CN116686709B - 一种铁甲草一步法组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铁甲草一步法组织培养方法。本发明方法包括以下步骤：S1.取发芽后生长了20天的铁甲草无菌苗1.0‑1.5cm长度的茎段为外植体，将外植体浸泡在NAA、6‑BA或TDZ激素溶液中20‑60min，然后取出外植体，用无菌吸水纸除去外植体表面残留的激素溶液；S2.将外植体接种至MS培养基上培养35‑45d，获得生根的铁甲草再生苗，然后驯化移栽。利用本发明方法，铁甲草茎段外植体在MS培养基上培养40天，就能获得生根的完整植株，仅需一步培养就完成了组织培养过程。本发明为铁甲草育种建立了一套高效的诱导铁甲草外植体形成不定芽的一步法组织培养方法，该方法为铁甲草生物技术育种奠定了良好的基础，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种铁甲草一步法组织培养方法。
背景技术
铁甲草分布于福建、台湾、湖北、湖南、广东、广西等地，也分布于日本、缅甸、越南及印度北部，在梅州等客家地区较为常用。铁甲草作为观叶植物露天栽培。幼叶含有丰富的维生素，用开水焯一下，幼叶可食用，是老百姓餐桌上的美味山野菜。炒食、做馅食用，铁甲草的幼叶，可以盐渍、速冻保鲜，是山野菜中的极品。又是观赏的绿化植物，具清雅、幽静之美，是庭院、公园、机关等绿化的优良品种。铁甲草集食用、药用、观赏价值于一身，是一种极具开发潜力的植物。
铁甲草为药食同源名贵中药材，其性凉、味甘、微苦，有护肝明目之功效。近几年，国内外对其进行了系统的研究，获得了包括齐墩果酸在内的多个活性成分。由于人们生活质量的不断提高，肥胖以及脂肪肝等疾病的发病率也不断的在上升。近几年来，随着对其功效及化学成分的深入了解，对其活性成分的研究也日益深入。铁甲草有很强的抗氧化活性，醋酸乙酯提取物中有很高的黄酮、酚类物质，具有很好的DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)清除能力，而且对油脂过氧化值有很大的影响。用乙酸乙酯可以选择性地分离富集铁甲草醇提溶物中的抗氧化物质，因此它有一定的实用价值。除此之外，铁甲草提取物具有抗氧化作用，它与各种多糖成分混合，可作为以山茶油为基质油的护肤霜，在化妆品市场占有重要地位。除此之外，相关学者还将铁甲草的水煎液用于乙肝病毒性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎的研究
如今，大多数的草药都是人工种植，但是，由于土地等方面的限制，很少有可以种植草药的地方。另外，这种植物的种子坚硬，在自然条件下萌发缓慢，必须用热水泡一泡，或者是得用沙纸擦干，费时费力。自21世纪初起，组织栽培技术已经广泛应用在国内，同时其可以有效地解放土地资源，使植物生长受外界环境限制的因素减少，运用细胞全能性原则进行栽培，既能保持母株优良的性能，又能降低成本。
发明内容
本发明目的是针对现有诱导铁甲草外植体形成不定芽的过程中存在的不定芽诱导率低和不定芽再生时间长等问题，而提供一种高效诱导铁甲草外植体产生不定芽的一步法组织培养方法。
本发明为了提高诱导铁甲草外植体不定芽形成的质量和效率，采用高浓度激素溶液(NAA、6-BA、TDZ溶液)对铁甲草茎段外植体进行短期浸泡处理，然后将处理后的茎段外植体接种至MS培养基上进行无菌培养，可以显著提高不定芽的诱导效率和缩短培养周期，并且可以直接获得生根的再生植株。
本发明的一种铁甲草一步法组织培养方法，包括以下步骤：
S1.取发芽后生长了20天的铁甲草无菌苗1.0-1.5cm长度的茎段为外植体，将外植体浸泡在激素溶液中20-60min，然后取出外植体，用无菌吸水纸除去外植体表面残留的激素溶液；
S2.将外植体茎段轴向水平接种至MS培养基上培养35-45d，获得生根的铁甲草再生苗，然后驯化移栽。
优选，所述的步骤S1中的将外植体浸泡在激素溶液中20-60min，是将外植体在浓度为30mg/L的NAA溶液中浸泡30min。
优选，所述的步骤S1中的将外植体浸泡在激素溶液中20-60min，是将外植体在浓度为20mg/L的6-BA溶液中浸泡20min。
优选，所述的步骤S1中的将外植体浸泡在激素溶液中20-60min，是将外植体在浓度为0.25mg/L的TDZ溶液中浸泡40min。
优选，所述的步骤S2为：将外植体茎段轴向水平接种至MS培养基上培养40d，获得生根的铁甲草再生苗，然后驯化移栽。
所述的铁甲草无菌苗是按照如下方法制备获得的：取铁甲草种子，用80℃的水将种子进行恒温浸泡10min，然后用体积分数75％的乙醇水溶液浸泡30-45s，然后使用质量分数2.5％的次氯酸钠(NaClO)水溶液浸泡10-15min，期间不断震荡，用灭菌蒸馏水冲洗3-4次，每次冲洗1min，最后，接种于MS培养基培养。
优选，所述的MS培养基：含有16.5g/L硝酸铵、19g/L硝酸钾、1.7g/L磷酸二氢钾、3.7g/L七水硫酸镁、4.4g/L二水氯化钙、16.9mg/L一水硫酸锰、8.6mg/L七水硫酸锌、6.2mg/L硼酸、0.83mg/L碘化钾、0.25mg/L二水硫酸钼二钠、0.025mg/L五水硫酸铜、0.025mg/L六水氯化钴、37.3mg/L二水乙二胺四乙酸钠、27.8mg/L七水硫酸亚铁、2mg/L甘氨酸、0.1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆醇、0.5mg/L烟酸、100mg/L肌醇、30g/L蔗糖和7g/L琼脂，余量为水。
本发明的有益效果：
本发明主要是改变了传统诱导铁甲草外植体形成不定芽的方法，即利用高浓度激素溶液对铁甲草茎段外植体进行短期浸泡处理，由此促使铁甲草茎段外植体以更高的效率脱分化形成更多的不定芽，是一种可以快速的获得铁甲草的不定芽的方法。
利用本发明方法，铁甲草茎段外植体在MS培养基上培养40天，就能获得生根的完整植株，仅需一步培养就完成了组织培养过程；不需要常规方法中的专门的伸长培养(通常需要20天)和生根培养(通常需要30天)的培养基和培养步骤。本发明方法不仅节约了培养基成本，简化了操作和减少了人工成本，时间上，本发明方法比常规方法可以节约50-60天。
本发明为铁甲草育种建立了一套高效的诱导铁甲草外植体形成不定芽的一步法组织培养方法，该方法为铁甲草生物技术育种奠定了良好的基础，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是利用高浓度激素浸泡处理铁架草外植体所获得的不定芽诱导效果；图A和图B：将铁甲草外植体于30mg/L NAA溶液中浸泡30min后接种至MS培养基上培养40天后的效果；图C和图D：将铁甲草外植体于20mg/L 6-BA溶液中浸泡20min后接种至MS培养基上培养40天后的效果；图E和图F：将铁甲草外植体于0.25mg/L TDZ溶液中浸泡40min后接种至MS培养基上培养40天后的效果(bars＝1.5cm)。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
(1)制备用于处理铁甲草外植体的激素溶液
准确称取一定量的6-苄氨基嘌呤(6-BA，简称BA)、萘乙酸(NAA)、噻苯隆(TDZ)(Sigma，USA)粉末，用1mol/L NaOH溶液充分溶解，再用去离子水定容，配制成不同浓度的BA(0、10、20、60和120mg/L)溶液，不同浓度NAA(0、10、30、60和120mg/L)溶液以及不同浓度TDZ(0、0.15、0.25、0.5和1mg/L)溶液。然后用1mol/L HCl溶液调整TDZ溶液的pH至5.8-6.0，使用前用0.22微米的水系滤膜(Millipore，USA)对已配制好的BA、NAA、TDZ溶液进行过滤灭菌。
(2)获取铁甲草外植体
取适量的铁甲草种子，首先使用80℃的水将种子进行恒温浸泡10min，然后，再用体积分数75％的乙醇水溶液浸泡消毒30-45s，然后使用质量分数2.5％的次氯酸钠(NaClO)水溶液浸泡消毒10-15min，消毒期间需要不断震荡，在超净工作台内使用灭菌以后的蒸馏水来反复冲洗3-4次，每次清洗1min，最后，接种于MS培养基，每个处理接种5瓶，进行3次重复，培养至种子发芽后继续生长20天。截取生长了20天的铁甲草无菌植株1.0-1.5cm左右长度的植株茎段为试验的外植体。
(3)激素溶液处理铁甲草外植体
在超净工作台上，将截取的铁甲草外植体，放入上述步骤(1)制备的激素溶液(不同浓度的BA、NAA或TDZ溶液)至约0.5cm深度，轻轻摇动玻璃瓶15秒，使得所有的外植体都与溶液接触，盖上广口玻璃瓶盖，浸泡处理一段时间，处理时间为30min。之后倒掉激素溶液，用无菌的镊子将铁甲草外植体取出，放置在无菌吸水纸上，吸去外植体表面残留的激素溶液。
(4)铁甲草外植体不定芽诱导培养
将经过激素溶液处理后的铁甲草外植体茎段轴向水平接种至(无激素)MS培养基(Murashige and Skoog,1962)上培养40天。培养条件：室温为25℃、光照强度为2000lx、光照时间为每天12小时。
所述的MS培养基：MS培养基配方的无机成分(16.5g/L硝酸铵、19g/L硝酸钾、1.7g/L磷酸二氢钾、3.7g/L七水硫酸镁、4.4g/L二水氯化钙、16.9mg/L一水硫酸锰、8.6mg/L七水硫酸锌、6.2mg/L硼酸、0.83mg/L碘化钾、0.25mg/L二水硫酸钼二钠、0.025mg/L五水硫酸铜、0.025mg/L六水氯化钴、37.3mg/L二水乙二胺四乙酸钠、27.8mg/L七水硫酸亚铁)+MS培养基配方的有机成分(2mg/L甘氨酸、0.1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆醇、0.5mg/L烟酸)+100mg/L肌醇+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，余量为水。
(5)培养条件与数据分析
所有实验都是在相同条件下进行的。培养基均使用1mol/L HCl溶液或1mg/L NaOH溶液调整培养基的pH至6.0，然后在121℃、0.1MPa的条件下高压灭菌15min。组织培养室培养条件为2000lx的光照强度，12小时/天的光照时间，25±1℃的培养温度。所有试验处理均重复三次，试验数据为3次重复试验的平均值±标准差表示，所有数据采用SPSSStatistics17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(P≦0.05)，数据后字母不同表示处理间差异显著。
实施例2：不同浓度NAA溶液浸泡处理对铁甲草外植体再生效果的影响
参照实施例1方法，将经过不同浓度(0、10、30、60和120mg/L)NAA溶液浸泡30min后的铁甲草外植体，接种至MS培养基上进行不定芽诱导，培养40天后统计数据。结果如表1所示。
表1不同浓度NAA溶液处理铁甲草外植体30min后的再生效果
| NAA浓度(mg/L) | 株高(cm) | 不定芽再生率(％) | 主根长(cm) |
| 0 | 0.87±0.47d | 14.33±2.20e | 0d |
| 10 | 3.47±0.40c | 66.67±1.34c | 2.39±0.27b |
| 30 | 5.97±0.31a | 94.23±2.33a | 3.02±0.17a |
| 60 | 4.80±0.10b | 77.67±3.51b | 2.21±0.32b |
| 120 | 3.90±0.39c | 57.24±2.28d | 1.42±0.15c |
注：数据后面的字母表示显著性分析的结果。0为对照，外植体没有经过激素浸泡处理，直接接种到MS培养基上。
从表1可以看出来，将铁甲草茎段外植体分别浸泡在不同浓度NAA(0、10、30、60、和120mg/L)的溶液中30min后水平接种到MS培养基上来诱导不定芽的再生，其实验结果表明，NAA的最有效浸泡浓度为30mg/L，可以获得不定芽再生的最高百分比(94.23％)、最长株高(5.97cm)和最长的主根长(3.02)。然而，当NAA浓度超过30mg/L时，不定芽再生率(下降16.56％)、最长芽(株高下降1.17cm)略有下降。
实施例3：相同浓度NAA浸泡不同时间对铁甲草外植体不定芽再生效果的影响
参照实施例1方法，设置浸泡时间分别为0、30、60、90和120min，采用浓度为30mg/L的NAA对铁甲草外植体进行浸泡处理，之后将外植体接种至MS培养基上进行培养，40天后统计数据。结果如表2所示。
表2采用30mg/L的NAA浸泡处理铁甲草外植体不同时间后的再生效果
| NAA处理时间(min) | 株高(cm) | 不定芽再生率(％) | 主根长(cm) |
| 0 | 0.70±0.35c | 16.57±3.24e | 0d |
| 30 | 5.23±0.24a | 91.82±2.31a | 3.13±0.22a |
| 60 | 4.43±0.37b | 75.68±3.35b | 2.78±0.15b |
| 90 | 3.87±0.26b | 58.48±1.55c | 2.39±0.29b |
| 120 | 1.42±0.39c | 46.24±3.26d | 1.39±0.13c |
注：数据后面的字母表示显著性分析的结果。0为对照，外植体没有经过激素浸泡处理，直接接种到MS培养基上。
由表2可以看出来将铁甲草茎外植体分别在30mg/L的NAA溶液中浸泡不同时间(0、30、60、90、和120min)后水平接种到MS培养基上来诱导不定芽的再生，其实验结果表明：NAA的最有效伸长浸泡时间为30min，可以获得最长株高(5.23cm)、最高不定芽再生率(91.82％)和最长主根长(3.13cm)。
实施例4：不同浓度6-BA溶液浸泡处理对铁甲草外植体不定芽再生效果的影响
参照实施例1方法，将经过不同浓度(0、10、20、60和120mg/L)6-BA溶液浸泡20min后的铁甲草外植体，接种至MS培养基上进行不定芽诱导，培养40天后统计数据。结果如表3所示。
从表3可以看出来，将铁甲草茎段外植体分别浸泡在不同浓度(0、10、20、60和120mg/L)6-BA溶液中20min后水平接种到MS培养基上来诱导不定芽的再生，其实验结果表明，6-BA的最有效浸泡浓度为20mg/L，可以获得最大株高(2.23cm)、最佳的不定芽再生率(78.65％)和最长根(3.35cm)。
表3不同浓度6-BA溶液处理铁甲草茎段20min后的再生效果
| 6-BA浓度(mg/L) | 株高(cm) | 不定芽再生率(％) | 主根长(cm) |
| 0 | 0.63±0.15d | 15.24±4.76d | 0d |
| 10 | 2.07±0.40ab | 65.34±3.41b | 2.44±0.19b |
| 20 | 2.23±0.16a | 78.65±3.64a | 3.35±0.32a |
| 60 | 1.67±0.25b | 69.42±2.15b | 2.35±0.41b |
| 120 | 1.30±0.21c | 42.28±3.21c | 1.54±0.13c |
注：数据后面的字母表示显著性分析的结果。0为对照，外植体没有经过激素浸泡处理，直接接种到MS培养基上。
实施例5：相同浓度6-BA浸泡不同时间对铁甲草不定芽再生以及愈伤和植株高度的影响
参照实施例1方法，设置浸泡时间分别为0、10、20、40和80min，采用浓度为20mg/L的6-BA溶液对铁甲草外植体进行浸泡处理，之后将外植体接种至MS培养基上进行培养，40天后统计数据。结果如表4所示。
表4采用20mg/L的6-BA浸泡处理铁甲草外植体不同时间后的再生效果
注：数据后面的字母表示显著性分析的结果。0为对照，外植体没有经过激素浸泡处理，直接接种到MS培养基上。
从表4可以看出来，将铁甲草茎外植体分别浸泡在20mg/L的6-BA溶液中不同时间(0、10、20、40和80min)后水平接种到MS培养基上来诱导不定芽的再生，其实验结果表明：6-BA的最有效伸长浸泡时间为20min，可以获得最佳的株高(2.31)和不定芽再生率(80.78％)和最长根(3.18cm)。
实施例6：不同浓度TDZ溶液浸泡处理对铁甲草不定芽再生效果的影响
参照实施例1方法，将经过不同浓度(0、0.15、0.25、0.5和1mg/L)TDZ溶液浸泡40min后的铁甲草外植体，接种至MS培养基上进行不定芽诱导，培养40天后统计数据。结果如表5所示。
由表5可知，当浸泡的TDZ激素溶液浓度为0.25mg/L时，可获得最佳的不定芽诱导效果，株高(1.87cm)、不定芽再生率(58.65％)、主根长(2.31cm)都为最大值。
表5不同浓度TDZ溶液的浸泡对铁甲草不定芽再生以及愈伤和植株高度的影响
| TDZ浓度(mg/L) | 株高(cm) | 不定芽再生率(％) | 主根长(cm) |
| 0 | 0.62±0.12d | 14.39±3.28d | 0c |
| 0.15 | 1.76±0.19ab | 55.34±2.34a | 1.86±0.34ab |
| 0.25 | 1.87±0.18a | 58.65±3.64a | 2.31±0.28a |
| 0.5 | 1.47±0.17b | 43.42±2.15b | 2.11±0.32a |
| 1 | 1.25±0.11c | 37.28±3.21c | 1.23±0.14b |
注：数据后面的字母表示显著性分析的结果。0为对照，外植体没有经过激素浸泡处理，直接接种到MS培养基上。
实施例7：相同浓度TDZ浸泡不同时间对铁甲草外植体不定芽再生效果的影响
参照实施例1方法，设置浸泡时间分别为0、20、30、40和160min，采用浓度为0.25mg/L的TDZ溶液对铁甲草外植体进行浸泡处理，之后将外植体接种至MS培养基上进行培养，40天后统计数据。结果如表6所示。
由表6可知，当浸泡的TDZ溶液处理时间为40min时，可获得最佳的不定芽诱导效果，株高(1.92cm)、不定芽再生率(56.21％)、主根长(2.25cm)都为最大值。
表6不同浸泡时间对铁甲草不定芽再生以及愈伤和植株高度的影响
| TDZ处理时间(min) | 株高(cm) | 不定芽再生率(％) | 主根长(cm) |
| 0 | 0.73±0.24d | 13.58±2.69d | 0c |
| 20 | 1.69±0.18ab | 51.92±3.28a | 1.67±0.21ab |
| 40 | 1.92±0.21a | 56.21±2.53a | 2.25±0.17a |
| 80 | 1.53±0.13b | 41.82±3.43b | 1.96±0.26a |
| 160 | 1.31±0.16c | 38.56±2.72c | 1.25±0.22b |
注：数据后面的字母表示显著性分析的结果。0为对照，外植体没有经过激素浸泡处理，直接接种到MS培养基上。
对比例1：培养基中添加不同激素对铁甲草不定芽再生以及愈伤和植株高度的影响
为了更好的进行比较，还采用了传统方法及其培养基进行铁甲草不定芽再生诱导，分别直接添加不同的激素到MS培养基中，然后将与实施例1中相同的茎段外植体分别直接接种到培养基上进行不定芽诱导培养，培养40天后统计数据。结果如表7所示。
表7培养基中添加不同激素对铁甲草不定芽再生以及愈伤和植株高度的影响
| 添加激素 | 株高(cm) | 不定芽再生率(％) |
| 0 | 0.64±0.14c | 12.47±2.56c |
| 0.05mg/L TDZ | 1.05±0.13b | 38.12±1.31b |
| 0.5mg/L 6-BA | 1.28±0.11a | 47.73±2.47a |
| 0.02mg/L NAA | 1.19±0.15ab | 42.35±3.21ab |
注：数据后面的字母表示显著性分析的结果。0为对照，外植体没有经过激素浸泡处理，直接接种到MS培养基上。
从表7可以看出来，采用传统方法将铁甲草茎段外植体分别直接接种在添加了较低浓度激素的MS培养基上来诱导不定芽的再生。实验结果表明，采用传统方法获得铁甲草不定芽再生的效果都不佳。相对而言，不定芽再生效果最好的是在MS培养基中添加了0.5mg/L 6-BA，此时可以获得最大株高(1.28cm)、最佳的不定芽再生率(47.73％)。此外，采用传统方法诱导不定芽再生都还要经过不定芽伸长培养和生根培养，才可以获得完整植株。
Claims (4)
1.一种铁甲草一步法组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.取发芽后生长了20天的铁甲草无菌苗1.0-1.5cm长度的茎段为外植体，将外植体浸泡在激素溶液中，然后取出外植体，用无菌吸水纸除去外植体表面残留的激素溶液；所述的将外植体浸泡在激素溶液中是将外植体在浓度为30mg/L的NAA溶液中浸泡30min、将外植体在浓度为20mg/L的6-BA溶液中浸泡20min或将外植体在浓度为0.25mg/L的TDZ溶液中浸泡40min；
S2.将外植体茎段轴向水平接种至MS培养基上培养35-45d，获得生根的铁甲草再生苗，然后驯化移栽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤S2为：将外植体茎段轴向水平接种至MS培养基上培养40d，获得生根的铁甲草再生苗，然后驯化移栽。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的铁甲草无菌苗是按照如下方法制备获得的：取铁甲草种子，用80℃的水将种子进行恒温浸泡10min，然后用体积分数75％的乙醇水溶液浸泡30-45s，然后使用质量分数2.5％的次氯酸钠水溶液浸泡10-15min，期间不断震荡，用灭菌蒸馏水冲洗3-4次，每次冲洗1min，最后，接种于MS培养基培养。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的MS培养基：含有16.5g/L硝酸铵、19g/L硝酸钾、1.7g/L磷酸二氢钾、3.7g/L七水硫酸镁、4.4g/L二水氯化钙、16.9mg/L一水硫酸锰、8.6mg/L七水硫酸锌、6.2mg/L硼酸、0.83mg/L碘化钾、0.25mg/L二水硫酸钼二钠、0.025mg/L五水硫酸铜、0.025mg/L六水氯化钴、37.3mg/L二水乙二胺四乙酸钠、27.8mg/L七水硫酸亚铁、2mg/L甘氨酸、0.1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆醇、0.5mg/L烟酸、100mg/L肌醇、30g/L蔗糖和7g/L琼脂，余量为水。
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2023
- 2023-06-13 CN CN202310703820.6A patent/CN116686709B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0568001A2 (en) * | 1992-04-27 | 1993-11-03 | Showa Shell Sekiyu Kabushiki Kaisha | Antiviral agent containing crude drug |
| CN113317204A (zh) * | 2021-07-08 | 2021-08-31 | 嘉应学院 | 一种铁甲草幼苗不定芽诱导及植株高效再生方法 |
| CN115191350A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-10-18 | 广东海洋大学 | 一种诱导铁甲草茎段外植体不定芽再生的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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| 热带亚热带植物学报第22卷 第1~6期 总目次;热带亚热带植物学报;20141115(第06期);第1-10页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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