブ
リダイゼーション緩衝液（５×デンハルト液、６×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳ、１０μg／mlサケ精子ＤＮＡ）５m
l中で５０℃、２時間プレハイブリダイゼーションを行
なった。次いでプローブを加え、５０℃で一晩ハイブリ
ダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーションの
後、該メンブレンを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む
洗浄液で室温にて１０分間、２回洗浄し、続いて同じ洗
浄液で５０℃、３０分間で２回洗浄した。メンブレンは
乾燥させた後、Ｘ線フィルム（コダック社製）を入れた
カセット内で−８０℃、一晩感光させ、オートラジオグ
ラフィーを行った。形質転換を行っていない株（１）、
ｐＫＣ２２を導入した形質転換体（２）、ベクターのみ
を導入した形質転換体（３）について、サザンハイブリ
ダイゼーションにより検出されたシグナルのパターンを
比較した。
株の種子を発芽、生育させ、植物体より、同様にＤＮＡ
を抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII によ
る消化を行ない、１％アガロースゲル電気泳動及びサザ
ンハイブリダイゼーションに供した。ハイブリダイゼー
ション用プローブはｐＫＣ２２を用いた。サザンハイブ
リダイゼーションは、モレキュラー クローニング、ア
ラボラトリー マニュアル（Molecular Cloning, A L
boratory Manual ）、第９章、第３１〜５８頁〔コール
ド スプリング ハーバー（Cold Spring Harber）社、
１９８９年刊〕に記載の方法に従って行った。すなわ
ち、それぞれのＤＮＡ試料について１％アガロースゲル
電気泳動を行ない、電気泳動後、アルカリ変性を行ない
ナイロンメンブレン（ハイボンド−Ｎ、アマシャム社
製）上に一晩サザンブロットした。該メンブレンに紫外
線トランスイルミネーター（２５４ｎｍ）を３分間照射
させ、ＤＮＡを固定した。このメンブレンをプレハイブ
リダイゼーション緩衝液（５×デンハルト液、６×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳ、１０μg／mlサケ精子ＤＮＡ）５m
l中で５０℃、２時間プレハイブリダイゼーションを行
なった。次いでプローブを加え、５０℃で一晩ハイブリ
ダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーションの
後、該メンブレンを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む
洗浄液で室温にて１０分間、２回洗浄し、続いて同じ洗
浄液で５０℃、３０分間で２回洗浄した。メンブレンは
乾燥させた後、Ｘ線フィルム（コダック社製）を入れた
カセット内で−８０℃、一晩感光させ、オートラジオグ
ラフィーを行った。形質転換を行っていない株（１）、
ｐＫＣ２２を導入した形質転換体（２）、ベクターのみ
を導入した形質転換体（３）について、サザンハイブリ
ダイゼーションにより検出されたシグナルのパターンを
比較した。
【０１１３】形質転換体（２）には、（１）、（２）、
（３）共通の内在性のシグナルのほかに、ＥｃｏＲＩで
切断したサンプルでは約１．６ｋｂｐと０．７ｋｂｐ、
ＨｉｎｄIII で切断したサンプルでは約６ｋｂｐの位置
に、特異的なシグナルが観察され、目的遺伝子が形質転
換（２）に組み込まれていることが観察された。
（３）共通の内在性のシグナルのほかに、ＥｃｏＲＩで
切断したサンプルでは約１．６ｋｂｐと０．７ｋｂｐ、
ＨｉｎｄIII で切断したサンプルでは約６ｋｂｐの位置
に、特異的なシグナルが観察され、目的遺伝子が形質転
換（２）に組み込まれていることが観察された。
【０１１４】
配列番号：１ 配列の長さ：1035 配列の形：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：ゴシピウム バルバデンセ（Gossypium barbad
ense） 組織の種類：ワタ繊維 直接の起源 ライブラリー名：ワタ繊維組織由来ｃＤＮＡライブラリ
ー クローン名：ＫＣ２２ 配列 CAATAATTCT CTCTGTTTCT CTGGTTTAAA CATGGGTATG GGTTTAAGGA ATGGATTTCT 60 TTTGATTTTA TCTTGTGTTG TTACACTTTC CCTCTCAGTT TTGGGGCGAC CTGCCACTTT 120 CCTTGAAGAT TTTAGAATCA CTTGGTCTGA TTCTCATATT AGGCAAATCG ATGGAGGGAG 180 AGCCATCCAA CTTGTTCTCG ACCAAAATTC AGGCTGTGGA TTTGCTTCTA AAAGGCAGTA 240 TTTGTTCGGA CGTGTCAGCA TGAAAATCAA GCTCATCCCC GGCGACTCCG CCGGAACAGT 300 CACCGCCTTT TATATGAATT CTGTTACAGA TGCTGTGCGA GATGAGCTAG ACTTCGAGTT 360 CTTGGGAAAC CGTACCGGGC AGCCATATAC GGTTCAAACC AATATCTATG CCCATGGAAA 420 GGGTGACAGG GAACAAAGGG TTAACCTTTG GTTCGATCCT GCTGCAGATT TCCATACTTA 480 CTCAATCATG TGGAACCATC ATCAGATTGT GTTCTATATT GATGAAGTGC CAATTAGGGT 540 TTATAAGAAC AATGAAGCTA GAAATATCCC ATACCCAAAA CTCCAGCCAA TGGGAGTTTA 600 TTCAACGCTG TGGGAGGCTG ATGATTGGGC AACAAGGGGA GGTTTAGAGA AAATTGATTG 660 GACCAAAGCT CCGTTCTTAG CTTATTACAA GGACTTCGAC ATTGAAGGAT GTCCGGTTCC 720 AGGGCCAGTA AACTGTGCCA CAAACAGTAG GAACTGGTGG GAGGGCACTG CTTATCAAGC 780 CCTTAATGCC ATGGAAGCTA AAAGATATAG TTGGGTTCGT ATGAACCACG TGATATACGA 840 TTACTGCACC GACAAGTCCC GTTACCCGGT TACCCCACCG GAGTGCATGT CCATCATCTG 900 AAAATCCAAA CCCAAGTGAA GTTTCGTGTC CTATTTTACG TACATATGTA CCTCCCTTTA 960 TACAAATAAT AGAGCCATGC AAAAATTGGG TTTTAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1020 AAAAAAAAAA AAAAA 1035
ense） 組織の種類：ワタ繊維 直接の起源 ライブラリー名：ワタ繊維組織由来ｃＤＮＡライブラリ
ー クローン名：ＫＣ２２ 配列 CAATAATTCT CTCTGTTTCT CTGGTTTAAA CATGGGTATG GGTTTAAGGA ATGGATTTCT 60 TTTGATTTTA TCTTGTGTTG TTACACTTTC CCTCTCAGTT TTGGGGCGAC CTGCCACTTT 120 CCTTGAAGAT TTTAGAATCA CTTGGTCTGA TTCTCATATT AGGCAAATCG ATGGAGGGAG 180 AGCCATCCAA CTTGTTCTCG ACCAAAATTC AGGCTGTGGA TTTGCTTCTA AAAGGCAGTA 240 TTTGTTCGGA CGTGTCAGCA TGAAAATCAA GCTCATCCCC GGCGACTCCG CCGGAACAGT 300 CACCGCCTTT TATATGAATT CTGTTACAGA TGCTGTGCGA GATGAGCTAG ACTTCGAGTT 360 CTTGGGAAAC CGTACCGGGC AGCCATATAC GGTTCAAACC AATATCTATG CCCATGGAAA 420 GGGTGACAGG GAACAAAGGG TTAACCTTTG GTTCGATCCT GCTGCAGATT TCCATACTTA 480 CTCAATCATG TGGAACCATC ATCAGATTGT GTTCTATATT GATGAAGTGC CAATTAGGGT 540 TTATAAGAAC AATGAAGCTA GAAATATCCC ATACCCAAAA CTCCAGCCAA TGGGAGTTTA 600 TTCAACGCTG TGGGAGGCTG ATGATTGGGC AACAAGGGGA GGTTTAGAGA AAATTGATTG 660 GACCAAAGCT CCGTTCTTAG CTTATTACAA GGACTTCGAC ATTGAAGGAT GTCCGGTTCC 720 AGGGCCAGTA AACTGTGCCA CAAACAGTAG GAACTGGTGG GAGGGCACTG CTTATCAAGC 780 CCTTAATGCC ATGGAAGCTA AAAGATATAG TTGGGTTCGT ATGAACCACG TGATATACGA 840 TTACTGCACC GACAAGTCCC GTTACCCGGT TACCCCACCG GAGTGCATGT CCATCATCTG 900 AAAATCCAAA CCCAAGTGAA GTTTCGTGTC CTATTTTACG TACATATGTA CCTCCCTTTA 960 TACAAATAAT AGAGCCATGC AAAAATTGGG TTTTAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1020 AAAAAAAAAA AAAAA 1035
【０１１５】配列番号：２ 配列の長さ：289 配列の形：アミノ酸配列 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ゴシピウム バルバデンセ（Gossypium barbad
ense） 組織の種類：ワタ繊維 直接の起源 ライブラリー名：ワタ繊維組織由来ｃＤＮＡライブラリ
ー クローン名：ＫＣ２２ 配列 Met Gly Met Gly Leu Arg Asn Gly Phe Leu Leu Ile Leu Ser Cys 5 10 15 Val Val Thr Leu Ser Leu Ser Val Leu Gly Arg Pro Ala Thr Phe 20 25 30 Leu Glu Asp Phe Arg Ile Thr Trp Ser Asp Ser His Ile Arg Gln 35 40 45 Ile Asp Gly Gly Arg Ala Ile Gln Leu Val Leu Asp Gln Asn Ser 50 55 60 Gly Cys Gly Phe Ala Ser Lys Arg Gln Tyr Leu Phe Gly Arg Val 65 70 75 Ser Met Lys Ile Lys Leu Ile Pro Gly Asp Ser Ala Gly Thr Val 80 85 90 Thr Ala Phe Tyr Met Asn Ser Val Thr Asp Ala Val Arg Asp Glu 95 100 105 Leu Asp Phe Glu Phe Leu Gly Asn Arg Thr Gly Gln Pro Tyr Thr 110 115 120 Val Gln Thr Asn Ile Tyr Ala His Gly Lys Gly Asp Arg Glu Gln 125 130 135 Arg Val Asn Leu Trp Phe Asp Pro Ala Ala Asp Phe His Thr Tyr 140 145 150 Ser Ile Met Trp Asn His His Gln Ile Val Phe Tyr Ile Asp Glu 155 160 165 Val Pro Ile Arg Val Tyr Lys Asn Asn Glu Ala Arg Asn Ile Pro 170 175 180 Tyr Pro Lys Leu Gln Pro Met Gly Val Tyr Ser Thr Leu Trp Glu 185 190 195 Ala Asp Asp Trp Ala Thr Arg Gly Gly Leu Glu Lys Ile Asp Trp 200 205 210 Thr Lys Ala Pro Phe Leu Ala Tyr Tyr Lys Asp Phe Asp Ile Glu 215 220 225 Gly Cys Pro Val Pro Gly Pro Val Asn Cys Ala Thr Asn Ser Arg 230 235 240 Asn Trp Trp Glu Gly Thr Ala Tyr Gln Ala Leu Asn Ala Met Glu 245 250 255 Ala Lys Arg Tyr Ser Trp Val Arg Met Asn His Val Ile Tyr Asp 260 265 270 Tyr Cys Thr Asp Lys Ser Arg Tyr Pro Val Thr Pro Pro Glu Cys 275 280 285 Met Ser Ile Ile 289
ense） 組織の種類：ワタ繊維 直接の起源 ライブラリー名：ワタ繊維組織由来ｃＤＮＡライブラリ
ー クローン名：ＫＣ２２ 配列 Met Gly Met Gly Leu Arg Asn Gly Phe Leu Leu Ile Leu Ser Cys 5 10 15 Val Val Thr Leu Ser Leu Ser Val Leu Gly Arg Pro Ala Thr Phe 20 25 30 Leu Glu Asp Phe Arg Ile Thr Trp Ser Asp Ser His Ile Arg Gln 35 40 45 Ile Asp Gly Gly Arg Ala Ile Gln Leu Val Leu Asp Gln Asn Ser 50 55 60 Gly Cys Gly Phe Ala Ser Lys Arg Gln Tyr Leu Phe Gly Arg Val 65 70 75 Ser Met Lys Ile Lys Leu Ile Pro Gly Asp Ser Ala Gly Thr Val 80 85 90 Thr Ala Phe Tyr Met Asn Ser Val Thr Asp Ala Val Arg Asp Glu 95 100 105 Leu Asp Phe Glu Phe Leu Gly Asn Arg Thr Gly Gln Pro Tyr Thr 110 115 120 Val Gln Thr Asn Ile Tyr Ala His Gly Lys Gly Asp Arg Glu Gln 125 130 135 Arg Val Asn Leu Trp Phe Asp Pro Ala Ala Asp Phe His Thr Tyr 140 145 150 Ser Ile Met Trp Asn His His Gln Ile Val Phe Tyr Ile Asp Glu 155 160 165 Val Pro Ile Arg Val Tyr Lys Asn Asn Glu Ala Arg Asn Ile Pro 170 175 180 Tyr Pro Lys Leu Gln Pro Met Gly Val Tyr Ser Thr Leu Trp Glu 185 190 195 Ala Asp Asp Trp Ala Thr Arg Gly Gly Leu Glu Lys Ile Asp Trp 200 205 210 Thr Lys Ala Pro Phe Leu Ala Tyr Tyr Lys Asp Phe Asp Ile Glu 215 220 225 Gly Cys Pro Val Pro Gly Pro Val Asn Cys Ala Thr Asn Ser Arg 230 235 240 Asn Trp Trp Glu Gly Thr Ala Tyr Gln Ala Leu Asn Ala Met Glu 245 250 255 Ala Lys Arg Tyr Ser Trp Val Arg Met Asn His Val Ile Tyr Asp 260 265 270 Tyr Cys Thr Asp Lys Ser Arg Tyr Pro Val Thr Pro Pro Glu Cys 275 280 285 Met Ser Ile Ile 289
【０１１６】配列番号：３ 配列の長さ：1035 配列の形：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：ゴシピウム バルバデンセ（Gossypium barbad
ense） 組織の種類：ワタ繊維 直接の起源 ライブラリー名：ワタ繊維組織由来ｃＤＮＡライブラリ
ー クローン名：ＫＣ２２ 配列 CAATAATTCT CTCTGTTTCT CTGGTTTAAA C ATG GGT ATG GGT TTA AGG AAT 52 Met Gly Met Gly Leu Arg Asn 1 5 GGA TTT CTT TTG ATT TTA TCT TGT GTT GTT ACA CTT TCC CTC TCA GTT 100 Gly Phe Leu Leu Ile Leu Ser Cys Val Val Thr Leu Ser Leu Ser Val 10 15 20 TTG GGG CGA CCT GCC ACT TTC CTT GAA GAT TTT AGA ATC ACT TGG TCT 148 Leu Gly Arg Pro Ala Thr Phe Leu Glu Asp Phe Arg Ile Thr Trp Ser 25 30 35 GAT TCT CAT ATT AGG CAA ATC GAT GGA GGG AGA GCC ATC CAA CTT GTT 196 Asp Ser His Ile Arg Gln Ile Asp Gly Gly Arg Ala Ile Gln Leu Val 40 45 50 55 CTC GAC CAA AAT TCA GGC TGT GGA TTT GCT TCT AAA AGG CAG TAT TTG 244 Leu Asp Gln Asn Ser Gly Cys Gly Phe Ala Ser Lys Arg Gln Tyr Leu 60 65 70 TTC GGA CGT GTC AGC ATG AAA ATC AAG CTC ATC CCC GGC GAC TCC GCC 292 Phe Gly Arg Val Ser Met Lys Ile Lys Leu Ile Pro Gly Asp Ser Ala 75 80 85 GGA ACA GTC ACC GCC TTT TAT ATG AAT TCT GTT ACA GAT GCT GTG CGA 340 Gly Thr Val Thr Ala Phe Tyr Met Asn Ser Val Thr Asp Ala Val Arg 90 95 100 GAT GAG CTA GAC TTC GAG TTC TTG GGA AAC CGT ACC GGG CAG CCA TAT 388 Asp Glu Leu Asp Phe Glu Phe Leu Gly Asn Arg Thr Gly Gln Pro Tyr 105 110 115 ACG GTT CAA ACC AAT ATC TAT GCC CAT GGA AAG GGT GAC AGG GAA CAA 436 Thr Val Gln Thr Asn Ile Tyr Ala His Gly Lys Gly Asp Arg Glu Gln 120 125 130 135 AGG GTT AAC CTT TGG TTC GAT CCT GCT GCA GAT TTC CAT ACT TAC TCA 484 Arg Val Asn Leu Trp Phe Asp Pro Ala Ala Asp Phe His Thr Tyr Ser 140 145 150 ATC ATG TGG AAC CAT CAT CAG ATT GTG TTC TAT ATT GAT GAA GTG CCA 532 Ile Met Trp Asn His His Gln Ile Val Phe Tyr Ile Asp Glu Val Pro 155 160 165 ATT AGG GTT TAT AAG AAC AAT GAA GCT AGA AAT ATC CCA TAC CCA AAA 580 Ile Arg Val Tyr Lys Asn Asn Glu Ala Arg Asn Ile Pro Tyr Pro Lys 170 175 180 CTC CAG CCA ATG GGA GTT TAT TCA ACG CTG TGG GAG GCT GAT GAT TGG 628 Leu Gln Pro Met Gly Val Tyr Ser Thr Leu Trp Glu Ala Asp Asp Trp 185 190 195 GCA ACA AGG GGA GGT TTA GAG AAA ATT GAT TGG ACC AAA GCT CCG TTC 676 Ala Thr Arg Gly Gly Leu Glu Lys Ile Asp Trp Thr Lys Ala Pro Phe 200 205 210 215 TTA GCT TAT TAC AAG GAC TTC GAC ATT GAA GGA TGT CCG GTT CCA GGG 724 Leu Ala Tyr Tyr Lys Asp Phe Asp Ile Glu Gly Cys Pro Val Pro Gly 220 225 230 CCA GTA AAC TGT GCC ACA AAC AGT AGG AAC TGG TGG GAG GGC ACT GCT 772 Pro Val Asn Cys Ala Thr Asn Ser Arg Asn Trp Trp Glu Gly Thr Ala 235 240 245 TAT CAA GCC CTT AAT GCC ATG GAA GCT AAA AGA TAT AGT TGG GTT CGT 820 Tyr Gln Ala Leu Asn Ala Met Glu Ala Lys Arg Tyr Ser Trp Val Arg 250 255 260 ATG AAC CAC GTG ATA TAC GAT TAC TGC ACC GAC AAG TCC CGT TAC CCG 868 Met Asn His Val Ile Tyr Asp Tyr Cys Thr Asp Lys Ser Arg Tyr Pro 265 270 275 GTT ACC CCA CCG GAG TGC ATG TCC ATC ATC TGAAAATCCA AACCCAAGTG 918 Val Thr Pro Pro Glu Cys Met Ser Ile Ile 280 285 AAGTTTCGTG TCCTATTTTA CGTACATATG TACCTCCCTT TATACAAATA ATAGAGCCAT 978 GCAAAAATTG GGTTTTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 1035
ense） 組織の種類：ワタ繊維 直接の起源 ライブラリー名：ワタ繊維組織由来ｃＤＮＡライブラリ
ー クローン名：ＫＣ２２ 配列 CAATAATTCT CTCTGTTTCT CTGGTTTAAA C ATG GGT ATG GGT TTA AGG AAT 52 Met Gly Met Gly Leu Arg Asn 1 5 GGA TTT CTT TTG ATT TTA TCT TGT GTT GTT ACA CTT TCC CTC TCA GTT 100 Gly Phe Leu Leu Ile Leu Ser Cys Val Val Thr Leu Ser Leu Ser Val 10 15 20 TTG GGG CGA CCT GCC ACT TTC CTT GAA GAT TTT AGA ATC ACT TGG TCT 148 Leu Gly Arg Pro Ala Thr Phe Leu Glu Asp Phe Arg Ile Thr Trp Ser 25 30 35 GAT TCT CAT ATT AGG CAA ATC GAT GGA GGG AGA GCC ATC CAA CTT GTT 196 Asp Ser His Ile Arg Gln Ile Asp Gly Gly Arg Ala Ile Gln Leu Val 40 45 50 55 CTC GAC CAA AAT TCA GGC TGT GGA TTT GCT TCT AAA AGG CAG TAT TTG 244 Leu Asp Gln Asn Ser Gly Cys Gly Phe Ala Ser Lys Arg Gln Tyr Leu 60 65 70 TTC GGA CGT GTC AGC ATG AAA ATC AAG CTC ATC CCC GGC GAC TCC GCC 292 Phe Gly Arg Val Ser Met Lys Ile Lys Leu Ile Pro Gly Asp Ser Ala 75 80 85 GGA ACA GTC ACC GCC TTT TAT ATG AAT TCT GTT ACA GAT GCT GTG CGA 340 Gly Thr Val Thr Ala Phe Tyr Met Asn Ser Val Thr Asp Ala Val Arg 90 95 100 GAT GAG CTA GAC TTC GAG TTC TTG GGA AAC CGT ACC GGG CAG CCA TAT 388 Asp Glu Leu Asp Phe Glu Phe Leu Gly Asn Arg Thr Gly Gln Pro Tyr 105 110 115 ACG GTT CAA ACC AAT ATC TAT GCC CAT GGA AAG GGT GAC AGG GAA CAA 436 Thr Val Gln Thr Asn Ile Tyr Ala His Gly Lys Gly Asp Arg Glu Gln 120 125 130 135 AGG GTT AAC CTT TGG TTC GAT CCT GCT GCA GAT TTC CAT ACT TAC TCA 484 Arg Val Asn Leu Trp Phe Asp Pro Ala Ala Asp Phe His Thr Tyr Ser 140 145 150 ATC ATG TGG AAC CAT CAT CAG ATT GTG TTC TAT ATT GAT GAA GTG CCA 532 Ile Met Trp Asn His His Gln Ile Val Phe Tyr Ile Asp Glu Val Pro 155 160 165 ATT AGG GTT TAT AAG AAC AAT GAA GCT AGA AAT ATC CCA TAC CCA AAA 580 Ile Arg Val Tyr Lys Asn Asn Glu Ala Arg Asn Ile Pro Tyr Pro Lys 170 175 180 CTC CAG CCA ATG GGA GTT TAT TCA ACG CTG TGG GAG GCT GAT GAT TGG 628 Leu Gln Pro Met Gly Val Tyr Ser Thr Leu Trp Glu Ala Asp Asp Trp 185 190 195 GCA ACA AGG GGA GGT TTA GAG AAA ATT GAT TGG ACC AAA GCT CCG TTC 676 Ala Thr Arg Gly Gly Leu Glu Lys Ile Asp Trp Thr Lys Ala Pro Phe 200 205 210 215 TTA GCT TAT TAC AAG GAC TTC GAC ATT GAA GGA TGT CCG GTT CCA GGG 724 Leu Ala Tyr Tyr Lys Asp Phe Asp Ile Glu Gly Cys Pro Val Pro Gly 220 225 230 CCA GTA AAC TGT GCC ACA AAC AGT AGG AAC TGG TGG GAG GGC ACT GCT 772 Pro Val Asn Cys Ala Thr Asn Ser Arg Asn Trp Trp Glu Gly Thr Ala 235 240 245 TAT CAA GCC CTT AAT GCC ATG GAA GCT AAA AGA TAT AGT TGG GTT CGT 820 Tyr Gln Ala Leu Asn Ala Met Glu Ala Lys Arg Tyr Ser Trp Val Arg 250 255 260 ATG AAC CAC GTG ATA TAC GAT TAC TGC ACC GAC AAG TCC CGT TAC CCG 868 Met Asn His Val Ile Tyr Asp Tyr Cys Thr Asp Lys Ser Arg Tyr Pro 265 270 275 GTT ACC CCA CCG GAG TGC ATG TCC ATC ATC TGAAAATCCA AACCCAAGTG 918 Val Thr Pro Pro Glu Cys Met Ser Ile Ile 280 285 AAGTTTCGTG TCCTATTTTA CGTACATATG TACCTCCCTT TATACAAATA ATAGAGCCAT 978 GCAAAAATTG GGTTTTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 1035
【図１】ブラシノライド処理をしたリガンリントレス２
（Gossypium hirsutum) の生物の形態を示す写真であ
る。
（Gossypium hirsutum) の生物の形態を示す写真であ
る。
【図２】ブラシノライド処理をしたリガンリントレス２
（Gossypium hirsutum) の生物の形態を示す写真であ
る。
（Gossypium hirsutum) の生物の形態を示す写真であ
る。
【図３】ブラシノライド処理をしたコーカー３１２ (Go
ssypium hirstum)の生物の形態を示す写真である。
ssypium hirstum)の生物の形態を示す写真である。
【図４】プラスミドｐＢＩ３５Ｓ−２２の構築を示す図
である。
である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年２月２８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/01 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ 15/09 ＺＮＡ 9162−4Ｂ 15/00 Ｅ // Ｃ０７Ｊ 73/00 9162−4Ｂ ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 藤澤 浩一 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内 (72)発明者 西口 進 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内 (72)発明者 前川 宣彦 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内 (72)発明者 ランディ アレン アメリカ合衆国 テキサス州 ラブボッ ク，フォーティース ストリート 3104番 地
Claims (25)
- 【請求項１】 ゴシピウム(Gossypium) 属に属するワタ
植物を種子形態において、または生育過程において、ブ
ラシノステロイドで処理し、ワタ植物を生長させてワタ
朔果を得、さらに該植物の該ワタ朔果からワタ繊維を採
取することを特徴とする改良された繊維特性を有するワ
タ繊維の製造方法。 - 【請求項２】 ゴシピウム(Gossypium) 属のワタ植物
が、ゴシピウム・ヒルスツム(G.hirsutum)、ゴシピウム
・バルバデンセ(G.barbadense)、ゴシピウム・アルボレ
ウム(G.arboreum)、ゴシピウム・アノマルム(G.anomalu
m)、ゴシピウム・アルムリアヌム(G.armourianum) 、ゴ
シピウム・クロッツキアヌム(G.klotzchianum)、および
ゴシピウム・レモンデイ(G.raimondii) からなる群から
選ばれたものである請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 ワタ植物の種子をブラシノステロイドで
処理する請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 生長するワタ植物をブラシノステロイド
で処理する請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 生長するワタ植物を部分的にブラシノス
テロイドで処理する請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 処理されるべきワタ植物の部分が、蕾、
花、胚珠、子房、苞、葉、茎、根、果梗および未成熟の
朔果から選択される請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 開花後のワタ植物の子房をブライノステ
ロイドで処理する請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 ブラシノステロイドがブラシノライド、
ドリコライド、ホモドリコライド、２４−エピブラシノ
ライド、２８−ノルブラシノライド、カスタステロン、
ドリコステロン、ホモドリコステロン、ホモカスタステ
ロン、２８−ノルカスタステロン、ティファステロー
ル、テアステロール、２４−エピカスタステロン、２−
エピカスタステロン、３−エピカスタステロン、３，２
４−ジエピカスタステロン、２５−メチルドリコステロ
ン、２−エピ−２５−メチルドリコステロン、２，３−
ジエピ−２５−メチルドリコステロン、６−デオキソカ
スタステロン、６−デオキソドリコステロンおよび６−
デオキソホモドリコステロンからなる群から選ばれた化
合物である請求項１記載の方法。 - 【請求項９】 ブラシノステロイドを含む組成物が、液
状、ペースト状、粉末、あるいは粒状である請求項１記
載の方法。 - 【請求項１０】 ブラシノステロイドが組成物中、１×
１０-8〜１００ｐｐｍの濃度で含まれる請求項９記載の
方法。 - 【請求項１１】 請求項１記載の方法によって生産され
たワタ繊維。 - 【請求項１２】 ゴシピウム(Gossypium) 属に属するワ
タ植物の胚珠をブラシノステロイド含有液体培地中で培
養し、培養された胚珠からワタ繊維を採取することを特
徴とする改良された繊維特性を有するワタ繊維の製造
法。 - 【請求項１３】 ゴシピウム(Gossypium) 属のワタ植物
が、ゴシピウム・ヒルスツム(G.hirsutum)、ゴシピウム
・バルバデンセ(G.barbadense)、ゴシピウム・アルボレ
ウム(G.arboreum)、ゴシピウム・アノマルム(G.anomalu
m)、ゴシピウム・アルムリアヌム(G.armourianum) 、ゴ
シピウム・クロッツキアヌム(G.klotzchianum)、および
ゴシピウム・レモンデイ(G.raimondii) からなる群から
選ばれたものである請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 ブラシノステロイドがブラシノライ
ド、ドリコライド、ホモドリコライド、２４−エピブラ
シノライド、２８−ノルブラシノライド、カスタステロ
ン、ドリコステロン、ホモドリコステロン、ホモカスタ
ステロン、２８−ノルカスタステロン、ティファステロ
ール、テアステロール、２４−エピカスタステロン、２
−エピカスタステロン、３−エピカスタステロン、３，
２４−ジエピカスタステロン、２５−メチルドリコステ
ロン、２−エピ−２５−メチルドリコステロン、２，３
−ジエピ−２５−メチルドリコステロン、６−デオキソ
カスタステロン、６−デオキソドリコステロンおよび６
−デオキソホモドリコステロンからなる群から選ばれた
化合物である請求項１２記載の方法。 - 【請求項１５】 ブラシノステロイドを含む液体培地
が、ムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）、ギャンボー
グ（Ｂ５）、シェンク・アンド・ヒルデブラント（Ｓ
Ｈ）、ホワイト（Ｗ）、リンズマイヤー・アンド・スク
ーグ（ＬＳ）およびビスレイ・アンド・チンク（ＢＴ）
培地からなる群から選ばれた培地である請求項第１２項
記載の方法。 - 【請求項１６】 ブラシノステロイドが組成物中、１×
１０-8〜１００ｐｐｍの濃度で含まれる請求項１２記載
の方法。 - 【請求項１７】 請求項１２記載の方法によって生産さ
れたワタ繊維。 - 【請求項１８】 ワタ植物を種子形態においてまたは生
育過程において、ブラシノステロイドで処理することを
特徴とするワタ植物中で特定の遺伝子を発現させて、改
良された繊維特性を有するワタ繊維を生産する方法。 - 【請求項１９】 ゴシピウム(Gossypium) 属の植物が、
ゴシピウム・ヒルスツム(G.hirsutum)、ゴシピウム・バ
ルバデンセ(G.barbadense)、ゴシピウム・アルボレウム
(G.arboreum)、ゴシピウム・アノマルム(G.anomalum)、
ゴシピウム・アルムリアヌム(G.armourianum) 、ゴシピ
ウム・クロッツキアヌム(G.klotzchianum)、およびゴシ
ピウム・レモンデイ(G.raimondii) からなる群から選ば
れたものである請求項１８記載の方法。 - 【請求項２０】 ブラシノステロイドがブラシノライ
ド、ドリコライド、ホモドリコライド、２４−エピブラ
シノライド、２８−ノルブラシノライド、カスタステロ
ン、ドリコステロン、ホモドリコステロン、ホモカスタ
ステロン、２８−ノルカスタステロン、ティファステロ
ール、テアステロール、２４−エピカスタステロン、２
−エピカスタステロン、３−エピカスタステロン、３，
２４−ジエピカスタステロン、２５−メチルドリコステ
ロン、２−エピ−２５−メチルドリコステロン、２，３
−ジエピ−２５−メチルドリコステロン、６−デオキソ
カスタステロン、６−デオキソドリコステロンおよび６
−デオキソホモドリコステロンからなる群から選ばれた
化合物である請求項１８記載の方法。 - 【請求項２１】 ブラシノステロイドを含む組成物が、
液状、ペースト状、粉末、あるいは粒状である請求項１
８記載の方法。 - 【請求項２２】 ブラシノステロイドが組成物中、１×
１０-8〜１００ｐｐｍの濃度で含まれる請求項２１記載
の方法。 - 【請求項２３】 特定遺伝子の少なくとも１つが配列表
・配列番号１に記載の塩基配列を含む請求項１８の方
法。 - 【請求項２４】 請求項１８の方法によって得られたワ
タ植物。 - 【請求項２５】 請求項１８の方法によって得られたワ
タ種子。
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|---|---|---|---|
| US08/391,696 US5880110A (en) | 1995-02-21 | 1995-02-21 | Production of cotton fibers with improved fiber characteristics by treatment with brassinosteroids |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5880110A (ja) |
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