PT94967B - Processo para a producao de plantas transgenicas pertencentes a especie cucumismelo - Google Patents
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Description
DESCRICÃO
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.° 94.967
REQUERENTE: BIOSEM, francesa, com sede em B.P.l Chappes 63720 Ennezat, França,
EPÍGRAFE: Processo para a produção de plantas transgénicas pertencentes à espécie cucumis melo
INVENTORES: Michiel de Both, Sophia Ben Tahar, Marianne Noel, Joel Perret,
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.
França, 11.08.1989, sob o NS 89 10848, (NP! Mí
RF 1S732
BIOSEM
PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÉNICAS PERTENCENTES À ESPÉCIE CUCUMIS MELO
A presente invenção diz respeito a um processo para a transformação genética de plantas pertencentes ao género Cucumis e em particular do meloeiro (Cucumis melo). Este processo implica a transformação de explantes pelo Agrobacterium tumefaciens e a regeneração, in vitro, das plantas transformadas.
Esta técnica de transformação e regeneração pode ser utilizada para introduzir por exemplo um gene de resistência ao vírus do mosaico do pepineiro em plantas pertencentes à espécie Cucumis melo.
A transferência dos caracteres genéticos de uma espécie vegetal para uma outra é limitada, em numerosos casos, por barreiras de incompatibilidade.
Estes problemas verificam-se particularmente para a família das Cucurbitaceae, para os géneros Cucumis (o meloeiro eo pepineiro) e Cucurbita (a aboboreira).
,-2-
ç»
Assim, a transferência de caracteres agronomicamente interessantes tais como as resistências às doenças virais ou aos insectos, presentes nas espécies selvagens, não pode realizar-se para as espécies cultivadas.
Entre as espécies cultivadas do género Cucumis, os únicos cruzamentos sexuais possíveis fazem-se entre G. sativus (o pepineiro) e as espécies vizinhas C. hardwickii e C. Sikkimensis (Deakin e colab., 1971; Van Raamsdonk, 1989). Os cruzamentos de C. sativus com outras espécies selvagens apenas darão, na maior parte dos casos, frutos estéreis; contudo, o meloeiro (Cucumis melo) apresenta-se como uma espécie recalcitrante que não pode ser cruzada com nenhuma outra espécie (Kho e colab, 1980; Van Raamsdonk, 1989).
As aplicações das novas técnicas da engenharia genética apresentam uma alternativa prometedora para a introdução de novos caracteres com vista a um melhoramento das espécies vegetais.
Entre estas técnicas encontra-se a transformação genética pela introdução de um gene ou de genes estranhos, a hibridação somática por fusão de protoplasmas e a indução de variações somaclonais ou mutações para induzir modificações genéticas.
A transferência de genes estranhos nas espécies vegetais faz-se correntemente mediante utilização de estirpes de Agrobacterium tumefaciens contendo um plasmídeo Ti desarmado (Fraley e colab., •r>
-31986) (Klee e colab, 1987) (Horsch e colab., 1985). Actualmente uma grande variedade de plantas transgénicas foi obtida com Agrobacterium tumefaciens. Esta bactéria permite transferir um gene estranho para células vegetais que poderão regenerar plantas transformadas. Genes que codificam para caracteres agronómicos interessantes foram introduzidos em espécies vegetais. Assim, puderam obter-se plantas resistentes aos herbicidas (Degreef e colab., 1989) e aos insectos (Hilder e colab., 1987; Vaeck e colab., 1987).
A transferência de genes pode fazer-se quer a partir do plasmideo Ti desarmado, após recombinação homóloga, utilizando vectores intermediários (Fraley e colab., 1985) quer a partir de um vector binário com a ajuda de um plasmideo Ti desarmado (Bevan, 1984; Fraley e colab., 1986).
Esta transferência de genes pode assim realizar-se mediante utilização de Agrobecterium rhizogenes que induzirá a partir do tecido transformado raízes em vez de plantas transgénicas. A partir destas raízes transformadas, pode-se regenerar plantas tendo um fenotipo anormal (Chilton e colab., 1982, David e colab., 1984) .
Um carácter particularmente interessante ê a resistência ãs doenças virais. Plantas geneticamente transformadas resistentes a diferentes vírus foram obtidas (Powell Abel e colab., 1986)
(Cuozzo e colab. 1988) (Tumer e colab. 1987) (Hoekema e colab. 1989) (Van Dun e Boi» 1988). Estas plantas (tabaco, batateira e tomateiro) exprimem um gene que codifica para a proteína da capside do vírus para o qual sao resistentes. 0 mecanismo de protecção não está ainda demonstrado.
método clássico para proteger plantas contra doenças virais, consiste em inocular plantas com uma estirpe atenuada de vírus para prevenir a infecção por estirpes mais virulentas. Esta prática, chamada protecção cruzada, permitiu reduzir as perdas de rendimentos devidas às infecções virais (Broadbent 1976) (Fernow 1967) (Costa e Miller 1980).
Para aplicar as técnicas da engenharia genética, um sistema de regeneração de plantas a partir de células individuais ou de explantes, cultivados, será indispensável.
Tais métodos foram descritos recentemento para a regeneração das Cucurbitáceas não-transformadas :
Descreveu-se a regeneração do pepineiro, (Cucumis sativus) após indução de rebentos adventícios sobre caules resultantes de cotílédoneos, (Msikita e colab., 1988; Kim e colab., 1988);
Wehner e Locy (1981) tinham já descrito a indução de rebentos sobre cotilédones. Plantas de pepineiro puderam ser regeneradas mediante embriogénese somática. Estes embriões somáticos desenvol-5vem-se, quer em suspensões celulares resultantes de caules desenvolvidos a partir de explantes foliares (Chee e Tricoli, 1988) ou de hipocótilos (Rajasekaran e colab., 1983), quer directamente sobre caules cotiledonares (Cade e colab., 1988) ou foliares (Malepszy and Nadolska-Orczyk, 1983). Em todos os casos descritos anteriormente o material necessita de passar por uma fase de calogénese e de diferenciação celular. Uma passagem prolongada em calogénese pode induzir variações somaclonais não pretendidas. Em certos casos, estas variações podem provocar uma esterilidade nas plantas regeneradas.
Para o meloeiro (C. melo), a regeneração mediante organogenese foi já descrita quer directamente sobre cotilédones cultivados (Smith e colab., 1988; Niedz e colab., no prelo; Dirks e Van Buggenum, 1989), quer após uma passagem por caules resultantes de cotilédones (Mackay e colab., 1988; Moreno e colab. 1985; Orts e colab., 1987; Bouabdallah e Branchard, 1986), de hipocótilos (Abak e Dumas de Vaulx, 1980; Kathal e colab., 1986) ou de folhas (Kathal e colab., 1988).
A obtenção de plantas de meloeiro resultantes de embriões somáticos foi igualmente descrita (Oridate e Dosawac 1986; Branchard e Chateau, 1988).
Todas estas técnicas necessitam de uma passagem por uma etapa mais ou menos longa de indiferenciação e de calogénese que /
'3
-6-Ρ precederão a diferenciação de rebentos ou de embriões. Estes rebentos podem desenvolver-se e dar lugar quer a plantas com um fenotipo anormal quer a plantas estéreis (Bouabdallah e Branchard, 1986). Além disso, a indução de embriões ou de rebentos resultantes de caules, é menor comparada com a indução directa de rebentos sobre cotilédones.
Uma técnica de regeneração foi igualmente descrita para uma outra espécie de Cucurbitáceas. A aboboreira (Cucurbita pepo) (Jelaska, 1972, 1974). Este autor obteve plantas a partir de embriões somáticas resultantes de caules cultivados durante vários meses.
No que diz respeito â regeneração de plantas geneticamente transformadas, a patente de invenção europeia EP-A-0262972 descreve a transformação de Cucumis sativus (pepineiro) pelo Agrobacterium rhizogenes seguida de regeneração e a patente de invenção europeia EP-A-0265100 descreve a transformação de Cucumis sativus mediante fusão de protoplastas, seguida de regeneração.
De Both e Ben Tahar (1989) descreveram-se a obtenção de caules de meloeiro transformados. Estes caules que se desenvolveram sobre canamicina e que exprimem o gene da j^-glucuronidase não puderam desenvolver plantas transgénicas, apesar da aplicação de um protocolo experimental jã utilizado com sucesso na regene<0*
-7ração do meloeiro não-transformado.
A obtenção de plantas transgênicas na espécie Cucumis melo” nunca foi descrita.
facto de não existir até hoje método a regeneração, a partir de tecidos transformados, na espécie Cucumis melo, impede a obtenção de plantas transgênicas de meloeiro exprimindo caracteres agronomicamente interessantes tal como a resistência a doenças virais.
Um dos objectivos da presente invenção é conseguir a regene raçao de plantas transgênicas pertencentes à espécie Cucumis melo.
Um outro objectivo da presente invenção ê definir os meios de cultura que são necessários para cada etapa da regeneração de plantas transgênicas pertencentes ao género Cucumis.
Esta invenção aplica-se mais particularmente ã transformação genética de cotilédones, de hipocótilos e de folhas da espécie Cucumis melo mediante utilização de Agrobacterium tumefaciens seguida de indução de rebentos e da obtenção de plantas geneticamente transformadas. A transformação genética dos diferentes tecidos, anteriormente descritos, seguida da organogénese permite o melhoramento das espécies cultivadas e
ί * mais particularmente da espécie Cucumis melo”. As plantas regeneradas nas condiçoes descritas nesta invenção têm um fenotipo normal e são férteis.
Um outro objectivo desta invenção é a transformação genética do meloeiro para introduzir um gene de resistência ao vírus do mosaico do pepineiro (CMV).
Estes objectivos são atingidos pelo processo de acordo com a presente invenção.
A presente invenção diz respeito a um processo para a produção de plântulas transgénicas a partir de rebentos geneticamente transformados, pertencendo as referidas plântulas à espécie Cucumis melo e contendo pelo menos um gene introduzido por intermédio do Agrobacterium tumefaciens” caracterizado pela cultura em duas etapas sucessivas de rebentos geneticamente transformados, tendo a primeira destas etapas de cultura lugar sobre um meio de cultura celular vegetal contendo uma citocinina, e mais particularmente a 6-benzil-aminopurina (BAP), e a segunda, que se efectua quando os rebentos atingem pelo menos cerca de 3 mm de altura, tem lugar sobre um meio de cultura celular vegetal contendo como macroelementos :
KH^PO^ entre cerca de 50 e cerca de 100 mgL·-''
MgSO^ 75 e 300 ρ-
| CaCL2.2H2O | entre | cerca | de | 500 | e | cerca | de | 2500 | mgL' |
| kno3 | 11 | II | II | 750 | e | 11 | 11 | 1200 | 11 |
| NH,N0o | II | II | 11 | 150 | e | 11 | 11 | 200 | 11 |
A presente invenção diz igualmente respeito a um processo para a indução de rebentos geneticamente transformados a partir de explantes geneticamente transformados e contendo pelo menos um gene introduzido pelo Agrobactérium tumefaciens, sendo os referidos explantes provenientes de uma planta da espécie Cucumis melo, efectuando-se a indução sobre um meio de indução de rebentos geneticamente transformados comportando o conjunto sais minerais e vitaminas normalmente necessárias para a indução de rebentos a partir de explantes geneticamente não-transformados e contendo entre os sais inorgânicos cloreto de cálcio e bacto-agar ou agar-agar, caracterizado pelo facto de o teor deste meio em CaCl2 estar compreendido entre cerca de 440 e cerca de 2200 mgL-^ calculado em CaCl2.2H2O e em bacto-agar ou em agar-agar estar compreendido entre cerca de 0,8 e cerca de 1,2%, sendo o referido meio de indução adicionado de entre cerca de 0,3 e cerca de 1,13 mgL-^ de 6-benzil-aminopurina (BAP) e entre 0 e cerca de 1,3 mgL 1 de ãcido indol-3-acético (AIA).
De acordo com uma forma de realização preferida segundo a presente invenção, este processo de indução de rebentos transformados afectua-se sobre um meio de indução em que o teor em cálcio está compreendido entre cerca de 1000 e cerca de 2200 mgL *ί
-10mais particularmente entre cerca de 1750 e cerca de 2200 mgL
Mediante realização dos processos de acordo com a presente invenção pode-se transformar e regenerar um explante de uma planta pertencente ã espécie Cucumis melo em plantas transgénicas. A presente invenção diz igualmente respeito âs plantas transgénicas, âs plântulas transgénicas, aos rebentos transformados e aos explantes transformados susceptíveis de ser produzidos pelos processos de acordo com a presente invenção, assim como âs sementes.
A regeneração de plantas transformadas ou não transformadas a partir de explantes implica várias etapas de cultura celular, necessitando cada etapa de um meio de cultura de aditivos, por exemplo citocininas e de condições de cultura muito exactas e que variam frequentemente de acordo com a espécie a regenerar e de acordo com a via de regeneração (quer dizer mediante organo génese ou mediante embriogênese somática por exemplo.
Ainda que se conheça um conjunto de meios e de condições para a regeneração de uma planta não transformada, é impossível prever se estes mesmos meios e condições poderão ser aplicados com sucesso na regeneração da planta quando esta se encontra no estado transformado. A etapa suplementar de transformação necessita de utilizar outros meios, tais como meios de transformação e de co-cultura, e outros aditivos, por exemplo, a cefotaxina, ,-11que podem exercer um efeito sobre o comportamento das células em meios e condições aplicáveis nas etapas ulteriores. A suscepti bilidade das plantas transformadas à vitrificação é igualmente um elemento que necessita por vezes do desenvolvimento de condiçoes especiais.
Plantas vitrificadas sao caracterizadas por uma gama de anomalias morfológicas e fisiológicas resultantes das condições de cultura in vitro. As causas frequentemente citadas para explicar a vitrificação são :
uma concentração muito elevada em iões NH^+ ou em citocininas:
uma concentração muito baixa em agar (ou outro produto gelificante) no meio;
uma sensibilidade ao etileno produzida pela planta e que se encontra no volume do meio de cultura (Kevers e colab., 1984).
A vitrificação das culturas de plântulas de meloeiro in vitro causada pela presença de citocininas no meio de cultura foi descrita por Leshem e colab. (1984).
Todos estes elementos põem por conseguinte na afinação um conjunto de meios e de condições que conduz â regeneração de uma planta transgénica extremamente complexa.
-12Os inventores foram bem sucedidos na formação de um meio de indução de rebentos que permite a indução de rebentos genetica mente transformados a partir de explantes transformados. Este meio é um meio de indução de rebentos comportando o conjunto dos sais inorgânicos e vitaminas normalmente necessárias para a indução de rebentos a partir de explantes geneticamente não-trans^ formados e contendo entre os sais inorgânicos cloreto de cálcio e bacto-agar ou agar-agar, sendo o teor deste meio em CaC^ de cerca de 440 a cerca de 2200 mgL calculado em CaC^.ÊI^O e em bacto-agar óu agar-agar de cerca de 0,8 a cerca de 1,2%. Este meio de indução é adicionado de cerca de 0,3 a cerca de 1,13 mgL de 6-benzil-aminopurina (BAP) e cerca de 0 a cerca de 1,3 -1 mgL de acido indol-3-acético (AIA).
Um meio de indução particularmente preferido é um meio de indução cujo teor em cálcio é de cerca de 1000 cerca de 2200 mgL-·'', e mais particularmente de cerca de 1750 a cerca de 2200 mgL 1. Estas concentrações de cálcio representam um aumento de cerca de quatro a cinco vezes as concentrações utilizadas habitualmente nos meios de indução. De uma maneira geral, os inventores verificaram que concentrações elevadas de cálcio têm um efeito muito benéfico sobre as etapas de regeneração do melão transformado. A figura 4 mostra o efeito de diferentes concentrações de cálcio sobre a indução de rebentos em diferentes genotipos de melão.
De acordo com um modo de realização da presente invenção, o meio de indução de rebentos pode ser o meio de Murashige e Skoog (1962), conhecido sob o nome de meio MS, cujo o teor em cloreto de cálcio e bacto-agar ou agar-agar estã modificado, eventualmente, respeitando os limites indicados anteriormente. 0 meio MS, sem modificação, tem a seguinte composição :
| Meio MS | (mgL ) |
| (NH4)NO3 | 1 650 |
| kno3 | 1 900 |
| CaCl2.2H20 | 440 |
| MgSO4.7H2O | 370 |
| kh2po4 | 170 |
| FeSO4.7H2O | 27,8 |
| Na2EDTA | 33,6 |
| MnSO4.4H2O | 22,3 |
| ZnSO4.7H2O | 8,6 |
| h3bo3 | 6,2 |
| Kl | 0,83 |
| Na2Mo04.2H20 | 0,25 |
| CuSO4.5H2O | 0,025 |
| CoC12.6H20 | 0,025 |
| mio-inositol | 100 |
| ácido nicotínico | 0,5 |
| piridoxina.HCl | 0,5 |
| tiamina.HCl | 0,1 |
glicina 2,0 sacarose 0 000 pH 5,7 meio MS solidificado contém além disso 0,87 de agar-agar ou bacto-agar.
Um meio de indução preferido é o meio MS adicionado de 0,3 a 1,13 mgL 1 de BAP, e mais particularmente 0,85 mg/L de BAP sem qualquer outra citocinina.
As vitaminas presentes no meio de indução podem ser as normalmente presentes no meio MS. De acordo com um outro modo de realização de acordo com a presente invenção, estas vitaminas podem ser as vitaminas Staba (Staba, 1969).
Vitaminas de 11 St aba
| nicotinamida | 2 mgL1 |
| piridoxina-HCl | 2 mgL 1 |
| d-biotina | 1 mgL 1 |
| Ca-pantotenato | 1 mgL1 |
| tiamina-HCl | 1 mgL1 |
| cloreto de colina | 1 mgL1 |
| ãcido p-amino-benzoico | 0,5 mgL1 |
| ácido fólico | 0,5 mgL 1 |
| riboflavina | 0,5 mgL 1 |
| cianocobalamina | 1,5 yttgL1 |
Um meio de indução de rebentos particularmente preferido é
| o meio chamado meio M.I. afinado pelos inventores. 0 meio M.I. | |||
| tem a seguinte c | composição : | ||
| Meio M.I. Macro-elementos | : KNO3 | 1900 | mgL 1 |
| NH4NO3 | 1650 | ||
| CaCl2.2H2O | 2200 | ||
| MgSO^.7H2O | 370 | ||
| kh3po4 | 170 | ||
| Na£EDTA | idem MS | ||
| Micro-elementos | idem MS | ||
| Vitaminas | St aba | ||
| Mio-inositol | 100 | mgL-1 | |
| Sacarose | 30 | gL1 | |
| Agar-agar | 0,8% | ||
| BAP | 3,75 ytM | ||
| ABA | 1 yttM | ||
| 0 teor em | Agar do meio M.I. | solidificado pode | estar modifi- |
| cado entre 0,8% | e 1% (p/v), sendo | 0,8% o preferido. | É possível |
| adicionar cerca | de 1 xtM de ácido abscissico aos meios de indução | ||
| de acordo com a | presente invenção. |
Um outro meio utilizado pelos inventores é o que permite a obtenção de plântulas transgénicas a partir de rebentos transformados .
-16,1®*'
Este meio é um meio de cultura celular vegetal que contém como macro-elementos inorgânicos :
| KH2PO4 | cerca de | 50 - cerca de | 100 | ||
| MgSO4.7H2O | II | 11 | 75 - ” | 11 | 300 |
| CaCl2.2H2O | II | II | 500 - | II | 2500 |
| kno3 | II | II | 750 - | II | 1200 |
| ΝΗ,ΝΟη | 11 | II | 150 - | 11 | 200 |
Os outros constituintes do meio, por exemplo, micro-elementos, vitaminas, etc., são normalmente os utilizados nos meios de cultura celular, por exemplo o meio MS, e nas concentrações habituais. 0 teor em sacarose pode ser reduzido atê cerca de 10 gL 1.
Em um modo de realização preferido da presente invenção, o meio para o desenvolvimento de plântulas transgênicas contém como macro-elementos :
| kh2po4 | 85 | mgL |
| MgSO4.7H2O | 185 | II |
| CaCl2.2H20 | 1720 | II |
| kno3 | 950 | 11 |
| nh4no3 | 165 | 11 |
f-uDe salientar que o teor em CaC^^^O de acordo com este aspecto da presente invenção é cerca de cinco vezes mais elevado que nos meios clássicos. Pelo contrário, a concentração de KH^PO^, de MgSO^.YH^O e de KNO^ é de cerca de metade da que se encontra nos outros meios deste tipo e a de NH^NO^ é de cerca de um décimo.
Um meio particuiarmente preferido de acordo com a presente invenção para o desenvolvimento das plântulas transgénicas, é o meio chamado NB6, cuja composição está indicada no Quadro 1.
Este meio, utilizado pelos inventores, é essencial para se obter plântulas transgénicas a partir de rebentos. Contudo, é importante que a cultura de rebentos seja efectuada em duas etapas, tendo a primeira destas etapas lugar sobre um primeiro meio de cultura celular vegetal contendo uma citocinina. A citocinina pode ser a cinetina ou a BAP, sendo a BAP particuiarmente preferida. Um primeiro meio de cultura celular apropriado é, por exemplo, o meio MS adicionado de 0,1 - 1,2 mgL-^ de BAP e em particular de cerca de 0,2 mgL^. Este meio de cultura ê normalmente solidificado mediante adição de cerca de 0,87 de agar-agar ou bacto-agar.
Logo que os rebentos atingem cerca de 3 mm de altura ou mais sobre este primeiro meio, transferem-se para um segundo meio que é o meio que permite a obtenção de plântulas transgénicas e anterior mente definido com pormenor, por exemplo o meio MB6. Este meio
-18será chamado na descrição que se segue o meio do tipo MB6.
Sobre este meio do tipo MB6, os rebentos de pelo menos 3 mm de altura crescem e ao fim de cerca de 4 semanas as plântulas enraízam. Uma vez que as raízes secundárias se desenvolvem sobre este meio, as plantas podem ser transferidas para vasos contendo uma mistura de terra e areia grossa e cultivadas em estufa. As plantas transgênicas assim obtidas tem um fenotipo normal e são férteis.
Como ê evidente, os meios de acordo com a presente invenção contêm, eventualmente, agentes que permitem a selecção de transformantes, por exemplo antibióticos e agentes que inibem a cresci mento de A. tumefaciens, por exemplo a cefotaxima. As concentra ções de cefotaxima que podem ser utilizadas são da ordem de cerca -1 -1 de 200 mgL a cerca de 400 mgL . A aplicaçao simultânea de uma -1 selecção com a canamicina permite utilizar cerca de 200 mgL de cefotaxima para a inibição. É particularmente vantajoso utilizar
200 mgL de cefotaxima visto que o desenvolvimento das plantulas não é afectado por esta concentração mais fraca. As concentrações de canamicina utilizadas podem variar entre cerca de 50 e 400 mgL \ Se se utilizar o meio M.I. como meio de selecção, a concen tração de canamicina deve estar compreendida entre 150 mgL-^ e 400 mgL!·.
9De acordo com um modo de realização segundo a presente invenção o meio de indução de rebentos e o meio do tipo MB6 podem utilizar-se de maneira sucessiva na regeneração de plantas transgénicas de melão a partir de explantes transformados. Cortam-se os rebentos induzidos pela cultura sobre o meio de indução do explante e transferem-se para o primeiro meio de desenvolvimento de plântulas contendo citocinina, por exemplo BAP, e, em seguida, para o meio do tipo MB6.
De acordo com um outro modo de realização da presente invenção, trasferem-se explantes de plantas pertencentes â espécie Cucumis melo, através do agrobacterium tumefaciens e, em seguida, cultivam-se os explantes transformados assim obtidos, no meio de indução de rebentos. Submetem-se então os rebentos â etapa de desenvolvimento de plântulas transgénicas, que, como já se explicou, se desenrola em duas etapas, sendo a última destas etapas efectuada sobre o meio do tipo MB6. Finalmente, cultivam-se as plântulas transgénicas assim obtidas de acordo com métodos já conhecidos para o desenvolvimento de plântulas não-transformadas, para se obter plantas transgénicas.
explante utilizado como material de partida para a transformação e a regeneração de melões transgénicos pode ser qualquer explante transformãvel pelo Agrobacterium tumefaciens, por exemplo : cotilédones, hipócotilos, folhas. A utilização de cotilédones como explantes é particularmente vantajosa. Os invenϊ -2θs tores verificaram que o potencial de regeneração de rebentos em cotilédones colhidos em embriões tendo até 4 dias de cultura, e mais particularmente 2 dias de cultura, é superior ao apresentado por cotilédones mais jovens ou mais velhos (ver fig. 1). Este fenómeno foi observado em um grande número de diferentes variedades. É importante notar que os cotilédones são provenientes de embriões que germinaram durante 0 a 4 dias, sendo os embriões isolados de sementes maduras de melão. Uma germinação a partir de sementes não conduziu aos mesmos resultados vantajosos. 0 meio de germinação contém de preferência 0,8% (peso/volume) de agar-agar em ãgua estéril, podendo-se-lhe adicionar 50yUm de CoC^ ou NiC^, o que parece melhorar a indução dos rebentos na etapa seguinte. Como se indicou anteriormente, a duração da germinação está compreendida entre 0 e 4 dias. Uma duração de menos de três dias, e particularmente de dois dias, ê particularmente preferida. A germinação efectua-se normalmente sob uma intensidade luminosa compreendida entre 60 e 80ytEm” S~ , e um fotoperíodo de 16/24 horas a cerca de 26°C durante o dia e 24°C durante a noite.
A transformação genética de explantes de melão efectua-se mediante contacto de uma estirpe de A. tumefaciens, por exemplo sob a forma de uma suspensão bacteriana, com o explante que sofreu um golpe, por exemplo mediante corte. No caso de cotilédones, o contacto com as bactérias efectua-se quando os cotilédones têm entre 0 e 4 dias de idade, e mais particularmente 2 dias
-21...y
A duração deste contacto não é crítico; por exemplo, pode durar entre cerca de 30 minutos e uma hora e efectua-se por exemplo em uma suspensão em um meio de cultura M.S..
Secam-se então os explantes sobre papel de filtro estéril e transferem-se para um meio de co-cultura, que pode ser um meio MS solidificado com agar-agar. As condições de intensidade luminosa e de fotoperíodo que se aplicam quando da co-cultura são em geral as utilizadas quando da etapa de germinação. Normalmente, esta etapa de co-cultura dura cerca de 48 horas.
Numerosas espécies com nopalina e octapina de A tumefaciens são conhecidas e podem ser utilizadas para a transformação genética da espécie Cucumis melo.
Os inventores utilizaram a estirpe com octopina LBA4404 contendo o plasmídeo Ti pAL4404 mais o vector binário pGA472 oferecido por G. Ann, Washington University (Ann e colab, 1985) ou a estirpe com nopalina C58'3 (Ben Tahar e De Both, 1988). Retirou-se a estas estirpes o seu vector e introduziu-se o vector binário pBI121 (oferecido por R. Jefferson, Plant Breeding Institut) (Jefferson e colab., 1987) na estirpe LBA4404 que nao contêm o vector pGA472. Este vector binário possui um gene marcador de resistência à canamicina e um gene repórter, o gene da ^-glucuronidase que codifica para uma actividade enzimática. Este gene de resistência ã canamicina contém a região que codifica para o gene /-22ΐί
V da neomicina fosfotransferase isolado do transportador Tn5 flanqueado em 5' e 3' pelo promotor e terminador do gene da nopalina sintase. Flanqueia-se a região que codifica para o gene da ^-glucoronidase, do promotor do ARN 35S do vírus do mosaico da couve-flor e do terminador do gene da nopalina sintase.
Conserva-se a estirpe LBA4404 contendo o vector pBI121 a -20°C em glicerol a 15%. Esta estirpe desenvolve-se em um meio LB contendo 50 mg/L de canamicina.
Depois da etapa de co-cultura, transferem-se os explantes transformados para o meio de indução de rebentos descrito anteriormente. A este meio adicionam-se normalmente agentes que permitem a selecção dos transformantes, por exemplo a canamicina e agentes que inibam o crescimento de A. tumefaciens, por exemplo a cefotaxima.
Os inventores verificaram que a utilização de caixas de Petri Falcon de 9 cm de diâmetro da resultados particularmente vantajosos quando da etapa de indução de rebentos. As condições de intensidade luminosa e de fotoperíodo aplicadas durante esta etapa são as descritas na etapa de germinação sendo -2 -1 uma intensidade luminosa de 80ytE.M S particularmente preferida.
-23.s*
Os rebentos desenvolvem-se directamente sobre o explante e logo que eles atinjam um tamanho que permita a sua manipulação física (cerca de 0,2 - 1,5 mm, e mais particularmente 0,5 mm), são cortados do explante e transferidos para um novo meio, que normalmente é o que contém a BAP ou uma outra citocinina e que constitui o primeiro meio de cultura para o desenvolvimento de plântuias.
Em uma variante do processo de acordo com a presente invenção, a duração da etapa de indução, que normalmente é de cerca de 21 dias pode ser encurtada para 14 dias. Neste caso, os rebentos em vez de serem transferidos directamente para o primeiro meio de desenvolvimento de plântulas podem ser transferidos para um meio MS sem hormonas durante uma semana antes de serem submetidos â etapa de desenvolvimento de plântulas.
A etapa de desenvolvimento de plântulas decorre em duas partes como se explicou antes. Os rebentos desenvolvem-se sobre este meio e logo que atingem uma altura de cerca de 3 mm a 1,0 cm, são transferidos para o meio MB6, a que se adicionaram agentes selectivos para seleccionar os transformantes, por exemplo antibióticos e agentes que inibem o crescimento de A. tumefaciens. Contudo, estes agentes não são essenciais na regeneração.
Ao fim de algumas semanas sobre este meio, as plântulas transgénicas enraízam. As plantas podem ser transferidas para vasos contendo terra e areia grossa (2:1 v/v) imediatamente a seguir ao desenvolvimento de raízes secundárias.
De acordo com um modo de realização preferido da presente invenção, introduz-se um gene que cidifica para a proteína da capside do vírus do mosaico do pepineiro, em um explante de meloeiro por intermédio de A. tumefaciens. A presente invenção diz respeito a estas sequências e às sequências de ARN correspondentes (ver figuras 2 e 3), assim como aos fragmentos destas sequências aptas para conferir resistência ao CMV.
Este vírus é constituído por 4 ARNs de diferentes tamanhos; o gene da proteína da capside do CMV estã presente sobre o ARN 3 na extremidade 3' e sobre o ARN4. A tradução em proteína de capside apenas se faz a partir do ARN 4, tendo a extremidade 3' do ARN 3 estritamente a mesma sequência nocleotídica. Os inventores isolaram e sequenciaram o gene da proteína de capside de duas estirpes virulentas provenientes de diferentes regiões geográficas.
Neste aspecto da presente invenção utilizou-se uma estirpe de CMV virulenta francesa, chamada I17F e um plasmídeo (pUC18) contendo o ADN complementar do ARN 3 de uma estirpe virulenta, a FNY, isolado em New York em meloeiros infectados. É evidente
-25que se poderá introduzir qualquer outro gene nos explantes de meloeiro, por exemplo genes que codificam para a proteína de capside de outras estirpes de GMV, e outros vírus; o processo de acordo com a presente invenção permite, por conseguinte, a regeneração da planta transgénica contendo este gene.
EXEMPLOS
A) Processo para a produção de meloeiro transgénico exprimindo o gene de resistência à eanamicina e o gene da -glucuronidase.
1. GERMINAÇÃO DOS EMBRIÕES DE CUCUMIS MELO
Utilizam-se sementes maduras de melão (Cucumis melo L) para a obtenção de embriões maduros. Abrem-se os tegumentos da semente com um escalpelo evitando ferir os embriões. Esterilizam-se os embriões mediante imersão durante 5 segundos em etanol puro e depois em 200 ml de uma solução saturada de hipoclorito de cálcio e 0,05% de Tween 80 durante 20 minutos sob agitação constante. Lavam-se em seguida os embriões em água estéril durante 20 minutos. Secam-se, em seguida, os embriões sobre papel de filtro e depositam-se em caixas de Petri estéreis contendo 0,8% (peso/volume) de agar-agar em água estéril.
Deixa-se os embriões germinar durante dois dias em câmaras -2 -1 de cultura sob uma intensidade luminosa de 60 a 80 z<Em S e um
fotoperíodo de 16/24 horas a 26°C durante o dia e a 24°C durante a noite.
2. AS ESTIRPES DE AGROBACTERIUM TUMEFACIENS E OS VECTORES DE TRANSFORMAÇÃO.
Para as experiências de transformação cultiva-se a estirpe LBA4404 contendo o vector pBI121 (descrito nas páginas anteriores), em 10 ml de meio Luria-Bertani sem antibiótico sob agitação contínua (200 rpm) a 28°C durante 12 horas. Esta solução bacteriana vai servir para inocular um volume maior de LB (meio Luria-Bertani) (50 ml) suplementado com 100 mg L-^ de rifampicina e 50 mg L 1 d canamicina. 0 meio LB é constituído por 10 g de bactotriptona, 5 g de extractos de levedura e 10 g de cloreto de sódio por litro a pH 7,5. Mantém-se esta suspensão bacteriana sob agitação a 28°C durante 4 a 5 horas até que a densidade óptica seja de 1 para um comprimento de onda de 660 nanómetros. Centrifuga-se, em seguida, a suspensão bacteriana a 4000 rpm durante 5 minutos e retoma-se o sedimento no mesmo volume inicial no meio MS. Esta solução está pronta a contactar com o tecido vegetal.
3. PROCESSO DE TRANSFORMAÇÃO
Colhem-se com precaução os cotilédones resultantes de embriões que germinaram durante dois dias sobre o meio descrito
./·· no parágrafo 1, para evitar os tecidos do meristema apical. Cotilédones mais jovens ou mais velhos têm um potencial de regeneração de rebentos reduzido comparado com cotilédones colhidos de embriões com dois dias de cultura. Este resultado estã demostrado na figura (1).
Cortam-se cotilédones de dois dias em 4 na suspensão bacteriana retomada no meio MS para assegurar, após o corte, um contacto com a estirpe LBA4404 contendo o vector binário pBI121. Deixam-se os fragmentos de cotilédones durante um tempo compreendido entre 30 minutos e uma hora na suspensão bacteriana.
Seca-se cada fragmento sobre papel de filtro estéril e transfere-se para caixas de Petri contendo o meio MS solificado com 0,87 de agar-agar.
Cultivam-se os explantes em uma câmara de cultura in vitro de acordo com as condições de intensidade luminosa e de fotoperíodo descritas no parágrafo 1 e durante 48 horas.
4. INDUÇÃO DE REBENTOS
Após esta co-cultura de dois dias descrita anteriormente, transferem-se os fragmentos de cotilédones para um novo meio contendo MS adicionado de 400 mg.L^ de cefotaxima (Roussel-Uclaf),
-1 -1 50 mg.L de sulfato de canamicina, 1,13 mg.L de BAP e 0,88 mg.L~l de ΑΙΑ. A presença de cefotaxima é necessária para inibir
-28o crescimento da bactéria. 0 sulfato de canamicina é utilizado como agente selectivo para seleccionar assim as células transformadas. As células transformadas serão as que possuam no seu genoma o gene da resistência â canamicina e o gene da j^-glucuronidase descrito no parágrafo 2. A hormona vegetal BAP adicionada ao meio de cultura é necessária para a indução de rebentos nas concentrações descritas antes. A presença de AIA é, pelo contrário, facultativa.
Estas células assim transformadas induzirão rebentos que se desenvolverão em 50 mg/L de canamicina.
Incubam-se fragmentos de cotilédones em câmaras de cultura in vitro de acordo com as condições de intensidade luminosa e de fotoperíodo descritas no parágrafo 1.
Ao fim de 3 a 5 semanas os rebentos desenvolvem-se na presença de 50 mg/litro de canamicina directamente a partir dos fragmentos de cotilédones com este meio de indução, nenhum rebento se pode desenvolver em 50 mg/litro de canamicina a partir de fragmentos de cotilédones não transformados. Este efeito ê demonstrado pela figura 2.
5. DESENVOLVIMENTO DE PLÂNTULAS TRANSGÊNICAS
Logo que os rebentos, induzidos directamente sobre os fragmentos de cotilédones cultivados sobre o meio descrito no /-29V parágrafo 3, na presença de 50 mg/litro de canamicina, atingem o tamanho de 0,5 mm de altura, sao cortados dos fragmentos de cotilédones. Transferem-se estes rebentos individualmente para um novo meio de cultura contendo MS adicionado de 0,68 mg.litro-1
-1 -1 de BAP, 400 mg.litro de cefotaxima e 50 mg.litro de sulfato de canamicina. Estes rebentos desenvolvem-se sobre este meio e depois de 2 a 4 semanas quando eles atingem 3 mm de altura, trans ferem-se de novo individualmente, desta vez para vasos de cultura de 500 ml de volume sobre 100 ml de meio MB6 (ver quadro 1) contendo 50 mg.L 1 de sulfato de canamicina e 400 mg.L 1 de cefotaxima.
Os rebentos de 3 mm de altura desenvolvem-se sobre este meio anteriormente descrito, e ao fim de 4 semanas as plântulas transgénicas enraízam. Logo que se desenvolvam as raízes secundárias sobre o meio descrito anteriormente, transferem-se as plantas para vasos contendo uma mistura de terra e areia grossa (2:1) e cultivam-se em estufa. Durante os sete primeiros dias, protegem-se as plantas com uma cobertura de plástico para conservar uma atmosfera húmida. Regam-se as plantas diariamente.
A foto 1 apresenta uma planta transgénica (B) e uma planta não transgênica (A).
Levou-se uma das plantas assim regeneradas (chamada 884-5) à floração e autofecundação. Recolheram-se as sementes. Germinaram quatro plantas R^ e confirmou-se o seu carácter transgênico
de acordo com testes descritos a seguir.
primeiro teste, que detecta a actividade da enzima P -glucuronidase (G.U.S.) efectuou-se de acordo com o método descrito por Jefferson e colab. (1987). Um outro teste implica a indução de caules sobre uma folba ou sobre um explante de pecíolo em um meio contendo canamicina. A formação de um caule indica que a planta ê transgênica. A concentração de canamicina necessária em um meio M.S. contendo BAP e NAA, varia em função da concentração de hormona e de tecido. Por exemplo, em um meio
M.S. adicionado de 1 mgL de BAP e de NAA, 100 mg/L de canamicina são suficientes para inibir a formação de caules sobre folhas e sobre pecíolos.
A presença de genes estranhos em plantas regeneradas foi igualmente testada com a reacção de polimerase em cadeia (P.C.R.) (ver Lassner e colab. 1989; De Both 1990) utilizando 2,5 unidades de Taq polimerase. Os iniciadores utilizados permitem a amplificação simultânea do gene GUS e do gene NPT. A PCR apenas se efectuou sobre a geração Rl, para evitar falsos positivos devidos â presença de Agrobacteria no tecido regenerado.
B) Produção de meloeiros transgénicos que exprimem um gene de resistência ao herbicida fosfinotricina.
vector binário pIBló.l (Hoechst, GmbH, Frankfurt, FRG) /-31comporta o gene neo e o gene pat (fosfinotricina-acetil-transferase), que confere resistência â fosfinotricina.
Utilizou-se o processo de transformação e de regeneração descrito no exemplo A para a produção de plantas de genotipo Vedrantais, transformado pelo vector. 0 carácter transgênico das plantas assim obtidas foi confirmado pelo teste da formação de caules e de hibridação de sondas de neo de acordo com o método descrito por Southern.
Estas plantas foram autofecundadas e as sementes assim obtidas germinadas em estufa. As plantas assim obtidas sofreram um tratamento com o herbicida e algumas mostraram-se resistentes.
C) Produção de meloeiros transgénicos que exprimem a proteína de capside do vírus do mosaico do pepineiro (CMV).
Nos exemplos que se seguem, uma estirpe de CMV virulenta francesa, chamada I17F e um plasmídeo (pUC18) contendo o ADN complementar do ARN3 de uma estirpe virulenta, chamada FNY, isolada em New York em meloeiros infectados, serviram como fonte de genes de proteínas de capside do C.M.V..
-321. CLONAGEM DA PROTEÍNA DE CAPSIDE DA ESTIRPE FNY
A partir do mapa de restrição do plasmídeo pUC18 contendo o ADNc do ARN3 determinado por P. Palukaitis clonou-se um fragmento com um tamanho de 1,6 Kb cobrindo a extremidade 3' da sequência da proteína de capside de 1 Kb em um vector de expressão Blue scribe. Sub-clonou-se este ADNc no vector Blue scribe (BS+) (catálogo Stratagene) e submeteu-se cada fragmento sub-clonado a uma sequência de acordo com o protocolo sequenase R (versão 2 de USB : United State Biochemical). Analisaram-se os fragmentos que sofreram a sequenciação sobre gel de acrilamida a 6%, desnaturante de acordo com o método descrito em Maniatis e colab, 1982. Fixou-se, em seguida, o gel durante 10 minutos em 10% de ácido acético, secou-se sob vazio durante 30 minutos a 80°C e submeteu-se, depois, a uma autoradiografia (Maniatis e colab. 1982). 0 início da sequência líder da proteína de capside FNY tem o mesmo comprimento que a da estirpe Y japonesa (comunicação privada com P. Palukaitis). A sequência parcial do ARN4 da estirpe Y foi publicada (Hidaka e colab. 1985). Por comparação com esta sequência é possível posicionar o início da sequência líder da estirpe FNY.
A sequência da proteína da capside cobrindo a sequência líder, a região que codifica e a região 3' que não codifica está representada na figura 2. A partir desta sequência foram sinteti zados 2 oligonucleotídos de 30 bases complementares em 3' e5' e a
-33Ί» sequência da proteína de capside foi ampliada utilizando a técnica PCR (Polimerase Chain Reaction) descrito por Scharf e colab.
(1986). 0 produto da amplificação foi analisado sobre gel de agarose a 1% para confirmar o tamanho deste fragmento de 1034bp.
Os oligonucleotídos com 5' e 3' possuem sítios de restrição BamHl na sua extremidade. Assim, foi possível clonar este produto de amplificação no sítio único BamHl do vector pBIOS3. Este vector pBIOS3 construído no laboratório dos inventores possui um promotor e um terminador vegetal. 0 promotor 35S provêm do ARN 35S do vírus do mosaico da couve-flor e o terminador NOS provém da região 3', que não codifica, do gene da nopalina sintase.
2. CLONAGEM DA PROTElNA DA CAPSIDE DA ESTIRPE I17F
Onocularam-se plantas de tomateiro no estádio de 2 folhas com a estirpe I17F do CMV. Quinze dias depois da infecção, purifi. cou-se o vírus a partir das folhas infectadas de acordo com a técnica descrita na tese do Dr. G. Marchoux (1975). A qualidade do ARN virai (ARN 1,2,3 e 4) ê controlada sobre gel de agarose a 1%. Uma vez controlado, sintetiza-se um ADN complementar aos 4 ARNs utilizando o estojo de Amersham CDNA Synthesis System plus. Deposita-se o ADN radioactivo complementar dos 4 ARNs sobre um geldeagarose a 1Z. Depois da migração destes ADNs seca-se o gel sob vazio e submete-se depois a uma autoradiografia (Maniatis e colab. 1982). Estes ADNs complementares, possuindo extremidades de fim livre, são, em seguida, clonados no sítio Smal do
-34plasmídeo pUC18 desfosforilado (Maniatis e colab. 1982). Este plasmídeo comporta a resistência â ampicilina. Bactérias E. coli JM101, tornadas competentes pelo método do cloreto de cálcio (Maniatis e colab. 1982), são transformadas pelos plasmídeos pUC18 contendo os ADN complementares dos ARNs virais. 0 plasmídeo pUC18 comporta a resistência à ampicilina; as colónias bacterianas transformadas selecionam-se em meio Luria Broth (Maniatis e colab. 1982) adicionando de 100 mg/litro de ampicilina por um lado e pela cor azul das colónias (Maniatis e colab. 1982) por outro lado. Isola-se o plasmídeo recombinante de cada colónia e purifica-se de acordo com a técnica descrita por Birnboin e Doly (Maniatis e colab. 1982). Os plasmídeos recombinantes são digeridos pelas enzimas de restrição EcoRI e BamHl; estas enzimas que cortam ao redor do sítio Smal permitem separar, mediante electroforese, o plasmídeo pUC18 por um lado e o ADN complementar por outro lado. Os produtos da digestão são depositados sobre um gel de agarose 1% e depois da migração seleccionam-se os plasmídeos contendo um ADN complementar com um tamanho de 1 Kb (tamanho do ADN complementar). Uma carta de restrição utilizando as enzimas HindIII , Sall e HindII permitiu, mediante comparação com a da estirpe D publicada por Cuozzo e colab. (1988), identificar os plasmídeos recombinantes que possuem o ADN complementar do ARN 4. Este clone que possui o gene que codifica para a proteína da capside ê reclonado entre os sítios de restrição EcoRI e BamHl do plasmídeo Bluescribe (BS+ e BS-) (catálogo Stratagène). Fragmentos de tamanho menor foram
-35«* reclonados no vector Blue scribe e o ADN de hélise simples de cada um destes plasmídeos recombinantes foi preparado de acordo com a técnica descrita por Stragène. Determinou-se a sequência destes diferentes fragmentos clonados de acordo com a técnica descrita no protocolo sequência R versão 2 de USB United States Biochemicals. Analisaram-se os fragmentos sequenciados sobre gel desnaturante de acrilamida a 6% (Maniatis e colab. 1982), fixa-se em seguida o gel durante 10 minutos em 10% de ácido acético e seca-se depois sob vazio a 80°C durante 30 minutos e submete-se depois a uma autoradiografia (Maniatis e colab. 1982). A sequência da proteína de capside da estirpe 017F está representada na Fig. 3.
Separa-se, em seguida, a sequência da proteína de capside do plasmídeo recombinante mediante digestão com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI. Juntam-se os ligandos (linkers)
BamHI às extremidades da sequência (Maniatis e colab. 1982) que se submete, em seguida, a uma clonagem nos sítios BamHI do plasmídeo pBIOS 3 desfosforilado (Maniatis e colab. 1982). Coloca-se em seguida esta sequência que codifica para a proteína da capside entre o promotor 35S e o terminador NOS.
3. INTRODUÇÃO DOS GENES QUE CODIFICAM PARA AS PROTEÍNAS
DA CAPSIDE DO CMV (ESTIRPES I17F E FNY RESPECTIVAMENTE)
NOS COTILÉDONES DE MELOEIRO E REGENERAÇÃO DE PLANTAS
TRANSGÉNICAS.
-36Os 2 genes que codificam para as proteínas de capside (I17F e FNY) colocados entre as sequências são, em seguida, clonados separadamente no vector binãrio pBI121 (Jefferson e colab. 1987) modificado pela supressão do sítio EcoRi 3' do gene GUS, e a criação de um sítio EcoRi no sítio HindIII. Estas modificações permitem a inserção da cassete promotor-gene estruturado -terminador resultante de pBIOS 3.
Introduz-se, finalmente, este último vector na estirpe LBA 4404. As estirpes de Agrobacterium contendo o vector binãrio que possui por um lado a sequência da proteína de capside da estirpe FNY (pBIOSl32) e por outro lado da estirpe I17F (pBOSl35) são utilizadas para infectar cotilédones de meloeiros no estádio de 2 dias de acordo com o processo descrito no exemplo A. 0 processo de regeneração dos cotilédones é o mesmo que se descreveu no exemplo A. Analisam-se as plantas de meloeiro regeneradas sobre o meio selectivo contendo 100 mg/litro de canamicina. Confirmou-se o carácter transgénica das plantas regeneradas mediante detecção da actividade de G.U.S. e pela técnica de formação de caules de acordo com o processo descrito no exemplo A.
A expressão da proteína de capside da estirpe I17F foi detectada em uma planta quando de uma análise Western blot com anticorpos contra a estirpe I17F intacta. A proteína da capside expressa, representa, nas folhas, cerca de 0,0H da proteína solúvel total.
-37As plantas transformadas são em seguida, desenvolvidas até à obtenção de sementes. Estas plantas transformadas demonstraram ser resistentes ao vírus do mosaico do pepineiro.
A figura 5 representa um Western blot pondo em evidência bandas imunoreactivas detectadas com anticorpos contra o CMV estirpe I17F.
Testaram-se quinze plantas RI para a resistência mediante inoculação mecânica com o vírus.
A inoculação faz-se sobre a folha de uma plântula no estádio de uma folha. Os sintomas que aparecem sobre as folhas formadas em seguida permitem estudar a infecção sistémica do vírus. Entre estas quinze plantas, uma dezena demonstrou ser transgénica pela expressão de GUS.
Em pelo menos uma destas plantas transgénicas Rl, a quarta folha demonstra, dezanove dias depois da inoculação, uma redução importante dos sintomas e uma ausência de mosaico, em comparação com a testemunhas Vedrantais não-transformadas.
-38BIBLIOGRAFIA
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Claims (5)
- REIVINDICAÇÕES1.- Processo para a produção de plântulas transgénicas a partir de rebentos geneticamente transformados, pertencendo as referidas plântulas â espécie Cucumis melo e contendo pelo menos um gene introduzido por intermédio do Agrobacterium tumefaciens, caracterizado pelo facto de se cultivar em duas etapas sucessivas rebentos geneticamente transformados, tendo a primeira destas etapas de cultura lugar em um meio de cultura celular vegetal contendo uma citocinina, e mais particularmente a 6-benzil-aminopurina (BAP), e a segunda, que se efeetua quando os rebentos atingem pelo menos cerca de 3 mm de altura, em um meio de cultura celular vegetal contendo, como macro-elementos;
kh2po4 cerca de 50 a cerca de 100 mgL 1 -1 MgSO4 cerca de 75 a cerca de 300 mgL -1 CaCl2.2H20 i cerca de 500 a cerca de 2500 mgL -1 kno3 cerca de 750 a cerca de 1200 mgL -1 NH4NO3 cerca de 150 a cerca de 200 mgL 2.- Processo de acordo com a reivindicaç ão 1 , caracteri zado pelo facto de o meio de cultura utilizado na segunda eta pa de cultura conter, como macro- -elementos: kh2po4 85 mgL 1 MgSO4 185 mgL 1 CaCl2-2H2O 1720 mgL 1 -1 kno3 950 mgL -1 NH4NO3 165 mgL 3,- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do pelo facto de o meio de cultura ser o meio MB6 comportando a composição indicada a seguir mg/1kh2po4 85 MgSO4.7H2O 185 CaCl2.2H220 1720 kno3 950 NIL· NO, 165 MnSO,. H,0 4 216,9-Μ·ΚΙ η3βο3ZnSO4.7H2O CuSO4.5Η2Ο Na2Mo04.2 Η20 CoC12.6H20FeSO4.7Η2Ο Na2EDTA ãcido nicotínico tiamina-HCl piridoxina-HCl glicina mio-inositol sacarose gelrito pH 5,6 mg/10,836,28,60,0250,250,02527,8537,250,500,100,50 - 2,010010 0004 000
- 4.- Processo para a produção de plantas transgénicas pertencentes à espécie Cucumis melo, caracterizado pelo facto de as plântulas transgénicas susceptíveis de ser produzidas de acor do com a reivindicação 1 e tendo raízes secundárias serem transferidas para um meio de cultura normalmente necessário para o de senvolvimento de plantas não-geneticamente transformadas a partir de plântulas.-485. - Processo para a indução de rebentos geneticamente transformados a partir de explantes geneticamente transformados e contendo pelo menos um gene introduzido por Agrobacterium tumefaciens, sendo os referidos explantes provenientes de uma planta da espécie Cucumis melo, efectuando-se a indução em um meio de indução de rebentos geneticamente transformados comportando o conjunto sais minerais e vitaminas normalmente necessários para a indução de rebentos a partir de explantes geneticamente não transformados e contendo entre os sais inorgânicos cloreto de cálcio e bacto-agar ou agar-agar, caracterizado pelo facto de o teor deste meio de cultura em CaCl2 ser de cerca de 440 a cerca de 2200 mgL calculado em CaCl2.2H2O e de o teor em bacto-agar ou em agar-agar ser de cerca de 0,8 a cerca de 1,2%, sendo o referido meio de indução adicionado de cerca de0,3 a cerca de 1,13 mgL de 6-benzil-aminopurina (BAP) e de cerca de 0 a cerca de 1,3 mgL de ãcido indol-3-acético (AIA).6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o meio de indução ser o meio de Murashige eSkoog (1962) conhecido sob o nome de meio MS, adicionado de 0,3-1 -1 a 1,13 mgL de BAP e mais particularmente de 0,85 mgL , sendo a referida BAP a única hormona vegetal presente.7.- Processo de acordo com a reivindicação 5, caracteriza do pelo facto de as vitaminas presentes no meio de indução se-49 rem as vitaminas de Staba (1969).8. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o teor em cálcio ser de cerca de 1000 a cerca de 2200 mgL·-1, mais particularmente de cerca de 1750 a cerca de 2200 mgL \9. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o meio de indução ser o meio chamado Meio M.I. tendo a seguinte composição:Meio M.I.
Macro-elementos: KN°3 1900 NH^O^ 1650 CaCl2.2H20 2200 MgSO4.7H20 370 kh2po4 170 NA25DTA idem MS Micro-elementos idem MS Vitaminas Staba Mio-inositol 100 mgL -1 Sacarose 30 gL x Agar-agar 0,8 % BA? 3,75 jiM ABA 1 ^iM 5010.- Processo para a produção de plântulas transgénicas de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obterem os rebentos transformados de acordo com uma qualquer das reivindicações 5 a 9.11. - Processo de transformação genética de explantes de plantas pertencentes â espécie Cucumis melo, caracterizado pe lo facto de os referidos explantes serem cotilédones resultante de embriões isolados de sementes, tendo os referidos cotilédones germinado durante 0 a 4 dias, e mais particularmente durante 2 dias, e de se efectuar a transformação por intermédio doAgrobactérium tumefaciens.12. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de a transformação dos cotilédones se efectuar mediante contacto de fragmentos de cotilédones com uma suspensão bacterianade A. tumefaciens, contendo o A. tumefaciens um gene funcional destinado a ser introduzido na planta, seguido de co-cultura dos fragmentos de cotilédones e das bactérias durante cerca de 48 horas.13.- Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de a suspensão bacteriana ser uma suspensão de bactérias no meio MS e o meio de co-cultura ser meio MS solidificado com agar-agar.14. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de o gene destinado a ser introduzido na planta por intermédio do Agrobacterium tumefaciens ser o gene que codifica para a proteína de cap.side do vírus do mosaico do pepino (CMV).15. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o gene comportar a sequência seguinte ou um fragmento desta sequência apta a conferir resistência ao vírus do mosaico do pepino.OIT ATTG TCTA CTGA CTAT ATAG AGAG TGT T TG1G CTGT GIT1 1CTC TTTT 51 GTGT CGTA ,GAAT TGAG TCGA GTC ATG GAC ΑΛΑ TCT GAA TCA ACC n flet As? ly» Ser 61u Str Thr 7 AGT GCT GGT CGT AAC CGT CGA CGT CGT CCG CGT CGT GGT 134 Ser AU Gly Ari Asn Ari Ari Ari Ari Pro Art Art Gly 20 TCC CGC TCC GCC CCC TCC TCC GCG GAT GCT AAC TTT AGA 173 Ser Ari Str AU Pro Ser Ser Ala Ase Ala Asn Phe Ari 33 GTC TTG TCG CAG CAG CTT TCG CGA CTT AAT AAG ACG TTA 212 Vil leu Ser Gin Gl ft Leu Ser Ari Leu Asa Ly» Thr leu 46 GCA GCT GGT CGT CCA ACT ATT AAC CAC CCA ACC TTT GTA 251 AU AU 51 y Ari Pro Thr lie Asa HH Pro Thr Phe Vai 5? GGG AGT GAA CGC T6T AGA CCT GGG TAC ACG TTC ACA TCT 290 Gly Ser Gl u Ari Cys Ar$ Pro Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 72 ATI ACC CIA AAG CCA CCA AAA ATA GAC CGT GGG TCT TAT 329 Ile Thr leu Ly» Pro Pro Ly» II e Ase Ari Gly Ser Tyr «5 TAC GGT AAA AGG TTG TTA CTA CCT GAT TCA GTC ACG GAA 36« Tyr Gly ly» Ari leu leu leu Pro As? Ser Vai Thr Gl u n TAT GAT AAG AAG CTT GTT TCG CGC ATT CAA ATT CGA GTT 407 Tyr ly» ly» leu Vai Ser An Ile Gin 11a Ari Vai Hl ΑΛΤ CCT TTG CCS AAA TTT GAT TCT ACC GTG TGG GTG ACA 446 Asn Pro leu Pro ly» Phe A»? Ser Thr Vai Tr? Vai Thr 124 f ~52~ sGTC CGT AAA GTT CCT GCC TCC TCG GAC TTA TCC GTT 6CC 485 Vai Ari Lrs Vai Pro Ala Sar S«r Asp Ltu Sar Vai Ala 137 GCC ATC TCT GCT ATG TTC GCG GAC GGA GCC TCA CCG GTA 524 Ala n« Sar Ala n<t Pha Ala Asp Gly Ala Sar Pro Vai 150 CTG GTT TAT CAG TAT GCC GCA TCT GGA GTC CAA GCC AAC 563 Ltu Vai Tyr Gin Tyr Ala Ala Sar Gly Vai Gin Ala Asn 163 AAC AAA CTG TT6 TAT GAT CTT TCG GCG ATG CGC GCT GAT 603 Asn Lys Ltu Ltu Tyr Asp Ltu Str Ala nat Ari Ala Asp 176 ATA GGT SAC ATG AGA AAG TAC 6CC GTC CTC GTG TAT TCA 641 n * Gly Asp n«t Ar? Lys Tyr Ala Vai Ltu Vai Tyr Str 189 AAA GAC GAT GCG CTC GAG ACG GAC GAG CTA 5TÃ CTT CAT 680 Lys Asp Asp Ala Ltu Glu Thr Asp Glu, Ltu Vai Ltu His 202 GTT GAC ATC GAG CAC CAA CGC ATT CCC ACA TCT GGA GTG 719 Vai Asp 11« Glu His Gin Ars 11a Pro Thr Sar Gly Vai 215 CTC CCA GTC TGATTCCGTGTTCCCAGAATCCTCCCTCCGATCTCTGTGG 768 Ltu Pro Vai 218’CGGGAGCTGAGTTGGCAGTTCTGCTATAAACTG7CTGAAGTCACTAAACGTT 820 TTTTACGGTGAACGGG7TGTCCATCCAGCTTACGGCTAAAATGGTCAGTCGT 872 GGAGAAATCCACGCCAGCAGATTTACAAATCTCTGAGGCGCCTTTGAAACCA 924 TCTCCTAGG1TTCTTCGGAAGGACTTCGG7CCGTGTACCTCTAGCACAACGT 97616.- Processo de acordo com a reivindicação 14, caracteri» * zado pelo facto de o gene comportar a sequência seguinte ou um fragmento desta sequência apta a conferir resistência ao vírus do mosaico do pepino:AGAGAGTGTGTGTGCTGTGTTTTCTCTTTTGTGTCGTAGAATTGAGTCGAG 51TC ATG GAC AAA TCT GAA TCA ÃCC AGT GCT GGT CGT AAC 89Met Asp Lys Ser '~lu Ser Thr Ser Ala Gly Arg Asn 12CGT CGA CGT CGT CCG CGT CGT GGT TCC CGC TCC GCC CCC 128 Arg Arg Arg Arg Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ser Ala Pro 25TCC TCC z~ a rn A X AAC TTT AGA GTC 1 TTG ' TCG < CAG < CAG 167 Ser Ser Ala Asp Ala Asn Phe Arg Vai Leu Ser ι Gin < Gin 38 /-**H*T» s» a x TCG CGA AAT AAG ACG TTA GCA GCT GGT 1 CGT ' CCA 206 Leu Ser Arg Leu Asn Lys Thr Leu Ala Ala Gly , Arg Pro 51 ACT ATT AAC CAC CCA ACC TTT GTA USJV AGT GAA CGC TGT 245 Thr Ile Asn His Pro Thr Phe Vai Gly Ser Glu Arg Cys 64 AGA CCT TAC ACG TTC ACA TCT ATT ACC CTA AAG CCA 284 Arg Pro Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ile Thr Leu Lys Pro 77 CCA AAA ATA ga: CGT TCT TAT TAC GGT AAA AGG TTG 323 Pro Lys Ile AS.. Arg Gly Ser Tyr Tyr Gly Lys Arg Leu 90 * * Λ CTA CCT z·^ σι νίΛά TCA GTC ACG GAA x«rtx GAT AAG AAG CTT 362 Leu Leu Pro Asp Ser Vai Thr Glu Tyr Asp Lys Lys Leu 103 GTT TCG CGC ATT CAA ATT CGA GTT AAT CCT TTG CCG AAA 401 Vai Ser Arg Ti o Gin Ile Arg Vai Asn Pro Leu Pro Lys 116 TTT GAT TCT ACC GTG TGG GTG ACA GTC CGT AAA GTT CCT 440 Phe Asp Ser Thr Vai Trp Vai Thr Vai Arg Lys Vai Pro 129 GCC TCC TCG GAC TTA TCC GTT GCC GCC ATC TCT GCT ATG 479 Ala Ser Ser Aso • Leu Ser Vai Ala Ala Ile Ser Ala Met 142 TTC GCG GAC GGA GCC TCA CCG GTA CTG GTT TAT CAG TAT 518 Phe Ala Asp Gly Ala Ser Pro Vai Leu Vai Tyr Gin Tyr 155 GCC GCA TCT GGA GTC CAA GCC AAC AAC AAA CTG TTG TAT 557 Ala Ala Ser Gly Vai Gin Ala Asn Asn Lys Leu Leu Tyr 168 GAT CTT TCG GCG ATG CGC GCT GAT ATA GGT GAC ATG AGA 596 Asp Leu Ser Ala Met Arg Ala Asp Ile Gly Asp Met Arg 181 AAG TAC GCC GTC CTC GTG TAT TCA AAA GAC GAT GCG CTA 635 Lys Tyr Ala Vai Leu Vai Tyr Ser Lys Asp Asp Ala Leu 194 GAG ACG GAC GAG CTA GTA CTT CAT GTT ’ GAC ATC . GAG CAC 674 Glu Thr Asp Glu Leu Vai Leu His Vai Asp Ile Glu His 207 CAA . CGC ATT CCC ACG ' GGA , GTG ί CTC : CCA GTC : TGA .TTCGT 715 Gin . Arg Ile Pro Thr Ser ’ Gly Vai . Leu Pre ι Vai 218 767819871 .TTACAAATCTCTGAGGGGGCTTTGAAACCATCTCCTAGGTTTCTTCGGAAGG 9 23 ACTTCGGTCCGTGTACCTCTAGCACAACGTGCTAGTTTCAGGGTACGGGTGC 975CCCCCCACTTTCGTGGGGGCCTCCAAAAGGAG100717.- Processo para a produção de plantas transgénicas a partir de explantes, sendo os referidos explantes provenientes de uma planta pertencente à espécie Cucumis melo, caracterizado por compreender as seguintes etapas sucessivas:i) transformação genética de explantes de acordo com uma qualquer das reivindicações.. 11 a 15;ii) indução de rebentos geneticamente transformados a par tir de explantes transformados obtidos na etapa i), efectuando-se a referida indução de rebentos de acordo com uma qualquer das reivindicações 5 a 9;iii) desenvolvimento de plãntulas trangénicas a partir dos rebentos geneticamente transformados obtidos na etapa (ii), efec tuando-se o referido desenvolvimento de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3;iv) desenvolvimento de plantas transgénicas a partir das plãntulas transgénicas obtidas na etapa (iii), efectuando-se o referido desenvolvimento de acordo com a reivindicação 4.5518.- Meio de altura celular apto para o desenvolvimento de rebentos em plântulas durante a regeneração de uma planta, carac terizado pelo facto de conter, como macro-elementos:KH2PO4 cerca de 50 a cerca de 100 mgL MgSO4.7H2O cerca de 75 a cerca de 300 mgL CaCl2.2H2O cerca de 500 a cerca de 2500 mgL 1 de -1 kno3 cerca de 750 a cerca 1200 mgL NH4NC>3 cerca de 150 a cerca de 200 mgL 19.- Meio de cultura celular de acordo com a reivindicação caracterizado pelo facto de conter, como macro- -elementos: 85 -1 kh2po4 mgL MgSO4.7H2O 185 mgL 1 CaCl2-2H2O -1 1720 mgL -1 kno3 950 mgL -1 NH4NO3 165 mgL 20.- Meio de cultura celular de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de ter a seguinte composição:mg/1kh2po4 35 MgSO4.7H2O 185 CaCl2.2H220 1720 KNO-, 950 NH4NO3165 mg/1MnSOKlH3BOZnso h2°7H2° - 5H2O16,90,83
- 6,28,60,025Na2Mo04.2 H2O 0,25CoC12.6H20 0,025FeSO4.7H2O 27,85Na2EDTA 37,25 ãcido nicotínico 0,50 tiamida-HCl 0,10 piridoxina-HCl 0,50 clicina 2,0 mio-inositol sacarose gelrito pH 5,610010000400021.- Meio de indução de cultura celular vegetal inorgânicos e de vitaminas de rebentos constituído por um meio comportando o conjunto dos seus sais normalmente necessários para a indução de rebentos a partir de explantes não geneticamente transformados e contendo entre estes sais inorgânicos cloreto de cálcio e bacto-agar ou agar-agar, caracterizado pelo facto de oΜ-,^7teor deste meio em CaCl^ estar compreendido entre 440 e2200 mgL calculado em CaC^.K^O e em bacto-agar ou agar-agar entre 0,8 e 1,2 %, adicionando-se ao referido meio 0,3 a 2,0 mgL 1 de BAP e 0 a 1,3 mgL de AIA.22.- Meio de indução para rebentos de acordo com a reivin dicação 21, caracterizado pelo facto de ser constituído pelo meio de cultura preparado de acordo com Murashige e Skoog (1962) chamado meio MS, adicionado de 0,3 a 1,13 mgL 1 de BAP, mais particularmente de 0,85 mgL \ sendo a referida BAP a única hormona vegetal presente.23. - Meio de cultura de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de as vitaminas presentes no meio de indução serem vitaminas Staba (1969).24. - Meio de indução para rebentos de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de o teor em cãlcio estar compreendido entre cerca de 1000 e cerca de 2200 mgL 1 e mais particularmente entre cerca de 1750 e cerca de 2200 mgL25. - Meio de indução para rebentos de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de ter a seguinte composição:Meio M.I.
Macro-elementos: KNOg 1900 NH4NO3 1650 CaCl2.2H2O 2200 MgSO4.7H2O 370 KII2PO4 170 na2edta idem MS Micro-elementos idem MS Vitaminas Staba -1 Mio-inositol 100 mgL -1 Sacarose 30 gL x Agar-agar 0,8 % BAP 3,75 ^iM ABA 1 uM 26.- Rebentos geneticamente transformados, caracterizados pelo facto de pertencerem à espécie Cucumis melo e serem susceptíveis de serem obtidos de acordo com uma cualquer das reivindicações 5 a 9.27,- Cotilêdoneos geneticamente transformados, caracteriza dos pelo facto de pertencerem à espécie Cucumis melo e serem susceptiveis de serem obtidos de acordo com uma qualquer das reivindicações 11 a 15.5928. - Plântulas transgénicas, caracterizadas pelo facto de pertencerem à espécie Cucumis melo e serem susceptíveis de se rem obtidas de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3.29. - Plantas transgénicas, caracterizadas pelo facto de pertencerem à espécie Cucumis melo, e serem susceptíveis de serem obtidas de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 16.30. - Melões transgénicos que podem ser produzidos de acor do com uma qualquer das reivindicações 15 ou 16, caracterizados pelo facto de exprimirem a proteína de cápside do vírus do mosai co do pepino.31. - Sementes, caracterizadas pelo facto de serem obtidas a partir de plantas transgénicas de acordo com a reivindicação 29.32. - Processo para tornar uma planta, em particular uma planta pertencente à espécie Cucumis melo, resistente ao vírus do mosaico do pepino, caracterizado pelo facto de se introduzir e exprimir de maneira estável na planta pelo menos um fragmento da sequência ilustrada a seguir e codificando para a proteína de cápside do vírus do mosaico do pepino, sendo o referido fragmento apto para conferir a referida resistência:GTTATTGTCTACTGACTATATAGAGAGTGTTTGTGCTGTGTTTTCTCTTTT 51GTGTCGTAGAATTGAGTCGAGTC ATG GAC AAA TCT GAA TCA ACC 95Met Asp Lys Ser Glu Ser Thr 7-60AGT GCT GGT CGT AAC CGT CGA CGT CGT CCG CGT CGT GGT 134 fSer Ala Gly Arg Asn Arg Arg Arg Arg Pro Arg Arg Gly 20TCC CGC TCC GCC CCC TCC TCC GCG GAT GCT AAC TTT AGA 173Ser Arg Ser Ala Pro Ser Ser Ala Asp Ala Asn Phe Arg 33GTC TTG TCG CAG CAG CTT TCG CGA CTT AAT AAG ACG TTA 212Vai Leu Ser Gin Gin Leu Ser Arg Leu Asn Lys Thr Leu 46'GCA GCT GGT CGT CCA ACT ATT AAC CAC CCA ACC TTT GTA 251Ala Ala Gly Arg Pro Thr Ile Asn His Pro Thr Phe Vai 59GGG AGT GAA CGC TGT AGA CCT GGG TAC ACG TTC ACA TCT 290Gly Ser Glu Arg Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 72ATT ACC CTA AAG CCA CCA AAA ATA GAC CGT GGG TCT TAT 329Ile Thr Leu Lys Pro Pro Lys Ile Asp Arg Gly Ser Tyr 85TAC GGT AAA AGG TTG TTA CTA CCT GAT TCA GTC ACG GAA 368Tyr Gly Lys Arg Leu Leu Leu Pro Asp Ser Vai Thr Glu 98TAT GAT AAG AAG CTT GTT TCG CGC ATT CAA ATT CGA GTT 407 Tyr Asp Lys Lys Leu Vai Ser Arg Ile Gin Ile Arg Vai 111AAT CCT TTG CCG AAA TTT GAT TCT ACC GTG TGG GTG ACA 446 Asn Pro Leu Pro Lys Phe Asp Ser Thr Vai Trp Vai Thr 124GTC CGT AAA GTT CCT GCC TCC TCG GAC TTA TCC GTT GCC 485 Vai Arg Lys Vai Pro Ala Ser Ser Asp Leu Ser Vai Ala 137GCC ATC TCT GCT ATG TTC GCG GAC GGA GCC TCA CCG GTA 524 Ala Ile Ser Ala Met Phe Ala Asp Gly Ala Ser Pro Vai 150CTG GTT TAT CAG TAT GCC GCA TCT GGA GTC CAA GCC AAC 563Leu Vai Tyr Gin Tyr Ala Ala Ser Gly Vai Gin Ala Asn 163AAc'aAA CTG TTG TAT GAT CTT TCG GCG ATG CGC GCT GAT 602Asn Lys Leu Leu Tyr Asp Leu Ser Ala Met Arg Ala Asp 176ATA GGT GAC ATG AGA AAG TAC GCC GTC CTC GTG TAT TCA 641Ile Gly Asp Met Arg Lys Tyr Ala Vai Leu Vai Tyr Ser 189AAA GAC GAT GCG CTC GAG ACG GAC GAG CTA GTA CTT CAT 680Lys Asp Asp Ala Leu Glu Thr Asp Glu Leu Vai leu His- 202GTT GAC ATC GAG CAC CAA CGC ATT CCC ACA TCT GGA GTG 719Vai Asp Ile Glu His Gin Arg Ile Pro Thr Ser Gly Vai 215 r61-CTC CCA GTC '”GA'T—τ’γ'—m—·· -. ,Leu ?rc Vai * * ---^CCTCCGATCTCTGCGG 7S3213CKGAGCOGAOTGSOAGrrcTGCOA^CTÍ-ffiAOTc-^^Π*****”*··· n —-----------SC^ACGGCTAAAATGGrCAGTCGT 372GGAGAAATCCACSCCAGCAGArrCACAAATCTCrSAGGCCCC™—!! a r „,---«AAACCA 924TCTCCTAGGrrTCTGCGGAAGGACTTCGGTCCGTGrACCTCTAGCACAACGT 97S 33·- Processo para tornar uma planta, em particular uma planta pertencente ã espécie Cucumis melo, resistente ao ví rus do mosaico do pepino, caracterizado pelo facto de se introduzir e exprimir de maneira estável na .planta pelo menos um fragmento da sequência ilustrada a seguir e codificando pa ra a proteína de capside do vírus do mosaico do pepino, estan do o referido fragmento apto para conferir a referida resistência:AGAGAGTGTGTGTGCTGTu j. x x x CTCT1 i^UiUICGTAGAATTGAGTCGAGTC ATG GAC AAA TCT GAA TCA ACC AGT GCT eriuí- As-n r’,, CGT AAC fi— as? Lys Ser G-u Ser Thr Ser Ala Gly Ar? AsnCGT CGA CGT CGT CCG CGT CGT GGT TCC CGC TCC GC~ C*·**Ar? Ar? Ar? Ar? Pro Ar? Ar? Gly Sôr fe fe fe feTCC TCC GCG GAT GCT AAC TTT AGA GTC TTG TCG CAG r^rSer Ser Ala As? Ala Asn Phe Ar? Vai Leu Ser Gla GlaCTT TCG CGA CTT AAT AAG ACG TTA GCA GCT GGT CGT CCALeu Ser Ar? Leu Asa Lys Thr Leu Ala Ala fe fe feACT ATT AAC CAC CCA ACC TTT GTA GGG AGT GAA C~ -rThr Ile Asn His Pro Thr Phe Vai Gly S® ígAGA CCT GGG TAC ACG TTC ACA TCT AT” ACC C— sir r-Aro Pro Gly Tyr Thr Phe Thr Ser íS Thi Èts ZCCA AAA ATA GAC CGT C-GG TCT TAT TAC GGT AAA AG- — ?r= lys Ile As? Arç Gly Ser Tyr Tyr Gl) ££ g?TTA CTA CCT GAT TCA GTC ACG GAA TAT GAT AAG Air Γ-* leu leu Pro As? Ser Vai Thr Glu Tyr Sp ££SI89 121231672062452843233621022GTT TCG CGC ATT CAA ATT CGA GTT AAT CCT TTG CrS 22,2* imVai Ser Arg Ile Gin Ile Arg Vai Asn Bra Leu Bra Lvs Π6TTT GAT TCT ACC GTG TGG GTG ACA. GTC CGT AAA GTT CCT 440Bhe As? Ser Thr Vai Tr? Vai Thr Vai Arg Lys Vai Bro 129GCC TCC TCG GAC TTA TCC lãH GCC GCC ÀTC TCT GCT ATG 479Ala Ser Ser As? Leu Ser Vai Ala Ala Ile Ser Ala Met 142TTC GCG GAC GGA GCC TCA CCG GTA CTG GTT TAT CAG '’ΆΤ 518Bhe Ala As? Gly Ala Ser Pro Vai Leu Vai Tyr Gin Tyr 155GCC GCA TCT GGA GTC CAA GCC AAC AAC AAA CTG TTG TAT 557Ala Ala Ser Gly Vai Gin Ala Asn Asn Lys Leu Leu Tyr ’ 168GAT CTT TCG GCG ATG CGC GCT GAT ATA GGT GAC ATG AGA 596 As? Leu Ser Ala Met Arg Ala Asp Ile Gly As? Met Arg 181 AAG TAC GCC GTC CTC GTG TAT TCA AAA GAC GAT GCG CTA 635 Lys Tyr Ala Vai Leu Vai Tyr Ser Lys As? As? Ala Leu 194 ACG GAC GAG CTA GTA CTT CAT GTT GAC ATC GAG CAC 674 Glu Thr As? Glu Leu Vai Leu His Vai Aso * Ile Glu His 207 CAA CGC ATT ccc ACG TCT GGA GTG CTC CCA GTC TGATTCGT 715 Gin Arr «tf Ile Bro Thr Ser Gly Vai Leu Bro Vai 218 GTTCCCAGAATCCTCCCTCCGATCTCTGTGGCGGGAGCTGAGTTGGCAGTTC 767 TGCTATAAACTGTCTGAAGTCACTAAACGTTTTTACGGTGAACGGGTTGTCC 819 ATCCAGCTTACGGCTAAAATGGTCAGTCGTGGAGAAATCCACGCCAGTAGAT 871TTACAAATCTCTGAGGCGCCTTTGAAACCATCTCCTAGGTTTCTTCGGAAGG ^23 ACTTCGGTCCGTGTACCTCTAGCACAACGTGCTAGTTTCAGGGTACGGGTGC 975 ccccccactttcgtgggggcctccaaaaggag 1Q 0 7 / -63RESUMOPROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÉNICAS PERTENCENTES Ã ESPÉCIE CUCUMIS MELODescreve-se um processo para a produção de plântulas transgénicas a partir de rebentos geneticamente transformados, pertencendo as referidas plântulas à espécie Cucumis melo e contendo pelo menos um gene introduzido por intermédio de Agrobacterium tumefaciens, caracterizado pelo facto de se cultivar, em duas etapas sucessivas rebentos geneticamente transformados, tendo a primeira destas etapas de cultura lugar num_meio de cultura celular vegetal contendo uma citocinina e mais particularmente 6-benzil-aminopurima (BAP) e a segunda que se efectua quando os rebentos atingem pelo menos cerca de 3 mm de altura, num meio de cultura celular vegetal contendo, como macro-elementos:kh2po4 cerca de 50 a cerca de 100 mgL MgSO4 cerca de 75 a cerca de 300 mgL CaCL2.2H20 cerca de 500 a cerca de 2500 mgL kno3 cerca de 750 a cerca de 1200 mgL NH.NO, cerca de 150 a cerca de 200 mgL
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