CN104782496A - 一种大薯组织培养再生体系的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大薯组织培养再生体系的建立方法，大薯（Dioscorea alata L.）又名参薯,为多年生缠绕草质藤本,隶属于薯蓣科薯预属;大薯营养丰富,色泽鲜艳,口感俱佳,是人们喜爱的一种食物。大薯耐旱,耐热,产量潜力高,且淀粉含量较高,生育期短,是一种颇具发展潜力的能源植物。目前,大薯主要通过地下块茎进行无性繁殖,种子材料消耗大,且这种自留种的栽培形式会使其种性退化,品质降低,产量下降，因此有必要构建大薯离体培养再生体系。本发明的主要流程为：外植体消毒处理→接种于萌动培养基诱导出愈伤组织→愈伤组织增殖培养→愈伤组织分化为丛生芽→生根及成苗培养。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种大薯组织培养再生体系的建立方法。
背景技术
当今,大量的开采和过度的使用矿物资源造成了严重的能源短缺和环境污染。因此，以能源植物为主的生物质能将是人类未来的理想选择，开发能源植物作为现有能源的补充和替代品既能逐步缓解能源危机,又因生产成本低,符合可持续发展的要求和趋势。草本植物具有对环境适应能力强、分布广、生长快、生长周期短,有利于大面积种植,进行产业化生产。大薯（Dioscorea alata L.）又名参薯,为多年生缠绕草质藤本,隶属于薯蓣科薯预属草本植物。大薯耐旱,耐热,产量潜力高,且淀粉含量较高,生育期短,是一种颇具发展潜力的能源植物。
目前,大薯主要通过地下块茎进行无性繁殖,种子材料消耗大,且这种自留种的栽培形式会使其种性退化,品质降低,产量下降，因此,改善品质,提高产量,减少种植损耗,己成为大薯生产中急待解决的问题。随着生物技术的发展,人们利用组织培养技术恢复其品种的优良性能,增强其抗御病害的能力,达到提高其产量,改善其品质的目的。本发明通过外植体消毒处理→接种于萌动培养基诱导出愈伤组织→愈伤组织增殖培养→愈伤组织分化为丛生芽→生根及成苗培养等流程建立了大薯离体培养再生体系，为大薯的工厂化生产和推广应用提供了技术支持。
发明内容
本发明的目的在于提供出一种大薯组织培养再生体系的建立方法，本发明通过：外植体消毒处理→接种于萌动培养基诱导出愈伤组织→愈伤组织增殖培养→愈伤组织分化为丛生芽→生根及成苗培养等步骤，建立了大薯离体培养再生体系，从而实现了本发明的目的。
本发明的一种大薯组织培养再生体系的建立方法，包括以下的步骤：
（1）外植体消毒处理：晴天从田间取无病害大薯幼嫩茎，用自来水冲洗干净后,用中性洗衣粉轻洗外植体。置于流水下冲洗l～2h后置于无菌超净工作台上,备用。先用75%酒精快速灭菌10～20s,然后用无菌水冲洗3～4次,接着用0.1% HgC12分别消毒5～15min，无菌水冲洗3～5次后用无菌滤纸擦干外植体表面水分后备用。
（2）愈伤组织诱导：将步骤（1）消毒处理好的茎段接种于萌动培养基中进行愈伤组织诱导培养。接种后先黑暗条件下培养，待种子萌发后再移至置于每天光照12～14小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计萌动率。
（3）增殖培养：将步骤（2）诱导培养得到的愈伤组织转接到增殖培养基中进行继代。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计增殖情况。
（4）分化培养：将步骤（3）继代得到的愈伤组织转接至分化培养基中进行诱导分化培养。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计分化情况。
（5）生根培养：将经步骤（4）分化培养得到的无根试管苗转接至生根培养基中进行生根。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计生根情况。
（6）炼苗移栽：试管苗生根20天后，具备发达健壮的根时将组培苗不揭瓶盖在自然光下炼苗7天。移栽时用镊子从瓶中取出组培苗,小心洗净基部残留的培养基,选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水,遮荫处理。移栽后经常喷水,保持空气湿度。植株成活后转入正常土壤中定植。
上述步骤（2）所述的萌动培养基为：MS+1.0～2.0mg/L 6-BA+ 2.0～5.0mg/L 2,4-D+25～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（3）所述的增殖培养基为：MS+1.0～5.0mg/L6-BA+1.0～3.0mg/LNAA+25～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（4）所述的分化培养基为：MS+0.1～0.5mg/LNAA+0.5～1.0mg/L6-BA+20～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（5）所述的生根培养基为：1/2MS+0.1～1.0mg/LNAA+20～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
本发明的优点是：通过外植体消毒处理→接种于萌动培养基诱导出愈伤组织→愈伤组织增殖培养→愈伤组织分化为丛生芽→生根及成苗培养等流程建立了大薯离体培养再生体系，为大薯的工厂化生产和推广应用提供了技术支持。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1
（1）外植体消毒处理：晴天从田间取无病害大薯幼嫩茎，用自来水冲洗干净后,用中性洗衣粉轻洗外植体。置于流水下冲洗lh后置于无菌超净工作台上,备用。先用75%酒精快速灭菌10s,然后用无菌水冲洗3次,接着用0.1% HgC12分别消毒5min，无菌水冲洗3次后用无菌滤纸擦干外植体表面水分后备用。
（2）愈伤组织诱导：将步骤（1）消毒处理好的茎段接种于萌动培养基中进行愈伤组织诱导培养。接种后先黑暗条件下培养，待种子萌发后再移至置于每天光照12小时，光照强度为1000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后萌动率达到96.8%。所述的萌动培养基为：MS+1.0mg/L 6-BA+ 2.0mg/L 2,4-D+25g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.4。
（3）增殖培养：将步骤（2）诱导培养得到的愈伤组织转接到增殖培养基中进行继代。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后增殖系数达到6.83。所述的增殖培养基为：MS+1.0mg/L6-BA+1.5mg/LNAA+25g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.4。
（4）分化培养：将步骤（3）继代得到的愈伤组织转接至分化培养基中进行诱导分化培养。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计分化率达到100%。所述的分化培养基为：MS+0.1mg/LNAA+0.5mg/L6-BA+20g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4。
（5）生根培养：将经步骤（4）分化培养得到的无根试管苗转接至生根培养基中进行生根。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后生根率达到100%。所述的生根培养基为：1/2MS+0.1mg/LNAA+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.4。
（6）炼苗移栽：试管苗生根20天后，具备发达健壮的根时将组培苗不揭瓶盖在自然光下炼苗7天。移栽时用镊子从瓶中取出组培苗,小心洗净基部残留的培养基,选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水,遮荫处理。移栽后经常喷水,保持空气湿度。植株成活后转入正常土壤中定植，移栽30天后成活率达到97.4%。
实施例2
（1）外植体消毒处理：晴天从田间取无病害大薯幼嫩茎，用自来水冲洗干净后,用中性洗衣粉轻洗外植体。置于流水下冲洗2h后置于无菌超净工作台上,备用。先用75%酒精快速灭菌15s,然后用无菌水冲洗5次,接着用0.1% HgC12分别消毒8min，无菌水冲洗3次后用无菌滤纸擦干外植体表面水分后备用。
（2）愈伤组织诱导：将步骤（1）消毒处理好的茎段接种于萌动培养基中进行愈伤组织诱导培养。接种后先黑暗条件下培养，待种子萌发后再移至置于每天光照13小时，光照强度为1500lx，置于培养温度为26℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后萌动率达到94.9%。所述的萌动培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+ 5.0mg/L 2,4-D+25g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.6。
（3）增殖培养：将步骤（2）诱导培养得到的愈伤组织转接到增殖培养基中进行继代。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为26℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后增殖系数达到6.16。所述的增殖培养基为：MS+1.2mg/L6-BA+3.0mg/LNAA+25g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.4。
（4）分化培养：将步骤（3）继代得到的愈伤组织转接至分化培养基中进行诱导分化培养。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为27℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计分化率达到90%。所述的分化培养基为：MS+0.3mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+25g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.6。
（5）生根培养：将经步骤（4）分化培养得到的无根试管苗转接至生根培养基中进行生根。接种后置于每天光照14小时，光照强度为3000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后生根率达到96.1%。所述的生根培养基为：1/2MS+0.5mg/LNAA+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.6。
（6）炼苗移栽：试管苗生根20天后，具备发达健壮的根时将组培苗不揭瓶盖在自然光下炼苗7天。移栽时用镊子从瓶中取出组培苗,小心洗净基部残留的培养基,选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水,遮荫处理。移栽后经常喷水,保持空气湿度。植株成活后转入正常土壤中定植，移栽30天后成活率达到95.9%。
Claims (5)
1.一种大薯组织培养再生体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）外植体消毒处理：晴天从田间取无病害大薯幼嫩茎，用自来水冲洗干净后,用中性洗衣粉轻洗外植体，置于流水下冲洗l～2h后置于无菌超净工作台上,备用，先用75%酒精快速灭菌10～20s,然后用无菌水冲洗3～4次,接着用0.1% HgC12分别消毒5～15min，无菌水冲洗3～5次后用无菌滤纸擦干外植体表面水分后备用；
（2）愈伤组织诱导：将步骤（1）消毒处理好的茎段接种于萌动培养基中进行愈伤组织诱导培养，接种后先黑暗条件下培养，待种子萌发后再移至置于每天光照12～14小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计萌动率；
（3）增殖培养：将步骤（2）诱导培养得到的愈伤组织转接到增殖培养基中进行继代，接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计增殖情况；
（4）分化培养：将步骤（3）继代得到的愈伤组织转接至分化培养基中进行诱导分化培养，接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计分化情况；
（5）生根培养：将经步骤（4）分化培养得到的无根试管苗转接至生根培养基中进行生根，接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计生根情况；
（6）炼苗移栽：试管苗生根20天后，具备发达健壮的根时将组培苗不揭瓶盖在自然光下炼苗7天，移栽时用镊子从瓶中取出组培苗,小心洗净基部残留的培养基,选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水,遮荫处理，移栽后经常喷水,保持空气湿度，植株成活后转入正常土壤中定植。
2. 根据权利要求1所述的一种大薯组织培养再生体系的建立方法，其特征在于步骤（2）所述的萌动培养基为：MS+1.0～2.0mg/L 6-BA+ 2.0～5.0mg/L 2,4-D+25～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
3.根据权利要求1所述的一种大薯组织培养再生体系的建立方法，其特征在于步骤（3）所述的增殖培养基为：MS+1.0～5.0mg/L6-BA+1.0～3.0mg/LNAA+25～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
4.根据权利要求1所述的一种大薯组织培养再生体系的建立方法，其特征在于步骤（4）所述的分化培养基为：MS+0.1～0.5mg/LNAA+0.5～1.0mg/L6-BA+20～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
5.根据权利要求1所述的一种大薯组织培养再生体系的建立方法，其特征在于步骤（5）所述的生根培养基为：1/2MS+0.1～1.0mg/LNAA+20～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
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