CN113317204B - 一种铁甲草幼苗不定芽诱导及植株高效再生方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种铁甲草幼苗不定芽诱导及植株高效再生方法。本发明直接由铁甲草的无菌苗作为外植体进行不定芽的诱导，约2周即开始分化不定芽，在一棵植株上短时间内可获取多个分化不定芽；当铁甲草不定芽长至高2cm以上，将不定芽转接到生根培养基生根，形成再生植株。通过不定芽诱导途径得到不定芽效率与传统通过种苗的茎段、叶片、根段等组织伤口诱导愈伤相比，极大缩短了获得再生植株的时间，极大地降低了铁甲草的培育成本。

Description

一种铁甲草幼苗不定芽诱导及植株高效再生方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种铁甲草幼苗不定芽诱导及植株高效再生方法。

背景技术

铁甲草(Cassia mimosoides Linn.)为豆科决明属植物，又名山扁豆，学名是含羞草决明。一年生或多年生亚灌木状草本。分布于广东、安徽、广西、四川、台湾等地。决明属的很多植物，在民间已经被作为药材使用，该属植物有着多方面的药理活性，用于治疗各种疾病，如腹泻。铁甲草最初记载于明朝《救荒本草》，为药食同源，全草可药用，性平，味甘、微苦，清热解毒，健脾利湿，通便等。其幼嫩茎叶可以泡茶以根治痢疾。主治黄疸，暑热导致的吐泻，小儿疳积水肿，疔疮痈肿，毒蛇咬伤等。铁甲草的化学成分包括黄酮类、槲皮素、甾醇和蒽醌类等，国内外关于铁甲草药理活性的研究主要集中在其保肝作用上。早期日本学者发现铁甲草中的蒽醌类化合物抑制脂肪酶的作用较强，可防止和改善肝脏肥大、体形肥胖及高脂饮食引起的高甘油三酯血症等。沈创鹏等同样发现铁甲草水提物具有降脂疗效及对肝组织的保护作用。通过对铁甲草化学成分的深入分析，张纪达等发现铁甲草醇提物可以抑制二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化，具有一定的保肝活性，其机制可能与其中的化学成分大黄素、齐墩果酸有关。此外有关学者还对铁甲草的水煎液进行了乙肝病毒性肝炎、酒精性肝炎以及自身免疫性肝炎的研究，比如对小鼠酒精和CCl₄造成的急性肝损伤的保护作用。在抗氧化活性方面，研究发现铁甲草乙酸乙酯萃取液黄酮和酚类含量高，其对DPPH清除能力也较好，有较强的抗氧化活性。黄丽等人选用过氧化氢制备具有损伤直接、短时间造成急性损伤特点的肝细胞损伤模型。在高剂量铁甲草干预后，肝细胞存活数量较多，结构完整，ALT、AST、MDA水平下降，GSH-px、GSH水平上升。表明铁甲草可能具有清除自由基，拮抗脂质过氧化反应，提高抗氧化物GSH-px、GSH的含量、降低氧化物MDA水平，保护线粒体膜和肝细胞膜作用。

铁甲草野生于荒山坡地，喜湿润气候，高温多雨季节生长较快，不耐寒。现人工科学栽培，利用种子繁殖时，播种前用45℃热水将种子浸泡24小时。多用条播法播种，结合浇水覆盖细土3厘米左右。亩播种量3千克左右。保持播种沟湿润，以促苗和加强苗木。铁甲草生长期间，要注意病虫害的防治，加强田间管理。通常产区春播者在第2年秋季采收，秋播者在第3年秋季采收，这时，根系会长得很结实，营养成分会积累起来，品质好。铁甲草栽培2年后的，种子续断到9月下旬会陆续成熟，收获、干燥和脱粒。有性繁殖周期长，不利于优良性状的遗传。植物组织培养技术可将植物的组织、器官、胚胎等进行离体培养，使其在短期内成长为完整植株。目前，组织培养在植物快速繁殖、单倍体育种、种质资源保存等方面得到了广泛运用，组织培养技术具有成本低，效率高，环境条件可控等优点，可减少误差、在短时期内获得大量无菌苗。

目前，国内外的研究主要集中在铁甲草化学组分研究与药理学研究，对铁甲草组织培养的研究相对较缺乏。这为铁甲草组织培养技术的系统研究提供了研究空间和研究价值。发展和建立铁甲草快速生长的组织培养育种体系，对大量培育种苗、满足人工栽培和以及保护野生铁甲草资源非常重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种铁甲草幼苗不定芽诱导及植株高效再生方法。

本发明基于梅州客家地区对铁甲草日益增长的实际需求以及为铁甲草化学成分及药理活性深入分析原材料的获取提供方便，拟采用组织培养技术人工培育铁甲草，以期显著提高铁甲草种苗繁育速度和质量，一方面可以解决铁甲草自然繁殖周期时间较长的问题；另一方面，为更进一步了解铁甲草药理活性分析及保肝应用等基础研究提供原材料支持。

本发明通过快速获得铁甲草再生无菌苗的培育方式，直接由铁甲草的无菌苗作为外植体进行不定芽的诱导，不定芽生长的具体部位为铁甲草的茎与子叶的连接部位，易产生且分化迅速，约2周即开始分化，并且在一棵植株上可萌发多个小芽，短时间内可获取多个分化不定芽。

外植体灭菌是初代培养能否成功的关键因素之一。本发明采取80℃水浴5min，5％NaClO灭菌5min，结果48h内萌发率可达95％。

不定芽诱导过程中生长调节剂种类和配比的选择至关重要，本发明通过添加不同配比的BA+NAA激素组合的培养基，得到了100％的不定芽诱导率。不定芽诱导培养基中所含的植物生长调节剂组合和浓度对不定芽的分化状态有较大的影响。本发明中，虽然所有处理组配比均可以促进不定芽的发生，但1/2MS+3.0mg/L BA+0.1mg/L NAA和1/2MS+3.0mg/LBA+0.3mg/L NAA对不定芽萌发和不定芽分化生长有较好的促进效果，不定芽生长健壮、叶色浓绿(图2)。

在1/2MS+3.0mg/L BA+0.1mg/L NAA基础上添加4.0mg/L Gln培养基的平均第一对不定芽长度长于不添加组，而其第二对不定芽的长度差异不明显。1/2MS+3.0mg/L BA+0.1mg/L NAA+1.0mg/L AgNO₃培养基的平均第一对和第二对不定芽长度均长于1/2MS+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA培养基中诱导出的第一第二对不定芽平均长度。表明一定浓度的Gln、AgNO₃对铁甲草不定芽诱导的促进效果显著，使不定芽状态更好，AgNO₃的促进能力更强。三种培养基评判效果的主要依据是对第一和第二对不定芽长度的影响，结果是采用AgNO₃处理比Gln和KT效果好。试验说明其最佳不定芽诱导培养基是1/2MS+3.0mg/L BA+0.1mg/L NAA+1.0mg/L AgNO₃。

铁甲草不定芽在不添加NAA的1/2MS培养基即可生根培养，且根的生长状态较好。移栽基质营养土，移栽成活率可达75％。

本发明发现，铁甲草不定芽诱导培养基为1/2MS+3.0mg/L BA+0.1mg/L NAA，外源添加4.0mg/L Gln和1.0mg/L AgNO₃对铁甲草不定芽诱导有一定的促进作用，并建立了一种高效植株再生体系，以不定芽为外植体，最佳生根培养基为1/2MS，再生苗移栽后成活率可达75％。

因此，本发明的铁甲草幼苗不定芽诱导及植株高效再生方法，包括以下步骤：

a.将铁甲草种子经催芽处理和消毒后，播种到1/2MS培养基中；

b.取铁甲草种子培养10天后的无菌苗完整植株，接种于不定芽诱导培养基中，诱导不定芽；所述的不定芽诱导培养基：每升含有BA 1.0-3.0mg、NAA 0.1-0.3mg、AgNO₃1.0mg、蔗糖30g和琼脂8g，余量为1/2MS，pH 5.8-6.0；或每升含有BA 1.0-3.0mg、NAA0.1-0.3mg、Gln 4.0mg、蔗糖30g和琼脂8g，余量为1/2MS，pH 5.8-6.0；

c.当铁甲草不定芽长至高2cm以上，将不定芽转接到生根培养基生根，形成再生植株。

优选，所述的不定芽诱导培养基：每升含有BA 3.0mg、NAA 0.1mg、AgNO₃ 1.0mg、蔗糖30g和琼脂8g，余量为1/2MS，pH 5.8-6.0。

优选，所述的不定芽诱导培养基：每升含有BA 3.0mg、NAA 0.1mg、Gln 4.0mg、蔗糖30g和琼脂8g，余量为1/2MS，pH 5.8-6.0。

优选，所述的生根培养基为1/2MS培养基。

优选，所述的1/2MS培养基，每升含有蔗糖30g和琼脂8g，余量为1/2MS，pH 5.8-6.0。

优选，所述的步骤a的催芽处理为：将铁甲草种子置于80℃水浴5min，然后取出。

优选，所述的步骤a的消毒为：先用体积分数75％乙醇水溶液浸泡3次，每次15s，然后用质量分数5％NaClO水溶液浸泡5min，无菌水漂洗3次，然后置于灭好菌的滤纸上吸干水分。

优选，所述的方法中的培养条件为：光照12h/黑暗12h，光照强度为2000～2500lx，相对湿度80％，温度为22-25℃。

本发明具有以下优点：

利用本发明方法，短时间内可获取多个分化不定芽，因此铁甲草通过不定芽诱导途径得到不定芽效率与传统通过种苗的茎段、叶片、根段等组织伤口诱导愈伤相比，极大缩短了获得再生植株的时间，极大地降低了铁甲草的培育成本。

附图说明

图1是外源添加不同配比的BA和NAA对不定芽诱导的影响。

图2是野生型和A8、A9培养基诱导产生的不定芽；其中图A为野生型铁甲草，没有不定芽产生；图B为1/2MS+3.0mg/L BA+0.1mg/L NAA培养基(A8)产生的不定芽；图C为1/2MS+3.0mg/L BA+0.3mg/L NAA培养基(A9)产生的不定芽。

图3是外源添加Gln对不定芽诱导产生的影响；注解：*代表P<0.05，**代表P<0.01。

图4是外源添加不同浓度Gln产生的不定芽；其中图A～E依次为添加0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、6.0mg/L、8.0mg/L Gln。

图5是外源添加不同浓度AgNO₃对不定芽诱导的影响；注解：*代表P<0.05，**代表P<0.01。

图6是外源添加不同浓度AgNO₃产生的不定芽；其中图A～E依次为添加0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L AgNO₃。

图7是外源添加不同浓度KT对不定芽诱导的影响。

图8是外源添加不同浓度KT产生的不定芽；其中图A～E依次为添加0mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L KT。

图9是铁甲草在营养土中生长。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

1实验材料

1.1实验原料

选择广东梅州阴那山作为采样点，采集铁甲草果荚，收集颗粒饱满，品质良好的种子放于密封袋，4℃条件下贮藏。

1.2培养条件

1/2MS基本培养基中添加8g/L琼脂和30g/L蔗糖，用氢氧化钠溶液调整pH值为5.80～6.00，121℃、101MPa灭菌20min，倒板到组培瓶中，待培养基冷却凝固后使用。恒温培养箱条件为，光照12h，黑暗12h，光照强度为2000～2500lx，相对湿度80％，温度为22℃。

1.3实验仪器与实验试剂

所用实验仪器与实验试剂如表1和表2所示。

表1实验仪器

表2实验试剂

2实验方法

2.1无菌幼苗的获得

取4℃存储的待播种的种子，挑选籽粒饱满且无病虫害种子流水冲洗10min，每支2ml离心管中转入适量清洗后的铁甲草种子，加入少量自来水(水量以没过种子为宜)，将离心管插入泡沫板，放入水浴锅。经过80℃水浴处理5min后，将种子转入50ml离心管，先用体积分数75％乙醇水溶液浸泡3次，每次15s，然后用质量分数5％NaClO水溶液浸泡5min，转移至超净工作台，无菌水漂洗3次，将其置于灭好菌的滤纸上吸干水分，而后用镊子夹取种子接种到1/2MS空白萌发培养基中。

2.2无菌苗不定芽诱导

2.2.1不同配比的BA和NAA对不定芽的诱导

在1/2MS基本培养基基础上，外源添加不同质量浓度及配比的BA和NAA(表3)，观察其对不定芽分化的影响。取铁甲草种子培养10天后长势良好均一的无菌苗，用镊子将整个完整植株夹出，接种于不定芽诱导培养基中(接种过程要使幼苗的根部尽可能大部分的接触培养基)。其配比组合如表3所示。共设9个浓度组合，每个浓度组合条件下接种10瓶，每瓶3株无菌苗。实验重复3次。培养50d后统计并观察不定芽的分化情况。

BA、NAA在使用前先分别用少量4M NaOH水溶液、体积分数95％乙醇水溶液溶解，用灭菌的纯水定容，再用13mm针头过滤器滤菌，得到浓度为0.2mg/ml母液，待MS培养基灭菌结束后，温度降到60℃左右时加入。BA和NAA溶液-20℃，避光保存。

表3不同配比BA和NAA

2.2.2 Gln、AgNO₃和KT对不定芽的诱导

在诱导不定芽分化培养基1/2MS+3.0mg/L BA +0.1mg/L NAA基础上分别加入不同质量浓度的Gln、AgNO₃、KT溶液(表4)，观察其对不定芽生长的影响。将播种10天后获得的无菌苗接种到各个处理组中，每种因素设置4个对照组，每个浓度接种10瓶，每瓶3株无菌苗，实验重复3次。分别培养3周(Gln)，7周(AgNO₃)，7周(KT)后统计并观察不定芽的分化情况，从中筛选出最佳不定芽分化培养基。

L-Gln和AgNO₃在使用前先用灭菌的纯水溶解后定容，再用13mm针头过滤器滤菌，得到浓度为10mg/ml L-Gln和25mg/ml AgNO₃母液，待MS培养基灭菌结束后，温度降到60℃左右时加入。L-Gln和AgNO₃溶液-20℃，避光保存。

KT在使用前先用少量5％的盐酸溶解，用灭菌的纯水定容，再用13mm针头过滤器滤菌，得到浓度为2.0mg/ml KT母液，待MS培养基灭菌结束后，温度降到60℃左右时加入。KT溶液-20℃，避光保存。

表4在BA和NAA最适配比培养基上添加Gln、AgNO₃和KT

2.3不同浓度NAA对不定芽生根的影响

在1/2MS基本培养基基础上，外源添加不同质量浓度NAA(表5)，观察其对不定芽的生根效果。选取不定芽诱导培养基中诱导30d后长势均一、芽高2cm左右的单芽，将其用手术刀剪下，垂直接种于不同浓度的NAA生根培养基中。共4组对比处理。每个浓度处理5～6瓶，每瓶接3个单芽，实验重复3次。30d后统计。

每组处理10瓶，每瓶接种3株幼苗。每组实验重复3次。数据统计取3次实验的平均值。

表5不同浓度NAA

2.4统计指标及数据处理

得到的数据均采用Excel软件处理和分析。各项指标的计算公式如下。

不定芽诱导率＝(产生不定芽的幼苗数/接入茎段数)×100％；

生根率＝(产生不定根苗数/接种不定芽总数)×100％；

生根系数＝(生根数/生根外植体数)×100％；

移栽成活率＝(成活的苗数/移栽总苗数)×100％。

3结果与分析

3.1不同配比的BA和NAA对不定芽诱导的影响

由图1结果可知，添加不同浓度配比6-BA和NAA的培养基，3周后发现所有处理组不定芽诱导率均可达100％，其各浓度配比不定芽诱导情况之间的差异无统计学意义(P>0.05)。从均值上看，处理组A2、A8、A9的诱导不定芽平均数最高，为6。肉眼观察可发现，处理组A8、A9，不定芽生长较为健硕粗壮(图2)，其中处理组A8为更好(图2B)。综合效果和成本，本实验选取A8(1/2MS+3.0mg/L BA+0.1mg/L NAA)培养基为进一步探讨不定芽诱导更优条件的基础培养基。

3.2 Gln对不定芽诱导产生的影响

由图3、图4结果可知，在1/2MS+3.0mg/L BA +0.1mg/L NAA芽诱导培养基基础上，随着Gln浓度的上升，第一对不定芽的长势呈先上升后下降趋势；当Gln浓度达到4.0mg/LGln时，能最大幅度地提高第一对不定芽的平均长度，此时第一对不定芽长度可达到1.61cm(P<0.01)，长势也相对较好。可见过高的Gln浓度会抑制第一对不定芽的伸长，且小苗比较健壮，叶色比较嫩绿。说明外源添加4.0mg/L Gln可以促进不定芽生长。而Gln对第二对不定芽的生长无明显促进作用。

3.3 AgNO₃对不定芽诱导产生的影响

由图5、图6结果可知，在1/2MS+3.0mg/L BA +0.1mg/L NAA芽诱导培养基基础上，添加不同浓度AgNO₃，50d后统计不定芽长度，发现添加低浓度的AgNO₃(0.5mg/L、1.0mg/L)可明显促进第一、第二对不定芽的生长长度(P均<0.01)，而继续加大AgNO₃浓度(2.0mg/L、4.0mg/L)对第一、第二对不定芽的伸长促进作用降低(第一对不定芽均为P>0.05，第二对不定芽分别为P<0.01和P<0.05)，高浓度AgNO₃对第一对不定芽的生长无明显促进作用。结果表明，外源添加0.5-1.0mg/L AgNO₃可以促进不定芽生长。

3.4 KT对不定芽诱导产生的影响

由图7、图8结果可知，在1/2MS+3.0mg/L BA +0.1mg/L NAA芽诱导培养基基础上，不同浓度KT(0.1mg/L，0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L)对第一和第二对不定芽长度无明显促进作用，第一对不定芽从低浓度到高浓度的平均芽长分别为1.5，1.1，1.5，1.5，1.1cm，第二对不定芽从低浓度到高浓度的平均芽长分别为1、1.1、1.1、1.2、1.2cm，差异无统计学意义(P>0.05)。由此可看出，KT对不定芽的生长无明显作用。

3.5不同浓度NAA对不定芽生根的影响

在铁甲草不定芽长到2cm左右时，进行不定芽的生根培养，培养20d后，可观察到不定芽的根生长旺盛。由表6可知，随着细胞生长素NAA浓度的增加(0.1mg/L～0.2mg/L)，铁甲草不定芽生根率呈上升趋势，在1/2MS+NAA 0.2mg/L培养基上生根率最高，为77.8％。当NAA浓度达到0.5mg/L～1.0mg/L时，铁甲草不定芽生根率下降。生根系数随着NAA浓度升高，一直呈增长趋势，在1/2MS+NAA 1.0mg/L时生根系数最高，为4.5。而平均生根长度与生根系数成反比，即为1/2MS+NAA 0.1mg/L时平均生根长度最长，为3.43。实验过程中发现，平均生根长度越短，其根系越粗。而根系越长越有利于植株捕获自身所需营养，综上所述可得出，生根效果最好的根诱导培养基为1/2MS+0mg/L NAA。

表6不同浓度NAA对不定芽生根的影响

注解：*代表P<0.05，**代表P<0.01

3.6再生植株的体外培养

生根培养4个月之后移栽到基质营养土中，30d后统计植株的存活率为75％(图9)。

Claims (4)

1.一种铁甲草幼苗不定芽诱导及植株高效再生方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.将铁甲草种子经催芽处理和消毒后，播种到1/2MS培养基中；

b.取铁甲草种子培养10天后的无菌苗完整植株，接种于不定芽诱导培养基中，诱导不定芽；所述的不定芽诱导培养基：每升含有BA 3.0mg、NAA 0.1mg、AgNO₃ 1.0mg、蔗糖30g和琼脂8g，余量为1/2MS，pH 5.8-6.0；或每升含有BA 3.0mg、NAA 0.1mg、Gln 4.0mg、蔗糖30g和琼脂8g，余量为1/2MS，pH 5.8-6.0；

c.当铁甲草不定芽长至高2cm以上，将不定芽转接到生根培养基生根，形成再生植株；所述的生根培养基为1/2MS培养基，每升含有蔗糖30g和琼脂8g，余量为1/2MS，pH 5.8-6.0。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤a的催芽处理为：将铁甲草种子置于80℃水浴5min，然后取出。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤a的消毒为：先用体积分数75％乙醇水溶液浸泡3次，每次15s，然后用质量分数5％NaClO水溶液浸泡5min，无菌水漂洗3次，然后置于灭好菌的滤纸上吸干水分。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，培养条件为：光照12h/黑暗12h，光照强度为2000～2500lx，相对湿度80％，温度为22-25℃。

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