CN110089433B - 一种露薇花快速组培繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物栽培技术领域，特别是涉及一种露薇花快速组培繁殖的方法，包括以下步骤：(1)露薇花外植体消毒：用75％的酒精浸泡20‑35s，再用0.1％HgCl2溶液浸泡1‑14min；(2)露薇花外植体诱芽培养：将露薇花花梗腋芽作为外植体接种于诱芽培养基中进行不定芽的诱导形成露薇花丛生芽；(3)露薇花丛生芽增殖培养：将丛生芽转接至增殖培养基中培养40天；(4)露薇花壮苗生根培养：选取1.5‑2cm长的小苗转移至壮苗生根培养基中，培养30天。本方法繁殖率高，可以快速大量生产性状一致的露薇花组培苗，缩短了露薇花培养周期，该技术可用于工厂化生产。
Description
技术领域
本发明属于植物栽培技术领域，具体地说是一种露薇花快速组培繁殖的方法。
背景技术
露薇花，(Lewisia cotyledon)是一种马齿苋科植物，露薇花属多年生草本花卉，原产美国西海岸中部山区。露薇花是色彩非常亮丽的花簇，绽放在莲座状叶丛的顶端，形态端庄、颜色艳丽，深受园艺爱好者的喜爱。目前，露薇花主要是通过种子繁殖和分株繁殖的方式，分株繁殖的繁殖系数较低，因此逐渐被淘汰。而种子繁殖虽然繁殖系数提高了，但是存在以下缺陷：优良种子严重依赖于进口，因此价格昂贵，而且播种繁殖流程繁琐，生长周期较长，严重阻碍了露薇花的推广应用。因此，建立优质高效地露薇花离体繁殖技术体系能够达到快速繁殖的目的，同时也为进一步开发利用露薇花资源提供理论和技术支持，满足市场对露薇花的大量需求。
发明内容
本发明为了克服上述技术问题的不足，提供了一种露薇花快速组培繁殖的方法，该方法实用性强、操作简便、快捷经济，繁殖率高，可快速大量生产性状一致的露薇花组培苗，解决了耗费时间长，工厂化生产成本高的问题。
解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供的露薇花快速组培繁殖的方法，包括以下步骤：
(1)露薇花外植体消毒：选用露薇花花梗腋芽，用流动水冲洗30min，然后移至无菌工作台上，先用体积分数为75％的酒精浸泡20-35s，无菌水冲洗4-5次，再用体积分数为0.1％HgCl2溶液浸泡1-14min，再用无菌水冲洗4-5次，用灭菌后的叶片铺于滤纸上吸干露薇花花梗腋芽表面残留的水分，完成消毒；
(2)露薇花外植体诱芽培养：将已消毒过的露薇花花梗腋芽作为外植体接种于诱芽培养基中，用黑色布完全遮盖诱芽培养基和露薇花花梗腋芽，等待5天之后，将诱芽培养基和露薇花花梗腋芽置于光照培养箱中进行不定芽的诱导；光照培养箱中光照强度为1800Lux，光照时间为12h，培养温度为25℃；培养20天后，露薇花花梗腋芽开始出现明显膨胀现象，并且快速萌芽，形成露薇花丛生芽；
(3)露薇花丛生芽增殖培养：将步骤(2)中诱导出的露薇花丛生芽分离成单株，转接至增殖培养基中，将增殖培养基和露薇花丛生芽置于光照培养箱中进行增殖培养，光照培养箱中光照强度为1800Lux，光照时间为12h，培养温度为25℃；培养40天后，露薇花丛生芽增殖倍数为5.13，平均株高增量为2.13cm；
(4)露薇花壮苗生根培养：将步骤(3)培养出的露薇花丛生芽取出，分离成单株，选取1.5-2cm长的小苗转移至壮苗生根培养基中，将壮苗生根培养基和露薇花丛生芽置于光照培养箱中进行壮苗生根培养，光照培养箱中光照强度为1800Lux，光照时间为12h，培养温度为25℃；培养30天后，小苗全部生根，叶片呈现颜色较深的绿色，且叶片数量增加，主茎变粗。
进一步地说，步骤(1)中用75％酒精处理30s，再用0.1％的HgCl2溶液处理5min。
进一步地说，步骤(2)中所述的接种是将消毒过的露薇花花梗腋芽垂直插入诱芽培养基中，每个诱芽培养基中插入2个露薇花花梗腋芽。
进一步地说，步骤(2)中所述的诱芽培养基是以MS培养基为基础，添加6-BA1.0mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L作为激素，用1mol/L的盐酸溶液或者氢氧化钠溶液调节诱芽培养基的pH值为6，搅拌均匀，于高压灭菌锅内灭菌20min，灭菌温度为121℃、灭菌压力为0.14Mpa。
进一步地说，步骤(3)中所述的转接是将露薇花丛生芽垂直插入增殖培养基中，每瓶增殖培养基中插入1株。
进一步地说，步骤(3)中所述的增殖培养基是以MS培养基为基础，添加6-BA1.5mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L作为激素，用1mol/L的盐酸溶液或者氢氧化钠溶液调节增殖培养基的pH值为6，搅拌均匀，于高压灭菌锅内灭菌20min，灭菌温度为121℃、灭菌压力为0.14Mpa。
进一步地说，步骤(4)中所述的转移是将露薇花丛生芽垂直插入壮苗生根培养基中，每瓶壮苗生根培养基中插入1株。
进一步地说，步骤(4)中所述的壮苗生根培养基是以1/2MS培养基为基础，添加NAA0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L，用1mol/L的盐酸溶液或者氢氧化钠溶液调节壮苗生根培养基的pH值为6，搅拌均匀，于高压灭菌锅内灭菌20min，灭菌温度为121℃、灭菌压力为0.14Mpa。
本发明的有益效果为：
本发明提供了露薇花快速繁殖的方法。本方法是利用露薇花花梗腋芽进行初代培养，形成不定芽，然后利用不定芽进行增殖培养形成大量的丛生芽，再进行丛生芽的壮苗生根培养。采用此组织培养方法繁殖露薇花，繁殖率高，可以快速大量生产性状一致的露薇花组培苗，缩短了露薇花培养周期，该技术可用于工厂化生产，将对露薇花的保护、开发和利用提供有效的新途径，具有重要的经济、社会和生态效益。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
图1是花梗腋芽不定芽过程图；
图2是丛生芽增殖过程图；
图3是幼苗生根过程；
图4是幼苗生根正面图；
图5是幼苗生根背面图。
具体实施方式
实施例1：
(1)露薇花无菌材料的获得：
选用露薇花花梗腋芽，用流动水冲洗30min，然后移至无菌工作台上，先用体积分数为75％的酒精浸泡20s，无菌水冲洗4次，再用体积分数为0.1％HgCl2溶液浸泡1min，再用无菌水冲洗4次，用灭菌后的叶片铺于滤纸上，吸干露薇花花梗腋芽的表面残留的水分，完成消毒；
(2)露薇花外植体诱芽培养：
将已消毒过的露薇花花梗腋芽作为外植体垂直插入诱芽培养基中，每个诱芽培养基中插入2个露薇花花梗腋芽，用黑色布完全遮盖诱芽培养基和露薇花花梗腋芽，等待5天之后，将诱芽培养基和露薇花花梗腋芽置于光照培养箱中进行不定芽的诱导；光照培养箱中光照强度为1800Lux，光照时间为12h，培养温度为25℃；培养20天后，露薇花花梗腋芽开始出现明显膨胀现象，并且快速萌芽，形成露薇花丛生芽，50d后统计出愈率为82.32％；所述的诱芽培养基是以MS培养基为基础，添加6-BA1.0mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L作为激素，用1mol/L的盐酸溶液或者氢氧化钠溶液调节诱芽培养基的pH值为6，搅拌均匀，于高压灭菌锅内灭菌20min，灭菌温度为121℃、灭菌压力为0.14Mpa。
(3)露薇花丛生芽增殖培养：将步骤(2)中诱导出的露薇花丛生芽分离成单株，垂直插入至增殖培养基中，每瓶增殖培养基中插入1株，将增殖培养基和露薇花丛生芽置于光照培养箱中进行增殖培养，光照培养箱中光照强度为1800Lux，光照时间为12h，培养温度为25℃；培养40天后，露薇花丛生芽增殖倍数为5.13，平均株高增量为2.13cm；增殖培养基是以MS培养基为基础，添加6-BA1.5mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L作为激素，用1mol/L的盐酸溶液或者氢氧化钠溶液调节增殖培养基的pH值为6，搅拌均匀，于高压灭菌锅内灭菌20min，灭菌温度为121℃、灭菌压力为0.14Mpa。
(4)露薇花壮苗生根培养：将步骤(3)培养出的露薇花丛生芽取出，分离成单株，选取1.5-2cm长的小苗垂直插入至壮苗生根培养基中，每瓶壮苗生根培养基中插入1株，将壮苗生根培养基和露薇花丛生芽置于光照培养箱中进行壮苗生根培养，光照培养箱中光照强度为1800Lux，光照时间为12h，培养温度为25℃；培养30天后，小苗全部生根，叶片呈现颜色较深的绿色，且叶片数量增加，主茎变粗。壮苗生根培养基是以1/2MS培养基为基础，添加NAA0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L，用1mol/L的盐酸溶液或者氢氧化钠溶液调节壮苗生根培养基的pH值为6，搅拌均匀，于高压灭菌锅内灭菌20min，灭菌温度为121℃、灭菌压力为0.14Mpa。
实施例2：
(1)露薇花无菌材料的获得：
选用露薇花花梗腋芽，用流动水冲洗30min，然后移至无菌工作台上，先用体积分数为75％的酒精浸泡35s，无菌水冲洗5次，再用体积分数为0.1％HgCl2溶液浸泡14min，再用无菌水冲洗5次，用灭菌后的叶片铺于滤纸上，吸干露薇花花梗腋芽的表面残留的水分，完成消毒；
(2)露薇花外植体诱芽培养：
将已消毒过的露薇花花梗腋芽作为外植体垂直插入诱芽培养基中，每个诱芽培养基中插入2个露薇花花梗腋芽，用黑色布完全遮盖诱芽培养基和露薇花花梗腋芽，等待5天之后，将诱芽培养基和露薇花花梗腋芽置于光照培养箱中进行不定芽的诱导；光照培养箱中光照强度为1800Lux，光照时间为12h，培养温度为25℃；培养20天后，露薇花花梗腋芽开始出现明显膨胀现象，并且快速萌芽，形成露薇花丛生芽，50d后统计出愈率为82.32％；所述的诱芽培养基是以MS培养基为基础，添加6-BA 1.0mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L作为激素，用1mol/L的盐酸溶液或者氢氧化钠溶液调节诱芽培养基的pH值为6，搅拌均匀，于高压灭菌锅内灭菌20min，灭菌温度为121℃、灭菌压力为0.14Mpa。
(3)露薇花丛生芽增殖培养：将步骤(2)中诱导出的露薇花丛生芽分离成单株，垂直插入至增殖培养基中，每瓶增殖培养基中插入1株，将增殖培养基和露薇花丛生芽置于光照培养箱中进行增殖培养，光照培养箱中光照强度为1800Lux，光照时间为12h，培养温度为25℃；培养40天后，露薇花丛生芽增殖倍数为5.13，平均株高增量为2.13cm；增殖培养基是以MS培养基为基础，添加6-BA1.5mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L作为激素，用1mol/L的盐酸溶液或者氢氧化钠溶液调节增殖培养基的pH值为6，搅拌均匀，于高压灭菌锅内灭菌20min，灭菌温度为121℃、灭菌压力为0.14Mpa。
(4)露薇花壮苗生根培养：将步骤(3)培养出的露薇花丛生芽取出，分离成单株，选取1.5-2cm长的小苗垂直插入至壮苗生根培养基中，每瓶壮苗生根培养基中插入1株，将壮苗生根培养基和露薇花丛生芽置于光照培养箱中进行壮苗生根培养，光照培养箱中光照强度为1800Lux，光照时间为12h，培养温度为25℃；培养30天后，小苗全部生根，叶片呈现颜色较深的绿色，且叶片数量增加，主茎变粗。壮苗生根培养基是以1/2MS培养基为基础，添加NAA0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L，用1mol/L的盐酸溶液或者氢氧化钠溶液调节壮苗生根培养基的pH值为6，搅拌均匀，于高压灭菌锅内灭菌20min，灭菌温度为121℃、灭菌压力为0.14Mpa。
实施例3：
(1)露薇花无菌材料的获得：
选用露薇花花梗腋芽，用流动水冲洗30min，然后移至无菌工作台上，先用体积分数为75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗5次，再用体积分数为0.1％HgCl2溶液浸泡5min，再用无菌水冲洗4次，用灭菌后的叶片铺于滤纸上，吸干露薇花花梗腋芽的表面残留的水分，完成消毒；
(2)露薇花外植体诱芽培养：
将已消毒过的露薇花花梗腋芽作为外植体垂直插入诱芽培养基中，每个诱芽培养基中插入2个露薇花花梗腋芽，用黑色布完全遮盖诱芽培养基和露薇花花梗腋芽，等待5天之后，将诱芽培养基和露薇花花梗腋芽置于光照培养箱中进行不定芽的诱导；光照培养箱中光照强度为1800Lux，光照时间为12h，培养温度为25℃；培养20天后，露薇花花梗腋芽开始出现明显膨胀现象，并且快速萌芽，形成露薇花丛生芽，50d后统计出愈率为82.32％；所述的诱芽培养基是以MS培养基为基础，添加6-BA 1.0mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L作为激素，用1mol/L的盐酸溶液或者氢氧化钠溶液调节诱芽培养基的pH值为6，搅拌均匀，于高压灭菌锅内灭菌20min，灭菌温度为121℃、灭菌压力为0.14Mpa。
(3)露薇花丛生芽增殖培养：将步骤(2)中诱导出的露薇花丛生芽分离成单株，垂直插入至增殖培养基中，每瓶增殖培养基中插入1株，将增殖培养基和露薇花丛生芽置于光照培养箱中进行增殖培养，光照培养箱中光照强度为1800Lux，光照时间为12h，培养温度为25℃；培养40天后，露薇花丛生芽增殖倍数为5.13，平均株高增量为2.13cm；增殖培养基是以MS培养基为基础，添加6-BA1.5mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L作为激素，用1mol/L的盐酸溶液或者氢氧化钠溶液调节增殖培养基的pH值为6，搅拌均匀，于高压灭菌锅内灭菌20min，灭菌温度为121℃、灭菌压力为0.14Mpa。
(4)露薇花壮苗生根培养：将步骤(3)培养出的露薇花丛生芽取出，分离成单株，选取1.5-2cm长的小苗垂直插入至壮苗生根培养基中，每瓶壮苗生根培养基中插入1株，将壮苗生根培养基和露薇花丛生芽置于光照培养箱中进行壮苗生根培养，光照培养箱中光照强度为1800Lux，光照时间为12h，培养温度为25℃；培养30天后，小苗全部生根，叶片呈现颜色较深的绿色，且叶片数量增加，主茎变粗。壮苗生根培养基是以1/2MS培养基为基础，添加NAA0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L，用1mol/L的盐酸溶液或者氢氧化钠溶液调节壮苗生根培养基的pH值为6，搅拌均匀，于高压灭菌锅内灭菌20min，灭菌温度为121℃、灭菌压力为0.14Mpa。
以下结合各平行试验，确定各步骤的最佳参数：
1.露薇花愈伤组织诱导
(1)露薇花外植体及灭菌时间选择
对外植体叶片和花梗腋芽先用75％酒精20s、30s处理，再用0.1％的HgCl2处理1min、3min、5min、7min、9min、10min、12min、14min；随着消毒时间的增加，叶片和花梗腋芽的污染率都表现呈下降趋势，褐化率呈上升趋势，存活率先上升后下降，叶片在0.1％HgCl2处理5min的时候达到顶峰，后逐渐降低，而花梗腋芽则在10min达到顶峰后降低；
通过单因素分析，叶片酒精处理为20s较好，其污染率虽然稍高于30s，但是褐化率相对较低，且存活率相对较高；HgCl2处理时间为5min时，其污染率只有15.56％，褐化率为10％，存活率达到74.44％，第一个叶片发生变化是在28d开始，出现叶片变厚、裂开等现象，但产生愈伤组织缓慢，裂开后生长停滞了一小段时间，60d统计出愈率为73.70％；而花梗腋芽的酒精灭菌时间为30s较好，其污染率低于20s，虽然褐化率较20s较高，但存活率高于20s；0.1％HgCl2的处理时间为10min最合适，其污染率为14.67％，褐化率为17.33％，存活率为68％，在第20d开始出现明显膨胀现象，并且快速萌芽，形成丛生芽，50d后统计出愈率为82.32％；
从存活率和出愈率来看，叶片灭菌时间短，损伤较低，存活率较高，但是出愈率低，花梗腋芽虽然存活率相对叶片较低，但是出愈率比叶片高。从初代培养的过程来看，花梗腋芽开始出愈的时间短于叶片的，启动比叶片快，能够快速形成丛生芽，而叶片从出现裂变到产生愈伤组织这段时间生长缓慢，且愈伤组织生长速度也有待提高。因此，选择花梗腋芽作为露薇花组培材料，用75％酒精处理30s，再用0.1％的HgCl2处理5min更佳。
(2)初代培养基本培养基种类的选择
选取5种基本培养基分别为MS、1/2MS、1/4MS(MS中大量元素减少至1/2、1/4)、N6、B5，添加激素6-BA 0.5mg/L与NAA 0.1mg/L，每个培养瓶中接种2个花梗，每个处理10瓶，重复3次，共30瓶。在接种20d以后，MS、1/2MS、N6培养基中花梗开始膨胀，30d后，1/4MS、B5培养基花梗也开始膨胀；MS、1/2MS、N6培养基可以看到花梗长出新芽，而MS培养基腋芽基部已分化较小的幼芽(如图1所示)；50d后，统计各培养基的诱导率，MS培养基的诱导率为78.33％，1/2MS培养基的诱导率为61.67％，1/4MS培养基的诱导率为23.33％，N6培养基的诱导率为53.33％，B5培养基的诱导率为30％。综合结果，确认最佳培养基为MS培养基。
(3)初代培养植物激素种类与浓度的确定
以MS为基本培养基，通过三因素完全随机实验设计，选择细胞分裂素6-BA与生长素NAA、2，4-D三个因素，6-BA浓度为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L，NAA浓度为0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L，2，4-D浓度为0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L；
通过单因素比较，对比NAA与2,4-D的效果，通过方差分析可以明显看出NAA和6-BA组合明显比2,4-D和6-BA组合效果好。而在NAA与6-BA组合中，露薇花花梗腋芽的诱导率随着NAA浓度的增加而呈下降趋势，而6-BA浓度为1.0mg/L时，在同生长素(NAA)浓度组合中其诱导率普遍高于其他浓度6-BA，诱导率最高值达到85％。因此可以确定最佳露薇花初代培养的激素组合为6-BA1.0mg/L和NAA0.1mg/L；
进一步说明，露薇花初代培养的最佳条件为：以露薇花花梗作外植体，用75％酒精处理30s，再用0.1％的HgCl2处理5min，无菌水冲洗5次，接种于MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.1mg/L培养基中进行培养，期间，光照培养箱中光照强度为1800Lux，光照时间为12h，温度为25℃，20d后花梗腋芽开始出现明显膨胀现象，并且快速萌芽，形成丛生芽。
2.露薇花继代增殖培养
(1)继代培养基本培养基种类的选择
将步骤1中诱导出的不定芽分离成单株，将其垂直插入到增殖培养基中，选取4种基本培养基MS、1/2MS、1/4MS(MS中大量元素减少至1/2、1/4)、N6，添加激素6-BA 1.0mg/L与NAA 0.5mg/L，每个培养瓶中接种1个芽，每个处理10瓶，重复3次，共30瓶；
其中MS培养基的增殖倍数最高为4.4(如图2所示)，其次是N6培养基为3.83，第三位1/2MS培养基为3.14，增值倍数最少的是1/4MS培养基为2.43，且四种培养基的增殖倍数都有显著性差异。在花梗芽增殖生长期间，花梗芽的株高也有一定变化，MS培养基的平均株高增量达到1.69cm，N6和1/2MS培养基两种平均株高增量分别为1.47cm和1.4cm，两者无显著性差异，1/4MS培养基的平均株高增量最少为1.25cm；
综合以上，MS的增殖倍数最高，平均株高增量也最高，所以MS最适合露薇花花梗芽继代增殖培养。
(2)继代培养植物激素种类与浓度的确定
将步骤1中诱导出的不定芽分离成单株，将其垂直插入到增殖培养基中，以MS为基本培养基，选择细胞分裂素6-BA与生长素NAA、2，4-D三个因素，通过初代培养效果设置激素浓度，6-BA浓度为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L；NAA浓度为0.1mg/L、0.5mg/L；2，4-D浓度为0.1mg/L、0.5mg/L。每个培养瓶中接种1个芽，每个处理10瓶，重复3次，共30瓶；
通过比较两种不同生长素配比6-BA，可以发现NAA的效果明显优于2,4-D，说明NAA与6-BA组合的增殖效果相较于2,4-D与6-BA来说更合适。比较同种生长素的浓度梯度，发现低浓度生长素增殖效果都是优于高浓度生长素。在NAA 0.1mg/L和6-BA1.5mg/L配比下，增殖效果很明显，其增殖倍数为5.13，株高增量为2.13；其次是在NAA 0.1mg/L和6-BA1.0mg/L配比下，其增殖倍数为4.3，株高增量为1.73；因此，选择6-BA 1.5mg/L与NAA 0.1mg/L组合作为露薇花花梗芽增殖的最佳激素组合。
综合以上，露薇花继代培养的最佳条件为：将步骤1中诱导出的不定芽分离成单株，将其垂直插入到增殖培养基MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.1mg/L之中，每瓶接种1株；随后将培养瓶中放置于人工光照培养箱中进行增殖培养，光照培养箱中光照强度为1800Lux，光照时间为12h，温度为25℃，40d后，幼芽增殖倍数为5.13，平均株高增量为2.13cm。
3.露薇花组培苗壮苗生根培养
(1)壮苗生根培养基本培养基种类的选择
将上述步骤2中培养出的花梗芽增值培养得到的无菌试管苗，选取1.5-2cm的单株小苗，将其垂直插入到1/2MS、1/4MS基本培养基中，添加激素NAA 0.1mg/L。每个培养瓶中接种1个芽，每个处理10瓶，重复3次，共30瓶；其中1/2MS培养基的全部生根，平均生根数达到12.3根，从生长状态来看，其叶片颜色绿色较深，且叶片数量增加多，体积变大，主茎变粗(如图3、4、5所示)；而1/4MS培养基的生根率只有76.67％，且平均生根数也只有6.4根，叶片的颜色也稍淡绿，叶片增加较少，看起来较稀疏，主茎较细，因此，1/2MS培养基更适合露薇花组培苗壮苗生根。
(2)壮苗生根培养植物激素种类与浓度的确定
将上述步骤2中培养出的花梗芽增值培养得到的无菌试管苗，选取2cm左右的单株小苗，将其垂直插入到1/2MS基本培养基中，分别添加激素NAA(0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L)、IBA(0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L)两种激素，每个培养瓶中接种1个芽，每个处理10瓶，重复3次，共30瓶；其中，在1/2MS培养基中，不添加任何激素，其生根率极低，30株只有2株明显生根，平均生根数也只有1.69，叶片呈淡绿色，植株基本没变化；在1/2MS培养基中，添加激素NAA的四个浓度中，浓度为0.1mg/L和0.2mg/L的诱导生根率率最高，生根率都达到100％，平均生根数12.3，且叶绿，叶片数量增加，叶片面积变大，根多；在1/2MS培养基中，添加激素IBA的四个浓度中，IBA浓度为0.2mg/L时生根诱导效果最好，生根率100％，平均生根数9.48，且叶绿，叶片数量增加，叶片面积变大，根有几根伸长，大多数粗短；从整体比较，NAA的生根率略高于IBA，但平均生根数上NAA显著性高于IBA，因此，选择生长素NAA0.2mg/L作为最佳露薇花组培苗壮苗生根激素及浓度；
综合以上，露薇花壮苗生根培养的最佳条件为：将上述步骤2中培养出的花梗芽增值培养得到的无菌试管苗，选取2cm左右的单株小苗，将其垂直插入到壮苗生根培养基1/2MS+NAA0.2mg/L之中，每瓶接中1个芽；随后将培养瓶放置于人工光照培养箱中进行壮苗生根培养，光照培养箱中光照强度为1800Lux，光照时间为12h，温度为25℃，30d后小苗全部生根，平均生根数达到12.3根，从生长状态来看，叶片颜色绿色较深，且叶片数量也有增加，主茎变粗。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质上对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种露薇花快速组培繁殖的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）露薇花外植体消毒：选用露薇花花梗腋芽，用流动水冲洗30min，然后移至无菌工作台上，先用体积分数为75%的酒精浸泡20-35 s，无菌水冲洗4-5次，再用体积分数为0.1%HgCl2溶液浸泡1-14 min，再用无菌水冲洗4-5次，用灭菌后的叶片铺于滤纸上吸干露薇花花梗腋芽表面残留的水分，完成消毒；
（2）露薇花外植体诱芽培养：将已消毒过的露薇花花梗腋芽作为外植体接种于诱芽培养基中，用黑色布完全遮盖诱芽培养基和露薇花花梗腋芽，等待5天之后，将诱芽培养基和露薇花花梗腋芽置于光照培养箱中进行不定芽的诱导；光照培养箱中光照强度为1800Lux，光照时间为12 h，培养温度为25 ℃；培养20 天后，露薇花花梗腋芽开始出现明显膨胀现象，并且快速萌芽，形成露薇花丛生芽；所述的诱芽培养基是以MS培养基为基础，添加6-BA1.0 mg/L、NAA0.1 mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7 g/L，调节诱芽培养基的pH值为6，搅拌均匀，于高压灭菌锅内灭菌20min，灭菌温度为121℃、灭菌压力为0.14Mpa；
（3）露薇花丛生芽增殖培养：将步骤（2）中诱导出的露薇花丛生芽分离成单株，转接至增殖培养基中，将增殖培养基和露薇花丛生芽置于光照培养箱中进行增殖培养，光照培养箱中光照强度为1800Lux，光照时间为12 h，培养温度为25 ℃；培养40 天后，露薇花丛生芽增殖倍数为5.13，平均株高增量为2.13 cm；所述的增殖培养基是以MS培养基为基础，添加6-BA1.5 mg/L、NAA0.1 mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7 g/L，调节增殖培养基的pH值为6，搅拌均匀，于高压灭菌锅内灭菌20min，灭菌温度为121℃、灭菌压力为0.14Mpa；
（4）露薇花壮苗生根培养：将步骤（3）培养出的露薇花丛生芽取出，分离成单株，选取1.5-2cm长的小苗转移至壮苗生根培养基中，将壮苗生根培养基和露薇花丛生芽置于光照培养箱中进行壮苗生根培养，光照培养箱中光照强度为1800Lux，光照时间为12 h，培养温度为25 ℃；培养30 天后，小苗全部生根，叶片呈现颜色较深的绿色，且叶片数量增加，主茎变粗；所述的壮苗生根培养基是以1/2MS培养基为基础，添加NAA0.2 mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7 g/L，调节壮苗生根培养基的pH值为6，搅拌均匀，于高压灭菌锅内灭菌20min，灭菌温度为121℃、灭菌压力为0.14Mpa。
2.根据权利要求1所述的露薇花快速组培繁殖的方法，其特征在于，步骤（1）中用75%酒精处理30 s，再用0.1% 的HgCl2溶液处理5min。
3.根据权利要求1所述的露薇花快速组培繁殖的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的接种是将消毒过的露薇花花梗腋芽垂直插入诱芽培养基中，每个诱芽培养基中插入2个露薇花花梗腋芽。
4.据权利要求1所述的露薇花快速组培繁殖的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的转接是将露薇花丛生芽垂直插入增殖培养基中，每瓶增殖培养基中插入1株。
5.根据权利要求1所述的露薇花快速组培繁殖的方法，其特征在于，步骤（4）中所述的转移是将露薇花丛生芽垂直插入壮苗生根培养基中，每瓶壮苗生根培养基中插入1株。
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