JP2000300098A - Ｃｕｃｕｍｉｓｍｅｌｏ（マスクメロン）種に属する遺伝子導入植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ウリ属、特にメロンに属する植物の遺伝子導
入植物であって、例えばマスクメロン種に属する植物内
にキュウリモザイク病ウイルスに対する抵抗性遺伝子を
導入した遺伝子導入植物を提供する。 【解決手段】 マスクメロン種に属する表現型が正常な
遺伝子導入植物であって、アグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンスの媒介によって導入された少なくとも１つの
ＤＮＡ配列を含む遺伝子導入植物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ウリ属特にメロン
（マスクメロン Cucumis melo）に属する植物の遺伝子
的形質転換方法に関する。かかる方法には、アグロバク
テリウム・ツメファシエンスによる外植体の形質転換及
び形質転換された植物の生体外（in vitro）の再生が関
与している。

【０００２】かかる形質転換及び再生技術は、例えばマ
スクメロン種に属する植物内にキュウリモザイク病ウイ
ルスに対する抵抗性遺伝子を導入するために用いること
ができる。

【０００３】

【従来の技術】１植物種の遺伝子特性をもう１つの植物
種に移入することは、数多くの場合において非適合性と
いう障害によって制限されている。

【０００４】かかる問題は特にカボチャ（Cucurbitacea
e）科、ウリ（Cucumis）属（メロン及びキュウリ）及び
カボチャ属（セイヨウカボチャ）について見られるもの
である。したがって、野生種に存在するウイルス性疾病
又は害虫に対する抵抗性といった作物学的に有利な性質
は、一栽培種には移入することができない。

【０００５】ウリ属の栽培種の中で可能な唯一の性交配
は、C. sativus（キュウリ）とその類似種であるC. har
dwickii及びC. sikkimensis間のものである（Deakin
他、１９７１年；Van Raamsdonk、１９８９年）。C. sa
tivusとその他の野生種の間の交配はほとんどの場合に
おいて、不稔の実しか与えないだろう；ただしメロン
（Cucumis melo）は、他のいかなる種とも交配され得な
い種である（Kho他、１９８０年；Van Raamsdonk、１９
８９年）。

【０００６】遺伝子工学の新しい技術の応用は、植物種
の改良を目的とした新しい性質の導入のための将来性あ
る代替案である。これらの技術の中には、外来（異質）
の単数又は複数の遺伝子の導入、原形質体の融合による
体細胞交雑及びソマクローナル変化の誘導又は遺伝子的
変更を誘導するための突然変異などがある。

【０００７】植物種内への外来遺伝子の移入は、無防備
のＴｉプラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファ
シエンスの菌株を用いることによってかなり一般的な形
で行なわれている（Fraley他、１９８６年）（Klee他、
１９８７年）（Horsch他、１９８５年）。実際、アグロ
バクテリウム・ツメファシエンスを用いてさまざまな遺
伝子導入植物が得られた。この細菌は、形質転換された
植物を再生することのできる植物細胞に外来遺伝子を移
入することを可能にする。有利な作物学上の性質をコー
ドする遺伝子が、植物種内に導入された。こうして、除
草剤（Degreef他、１９８９年）及び害虫（Hilder他、
１９８７年；Vaeck他、１９８７年）に対する抵抗性を
もつ植物を得ることができた。

【０００８】遺伝子の移入は、中間ベクターを用いるこ
とにより相同組換えの後、無防備のＴｉプラスミドから
（Fraley他、１９８５年）もしくは無防備のＴｉプラス
ミドを用いて二元ベクターから（Bevan、１９８４年；F
raley他、１９８６年）行うことができる。

【０００９】かかる遺伝子移入は同様に、形質転換され
た組織から遺伝子導入植物の代わりに根を誘導するよう
な側根を生じるアグロバクテリウムを用いることによっ
ても行うことができる。これらの形質転換された根か
ら、異常な表現型をもつ植物を再生することができる
（Chilton他、１９８２年、David他、１９８４年）。

【００１０】特に有利な性質は、ウイルス性の疾病に対
する抵抗性である。さまざまなウイルスに対する抵抗性
を持つ遺伝子的に形質転換された植物が得られた（Powe
ll Abel他、１９８６年）（Cuozzo他、１９８８年）（T
umer他、１９８７年）（Hoekema他、１９８９年）（Van
Dun & Bol、１９８８年）。これらの植物（タバコ、ジ
ャガイモ及びトマト）は、かかる植物が抵抗性を有する
ウイルスのカプシドタンパク質をコードする遺伝子を発
現する。保護のメカニズムは今だに立証されていない。

【００１１】ウイルス性疾病に対して植物を保護するた
めの古典的な方法は、より有害な菌株による感染を予防
するため、ウイルスの弱毒化された菌株を植物に接種す
ることから成る。交差保護と呼ばれるこの実践方法によ
ると、ウイルス感染に起因する生産量の損失を軽減する
ことができた。（Broadbent、１９７６年）（Fernow、
１９６７年）（Costa & Miller、１９８０年）。

【００１２】遺伝子工学技術を応用するためには、培養
された個々の細胞又は外植体からの植物の再生システム
が必要不可欠である。

【００１３】かかる方法は最近、形質転換されていない
カボチャ（Cucurbitaceaes）の再生について開示され
た。

【００１４】子葉からのカルス（癒合組織）上の不定芽
の誘導後のキュウリ（Cucumis sativus）の再生が記述
された（Msikita他、１９８８年、Kim他、１９８８
年）；Wehner及びLocy（１９８１年）はすでに、子葉上
の芽の誘導について記述していた。キュウリの植物は、
体細胞胚形成によって再生させることができた。これら
の体細胞胚は、葉の外植体（Chee及びTricoli、１９８
８年）又は胚軸（Rajasekaran他、１９８３年）から発
達させられたカルスからの細胞懸濁液内で、もしくは子
葉カルス（Cade他、１９８８年）又は葉のカルス（Male
pszy及びNadolska-Orczyk、１９８３年）上で直接発達
させられた。上述の全てのケースにおいて該材料には、
カルス発生及び細胞異分化の段階を通過することが必要
であった。カルス発生段階を長時間通ると、望ましくな
いソマコローナル変化が誘導されうる。或る種の場合、
これらの変化は、再生された植物における不稔性を誘発
する可能性がある。

【００１５】メロン（C. melo）に関しては、器官形成
による再生については、すでに、培養に付された子葉に
対し直接的に（Smith他、１９８８年；Niedz他、印刷
中；Dirks及びVan Buggenum、１９８９年）；又は、子
葉からのカルスを通過した後に（Mackay他、１９８８
年；Moreno他、１９８５年；Orts他、１９８７年；Boua
bdallah及びBranchard、１９８６年）、胚軸からのカル
スの通過後（Abak及びDumas de Vaulx、１９８０年、Ka
thal他、１９８６年）又は葉からのカルスの通過後（Ka
thal他、１９８８年）に行なうものとして記述された。

【００１６】体細胞胚からのメロンの植物の獲得につい
ても同様に報告されている（Oridate及び Oosawa、１９
８６年；Branchard及びCHateau、１９８８年）。

【００１７】これらの技術は全て、多少の長さの差こそ
あれ、芽又は胚の分化に先行する異分化及びカルス発生
の段階の通過を必要とする。これらの芽は発育して、異
常な表現型をもつ植物又は不稔の植物をもたらす可能性
がある（Bouabdallah及び Branchard、１９８６年）。
そのうえ、カルスからの芽又は胚の誘導は、子葉上での
芽の直接的誘導に比べて弱いものである。

【００１８】もう１つのカボチャ（Cucurbitaceases）
種における再生技術についても記述されている：すなわ
ち、セイヨウカボチャ（Cucurbita pepo）に関するもの
である（Jelaska、１９７２年、１９７４年）。当該研
究者は、数カ月間栽培されたカルスからの体細胞胚から
植物を得た。

【００１９】遺伝子的に形質転換された植物の再生に関
しては、ＥＰ−Ａ−０２６２９７２は、側根を生じるア
グロバクテリウムによるCucumis sativus（キュウリ）
の形質転換とそれに続く再生について記述しており、Ｅ
Ｐ−Ａ−０２６５１００は原形質体（プロトプラスト）
の融合によるCucumis sativusの形質転換とそれに続く
再生について記述している。

【００２０】De Both及びBen Tahar（１９８９年）は、
形質転換されたメロンのカルスの獲得について報告し
た。カナマイシン上で発育しβ−グルクロニダーゼの遺
伝子を表現するこれらのカルスは、形質転換されていな
いメロンの再生においてすでに使用され成功した実験プ
ロトコルを使用したにもかかわらず、遺伝子導入植物を
発育させることができなかった。

【００２１】マスクメロン種における遺伝子導入植物の
獲得はいまだかつて一度も報告されていない。

【００２２】これまでマスクメロン種における形質転換
された組織からの再生方法が存在していないからといっ
て、ウイルス性疾病に対する抵抗性といった作物学的に
有利な性質を表現するメロンの遺伝子導入植物を得るこ
とが妨げられているわけではない。

【００２３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的の１つ
は、マスクメロン種に属する遺伝子導入植物の再生を可
能にすることにある。

【００２４】本発明のもう１つの目的は、Cucumis（ウ
リ）属に属する遺伝子導入植物の再生の各段階に必要な
培養培地を構成することにある。

【００２５】本発明は、更に限定的に言うと、アグロバ
クテルウム・ツメファシエンスの使用によるマスクメロ
ン種の子葉、胚軸、葉の遺伝子的形質転換と、それに続
く芽の誘導及び遺伝子的に形質転換された植物の獲得に
関する。上述のさまざまな組織の遺伝子的形質転換及び
それに続く器官形成により、栽培種、特に、マスクメロ
ン種の改良が可能となる。本発明で記述されている条件
下で再生された植物は、正常な表現型を有し繁殖能力を
もつ。

【００２６】本発明のもう１つの目的は、キュウリモザ
イク病ウイルス（ＣＭＶ）に対する抵抗性の遺伝子を導
入するためメロンを遺伝子的に形質転換することにあ
る。

【００２７】上述の目的は、本発明に基づく方法によっ
て達成される。

【００２８】

【課題を解決するための手段】本発明は、Agrobacteriu
m tumefaciens （アグロバクテリウム・ツメファンシエ
ンス）を介して導入された少なくとも１つの遺伝子を含
むCucumis melo（マスクメロン）種に属する幼植物を遺
伝子的に形質転換された芽から生産する方法において、
遺伝子的に形質転換された芽を連続した２段階で栽培す
ること及びかかる栽培段階のうちの第１の段階は、サイ
トキニン、更に限定的に言うと、６−ベンジルアミノプ
リン（ＢＡＰ）を含む植物細胞培養培地上で行なわれ、
芽が約３mm以上の高さに達した時点で行なわれる第２の
段階はマクロエレメントとして、 ＫＨ₂ＰＯ₄ 約 ５０〜約１００ mgL^{- 1} ＭｇＳＯ₄ 約 ７５〜約３００ mgL^{- 1} ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ 約５００〜約２５００mgL^{- 1} ＫＮＯ₃ 約７５０〜約１２００mgL^{- 1} ＮＨ₄ＮＯ₃ 約１５０〜約 ２００mgL^{- 1} を含む植物細胞培養培地上で行なわれることを特徴とす
る方法に関する。

【００２９】本発明は同様に、アグロバクテリウム・ツ
メファシエンスにより導入された少なくとも１つの遺伝
子を含み、遺伝子的に形質転換された外植体から遺伝子
的に形質転換された芽の誘導方法であって、かかる外植
物体はマスクメロン種の植物に由来するものであり、誘
導は、無機塩としては塩化カルシウムそして細菌−寒天
又は寒天−寒天を含む遺伝子的に形質転換されていない
外植体からの芽の誘導にとって通常必要とされるビタミ
ン及び無機塩の組合せを有する遺伝子的に形質転換され
た芽の誘導培地上で行なわれるような方法において、か
かる培地のＣａＣｌ₂含有量はＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏとし
て計算された場合約４４０〜約２２００mgL^{- 1}であり、
細菌−寒天又は寒天−寒天の含有量は約０．８〜約１．
２％であり、かかる誘導培地には約０．３〜約１．１３
mgL^{- 1} の６−ベンジル−アミノプリン（ＢＡＰ）及び約
０〜約１．３mgL^{- 1} のインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）
が加えられることを特徴とする誘導方法にも関する。

【００３０】本発明の好ましい一実施態様によると、形
質転換された芽のかかる誘導方法は、カルシウム含有量
が約１０００〜約２２００mgL^{- 1}、更に限定的に言う
と、約１７５０〜約２２００mgL^{- 1}である誘導培地上で
行なわれる。

【００３１】本発明の方法を実施することにより、マス
クメロン種に属する植物の外植体を形質転換して遺伝子
導入植物の形で再生することができる。本発明は同様
に、本発明の方法により生産されうるような遺伝子導入
植物、遺伝子導入幼植物、形質転換された芽及び形質転
換された外植体ならびに種子にも関する。

【００３２】外植体から形質転換された又はされていな
い植物の再生には、複数の細胞培養段階が関与し、各々
の段階が培養培地、例えばサイトキニンといった添加剤
ならびに、往々にして再生すべき種及び再生「経路」
（つまり例えば器官形成によるか又は体細胞胚形成によ
るか）に応じて異なる極めて精確な培養条件を必要とす
る。

【００３３】培地及び条件全体が、形質転換されていな
い１つの植物の再生についてわかっている場合でさえ、
形質転換された状態にある植物の再生においてかかる同
一の培地及び条件を適用して成功するかどうか予知する
ことは不可能である。追加の形質転換段階には、形質転
換培地及びコカルチャ（共培養）培地といったその他の
培地、及びセフォタキシムといったような、後の段階で
適用可能な培地及び条件における細胞の挙動に対し影響
を及ぼしうるようなその他の添加剤を使用する必要があ
る。ガラス化に対する形質転換された植物の感受性も
又、時として特殊な条件の開発を必要とする１つの要素
である。

【００３４】ガラス化された植物は、生体外（in vitr
o）培養条件の結果としての形態学的及び生理学的な一
連の異常により特徴づけられる。ガラス化を説明するた
めに往々にして挙げられる原因は、次のようなものであ
る： − ＮＨ₄ ⁺イオン又はサイトキニンの過度に高い濃度。 − 培地中の寒天（又はその他のゲル化剤）の過度に低
い濃度。 − 培養培地の容積内にある植物によって生成されたエ
チレンに対する感受性（Kevers他、１９８４年）。

【００３５】培地内にサイトキニンが存在することによ
る生体外のメロン幼植物培養のガラス化は、Leshem他
（１９８４年）により報告された。

【００３６】したがって、これらの要素の全てが、遺伝
子導入植物の再生に導く培地及び条件全体の調整をきわ
めて複雑なものにしている。

【００３７】当該発明者は、形質転換された外植体から
遺伝子的に形質転換された芽を誘導できるようにする芽
の誘導培地を組成することに成功した。かかる培地は、
無機塩としての塩化カルシウムと細菌−寒天又は寒天−
寒天を含む、遺伝子的に形質転換されていない外植体か
らの芽の誘導にとって通常必要とされる無機塩及びビタ
ミン全体を有する芽の誘導培地である。なおここで、か
かる培地のＣａＣｌ₂含有量はＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏとし
て計算した場合約４４０mgL^{- 1}〜約２２００mgL^{- 1}であ
り、細菌−寒天又は寒天−寒天の含有量は約０．８〜約
１．２％である。かかる誘導培地には、約０．３mgL^{- 1}
〜約１．１３mgL^{- 1}の６−ベンジルアミアノプリン（Ｂ
ＡＰ）及び約０〜約１．３mgL^{- 1}のインドール−３−酢
酸（ＩＡＡ）が添加される。

【００３８】特に好ましい誘導培地は、そのカルシウム
含有量が約１０００mgL^{- 1}〜約２２００mgL^{- 1}、更に限定
的に言うと、約１７５０mgL^{- 1}〜約２２００mgL^{- 1} であ
るような誘導培地である。これらのカルシウム濃度は、
誘導培地内で通常用いられる濃度の約４倍から５倍の増
大に相当する。一般的に言って、該発明者は、カルシウ
ムの高濃度が、形質転換されたメロンの再生段階に対し
て極めて有益な効果を有することを確認した。図４は、
異なる表現型のメロンにおける芽の誘導に対するカルシ
ウムのさまざまな濃度の影響を示している。

【００３９】本発明の一実施態様に従うと、芽の誘導培
地は、ＭＳ培地の名で知られるMurashige及びSkoog（１
９６２年）の培地であってよく、かかる培地のＣａＣｌ
₂及び細菌−寒天又は寒天−寒天の含有量は、場合によ
って、上述の限界を守りながら変更される。変更無しの
場合、ＭＳ培地の組成は以下のとおりである：

【００４０】ＭＳ培地 （mgL^{- 1}） ＮＨ₄ＮＯ₃ １６５０ ＫＮＯ₃ １９００ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ４４０ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ３７０ ＫＨ₂ＳＯ₄ １７０ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２７．８ Ｎａ₂ＥＤＴＡ ３３．６ ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ ２２．３ ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ８．６ Ｈ₃ＢＯ₃ ６．２ ＫＩ ０．８３ Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ０．２５ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０．０２５ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ ０．０２５ ミオ−イノシトール １００ ニコチン酸 ０．５ ピリドキシン・ＨＣｌ ０．５ チアミン・ＨＣｌ ０．１ グリシン ２．０ サッカロース（蔗糖） ０．０００ pH ５．７

【００４１】凝固したＭＳ培地は、更に０．８％の寒天
−寒天又は細菌−寒天を含んでいる。

【００４２】好ましい誘導培地は、ＭＳ培地に０．３〜
１．１３mgL^{- 1}のＢＡＰ、特に０．８５mgL^{- 1}のＢＡＰを
加えたもので、その他のサイトキニンは全く無いもので
ある。

【００４３】誘導培地内に存在するビタミンは、通常Ｍ
Ｓ培地中に存在するものであってもよい。本発明に基づ
くもう１つの実施態様に従うと、これらのビタミンは
「スタバ（Staba）」のビタミン（Staba、１９６９年）
であってよい。

【００４４】 「スタバ（Staba）」のビタミン ニコチンアミド ２ mgL^{- 1} ピリドキシン−ＨＣｌ ２ mgL^{- 1} ｄ−ビオチン １ mgL^{- 1} Ｃａ−パントテン酸塩 １ mgL^{- 1} チアミン−ＨＣｌ １ mgL^{- 1} 塩化コリン １ mgL^{- 1} ｐ−アミノ安息香酸 ０．５mgL^{- 1} 葉酸 ０．５mgL^{- 1} リボフラビン ０．５mgL^{- 1} シアノコバラミン １．５mgL^{- 1}

【００４５】特に好ましい芽の誘導培地は、当該発明者
が完成した「Ｍ．Ｉ．培地」と呼ばれる培地である。

【００４６】Ｍ．Ｉ．培地は以下のような組成を有す
る：Ｍ．Ｉ． 培地 ： マクロエレメント：ＫＮＯ₃ １９００mgL^{- 1} ＮＨ₄ＮＯ₃ １６５０ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ２２００ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ３７０ ＫＨ₂ＰＯ₄ １７０ Ｎａ₂ＥＤＴＡ ＭＳと同じ 微量成分 ＭＳと同じ ビタミン Staba ミオ−イノシトール １００mgL^{- 1} サッカロース ３０gL^{- 1} 寒天−寒天 ０．８％ ＢＡＰ ３．７５μM ＡＢＡ １μM

【００４７】凝固したＭ．Ｉ．培地の寒天含有量は０．
８％から１％（重量／体積）に変更することができる。
好ましくは０．８％である。本発明に基づく誘導培地に
アブシジン酸を約１μM加えることも可能である。

【００４８】当該発明者が完成したもう１つの培地は、
形質転換された芽から遺伝子導入幼植物を得ることがで
きるようにするものである。

【００４９】この培地は、無機マクロエレメントとして
以下のものを含む植物細胞培養培地である： ＫＨ₂ＰＯ₄ 約 ５０〜約 １００ mgL^{- 1} ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 約 ７５〜約 ３００ mgL^{- 1} ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ 約 ５００〜約２５００ mgL^{- 1} ＫＮＯ₃ 約 ７５０〜約１２００ mgL^{- 1} ＮＨ₄ＮＯ₃ 約 １５０〜約 ２００ mgL^{- 1}

【００５０】例えばマクロエレメント、ビタミンなどの
その他の培地構成成分は、ＭＳ培地のような細胞培養培
地において通常用いられる、通常の濃度のものである。
サッカロース含有量は、約１０gL^{- 1}まで減らすことがで
きる。

【００５１】本発明の好ましい一実施態様においては、
遺伝子導入幼植物の発育のための培地には、マクロエレ
メントとして以下のものが含まれている： ＫＨ₂ＰＯ₄ ８５mgL^{- 1} ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １８５mgL^{- 1} ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ １７２０mgL^{- 1} ＫＮＯ₃ ９５０mgL^{- 1} ＮＨ₄ＮＯ₃ １６５mgL^{- 1}

【００５２】本発明のかかる態様に従ったＣａＣｌ₂・
２Ｈ₂Ｏ含有量は、従来の培地の場合に比べ約５倍であ
ることに留意されたい。一方、ＫＨ₂ＰＯ₄、ＭｇＳＯ₄
・７Ｈ₂Ｏ及びＫＮＯ₃の濃度は、その他のこのタイプの
培地にみられるものの約半分であり、ＮＨ₄ＮＯ₃の濃度
は約１０分の１である。

【００５３】遺伝子導入幼植物の発育のための本発明に
基づく特に好ましい培地は、第１表にその組成が示され
ている、ＭＢ６と呼ばれる培地である。

【００５４】

【表５】

【００５５】当該発明者により完成されたこの培地は、
芽から遺伝子導入幼植物を得るために肝要なものであ
る。ただし、芽の栽培を２段階で行なうことが重要であ
り、これらの段階のうちの第１のものはサイトキニンを
含む第１の植物細胞培養培地上で行なわれる。このサイ
トキニンは、カイネチン（Kinetine）又はＢＡＰであっ
てもよい。特にＢＡＰが好まれる。適切な第１の細胞培
養培地は、例えばＭＳ培地に０．１〜１．２mgL^{- 1}、特
に約０．２mgL^{- 1}のＢＡＰを加えたものである。かかる
培養培地は通常、約０．８％の寒天−寒天又は細菌−寒
天の添加により凝固させられる。

【００５６】芽がこの第１の培地上で約３mm以上の高さ
に達した時点で、遺伝子導入幼植物の獲得を可能にする
ＭＢ６培地といった以下に詳述するような培地である第
２の培地上にこの芽を移植する。かかる培地のことを以
下では「ＭＢ６タイプの培地」と呼ぶ。

【００５７】このＭＢ６タイプの培地上で、高さ３mm以
上の芽は伸び、約４週間たつと、幼植物が根を付ける。
この培地上で二次根がひとたび発達すると、腐食土と粗
砂の混合物を含む鉢の中に植物を移植させて温室栽培に
付すことができる。こうして得られた遺伝子導入植物
は、正常な表現型を持ち、稔性がある。

【００５８】当然のことながら、本発明の培地には場合
によって、例えば抗生物質といった形質転換体の選択を
可能にする製剤及びセフォタキシムといったＡ．ツメフ
ァシエンスの増大を抑制する製剤が付加される。使用可
能なセフォタキシム濃度は、約２００mgL^{- 1}から約４０
０mgL^{- 1}である。カナマイシンでの選択を同時に適用す
ることにより、抑制のためのセフォタキシムを約２００
mgL^{- 1}用いることが可能となる。幼植物の発育は、この
むしろ低い濃度によって影響されないため、セフォタキ
シムを２００mgL^{- 1}用いることがきわめて好ましい。使
用されるカナマイシン濃度は、約５０から４００mgL^{- 1}
の間で変化しうる。Ｍ．Ｉ．培地が選択培地として用い
られる場合、カナマシイン濃度は１５０mgL^{- 1}から４０
０mgL^{- 1}でなくてはならない。

【００５９】本発明の一実施態様によると、芽の誘導培
地及びＭＢ６タイプの培地は、形質転換された外植体か
らのメロンの遺伝子導入植物の再生において連続的に用
いることができる。誘導培地上での培養により誘導され
た芽は、外植体が切除され、例えばＢＡＰのようなサイ
トキシンを含む第１の幼植物発育培地上に、次にＭＢ６
タイプの培地上に移植される。

【００６０】本発明のもう１つの実施態様によると、マ
スクメロン種に属する植物の外植体はアグロバクテリウ
ム・ツメファシエンスにより形質転換され、こうして得
られた形質転換された外植体は次に芽の誘導培地上で栽
培される。次に、芽は遺伝子導入幼植物の発育段階を受
ける。かかる段階はすでに説明したとおり、２段階で進
められ、これらの段階のうちの最後のものは、ＭＢ６タ
イプの培地上で行なわれる。最終的に、こうして得られ
た遺伝子導入幼植物は、形質転換されていない幼植物の
発育において既知の方法により栽培され、遺伝子導入植
物が得られることになる。

【００６１】遺伝子導入メロンの形質転換及び再生のた
めの出発物質として用いられる外植体は、例えば子葉、
胚軸、葉といったアグロバクテリウム・ツメファシエン
スにより形質転換可能ないかなる外植体でもよい。外植
体としての子葉の使用が特に有利である。当該発明者
は、最高４日間、更に限定的に言うと、２日間の栽培が
なされた胚から採取された子葉上での芽の再生の可能性
は、それより若い又はそれより古い子葉が示す可能性よ
りも高い（図１参照）。この現象は、異なる数多くの変
種においてみられた。子葉は、０日〜４日間発芽した胚
からのものであり、胚はメロンの成熟した穀粒から分離
されたものである、ということを明記しておくことが大
切である。種子からの発芽は、同じ有利な結果をもたら
さない。発芽培地は、好ましくは、滅菌水中の０．８％
（重量／体積）の寒天−寒天であり、これには５０μm
のＣｏＣｌ₂又はＮｉＣｌ₂を添加することができ、こう
して次の段階における芽の誘導が改善されるように思わ
れる。上述のとおり、発芽期間は０日から４日である。
３日未満、特に、２日未満の期間が特に好ましい。発芽
は通常６０から８０μEm^{- 2}s^{- 1}の光度で、１６／２４時
間の光周期で、昼間はは約２６℃、夜間は２４℃で行な
われる。

【００６２】メロンの外植体の遺伝子的形質転換は、例
えば細菌懸濁液の形でのＡ．ツメファシエンス菌株と、
例えば切断により傷を受けた外植体との接触により行な
われる。子葉の場合、細菌との接触は、子葉が０日から
４日、更に限定的に言うと、２日の発育を経た時点で行
なわれる。

【００６３】かかる接触の時間は、きわめて重要なもの
ではない。例えば、この接触は約３０分から１時間であ
ってもよいし、Ｍ．Ｓ．培養培地内での懸濁液中などで
行なわれる。

【００６４】その後、外植体は滅菌されたろ紙上で乾燥
され、寒天−寒天で凝固させられたＭＳ培地でありうる
コカルチャ培地上に移植される。コカルチャの際に適用
される光度及び光周期の条件は、一般に発芽段階の際に
用いられたものと同じである。通常、このコカルチャ段
階は約４８時間続く。

【００６５】Ａ．ツメファシエンスのノパリン及びオク
トピンを有する数多くの菌株が知られており、マスクメ
ロン種の遺伝子的形質転換に用いることができる。

【００６６】当該発明者は、ワシントン大学の G.Annに
より提供されている（Ann他、１９８５年）バイナリー
ベクターｐＧＡ４７２とＴｉプラスミドｐＡＬ４４０４
を含むオクトピンを有する菌株又はノパリンを有する菌
株（Ben Tahar及びDe Both、１９８８年）を用いた。こ
れらの菌株はそのベクターがかき取られ、Plant Breedi
ng InstitutのR. Jeffersonにより提供されているバイ
ナリーベクターｐＢＩ１２１（Jefferson他、１９８７
年）が、ベクターｐＧＡ４７２を含まない菌株ＬＢＡ４
４０４内に導入された。このバイナリーベクターは、カ
ナマイシン抵抗性をもつ標識遺伝子及び「リポータ」遺
伝子つまり酵素活性をコードするβ−グルクロニダーゼ
の遺伝子を有する。かかるカナマイシン抵抗性遺伝子
は、ノパリンシンターゼの遺伝子のプロモータ及びター
ミネータが５′及び３′において添えられたトランスポ
ゾンＴｎ５から単離されたネオマイシンリン酸転移酵素
の遺伝子のコード領域を含んでいる。β−グルクロニダ
ーゼの遺伝子のコード領域には、カリフラワのモザイク
病ウイルスのＲＮＡ３５Ｓプロモータ及びノパリンシン
ターゼの遺伝子のターミネータが添えられている。

【００６７】ベクターｐＢＩ１２１を含む菌株ＬＢＡ４
４０４は１５％のグリセリン内で−２０℃で保存され
る。この菌株は５０mg/Lのカナマイシンを含むＬＢ培地
上で成長する。

【００６８】コカルチャ段階の後、形質転換された外植
体は、前述の芽の誘導培地上に移植される。かかる培地
には通常、例えばカナマイシンのような形質転換体の選
択を可能にする製剤及び、例えばセフォタクシムのよう
なＡ．ツメファシエンスの生長を抑制する製剤が添加さ
れる。

【００６９】本発明者等は、直径９cmのペトリ皿「Falc
on」^{T M}の使用により、芽の誘導段階の際にきわめて有利
な結果が得られるということを確認した。この段階中に
適用される光度及び光周期条件は、発芽段階の際に適用
されるものと同じであり、８０μE・M^{- 2}s^{- 1}の光度が特に
好ましい。

【００７０】芽は外植体上に直接発育し、物理的操作が
可能となるサイズ（約０．２〜１．５mm、特に０．５m
m）に達したとき、これらの芽を外植体から切除して、
新しい培地すなわち通常ＢＡＰ又はその他のサイトキニ
ンを含み幼植物発育のための「第１の」培養培地を構成
する培地に移植する。

【００７１】本発明に基づく方法の一変形態様において
は、通常約２１日である誘導段階の期間は、１４日に短
縮することができる。この場合、芽は、直接第１の幼植
物発育培地上に移植される代りに、ホルモンを含まない
ＭＳ培地上に１週間移植され、その後幼植物発育段階に
付される。

【００７２】幼植物発育段階は、前述のように２段階で
進められる。芽はこの培地上において伸び、約３mm〜
１．０cmの高さに達したとき、抗生物質といった形質転
換体を選択するための選択剤とＡ．ツメファシエンスの
生長を抑制する製剤が加わったＭＢ６培地上に移植され
る。ただし、これらの製剤は、再生において必須なもの
ではない。

【００７３】この培地上で数週間経過した後、遺伝子導
入幼植物が根を付ける。植物は、二次根が発育した時点
で直ちに、腐食土及び粗砂（２：１ 体積／体積）を含
む鉢に移植することができる。

【００７４】本発明の好ましい実施態様に従うと、Ａ．
ツメファシエンスを介してメロンの外植体内に、キュウ
リのモザイク病ウイルスのカプシドタンパク質をコード
する遺伝子が導入される。本発明はこれらの配列及び相
応するＲＮＡ配列（図２及び図３参照）、ならびにＣＭ
Ｖに対する抵抗性を与えることのできるこれらの配列の
断片に関する。

【００７５】かかるウイルスは、異なるサイズの４つの
ＲＮＡで構成されている；ＣＭＶのカプシドタンパク質
の遺伝子は、ＲＮＡ３の末端３′上及びＲＮＡ４上に存
在する。カプシドタンパク質の翻訳は、ＲＮＡ４からし
か行なわれず、ＲＮＡ３の末端３′は厳密に同じヌクレ
オチド配列を有している。異なる地理的地域からきた２
つのウイルス菌株のカプシドタンパク質の遺伝子が本発
明者等により単離され、配列が決定された。

【００７６】本発明の当該態様においては、Ｉ１７Ｆと
呼ばれるフランス産の有害なＣＭＶの菌株及び感染した
メロンについてニューヨークで単離された有害な菌株Ｆ
ＮＹのＲＮＡ３の相補ＤＮＡを含むプラスミド（ｐＵｃ
１８）が用いられた。当然のことながら、ＣＭＶ及びそ
の他のウイルスのその他の菌株のカプシドタンパク質を
コードする遺伝子といった他のいかなる遺伝子でもこう
してメロンの外植体内に導入することができ、この場
合、本発明の方法はかかる遺伝子を含む遺伝子導入植物
の再生を可能にする。

【００７７】

【実施例】Ａ）カナマイシン抵抗性遺伝 子及びβ−グル
クロニダーゼ遺伝子を発現する遺伝子導入メロンの生産
方法 １．マスクメロンの胚の発芽 成熟胚を得るためメロン（Cucumis melo L）の成熟種子
を用いる。胚を傷つけないようにしながらメスで種皮を
開く。純粋エタノール内に５秒間、次に次亜鉛素酸カル
シウムと０．０５％のTween 80の飽和溶液２００ml中に
２０分間、つねに撹拌しながら浸漬することによって、
胚を滅菌する。次に胚を２０分間、滅菌水２００ml中で
洗う。その後、ろ紙上で胚を乾燥させ、滅菌水中０．８
％（重量／体積）の寒天−寒天を含む滅菌したペトリ皿
の中に置く。６０〜８０μE・M^{- 2}s^{- 1}の光度、１６／２４
時間の光周期で昼間は２６℃、夜間は２４℃で培養室内
にて２日間、胚を発芽させる。

【００７８】２．アグロバクテリウム・ツメファシエン
ス菌株及び形質 転換ベクター 形質転換実験のためには、ベクターｐＢＩ１２１を含む
菌株ＬＢＡ４４０４（前述のもの）を、１２時間２８℃
で連続的に撹拌しながら（２００rpm）抗生物質無しの
１０mlのLuria-Bertani培地内で培養させる。この細菌
溶液は、１００mgL^{- 1}のリファンピシンと５０mgL^{- 1}のカ
ナマイシンが補足された更に大量のＬＢ（Luria-Bertan
i 培地）（５０ml）に対する接種剤として役立つことに
なる。ＬＢ培地は、pH７．５で１リットルあたり１０ｇ
のＮａＣｌ、５ｇの酵母抽出物及び１０ｇのバクトトリ
プトンで構成されている。この細菌懸濁液を、６６０ナ
ノメートルの波長で光学的濃度が１となるまで、４時間
から５時間２８℃で撹拌下に保つ。次に細菌懸濁液を５
分間４０００rpmで遠心分離し、ＭＳ培地内で同じ初期
体積に沈渣を取り込む。かかる溶液は、いつでも植物組
織と接触させうる状態にある。

【００７９】３．形質転換手順 第１項で記述した培地上での２日間発芽した胚からの子
葉を頂生分裂組織を避けるよう注意して採取する。最も
若い又は最も古い子葉は、２日間培養した胚から採取し
た子葉に比べ、芽の再生の可能性が低い。この結果は、
図１に示されている。２日のこの子葉を、ＭＳ培地内に
取り込んだ細菌懸濁液中で４つに切断し、傷の後のバイ
ナリーベクターｐＢＩ１２１を含む菌株ＬＢＡ４４０４
と接触させる。子葉の断片を３０分から１時間細菌懸濁
液内に置く。各断片を滅菌ろ紙上で乾燥させ、０．８％
の寒天−寒天で凝固されたＭＳ培地を含むペトリ皿内に
移植する。第１項で記述した光度及び光周期条件で４８
時間生体外培養室内で外植体を培養させる。

【００８０】４．芽の誘導 上述の２日にわたるこのコカルチャの後、子葉の断片
を、４００mgL^{- 1}のセフォタキシム（Roussel-Uclaf）、
５０mgL^{- 1} の硫酸カナマイシン、１．１３mgL^{- 1}のＢＡ
Ｐ及び０．８８mgL^{- 1}のＩＡＡが添加されたＭＳを含む
新しい培地上に移植する。セフォタキシムの存在は、細
菌の生長を抑制するために必要である。硫酸カナマイシ
ンは、形質転換された細胞を選択するための選択剤とし
て用いられる。形質転換された細胞は、そのゲノム内に
第２項で記述したβ−グルクロニダーゼ遺伝子とカナマ
イシン抵抗性遺伝子を有する細胞となる。培養培地に加
えられた植物性ホルモンＢＡＰは、上述の濃度での芽の
誘導のために必要である。これに対してＩＡＡの存在は
任意である。こうして形質転換されたこれらの細胞は、
５０mg/lのカナマイシン上で発育することになる芽を誘
導する。子葉の断片を、第１項に記載された光度及び光
周期条件下で生体外培養室内で保温培養する。３週間か
ら５週間たつと、子葉の断片から直接カナマイシン５０
mgL^{- 1}が存在する中で芽が発育する。この誘導培地で
は、形質転換されていない子葉の断片から５０mgL^{- 1} の
カナマイシン上でいかなる芽も発育し得ない。かかる効
果は図２に示されている。

【００８１】５．遺伝子導入幼植物の発育 ５０mgL^{- 1}のカナマイシンが存在する中で第３項に記載
されている培地上で直接誘導された芽が高さ０．５mmの
サイズに達した時点で、子葉の断片からこれらの芽を切
除する。これらの芽を、０．６８mgL^{- 1}のＢＡＰ、４０
０mgL^{- 1}のセフォタキシム及び５０mgL^{- 1}の硫酸カナマイ
シンを添加したＭＳを含む新しい培地上に個々に移植す
る。これらの芽はこの培地上で伸び、２〜４週間後高さ
３mmに達した時点で、今後は５０mgL^{- 1}の硫酸カナマイ
シン及び４００mgL^{- 1}のセフォタキシムを含むＭＢ６培
地１００ml（第１表参照）上で容量５００mlの栽培用の
鉢の中に再び個々に移植する。上述のこの培地上で、高
さ３mmの芽が伸び、４週間たつと遺伝子導入幼植物が根
付く。二次根が上述の培地上でひとたび発育すると、植
物を腐食土と粗砂の混合物（２：１）を含む鉢の中に移
植し、温室栽培に付す。最初の７日間は、湿潤な大気を
保つためプラスチックのふたで植物を保護する。植物に
は毎日水をやる。こうして再生された植物（８８４−５
と呼ぶ）のうちの１本を開花させ、自殖させた。種子を
収集した。４本の植物Ｒ１を発芽させ、下記のテストを
適用することにより、その遺伝子導入特性を確認した。

【００８２】β−グルクロニダーゼ酵素（Ｇ．Ｕ．
Ｓ．）の活性を検知する第１のテストは、Jefferson他
の方法（１９８７年）に従って行なわれる。もう１つの
テストには、カナマイシンを含む培地上での葉又は葉柄
の外植体上のカルスの誘導が関与する。カルスの形成
は、その植物が遺伝子導入植物であることを示してい
る。ＢＡＰ及びＮＡＡを含むＭＳ培地内の必要なカナマ
イシン濃度は、ホルモンと組織の濃度に応じて変化す
る。例えば、１mgL^{- 1}のＢＡＰ及びＮＡＡが付加された
ＭＳ培地内では、葉及び葉柄上のカルスの形成を抑制す
るためには１００mgL^{- 1} のカナマイシンで充分である。
再生された植物における外来の遺伝子の存在も、２．５
単位のＴａｑポリメラーゼを用いてポリメラーゼ連鎖反
応（Ｐ．Ｃ．Ｒ．）（Lassner他、１９８９年；De Both
１９９０年）によりテストした。使用された先導体（a
morce）により、ＧＵＳ遺伝子とＮＰＴ遺伝子の同時増
幅が可能となった。再生された組織内にアグロバクテリ
アが存在することによる偽陽性を避けるため、ＰＣＲは
世代Ｒ１についてのみ行なわれた。

【００８３】Ｂ）ホスフィノトリシン除草剤に対する抵
抗性をもつ遺伝 子を発現する遺伝子導入メロンの生産 バイナリーベクターｐＩＢ１６．１（Hoechst、GmbH、
フランクフルト、西ドイツ）は、ｎｅｏ遺伝子とｐａｔ
遺伝子（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラー
ゼ）を含み、ホスフィノトリシンに対する抵抗性を与え
ている。実施例Ａ中に記されている形質転換及び再生方
法が、該ベクターにより形質転換された Vedrantais 遺
伝子型の植物の生産において用いられた。こうして得ら
れた植物の遺伝子導入特性をカルス形成テスト及びサザ
ン法に従ったｎｅｏプローブの交雑によって確認した。
これらの植物を自殖させ、こうして得られた種子を温室
で発芽させた。こうして得られた植物は、除草剤による
処理に対し、いくつかは抵抗性を示した。

【００８４】Ｃ）キュウリのモザイク病ウイルス（ＣＭ
Ｖ）のカプシド タンパク質を発現する遺伝子導入メロン
の生産 以下の例においては、Ｉ１７Ｆと呼ばれるフランスの有
害なＣＭＶの菌株及び感染したメロンについてニューヨ
ークで単離されたＦＮＹと呼ばれる有害な菌株のＲＮＡ
３の相補ＤＮＡを含むプラスミド（ｐＵＣ１８）が、Ｃ
ＭＶのカプシドタンパク質遺伝子の供給源として用いら
れた。

【００８５】１．ＦＮＹ菌株のカプシドタンパク質のク
ローニング P. Palukaitisにより決定されたＲＮＡ３のｃＤＮＡを
含むプラスミドｐＵＣ１８の制限地図に基づき、末端
３′において１kbのカプシドタンパク質の配列をカバー
する１．６kbのサイズの断片を発現ベクター「Blue scr
ibe」内でサブクローニングした。かかるｃＤＮＡをBlu
e Scribe（ＢＳ＋）（Stratagene目録）内でサブクロー
ニングし、サブクローニングされた各々の断片を「sequ
enase R」プロトコル（ＵＳＢのヴァージョン２；Unite
d State Biochemical）に従って配列決定した。配列決
定された断片を、Maniatis他、１９８２年において記述
されているような変性特性をもつ６％のアクリルアミド
ゲル上で分析した。次に１０％の酢酸内で１０分間固定
し８０℃で３０分間真空乾燥し、次にオートラジオグラ
フィに付した（Maniatis他、１９８２年）。ＦＮＹ菌株
のカプシドタンパク質のリーダー配列の最初は、日本Ｙ
菌株（P. Palukaitisとの私信）のものと同じ長さを有
する。Ｙ菌株のＲＮＡ４の部分配列が発表された（Hida
ka他、１９８５年）。この配列と比較することにより、
我々は、ＦＮＹ菌株のリーダー配列を位置づけすること
ができた。リーダー配列、コード領域及び３′非コード
領域をカバーするカプシドタンパク質の配列は、図２に
示されている。かかる配列に基づき、３′及び５′の３
０の相補性塩基の２つのオリゴヌクレオチドを合成し、
Scharf他（１９８６年）により記述されたＰＣＲ（ポリ
メラーゼ連鎖反応）技術を用いて、カプシドタンパク質
配列を増幅させた。増幅の生成物を１％のアガロースゲ
ル上で分析し、この１０３４bp断片のサイズを確認し
た。５′及び３′のオリゴヌクレオチドは、その末端に
制限部位ＢａｍＨ１を有している。したがって、かかる
増幅生成物をベクターｐＢＩＯＳ３の唯一の部位Ｂａｍ
Ｈ１にてクローニングすることができた。本発明者等の
実験室で構築されたこのベクターｐＢＩＯＳ３は、植物
性ターミネータとプロモータを１つずつ有している。つ
まり、カリフラワのモザイク病ウイルスのＲＮＡ３５Ｓ
からのプロモータ３５Ｓと、ノパリンシンターゼの遺伝
子の非コード領域３′からのターミネータＮＯＳであ
る。

【００８６】２．菌株Ｉ１７Ｆのカプシドタンパク質の
クローニング ＣＭＶの菌株Ｉ１７Ｆを双葉段階のトマトの幼植物に接
種した。感染から１５日後に、DR. G. Marchouxの論文
（１９７５年）に記されている技術に従って、感染した
葉からウイルスを純化した。ウイルスのＲＮＡ（ＲＮＡ
１、２、３及び４）の質を１％のアガロースゲル上で制
御する。ひとたび制御したならば４つのＲＮＡの相補Ｄ
ＮＡを、Amershamキット「ｃＤＮＡ Synthesis System
プラス」を用いて合成する。４つのＲＮＡの放射性相補
ＤＮＡを１％のアガロースゲル上に置く。これらのＤＮ
Ａの泳動の後、ゲルを真空乾燥し次にオートラジオグラ
フィに付す（Maniatis他、１９８２年）。純粋先端をも
つ末端を有するこれらの相補ＤＮＡを次に、脱リンされ
たプラスミドｐＵＣ１８の部位Ｓｍａｌでクローニング
する。かかるプラスミドは、アンピシリン抵抗性をも
つ。塩化カルシウム法（Maniatis他、１９８２年）によ
り応答能を与えられた大腸菌ＪＭ１０１を、ウイルスＲ
ＮＡの相補ＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣ１８により形
質転換させる。プラスミドｐＵＣ１８はアンピシリン抵
抗性を有するため、一方では１００mg/Lでアンピシリン
が付加されたLuria Broth培地（Maniatis他、１９８２
年）上で、又他方ではコロニーの青い色（Maniatis他、
１９８２年）により、形質転換された細菌コロニーを選
択する。各々のコロニーから組換え型プラスミドを単離
させ、Birnboin及び Dolyの技法に従って純化した（Man
iatis他、１９８２年）。組換え型プラスミドを制限酵
素ＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１で消化させる。部位Ｓｍａ
１のまわりで切断するこれらの酵素により、一方ではプ
ラスミドｐＵＣ１８他方では相補ＤＮＡを電気泳動によ
って分離させることができる。消化生成物を１％のアガ
ロースゲル上に置き、泳動の後、サイズ１kb（相補ＤＮ
Ａのサイズ）の相補ＤＮＡを含むプラスミドを選択す
る。酵素ＨｉｎｄIII；ＳａｌＩ及びＨｉｎｄIIと用い
ての制限地図により、Cuozzo他（１９８８年）によって
発表された菌株Ｄのものとの比較から、ＲＮＡ４の相補
ＤＮＡを有する組換え型プラスミドを識別することがで
きた。カプシドタンパク質をコードする遺伝子を有する
このクローンを、Bluescribeプラスミドの制限部位Ｅｃ
ｏＲＩ及びｂａｍＨＩの間で（ＢＳ＋及びＢＳ−）（St
ratagene目録）再クローニングした。よりサイズの小さ
い断片をBluescribeベクター内で再クローニングし、こ
れらの組換え型プラスミドの各々の一本鎖ＤＮＡを Str
agene が記した技法に従って調製した。クローニングさ
れたこれらの異なる断片の配列を、ＵＳＢ United Stat
es Biochemicalsのプロトコル「sequenase R」ヴァージ
ョン２内に記述されている技法に従って決定した。配列
が決定された断片を６％のアクリルアミドの変性ゲル
（Maniatis他、１９８２年）上で分析し、次に１０分間
１０％の酢酸中でゲルを固定して次に３０分間８０℃で
真空乾燥させ、その後オートラジオグラフィに付した
（Maniatis他、１９８２年）。菌株Ｉ１７Ｆのカプシド
タンパク質の配列は図３に示されている。

【００８７】その後カプシドタンパク質の配列を、制限
酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩの消化によって組換え型
プラスミドから出す。配列の末端でＢａｍＨＩリンカー
を付加し（Maniatis他、１９８２年）かかる配列を次に
脱リンされたプラスミドｐＢＩＯＳ３のＢａｍＨＩ部位
でクローニングする（Maniatis他、１９８２年）。こう
して、カプシドタンパク質をコードするこの配列は、プ
ロモータ３５ＳとターミネータＮＯＳの間に置かれる。

【００８８】３．メロンの子葉内でのＣＭＶ（それぞれ
菌株Ｉ１７Ｆ及 びＦＮＹ）のカプシドタンパク質をコー
ドする遺伝子の導入及び遺伝子導入植物の再生 対照配列の間に置かれたカプシドタンパク質（Ｉ１７Ｆ
及びＦＮＹ）を純粋にコードする２つの遺伝子を、次
に、遺伝子ＧＵＳの部位ＥｃｏＲＩ３′の抑圧及び部位
ＨｉｎｄIIIでの部位ＥｃｏＲＩの作成により変更され
たバイナリーベクターｐＢＩ１２１（Jefferson他、１
９８７年）内で別々にクローニングする。これらの変更
により、ｐＢＩＯＳ３からのプロモータ−構造遺伝子−
ターミネータカセットの挿入が可能となる。最後に、か
かる最後のベクターを菌株ＬＢＡ４４０４内に導入す
る。一方では菌株ＦＮＹ（ｐＢＩ０ＳＩ３２）他方では
菌株Ｉ１７Ｆ（ｐＢＩ０ＳＩ３５）のカプシドタンパク
質の配列を有するバイナリーベクターを含むアグロバク
テリウム菌株を、実施例Ａ中に記されているように２日
の段階のメロンの子葉を感染させるのに用いる。形質転
換された子葉の再生方法は、実施例Ａに記されているも
のと同じである。１００mg/Lのカナマイシンを含む選択
培地上で再生されたメロンの植物を分析する。再生され
た植物の遺伝子導入特性は、Ｇ．Ｕ．Ｓ．活性の検出及
び実施例Ａ内に記されているようなカルスの形成技術に
よって確認された。菌株Ｉ１７Ｆのカプシドタンパク質
の発現は、無傷の菌株Ｉ１７Ｆに対する抗体との「ウエ
スタンブロット」分析の際に植物内に検出された。発現
されたカプシドタンパク質は葉の中で、可溶性タンパク
質全体の約０．０１％を占めていた。その後、形質転換
した植物に種子をつけさせる。形質転換されたこれらの
植物は、キュウリのモザイク病ウイルスに対し抵抗性が
あることが立証されている。

【００８９】図５は、ＣＭＶ菌株Ｉ１７Ｆに対する抗体
を用いて検出された免疫反応性帯を実証するものであ
る。１５個のＲ１植物を、このウイルスを機械的に接種
することにより、ＣＭＶ抵抗性について試験した。接種
は、一葉期の実生の第一葉に行い、ＣＭＶによる全体的
な（組織全体の）感染を、続いて形成される葉上の症状
の発現によって評価する。これらの植物のうちの１０個
について、ＧＵＳ表現によって組換え体（transgenic）
であることが示される。これらの１０個の組換え体Ｒ１
の植物のうちの少なくとも一つについて、第四葉が、接
種された非転換の対照植物と比較して、接種後１９日目
で、症状の軽減が見られ、葉モザイクは存在しなかっ
た。

【００９０】参考文献 ABAK K, DUMAS DE VAULX R.著（1980年）−「カボチャ
属遺伝学共同報告書（Cucurbit Genetics Cooperative
Report）3」；27〜29, ANNG., WATSON B.D., STACHEL
S., GORDON M.P., EW N.共著（1985年）−「EMBO J.
4」；277〜284. BEN TAHAR S., DE BOTH M.T.J.共著（1
988年）−「アグロバクテリウム・ツメファシエンスを
用いたメロン（Cucumis melo L.）への外来遺伝子の導
入」、フランス・カボチャ属議事録．BEVAN M.著（1984
年）−「核酸研究12」（Nucleic Acid Research）；871
1〜8718.BOUA BDALLAH L., BRANCHARD M.共著（1986
年） Z. Pflanzenzuchtung 96 ；82〜85.BRANCHARD M., CHAT
EAU M.共著（1988年）−C.R.Acad, Sci Paris307、シリ
ーズIII；777〜780.BROADBENT L.著（1976年）− Ann.
Rev. Phyto-pathol（植物病理学年報）14；75. CADE R.
M., WEHNER T.C., BLAZICH共著（1988年）−カボチャ属
遺伝学共同報告書11；3〜4.CHEE P.P.,TRICOLI D.M.共
著（1988年）−植物細胞報告書（Plant Cell Reports）
7； ２７４〜 ２７７．ＣＨＩＬＴＯＮ Ｍ．Ｄ．，
ＴＥＰＰＥＲ Ｄ．Ａ．， ＰＥＴＩＴ Ａ．，ＤＡ
ＶＩＤ Ｃ．， ＣＡＳＳＥ ＤＥＬＢＡＲＴ Ｆ．，
ＴＥＭＰＥ Ｊ．共著（1982年）−「Nature（自然）
295」；432〜434.COSTA A.S., MULLER G.W. 共著（1980
年）−Plant Dis.（植物の疾病（disease））64 ；536.
CUOZZO M., O' CONNEL K.M., KANIEWSKI W., FANG R.
X., CHUA N.H.及びTUMER N.E.共著（1988年）−「バイ
オテクノロジー（Biotechnology）6 」；549〜557.DAVI
D C., CHILTON M.D., TEMPE J.共著（1984年）−「バイ
オテクノロジー 2」；73〜 76. DEAKIN J.R., BOHN G.
W., WHITAKER T.W.共著（1971年）−「経済植物学（Eco
nomic Botany）25」：195〜211.DE BOTH M.T.J., BEN T
AHAR S.共著（1989年）−ニューヨーク，植物育種にお
ける遺伝子操作に関する国際Eucarpia会議議事録；Plen
um Press（印刷中） DE BOTH M.T.J.著（1990年）−「植物の原形質体及び組
織へのelectroporationによる遺伝子移入」；ロンドン
大学学位論文 DEGREEF W., DELON R., DEBLOCK M., LEEAMANSJ., BOTT
ERMAN J.共著（1989年）−「バイオテクノロジー 7」；
61〜64.DIRKS R., VAN BUGGENUM M.共著（1989年）−
「植物細胞報告書 7」；626〜627.FERNOW K.H. （1967
年）−「植物病理学57」；1347. FRALEY R.T., ROGERS
S.G., HORSCH R.B.,EICHHOLTZ D.E., FLICK J., FINK
C., HOFFMANN., SANDERS共著（1985年）−「バイオテク
ノロジー 3」；629〜637.FRALEY R.T., ROGERS S.G., H
ORSCH R.B.共著（1986年）−「高等植物における遺伝子
的形質転換」 CRC評論紙、植物学 4（CRC Critical Re
v. Plant Sciences 4）；1〜46. HILDER V.A., GATEHOU
SE A.M.R., SHEERMAN S.E., BARKER R.F., BOULTERD.
（1987年）−「Nature（自然）300」；160〜163.HIDAKA
S., TSUNASAWA S., YOON J.O., NARITAK., TAKANAMI
Y., KUBO S., MIURA K.I.共著（1985年）−「生化学ジ
ャーナル（J. Biochem.）97」；161〜171.HOEKEMA A.,
HUISMAN M.J., MOLENDIJK L., VAN DE ELZEN P.J.M., C
ORNELISSENB.J.C.共著（1989年）−「バイオテクノロジ
ー 7」；273〜278.HORSH R.B., FRY J.E., HOFFMAN N.
L., WALLROTH M., EICHHOLTZ D.Z., ROGERS S.G.共著
（1985年）−「Science （科学）227 」；1229〜 1231.
JEFFERSON R.A., KAVANAGH T.A., BEVAN M.W.共著（19
87年）−「EMBOジャーナル 6」；3901〜 3907. JELASKA
S.著（1972年）−「Planta（Berl.）103 」；278〜280.
JELASKA S.著（1974年）−「Physial Plantarum（植物
生理学）31；257〜261. KATHAL R., BHATNAGARS.P., BH
OJWANI S.T.共著（1986年）−「植物生理学ジャーナル
（J. Plant Physiol.）126 」；59〜62.KATHAL R., BHA
TNAGAR S.P., BHOJWANI S.T.共著（1988年）−「植物細
胞報告書 7」；449〜451. KEVERS C., COUMANS M., COU
MANS-GILLES M.F.GASPAR T. （1984年）−「Physiol Pl
ant.（植物生理学）61」；69〜74.KHO Y.O., DEN NIJS
A.P.M., FRANKEN J.共著（1980年）−「Euphytica 2
9」；661〜672.KIM S.G., CHANG J.R., CHA H.C., LEE
K.W.共著（1988年）−「植物細胞組織器官培養（Plant
Cell Tissue Organ Culture）12 」；67〜74.KLEE H.,
HORSCH R., ROGERS S.,共著（1987年）−「植物生理学
年報（Ann. Rev. PlantPhysiol.）38 」；467〜486.LAS
SNER M.W., PETERSON P., YODER J.I.,共著（1989年）
−「Plant. Malec. Rep.（植物分子報告）7;116〜128.
LESHEM B., SHALEY D.P., IZHAR S.共著（1988年）−
「植物学会誌（Annals of Botany）61」；255〜260.MAC
KAY W.A., NG T.J., HAMMERSCHLAG F.A. 共著（1988
年）−「カボチャ属遺伝学共同報告書11」；33〜34.MAL
EPSY S., NADOLSKA-ORCZYK N.共著（1983年）−「Z. Pf
anzenphysiologie 111 ：；273〜276.MANIATIS T., FRI
TSCH E.F.及びSAMBROOK J.（1982年）−「分子クローニ
ング、実験マニュアル（Molecular cloning, a laborat
ory manual）」 MARCHOUX G.著−自然科学博士論文（1975年）−「キュ
ウリのモザイク病ウイルスのＲＮＡの生理学的及び遺伝
学的特性」MORENO V., GARCIA-SOGO M., GRANELL I.,GA
RCIA-SOGO B., ROIG L.A.共著（1985年）−「植物細胞
組織及び器官培養（Plant Cell Tissue and Organ Cult
ure）5」；139〜146.MSIKITA W., SKIRVIN R.M., JUVIK
J.A., SPLITTSTOESSER W.E. 共著（1988年）−「カボ
チャ属遺伝学共同報告書11」；5〜7.MURASHIGE T., SKO
OGF.共著（1962年）−「Physialogia plantarum （植物
生理学）」15；473〜497.NIEDZ R.P., SMITH S.C., DUN
BAR K.B.,MURAKISHI H.H., STEPHENS C.T.共著（1989
年）−「植物細胞組織及び器官培養」（印刷中） ORIDATE T., OOSAWA K. 共著（1986年）−「Japan J. B
reeding（日本育種改良ジャーナル 36 」；424〜428.OR
TS M.C., GARCIA-SOGO B., ROCHE M.V.,ROIGL.A., MORE
NO V.共著（1987年）−「HortScience（園芸学）22」；
666.POWEL ABEL P., NELSON R.S., DE B.,HOFFMANN N.,
ROGERS S.G., FRALEY R.T., BEACHYR.N.共著（1986
年）−「Science 232」 ；738〜743. RAJASEKARAN K., MULLINS M.G., NAIR Y.共著（1983
年）−「植物学会誌52」；417〜420.SHARF S.J., HORN
G.T., ERLICH H.A.共著（1986年）−「Science 233」
；1076〜1078.SMITH S., DUNBAR K., NIEDZ R., MURAK
ASHIH.共著（1988年）−1988年 6月ネバダ州ラスベガ
ス、TCA 年次会議議事録要約 STABA E.J.著（1969年）−「植物化学における最近の進
歩（Recent advancesin phytochemistry）、第２巻」中
の「植物化学者のための技術としての植物組織培養」刊
行；Scikel &Runeckels Appleton Century-crofts、ニ
ューヨーク TUMER N.E., O CONNEL K.M., NELSON R.S., SANDERS P.
R., BEACHY R.N., FRALEY R.T., SHAH D.M.共著（1987
年）−Embo J. 6 ；1181〜 1188. VAECK M., REYNAERTS
A., HOFTE H., JANSENS S., DE BEUCKELEER M., DEAN
C., ZABEAU M.,VAN MONTAGU M., LEEAMANS J.共著（198
7年）−「Nature（自然）328」；33〜37.VAN DUN C.M.
P., BOL J.F.共著（1988年）−「ウイルス学（Virolog
y）167」；649〜652.WEHNER T.C., LOCY R.D.共著（198
1年）−「Hort Science（園芸学）16」；759〜760.VAN
RAAMSDONK L.W.D.著（1989年）−「Prophyta 6」；231
〜232.

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、種々の遺伝子型における再生率に対す
る子葉の年令の影響を示すグラフである。

【図２】図２は、アグロバクテリウム・ツメファシエン
スを介して植物に導入される遺伝子配列の好ましい例
（本発明の好ましい遺伝子配列）を示す。

【図３】図３は、アグロバクテリウム・ツメファシエン
スを介して植物に導入される遺伝子配列の好ましい例
（本発明の他の好ましい遺伝子配列）と菌株Ｉ１７Ｆの
カプシドタンパク質の配列を示す。

【図４】図４は、種々の遺伝子型のメロンにおける芽の
誘導に対するＣａＣｌ₂濃度の影響を示すグラフであ
る。

【図５】図５は、ＣＭＶ菌株Ｉ１７Ｆに対する抗体を用
いて検出された免疫反応性帯（バンド）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ノエル・マリアンヌ フランス国、63000 クレルモント−フェ ランド、リュ・ド・シェバール・ブラン 30 (72)発明者 ピエレット・ジョエル フランス国、63540 ロマグナート、オー ピーエムイー、シェミン・ド・ジロー 26 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 CD13 CD14 CD22 4B024 AA08 BA80 CA02 DA01 EA04 FA02 FA07 FA10 GA11 GA17 4B065 AA89X AA95Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA25 BB37 BC31 CA24 CA53

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マスクメロン種に属する表現型が正常な
   遺伝子導入植物であって、Agrobacterium tumefaciens
   （アグロバクテリウム・ツメファシエンス）の媒介によ
   って導入された少なくとも１つのＤＮＡ配列を含む遺伝
   子導入植物。
2. 【請求項２】 マスクメロン種に属する表現型が正常な
   遺伝子導入植物組織であって、キュウリモザイク病ウイ
   ルスに対する抵抗性を付与する少なくとも１つのＤＮＡ
   配列を含む遺伝子導入植物組織。
3. 【請求項３】 組織が、０〜４日間発芽させた胚から得
   られた子葉である、請求項２記載の遺伝子導入植物組
   織。
4. 【請求項４】 組織がシュート芽である、請求項２記載
   の遺伝子導入植物組織。
5. 【請求項５】 植物組織がメロンである、請求項２記載
   の遺伝子導入植物組織。
6. 【請求項６】 ＤＮＡ配列が、キュウリモザイク病ウイ
   ルスのカプシドタンパク質をコードする、請求項２記載
   の遺伝子導入植物組織。
7. 【請求項７】 ＤＮＡ配列が、以下の配列のコード配列
   を有する、請求項６記載の遺伝子導入植物組織： 【表１】
8. 【請求項８】 ＤＮＡ配列が、以下の配列のコード配列
   を有する、請求項６記載の遺伝子導入植物組織： 【表２】
9. 【請求項９】 マスクメロン種に属する表現型が正常な
   遺伝子導入植物であって、キュウリモザイク病ウイルス
   に対する抵抗性を付与する少なくとも１つのＤＮＡ配列
   を含む、遺伝子導入植物。
10. 【請求項１０】 植物がメロンである、請求項９記載の
    遺伝子導入植物。
11. 【請求項１１】 ＤＮＡ配列が、タバコモザイク病ウイ
    ルスのカプシドタンパク質をコードする、請求項９記載
    の遺伝子導入植物。
12. 【請求項１２】 ＤＮＡ配列が、以下の配列のコード配
    列を有する、請求項９記載の遺伝子導入植物： 【表３】
13. 【請求項１３】 ＤＮＡ配列が、以下の配列のコード配
    列を有する、請求項９記載の遺伝子導入植物： 【表４】
14. 【請求項１４】 請求項９記載の遺伝子導入植物の種
    子。