JPH02502253A - 綿の再生及び形質転換 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕ■Ｌ、）種の綿の植物再生及び形質転換に向けられたも のである。

近年、異った分類学的群に属する植物からの各種起源の多くの組織がｉｎ　ｖｉ ｔｒｏ組織培養において確立されている。そのような培養の生育及び分化を調節 する幾つかの因子も又決定されている。異った植物ホルモン群及び直接的或いは 間接的に作用する植物成長制御体の間の微妙な相互作用の確立は単独或いは相乗 的組合せである程度細胞、組織及び器官の間に存在するある種の相関関係への洞 察を与えてきた。しかしながら、この情報は決して完全ではない。

しばらくの間、植物細胞培養液は非分化増殖状態に無限に維持されうろことが知 られていた。しかしながら、最近になって組織、器官或いは全植物生物体の再分 化が実験的に誘発されうろことが見出された。スクーグ（Ｓ　ｋｏｏｇ）等によ る°Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｒ　ｇｒｏｗｔｈａｎｄ　ｏ ｒｇａｎ　ｒｏｒｗｈａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｃｕｌ ｔｕｒｅｄ　１ｎｖｉｔｒｏ、−５ｙｓｐ、　　５ｏｃ−Ｅｘｐ、　　Ｂｉｏｌ 、　　　１　１　　：１８　　　１　３０＋１９５８、（ここにおいて準用する ）により、サイトキニン対オーキシンの相対比がタバコ髄組織における器官発生 の性質を決定することが示されている。カルス培養液からの再組織或いは再生は 、共に究極的にはｉｎ　ｖｉｔｒ。

の再発達に導（苗発生原基或いは胚の形成を含むものである。

器官発生対胚発生についての傾向は、尚関連する種及び化学的及び／又は物理的 性質のある種の引金因子に応じて異る。

１９０２年に、ハーバ−ラント（Ｉｌａｂｅｒｉａｎｄｔ）、”　Ｋ　ｕｌｔｕ ｒｖｅｒｓｕｃｈｅ　　ｓｉｔ　　１ｓｏｌｉｅｒｔｅｎ　　ｐＨａｎｚｅｎｚ ｅｌｌｅｎ、”Ｍａｔ、　Ｈ−Ｋａｉｓ、Ａｋａｄ、１１ｇ５．１１ｉｅｎ　１ １１　：　６２　（ここにおいて準用する）は、植物細胞は全植物を産出する能 力を有すると仮定し、これが何時の日か細胞培養において示されるであろうこと を予言した。１９６５年に、ライナート（Ｒｅｉｎｅｒｔ）”Ｕｎｔｅｒｓｕｃ ｈｕｎｇｅｎ　ｕｂｅｒ　ｄｉｅ　ｍｏｒｐｂｏｇｅｎｅｓｅａｎ　　Ｇｅｖｅ ｂｅｋｕｌｔｕｒｅｎ＊”　Ｂｅｒ、　　ｄｔ、　　Ｂｏｔ、　　Ｇｅｓ、　　 ７　１　　：　　１　５　、及びスチ二ワー）　（Ｓｔｅｗａｒｄ）等“Ｇｒｏ ｗｔｈ　ａｎｄ　ｏｒｇａｎｉｚｅｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｕｌｔ ｃ＋ｒｅｄ　ｃｅｌｌｓ／　ＩＩ　％Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　１ｎｃｕｌｔ ｕｒｅｓ　　ｇｒｏｗｎ　　ｆｒｏｓ’　　ｆｒｅｅｌｙ　　５ｕｓｐｅｎｄｅ ｄ　　ｃｅｌｌｓ、”　　ＡｔＪ。

Ｂｏｔ、４５　：　７０５−７０８、は独立に研究しながら１ｎｖｉｔｒｏの体 細胞胚発生を確認した。これらの両文献はここに引用する。実験的に体細胞胚発 生を操作するに際し、細胞培地の二成分、オーキシン及び窒素源が決定的役割を 果たすものと思われる。

又、体細胞胚発生の過程は、二つの段階、先ず高濃度のオーキシンの存在下にお ける胚発生能力を有する細胞の誘発及び第二にオーキシンの不存在下或いは低濃 度における胚細胞集団の胚への発達として起こることが示された。

器官発生成いは胚発生の誘発はカルスにおける区別された構造パターンに導く。

幾つかの植物種の詳細な研究は、苗木、芽或いは胚の発達に導く発達経路につい である種の一般化を行うことを可能にした。

組織培養技術の器官発生成いは胚発生を介しての植物の再生への適用は、おそら （工業的応用への継代発生における基本的研究の中で最も重要な寄与を残すもの と思われる。

ビーズレ−（Ｂｅａｓｌｅｙ）は１９７１年に綿の胚珠の培２１：９０６：９０ ７．１９７１、ここにおいて準用する〕。後にス−（Ｈｓｕ）等〔“Ｃａ１ｌｕ ｓ　１ｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　（２−ｃｂｌｏｒｅｔｂｙｌ）　ｐｂｏｓｐｂ ｏｎｉｃ　（ＣＰＡ）　ａｃｉｄ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄｃｏｔｔｏｎ　ｏｖ ｕｌｅｓ、”Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ　３６　：　１５０　１５３．１９ ７６、ここにおいて準用する〕は、培地へのＣＰＡ及ヒシヘレリン酸の添加によ る胚珠から得られたカルスの生育の刺激を観察している。その他の外植片例えば （ａ）葉〔デビス（Ｄｅｖｉｓ）等、”Ｉｎ　ｖｉＬｒｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏ ｆ　ｃａｌｌｕｓｔｉｓｓｕｅｓ　　ａｎｄ　　ｃｅｌｌ　　５ｕｓｐｅｎｓｉ ｏｎｓ　　ｆｒｏｍ　　ｏｋｒａ　　　（Ｈｉｂｉｓｃｕｓｅｓｃｕｌｅｎｔｕ ｓ）　　ａｎｄ　　ｃｏｔｔｏｎ　　（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　　ｈｉｒｓｕｔｕ ｓ）　　、”　　Ｉｎ杉土印９　：　３９５−３９８．１９７４　（ここにおい て準用する））：（ｂ）胚軸〔シェンク（５ｃｈｅｎｋ）等、“Ｍｅｄｉｕｍａ ｎｄ　　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　　ｆｏｒ　　１ｎｄｕｃｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　 ｇｒｏｗｔｈ　　ｏｆ　　ｍｏｎｏｃｏｔ−ｙｌｅｄｏｎｏｕｓ　ａｎｄ　ｄｉ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ　ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌ　　ｃｕｌｔｕｒｅｓ、”Ｃ ａｎ、　Ｊ、　Ｂａｔ、　　５０　：１９９　２０４．１９７２（ここにｉいて 準用する）〕：及び（ｃ）子葉〔ラニ（Ｒａｎｉ）等、Ｅｇｔａｂｌｉｓｂｓｅ ｎｔ　　ｏｆ　　Ｔｉ５ｓｕｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　　ｏｒ　　Ｃｏｔｔｏｎ 、”Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、Ｌｅｔｔ、　　７　：　　１６３　　１６９．１９７ ６、（ここにおいて準用する）〕からのカルス培養液がゴシビウム・ヒルスツム 及びＧ、アルボレウム（Ｇ　、　ａｒｂｏｒｅｕｓ）に対して確立されている。

カブターマン（Ｉａｔｔｅｒｍａｎ）等（Ｔｈｅ　１ｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　 ａｓｔｒｏｎｇ　　ｒｅｄｕｃｉｎｇ　　ａｇｅｎｔ　　ｕｐｏｎ　　１ｎｉｔ ｉａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｃａｌｌｕｓｆｒｏｓ　　ｔｈｅ　　ｇｅｒｍｉｎａ ｔｉｎｇ　　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　　ｏｆ　　Ｇｏｓｓｙ　　ｉｕｓ　　ｂａｒ ｂａ−ｄｅｎｓｅ、”　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ　４０　：　９８　１０ １．１９７７（ここにおいて準用する）〕は、Ｇ、バーバデンス（Ｇ。

ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）の子葉からのコンパクトなカルスが根を形成し、一つの 場合において完全な植物の再生も又得られたことを観察した。スミス（Ｓｍｉｔ ｈ）等〔“Ｄｅｆ　１ｎｅｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　　ｆｏｒ　　ｔｈｅ　　１ ｎｉｔｉａｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　ｇｒｏｗｔｈ　　ｏｆ　　ｃｏｔｔｏｎｃａ ｌｌｕｓ　　ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ＋Ｇｏｓｓｙ　　ｉｕｍ　　ａｒｂｏｒｅｕｍ 、−Ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ　　１　３：　３２９−３３４．１９７７　（ここにお いて準用する）〕は、Ｇ、アルボレウムの胚軸−由来の開始及び二次培養の条件 を決定した。引続きプライス（Ｐｒｉｃｅ）等〔“Ｃａ１ｌｕｓｃｕｌｔｕｒｅ ｓ　　ｏｒ　　ｓｉｘ　　５ｐｅｃｉｅｓ　　ｏｆ　　ｃｏｔｔｏｎ　　（Ｇｏ ｓｓｙｐｉｕｓ　　Ｌ、）ｏｎ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｍｅｄｉａ、　”　Ｐｌ、　 　Ｓｃｉ、　Ｌｅｔｔ、　　８：１１５−１１９．１９７７及び“Ｔｉ５ｓｕｅ 　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｒ　Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍｓｐｅｃｉｅｓ　　ａｎｄ　　ｉ ｔｓ　　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　　ｉｎ　　ｃｏｔｔｏｎ　　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　 　ａｎｄｃｒｏｐ　　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ、”’　　Ｂｅｌｔｗｉｄｅ　　 Ｃｏｔｔｏｎ　　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　　Ｒｅ５−ｅａｒｃｈ　　Ｃｏｎｆｅ ｒｅｎｃｅ　　Ｐｒｏｃ、　　　ｐｐ、５　１　　　　５　５％　　　１　９　 ７　７．　　ｏｆｔｈｅ　）Ｉａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｔｔｏｎ　Ｃｏｕｎｃｉｌ 、　ｋｌｅｍｐｈｉｓ　（各々ここに準用する）〕は５種のゴシビウムからのカ ルスの開始及び二次培養の条件を規定した。

多くの植物種の培養液を確立する際の共通の問題の一つは、培養培地中の外植片 の「褐色化」である。綿においては、このポリフェノール類の浸出はスクロース をグルコースで置換し、及び培養液を１０日毎に新鮮な培地に移すことにより克 服された。グルコース補給培地上での３〜４回の継代後、褐色は完全に消滅し、 培養液をスクロース補給培地に戻すことができた。誘発に伴う困難があったもの の、二次培養時のカルスの褐色及び維持はある種のゴシピウム種については克服 され、カルス培養液から植物を再生する全ての試みは不首尾であるか幾つかの時 間のかかる工程を含むものであった。タビニドス及びハミルトン（Ｄａｖｉｄｏ ｎｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｍｉｌｔｏｎ）　　（“ＰｌａｎｔＲｅｇｅｎｅｒａｔｉ ｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｃａ１ｌｕｓ　Ｔｉ５ｓｕｅ　ｏｒ　Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈ ｉｒｓ−ｕｔｕａ、＠Ｌ、Ｐ１ａｎｔ　Ｓｃｉ、Ｌｅｔｔ、３２　：　８９　９ ３．１９８３、（ここに準用する）〕は培養の開始後２年後に終に胚の形成され たことを報告している。

多くの生育物質例えば植物ホルモン及び合成成長制御化合物が植物再生をｉｎ　 ｖｉｔｒｏでもたらすために細胞培養培地中に利用されてきたが、異った物質の 植物再生に及ぼす効果の一般化は到達されておらず、特定化は更に少ない。事実 、同一物質が異った植物種に適用された場合には成長を制御、向上させるか或い は全く効果がないかのいずれかである。従って、ある種の標準的操作とは別に、 任意の新しい種に対する植物再生のための作業処方に到達する困難な課題が必然 的に残り、又多くの大きさの順序により植物形質転換を達成するより困難な課題 が残る。

本発明は実生から切出されたセグメントからの綿植物の迅速な再生方法を提供す る。説明される方法は高度の繰返し可能性及び信頼性を与え、又それは綿植物の 遺伝子形質転換を可能にする。

ｌ豆旦且１ 綿植物の体細胞からの任意の形質転換を伴った再生方法が提供される。

種子が殺菌され、暗所で生育されて実生にされる。実生は外植片の一源であり、 通常胚軸及び子葉である。もう一つの源は発達する果実の未熟接合子胚である。

外植片を細分し、第一のカルス生育培地（グルコースを含有）中でカルスが外植 片からフェノール分泌と対抗し、外植片の細胞を刺激して分割及び増殖するよう にさせる培養培地上で発達させる時間培養する。カルスはフェノール分泌段階を 通過後、カルスを胚発生カルスに発達させる新鮮なカルス生育培地（スクロース を含有）に移される。胚を次いで二次培養により多い胚発生カルスを産出するか 或いはもう一つの生育培養（植物発芽培地）に移し、苗を発達させるのに十分な 期間培養し、それをもう一つの生育期間後に温室に移し、次いで畑に移し、それ から種子を栽培することのできる成熟植物に成長させる。

胚は又浮遊液中で培養することもできる。この操作においては生育期間後に約６ ００ミクロンより大きいより好ましくは約８００ミクロンより大きい胚発生塊を 含有する胚を単離し、植物産生に利用する。より小さいカルスは植物形成カルス に成長するようにカルス生育培地に再循環されるか或いは胚源として維持される 。

形質転換は外植片、カルス或いは浮遊液発達の段階で生ずる。形質転換は外植片 、カルス及び／又は胚発生カルスを綿に外来性の発現性遺伝子配列を含有するア グロバクテリウムベクターの作用に遺伝子が細胞内に転移するのに十分な時間曝 すことを含む。残存アグロバクテリウムを次いでアグロバクテリウムに対して毒 性の抗生物質を用いて死滅させる。この後形質転換された苗に発達するための形 質転換細胞及び／又は胚発生カルスの選択を行った。浮遊培養においては、形質 転換及び／又は選択は細胞及び胚発生には余りにも未熟なカルスからの胚発生カ ルスの分離前或いは後に行われうる。

独特の表現型形質の植物を得ることができ、通常植物細胞成長に抑制的な抗生物 質に対して耐性を有する新規綿植物、殺草剤、真菌病原体に対して増大した耐性 を有する綿植物及びより良好な収率及び改良された繊維品質を示す綿植物が提供 される。

図面の簡単な説明 第１図は、形質転換の確立領域を示す組織培養技術に第２図は、葉（１４）及び 根（１６）を含む各種発達段階における体細胞胚（１２）を存する綿の胚発生カ ルス（ｌＯ）の写真図である。

第３図は、第２図に図示されるような胚発生カルス培養液を形成するために単離 された後期球状段階における体細胞綿胚の写真図である。

第４図は、第２図と同様に胚発芽培地上に発達する綿の胚及び若い苗（１８）の 写真図である。

第５図は、綿の浮遊培養液からの胚発生細胞の小塊の写真図である。

第６図は、浮遊培養液からの球状段階の胚の写真図である。

第７図は、発生する葉（１４）及び根（１６）を示す浮遊培養液から得られる発 芽胚を図示する。

第８図は、胚発芽培地上に生育する綿の苗の発達を図示する。

第９図〜第１５図は、綿の遺伝的形質転換を図示し、第９図はカナマイシン耐性 の遺伝子を含有する形質転換綿細胞からの細胞コロニー（２０）の発達を示す。

第１０図は、第９図の選択された抗生物質耐性細胞から抗生物質補給培地上に発 達する体細胞胚を示す。

第１１図は、殺草剤グリホセートに耐性を付与する遺伝子を含有する形質転換さ れた体細胞胚の発芽胚を示す。

第１２図は、第１１図の胚から発達した綿の苗を示す。

第１３図は、葉１４及び根１６の発達を有する鱗翅目の昆虫に耐性を付与するよ うに形質転換された発芽体細胞胚を示す。

第１４図は、第１３図の胚から発達された苗を示す。

第１５図は、カナマイシンに対する耐性を示す形質転換された胚から発達された 品種５ｉｏｋｒａの苗を示す。

第１６図は、Ｂｔプロトキシン遺伝子の５′末端を含有するプラスミドｍｐ１９ ／ｂｔの造築を示す。

第１７図は、Ｂｔプロトキシンコード化配列の５′末端に融合されたＣａ１ｉＶ 遺伝子■プロモーターを含有するプラスミドである―ｐ　ｌ　９　／　ｂｔ　ｃ ａ／　ｄｅｌの造築を示す。

第１８図は、ＣａＭＶ転写停止シグナルに融合されたプロトキシンの３′フード 化領域を有するプラスミドであるｐ７０２／ｂｔの造築を示す。

第１９図は、ＣａＭＶプロモーター及びターミネータ配列が隣接した完全なプロ トキシンコード化配列を含有するｐＢＲ３２２／ｂｔｌ　４の造築を示す。

第２０図はｐＲｌ［２５２／Ｔｎ９０３／Ｂｇｌｆｆの造築を示す。

第２１図はＰＣＩＢ５の造築を示す。

第２２図及び第２３図はｐｃＩＢ４の造築を示す。

第２４図はｐＣＩＢ２の造築を示す。

第２５図は、Ｔ−ＤＮＡ境界及び植物選択の遺伝子を含有する広宿主範囲のプラ スミドであるｐｃＩＢｌｏの造築を示す。

第２６図はｐｃＩＢＩ　Ｏ／　１９　Ｓｂｔの造築を示す。

第２７図はｐｃＩＢ７１０の造築を示す。

第２８図はｐｃＩＢｌ　０／　７１０の造築を示す。

第２９図はｐｃＩＢ　１０　／　３５　Ｓｔｂの造築を示す。

第３０図はｐｃＩＢ　１０　／　３５５ｂｔ（ｌ［ｐｎ　Ｔ　）の造築を示す。

第３１図はｐｃｌＢ　１０　／　３５５ｂｔ（Ｂｃｌ　Ｉ　）の造築を示す。

第３２図はｐｃＩＢ　１０／　３５Ｓｂｔ　（６０７）の造築を示す。

第３３図は、ベクターＤＥＩ　ＰＥＰＩ　Ｏを図示する。

第３４図は、パーティシリウム蔓延畑に植付けられた綿再生体から構成される畑 試験を示す。

第３５図は、第３３図に示された畑試験における再生ＳＪ４植物の後代を示す。

パーティシリウム真菌に対して改良された耐性を有するツマクローナル変種は矢 印で示される。

艮生旌量朋 本発明は綿植物特にゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｇｓｙ−ｐｉｕｓ　　ｈｉｒ ｓｕｔｕｍ）属の植物の畑における伝播のための体細胞からの組織培養による再 生に向けられたものである。

任意にこれらの細胞は外来遺伝子情報を含むように形質転換されてよい。

−本発明に従って有用な各種生育培地は下記の通りである。

種子発芽生育培地 修正ホワイトの原液の組成 （Ｐｈｙｔｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　１１　：　１０９−１２７．１９６１．こ こにおいて準用する）ＭｇＳＯａ・７１１１，０　　　　３．６ｇ　　溶解し最 終容量を１００ＯＪＩＣにする。ホワイトのＡＮａｔＳＯ＊　　　　　　　　２ ．　Ｏｖ　　　原液とラベルする。ｌＯＯＭＱ／Ｑの最終培地を使ＮａＢ＊ＰＯ ＊　”Ｈ＊０　　　　１．６５ｇ　　　用。

Ｃａ（Ｎｏ、）ｔ−４Ｂ、０　　　２．６　ｆ　　　溶解し最終容量を１０００ ３１１２にする。ホワイトのＢＫＮｏ、　　　　　　　　８０Ｏｎ　　　原液と ラベルする。１００Ｍ（１／Ｑの最終培地を使Ｅｌ　　　　　　　　　６５０η 　　用。

Ｎａｔｌ！ｏｏ、−２Ｈ＊０　　　　２．５ａ　　　溶解し最終容量を１００１ １Ｑにする。ホワイトのＣＣｏＣ１ｔ・６Ｈオ０　　　　２．５η　　原液とラ ベルする。１−０ｗＩ２／ｆｆの最終培地を使Ｍｎ５Ｏ−４ｘＯ３０００用。

Ｚｎ５Ｏ，・７Ｂ、０　　　　　５０１９ＣｕＳＯ４・５ＨｔＯ２，５０ ｈ関、５０η Ｆｅ　ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　ＭＳＦｅ　ＥＤＴＡのｌＯＭＱ／Ｑ を使用。

有機物　　　　　　　　　　　　ＭＳ有機物１０ｆｆｉＱ／１２を使用。

カルス生育／維持培地 ムラシゲ及びスクーグ（ＭＳ）原液の組成（Ｐｈｙｓｉｏｌ、ＰＩａｎｔ　１５ ：４７３−４９７．１９６２、ここにおいて準用する）ＮＨ，ＮＯ，４１，２６ ９溶解し最終容量を１０００１１Ｑまテニする。４０１１２／１２ＫＮＯ，４７ ，５０９の最終培地を使用。

ＣａＣ１，−２Ｈ，０１１，ＯＤｖ ＭｇＳＯ，・７Ｈ，０９，２５９ ＫＨ，Ｐ帆　　　　　　　４．２５９ Ｋｌ　　　　　　　　　　８３ｇｇ　　　溶解し最終容量を１０００１１２まで にする。ＭＳ−ＭｉｎｏｒＨｓＢＯｓ　　　　　　　　６２０　ｘｙ　　　とラ ベルする。ＩＤｘυ９の最終培地を使用する。

ＭｎＳＯ４４ｔＯ１６９０ｎ ＺｎＳＯ４４Ｈ＊０　　　　　８６０１ｍＮａ！１ｌ１００４・２ＢｔＯ２５ｎ ＣｕＳＯ４’５Ｌ０　　　　　２．５゜ｃｏｃｉ、・６Ｈｔ０　　　　　２．５ ｇニコチンｎ　　　　　　５０　ｍｇ　　　溶解し最終容量を１ｏｏｏｉ１２ま でにする。ＭＳ−ピリドキシンＢＣ１５０η　　Ｏｒｇａｎｉｃとラベルする。

１０１１１１２のアリコート中でチアミンＨＣＩ　　　　　　１０　ｎ　　　凍 結。１ＯＷＬ／１２の最終培地を使用する。

Ｆｅ　ＥＤＴＡ　　　　　　　　２．７８９　　２．７８９０ＦｅＳＯ，−７Ｂ 、Ｏを約２ＱＯｉ１２のイオン交換水にＦｅ５０．４）１，０　　　　　３．７ ３９　　　溶解する。３．７３９のＮａ、＋：ＤＴＡ−２ａ、ｏ（エチレンシア ＮａｔＥＤＴＡ・２ｆ１．Ｏミン四酢酸二水和物のニナトリウム塩）をもう一つ のビーカー内の２００１７２のイオン交換水中に溶解する。Ｎａ　ＥＤＴＡ溶液 を熱板上で約１０分間加熱する。常時撹拌しなからＦｅ５Ｏａ溶液をＮａＪＤＴ Ａ溶液に添加する。溶液を室温まで冷却し、容量を１０１００Ｏにする。ＭＳ　 ＥＤＴＡとラベルする。瓶をホイルでカバーし、冷蔵庫に貯蔵する。１０ｘＱ／ ｐの最終培地を使用。

チアミンＨＣ１５０ｍｇ　　　溶解し容量を５ＯＯｘＱにする。ＭＳ−チアミン とラベルする。４．０ｍＱ／（ｌの最終培地を使用。必要に応じて使用。

イノシトール　　　　　１０９　　　溶解し、最終容量を１０００ｉＱにする。

酩−グリシグリシン　　　　　　　０．２ｇ　　　ン／イノシトールとラベルす る。１０ｚＱ／Ｑの最終培地を使用。

植物発芽培地 ビーズレ−及びティンの原液の組成 （ＡＬ　Ｊ、　Ｂｏｔ、　６０　：　１３０−１３９．１９７３、ここにおいて 準用する）ＫＨｔＰＯ４２，７２ｇ　　　溶解し容量を１００ｉ＋Ｑにする。Ｂ ＆Ｔ−Ａ原液とＨｓＢＯｓ　　　　　　　　６１．８３ｍｇ　　　ラベルする。

１０１１２／Ｑの最終培地を使用。

Ｎａ、ＭｏＯ４−２Ｈ，０２，４２ｚｙＣａＣ１ｔ・２Ｂ＊０　　　　　４．４ １？　　　溶解し容量を１００ｍ１７にする。Ｂ＆Ｔ−Ｂ原液とＫｌ　　　　　 　　　　　ｇ、３ｑ　　　ラベルする。１０ｘＱ／Ｑの最終培地を使用。

ＣｏＣ１，・６１［１＊０　　　　　０．２４ｇ９ＭｇＳＯ＋・７ＦｂＯ４，９ ３ｙ　　　溶解し容量を１０（ｌ雇にする。旦灸エニ旦原旅とＭｎＳＯ４・Ｈｔ Ｏ１６９，０２ｔ９　　　ラベルする。１０１１υ′Ｑの最終培地を使用。

Ｚｎ５Ｏ，・７Ｈ，０８６，２’１ｘ９ＣｕＳＯ４・５ＨｔＯ０，２５１９ ＫＮ０．　　　　　　　２５．２７５９　　　溶解し容量を２００１ｇにする。

Ｂ＆Ｔ−Ｄ原液とラベルする。４０ｚＱ／Ｑの最終培地を使用。

ニコチン酸　　　　　４．９２ｘｙ　　　溶解し最終容量を１０（ｍ２にする。

Ｂ＆Ｔ−ピリドキシ７ＨＣ１８，２２ｔ９０ｒｇａｎｉｃｓとラベルする。１０ ｘＱ／（ｌの最終培地をチアミンＨＣ１１３，４９ｘ９　　　使用。

Ｆｅ　ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　ｌ０１ｅ／１２のＭＳ　Ｆｅ　ＥＤＴ Ａを使用。

イノシトール　　　　　　　　　１００ｔ９／Ｑの最終培地。

ＮＨＪＯｓ（１５ｇＭ）　　　　　　　　　　１２００．６１９／（１（Ｄ最終 培地。

上記の溶液の任意のものを用い、下記操作を用いて１ｅ培地を調整する。ベース として２００１１のイオン交換水を提供し、各種原液をｌｉ２について述べられ た量で添加する。例えば、最終培地において！ｏｌｅの原液が用いられるべき場 合には、１０ｆｆｉＱの原液が２００１の蒸留水に添加される。塩類の溶液中の 存在を確保するために原液は通常上記配合に示される順序に従って添加される。

十分に混合後、追加のイオン交換水を混合物に添加し、それを必要な５ｏｏｚＱ にし、混合物のＰＥＩを約５．８〜６．０に調整する。最終容量を１０００ｘＱ にし、通常組織培養寒天或いはその等個物を約０．８重量％の濃度まで添加する 。

これは流動性を減少するために溶液に何等かの固体性を与えるためのものである 。混合物を次いで１５〜２１ポンド／平方インチにおいて約５〜２０分間消毒し て汚染生物を殺し、適当にラベルして無菌培地として貯蔵する。

簡単に述べると、綿の種子を殺菌し、基礎寒天培地などの適当な種子発芽培地上 において暗所で実生を産生ずるのに十分な時間発芽させる。通常の生育期間は約 ４週間まで、典型的には７〜１４日間である。

外植片のセグメントを実生から切出す。外植片は胚軸或いは子葉から得られるも のが好ましい。或いは又、温室或いは畑に生育した綿植物の発達する果実から得 られる未熟胚を外植片として同様に用いることができる。試験セグメントは適当 な第一のカルス生育培地、好ましくはグルツースを含む完全ムラシゲ及びスクー グ（ＭＳ）栄養培地上で培養される。生育は約２５〜約３５℃の温度において約 １６時間の光及び約８時間の闇の光／闇すイクルにおいて培養することにより行 われる。培養は、培地が栄養成分が消費されるに従って定期的間隔で交換され、 約３〜約４時間未分化カルスが形成されるまで継続される操作である。カルスを 第二カルス生育培地、好ましくは炭素源としてナフタレン酢酸（ＮＡＡ）及びス クロースを補給されたＭＳ培地に移し、３〜４力月間培養されて胚を産出する。

胚は次いで第二カルス生育培地中に維持され、胚供給を維持するか或いは好まし くはカゼイン加水分解物及びアンモニウム源を含有するビーズレ−及びナインの 培地などの植物発芽培地に移され、２〜３週間培養されて苗を産出する。

苗は高湿度条件下に土壌に移され、次いで温室内のより大きいポットに移植され 、最終的に成熟まで成長するために畑に移される。

ここに簡単に説明した方法を用いて首尾良く組織及び浮遊培養によりゴシピウム ・ヒルスッム種の綿における体細胞胚形成を誘発し、最終的にＳＪ２、ＳＪ４、 ＳＪ５、Ｂ１６４４、Ｂ１８１０、Ｂ２７２４、ＧＣ５１０及びＣ１を含むゴシ ビウム・ヒルスッムのアヵラ品種及び非アカラ（Ａｃａｌａ）　ｒピッカー」ジ オクラ（Ｓｉｏｋｒａ）及び「ストリッパー」種ＦＣ２０１７のカルス培養物か ら得られる胚軸及び子葉から成熟植物を得た。培養物は、新規形質或いは性質を 有する定常な植物に形質転換された。

より詳細には、この操作は先ず綿種子の殺菌を含む。

適当な殺菌は種子を９５％エタノールに２〜３分間浸漬し、無菌水中で１回以上 濯ぎ、次いで種子を次亜塩素酸ナトリウムの１５％溶液中に１５〜２０分間浸漬 し、及び無菌水で数回濯ぐことにより達成される。

殺菌種子を次いで種子発芽培地と称される第一の培地に移す。種子発芽培地は通 常の塩含量の一つである。適当な発芽培地はホワイトの培地或いは生強度ＭＳ培 地（半分の成分強度）を含む基礎寒天培地である。発芽は通常暗所内で約１２〜 約１４日間に亘って起こる。

胚軸及び／又は子葉が発芽した種子がら好ましく切出され、セグメントに細分或 いは切断され、生育物質を補給されたＭＳ培地などの第一〇カルス生育培地上で 培養される。現在好ましい培地は、約０．４　ｍ９／　Ｑのチアミン塩酸塩、約 ３０９／１２のグルコース、約２１９／（１（１）＋７タレン酢酸、約１１９／ １２のキネチン、普通の生育制御剤及び約１００ｍ９／ｆのイノシトール及び寒 天を補給されたＭＳ培地である。チアミン塩酸塩は通常０．１〜約０．５ｍｙ／ （ｌの濃度範囲であり得、グルコースは約２０〜約３０ｙ　／（１、す−ｙｙレ ン酢酸は約１〜約１０ａ＋９／ｆｆ、キネチンは約１〜約２ｘｖ／（１、及びイ ノシトールは約５０〜約１００ｇ＋９／ｆｆの範囲でありうる。

培養液は約２５〜約３５℃、好ましくは約３０℃の温度において約１６時間の光 及び約８時間の闇の光／闇すイクルで維持される。約２０００〜４０００ルクス 、より好ましくは約３０００〜４０００ルクスの光強度を有するのが好ましい。

形成されたカルスは３〜４週間間隔で定期的に二次培養され、新鮮な第一のカル ス生育培地に移される。外植片の培養においては、培養培地の黒色化により証明 されるように、外植片からのフェノール化合物の分泌が生じうる。この場合には 、培地はより規則的に交換される。

黒色化は培養培地をｌＯ日日間−交換することにより避けられた。通常３回〜５ 回の培地交換後にフェノール分泌が消滅する。これが生ずる場合には、第一のカ ルス生育培地をスクロースを含有する或いは炭素源としてスクロースを補給され た新鮮なカルス生育培地で置換することができる。

３〜４週間の培養後、活発なカルスが外植片の切断表面上に発達する。これらの カルスを次いで好ましくは、約１〜約１０３１１９／１２．好ましくは約１〜約 ５ｔｇ／＋２のＮＡＡと組合わされたＭＳ培地である新鮮な第二〇カルス生育維 持培地に移す。サイトキニンは０〜約１９７（１の濃度で用いられる。カルス生 育培地は種子発芽培地よりも１０倍より多い塩を含有する高塩含量培地として特 徴付けられる。第−及び第二のカルス生育培地の本質的相違は炭素源である。フ ェノール分泌の間にはグルコースが用いられる。分泌が停止した時点ではスクロ ースが用いられる。カルス生育培地の残りは同一のままであるか又は変化させる ことができる。

これらのカルスを通常約５〜７継代後或いはカルスの一部にアントシアニン色素 形成が明らかとなるまで新鮮なカルス生育培地に定期的間隔で移し、その後黄白 色胚発生カルスが発達する。

胚発生カルスを次いで選択的に二次培養し、規則的二次培養により維持する。胚 発生カルスは各種発達段階の体細胞胚を含有する。あるものは小苗への生育を可 能にする発達点に到達している。しかしながら、殆んどは更に発達を必要とする 。あるものは発芽まで進行しており、その他のものは将来の使用のための胚源と して維持される。

第２図を参照すると、異った大きさの体細胞胚１２を有し、あるものが発生する 葉１４及び根１６を有するヱＬｌ綿１０のカルスを示すこの段階の発達が図示さ れている。第３図は、後期球状、段階で単離された体細胞胚を図示する。

第４図を参照すると、体細胞胚をここで胚発芽培地と称される通常アンモニア或 いはその等個物の形態での窒素に富んだ培地である第三の生育培地に移すことに より更に発達が達成される。適当な培地としては、好ましくは約ＳＯＯｘｇ／Ｑ までのカゼイン加水分解物を補給されたビーズレ−及びティンの培地が挙げられ る。

発芽は体細胞胚から起こり、２〜３週間以内に６枚までの葉及び良好な根系統の よく発達した苗１８が通常形成される。

この段階において、苗を小さな塊で土壌に移し、高湿度条件下に標準的インキニ ベーター内で生育される。温度は通常的２５〜３０℃に維持される（第７図参照 ）。

ある生育期間後、小植物を温室内のより大きいボア）に移植し、その後畑に移植 して成熟まで生育する。生育植物の全ては好ましくは温室内で生育させながら或 いは畑条件内で自己受粉するのが好ましく、種子を採集する。

種子を次いで発芽させ、４〜５週令の実生を後代列試験その他の標準的植物育成 操作のために畑に移す。上記操作を実施することにより約６〜約８カ月の期間中 に約３５％の外植片から生育可能な綿植物が産出される。

胚発生綿細胞の浮遊培養液中における増殖生育胚発生カルスを植物に発達させる 代りに、カルスをより小さい細片に切断し、更に浮遊培養技術を用いて発達させ てもよい。

この操作においては、浮遊濃度は通常第二カルス生育培地（ＮＡＡを補給された ＭＳ培地）などの８ＭＱのカルス生育培地に対して約７５０〜１００ＯＨのカル ス部数であり、浮遊状態で生育される。好ましい実施態様において、カルスの浮 遊液はＴ管内に挿入され、約１６時間の光及び約８時間の闇の光方式下に約Ｌ５ ｒｐｍで回転するローラードラム上に置かれる。生育は約３〜４週間である。

約３〜４週間毎に、浮遊液を濾過して第５図の群に図示されるような胚発生カル スの大きい細胞塊を除去し、第６図に示されるように後期球状段階において単離 される。ろ液は３〜４週間の生育期間栄養培地に戻される。

この操作を約３〜４週間の間隔で大きい塊の栽培と共に何回も繰返し、その時点 で培地を全部或いは部分的に新鮮なカルス生育培地で補給する。好ましくは、４ 容以上の新鮮な培地を約１容の残存浮遊液に対して添加する。

現在用いられるフィルターは、約６００ミクロンより大きい、好ましくは８００ ミクロンより大きいメッシュ径を有するのが好ましく、６００ミクロン未満の粒 径を有する細胞集団は植物に発達しないのに対し、６００ミクロンより大きい、 好ましくは８００ミクロンよす大きい細胞集団は胚発生となり生育可能な植物に 発達することのできる十分な分化をを行ったことが観察された。

浮遊培養は又胚発生カルスを液体胚生育培地を約２０ｚＱのＭＳ及び２０ｍｇＩ Ｑ濃度のＮＡＡの量で含有するＤｅｌｏｎｇ或いは三角フラスコなどのフラスコ に移すことによって開始することもできる。フラスコをジャイロ式シェーカー上 に置き、毎分約１００〜１１０ストロークで振盪する。３〜４週間後に、浮遊液 は上記のような濾過に適したものになり、大細胞塊を植物発達のために取出す。

より典型的には、第３回或いは第４回二次培養後に、Ｔ管或いはＤｅｌｏｎｇ或 いは三角フラスコからの細胞浮遊液をＮＡＡ　（ＺＯｍｇ／Ｎ　）を含有スル寒 天−固化ＭＳ培地或いはカゼイン加水分解物（５００１１ｇ／Ｉ２）及び窒素源 を含有するビーズレ−及びナインの培地上にプレート培養する。３〜４週間以内 に発達する胚を有する胚発生カルスが目に見えるようになる。同様に、より大き い塊を上記培地上にプレート培養した場合には、発達する胚を有する胚発生塊を 生ずる。

再浮遊成長方法において、ＭＳ培地を用いて胚の促進及び／又は保持を行うのに 対し、迅速植物発達のためには発芽培地が用いられる。

実生外植片は必要に応じて形質転換することができる。

この操作においては、殺菌種子の子葉及び／又は胚軸セグメントを用いることが できる。子葉が好ましい。

セグメントを抗生物質、例えばカナマイシンに対する耐性などのコード（遺伝マ ーカー）を含有するアグロバクテリウムベクターを含む培地内にベクターが遺伝 子を外植片の細胞に転移するのに十分な時間置く。通常１分乃至２４時間の範囲 の接触時間が用いられ、間欠的或いは静かな撹拌が伴なわれる。外植片を次いで 取出し、ＮＡＡ　（２ｚｖ／Ｑ　）を補給したＭＳ培地などの寒天−固化カルス 生育培地上に置き、２５〜３５℃、好ましくは３０℃で１６＝８時間の光：闇の 方式で１５〜２００時間インキニベートする。

インキュベーション後、外植片を好ましくは２００１１ｇ／ｅの抗生物質セフォ タキシムを補給した同一培地に移す。セフォタキシムは、残存するアグロバクテ リウムの増殖及び植物組織の過剰成長を防止するために含ませられる。或いは又 外植片をＮＡＡ　Ｃ２ｚｇ／（１）を補給したＭＳ培地で濯ぎ、更に濯ぐ前に４ 〜２８時間インキユベートシ、次いでセフォタキシムを含有する同一培地をイン キュベートすることができる。新鮮な培地上での４〜５週間の培養の終りに、発 達カルス即ち主たるカルスを主たる外植片組織の残部から分離し、ＮＡＡ（２１ １９／１２）、セフォタキシム（２００ｘｙ／（り及び硫酸カナマイシンなどの 抗生物質（５０１ｇ／ｅ）を含有するＭＳ培地に移される。抗生物質（カナマイ シン）の存在下において成長するその能力により同定される形質転換された主た るカルスを選択し、胚を発達させ、発芽させ、及び植物を上記操作に従って得る 。

細胞浮遊液の形質転換を達成することも実施可能である。７〜１４日間、通常７ 〜ｌＯ日間の通常の二次培養生育細胞に引続いて、細胞を沈澱させて上澄液を除 去する。残存濃縮浮遊細胞を４０００Ｘｙで５分間遠心分離させ、過剰の培地を 廃棄する。濃縮浮遊培養液をアグロバクテリウムを含有する８１１Ｑの同一培地 に再浮遊させる。

浮遊液をｒＴＪ管に移し、適当に撹拌してインキュベーションを行う。

細菌付着及びＤＮＡ転移を行わせるための約２〜２４時間、好ましくは３〜５時 間のインキュベーション後、浮遊液を取出し沈澱させる。細菌を含む上澄液を廃 棄し、細胞を新鮮な培地で洗浄する。浮遊液は必要に応じて約５分間遠心分離し 、上澄液を除去してよい。いずれの場合にも、細胞を同一培地に再浮遊させ、ｒ ＴＪ管或いはフラスコに移して浮遊二次培養を再開する。この目的は細胞培養液 内に残される未付着アグロバクテリウムベクターの量を最少にすることである。

約１５〜約２００時間、典型的には１５〜約７２時間、好ましくは１８〜２０時 間後に、浮遊液を濾過して大きい塊を除去し、新鮮な液体培地で洗浄して沈殿さ せる。

浮遊液をセフォタキシム（２００ｍｇ／ｅ）を含有する新鮮な液体培地に再浮遊 させ、ベトリ皿内の固化培地上でプレート培養する。

或いは又、浮遊液をセフォタキシムを含有する新鮮な培地に再浮遊させ、更に４ 〜２８日間生育させてからペトリ皿内の固化培地上でプレート培養してもよい。

細胞濃度は１容の浮遊細胞プラス３容のセフォタキシムを有する培地である。ｌ Ｏ〜３００ｍｙ／ｅ好ましくは約２０〜２００１１９／１２より好ましくは約４ ０〜８０ｚｖ／Ｑ　ｔｖカナマイシンがネオマイシンホスホトランスフェラーゼ （ＮＰＴ）遺伝子を発現する形質転換細胞の選択のために培地内に含ませられる 。選択濃度のカナマイシン中で増殖する細胞及び胚を更に上記の如くここに説明 する操作に従って全植物に発芽及び再生することのできる成熟体細胞胚に生育さ せる。

上記操作を用い、第９図を参照して形質転換の結果である各種細胞コロニーが示 される。抗生物質カナマイシンに対して耐性を示す綿細胞２０が存在する。第１ Ｏ図婆参照すると、抗生物質ＭＳ培地上の体細胞胚に発達する形質転換カルスが 示されている。第１１図はカナマイシン耐性を有するように確立され殺草剤グリ ホセートに耐性を有するように形質転換された形質転換体細胞胚を示す。第１２ 図は第１１図の胚からの植物を示す。第１３図はＭＳ培地上に生育する鱗翅目昆 虫に耐性を有するように形質転換された細胞を示し、第１４図においてはビーズ レ−及びティンの培地に移されたものを示し、第１５図は第１４図の苗のより成 熟した苗への更なる発達を示す。

綿害虫 に凰五ユ 葉外植片から出発する植物の　生 ゴッシビウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ）のアカラ （Ａｃａｌａ）綿品種ＳＪ２の種子を、９５％アルコールと３分間接触させて殺 菌し、次いで無菌水で２回濯ぎ、次亜塩素酸ナトリウムの１５％溶液に１５分間 浸漬し、次いで無菌水で濯いだ。殺菌種子を暗所中で基礎寒天培地上で約１４日 間発芽させて実生を産出した。この実生の子葉を２〜４ｚｘ″のセグメントに切 断し、それを無菌的に０．４ｍ９／Ｑのチアミン−ＨＣｌ、３０９／Ｑのグルコ ース、２．０１９／１２　（７）す７りＬ／７酢酸（Ｎ　Ａ　Ａ）　、１　ｍｙ ／（１のキネチン、１００ｉｙ／ｆｆｉのｍ−イノシトール、及び寒天（０，８ ％）を補給されたムラシゲ及びスクーグ（Ｍ　Ｓ　）主及び従塩類よりなるカル ス誘発培地に移した。培養物を約２０００〜４０００ルクスの光強度を与える蛍 光光線（冷昼光）を有スるパーシバルインキコベーター内で１６時間の光及び８ 時間の闇の条件下で約３０℃においてインキ１ベートした。

カルスは培養組織セグメント上に３〜４週間以内に形成され、白色乃至灰−緑色 であった。形成されたカルスを１ｏｏｉ９／＆のｍ−イノシトール、２０ｙ／Ｑ のグルコース、２１９／Ｑのナフタレン酢酸（ＮＡＡ）及び寒天よりなるカルス 生育培地上に３週間乃至４週間毎に二次培養した。組織外植片をカルス誘発培地 上に最初に置いた後４〜６カ月後に体細胞胚が形成された。カルス及び胚は３週 間乃至４週間毎に新鮮なカルス生育培地上に二次培養することによりカルス生育 培地上に維持した。

組織片上に形成された体細胞胚は新鮮なカルス生育培地或いはビーズレ−及びテ ィン（Ｂｅａｓｌｅｙ　＆　Ｔｉｎｇ）の培地（胚発芽培地）のいずれかに外植 した。

体細胞胚から形成された体苗を１２００ｔｙ／Ｑの硝酸アンモニウム及び有機窒 素源として５００ｘｙ／Ｑのカゼイン加水分解物を含有するビーズレ−及びティ ンの培地上に移した。培地を凝固剤（Ｇｅｌｒｉｔｅ）により固化し、苗をマゼ ンタボックス内に入れた。

体細胞胚は約３カ月以内に苗に発達した。これらの苗は６枚乃至８枚の葉を根に 付け、約３〜８インチの長さであり、土壌に移し、高湿度下にインキニベーター 中で３乃至４週間、次いで温室に移した。硬化後、植物は又開放耕地にも移され た。

Ｋ胤■ユ 培地として、全培地成分が半分の濃度に減少された生強度ＭＳ培地を用いた他は 実施例１の操作を繰返した。

本質的に同一の結果が得られた。

実施例３ 外植片が胚軸セグメントとされた他は実施例１及び２の操作を繰返した。本質的 に同一の結果が得られた。

実施例４ 外植片が未熟接合子胚とされた他は実施例１及び２の操作を繰返した。本質的に 同一の結果が得られた。

丸嵐五五 アカラ綿品種ＳＪ４、ＳＪ５．５Ｊ２Ｇ−１，ＧＣ５１０、Ｂ１６４４、Ｂ２７ ２４、Ｂ　１８１０．ピッカー品種５ｉｏｋｒａ及びストリッパー品種ＦＣ２０ １７を用いて実施例１及び２の操作を繰返した。全て首尾よく再生された。

大】Ｕ」旦 体細胞胚を形成することのできるカルスを得る程度まで実施例１の操作を繰返し た。約７５０〜１０００ｇｇの活発に生育する胚発生カルス片をＴ管内の０．４ 　友９／　（ｌチア　ミ７ＨＣ１，２０９／（ｌグルコース、１．　Ｏ０ｗ９／ Ｑ　（Ｄイノシトール及びナフタレン酢酸（２％ｇ／Ｃ）を補給したＭＳ主及び 従塩類よりなる液体浮遊培養培地８１１Ｑ単位中に浮遊させ、１６：８光対闇方 式下において１．５ｒｐｍで回転するローラードラム上に置いた。ここでも又約 ２０００〜４５００ルクスの光強度が蛍光光線（冷昼光）により与えられた。

４週間後に、浮遊液を８４０ミクロン径のナイロンメツシュを通して濾過して、 より大きい細胞塊を除去した。

８４０ミクロンより小さい両分を沈澱させ、約２０〜２５１１の新鮮な浮遊培養 培地で１回洗浄した。この浮遊液をＴ−管（管当り２　ＲＱ）に移し、各管を６ １１Ｑの新鮮な浮遊培養培地で希釈した。これらの培養液を上記操作を１０〜１ ２日間隔で繰返すことにより維持した。即ち浮遊液を濾過し、８４０ミクロンよ り小さい細胞凝集物を含有する画分のみを新鮮な浮遊培養培地に移した。全ての 場合において、８４０ミクロンより大きい細胞塊を含有する塊はカルス生育培地 上に置かれて成熟体胚を得た。

カルス生育培地上に形成された体細胞胚を取出し、胚発芽培地に移し、実施例１ の方法を用いて発芽させ、苗及び次いで畑生育植物に発達させた。

Ｋ凰■ユ 浮遊培養液を７５０〜１０００ｙ９の胚発生カルスを２１９／（ＩＮＡＡを含有 する１５〜２０ｆｆｉ１２のＭＳ液体培地を含むＤｅｌｏｎｇフラスコに移すこ とにより形成した以外は、実施例６の操作を繰返した。この培養液含有フラスコ をジャイロ式シェーカーに置き、１００〜１１０ストローク／分で振盪した。３ 週間後に浮遊液を８４０４０ミフロンナイロンメブシニして濾過し、実施例４と 同様にして植物生育用の大細胞塊を除去した。８４０ミクロン未満の浮遊物を沈 澱させ、ＭＳ液体培地中で一度洗浄し、２〜５峠のＭＳ液体培地に再浮遊させた 。浮遊液を１〜２１１の浮遊液及び１５１ａの新鮮なＭＳ液体培地を含有するＤ ｅｌｏｎｇフラスコ内の新鮮な培地に移すことにより二次培養した。培養液をこ の操作を７〜１０日間間隔で繰返すことにより維持した。各二次培養においては 、８４０ミクロン未満の浮遊物のみを二次培養し、大きい塊（８４０ミクロン以 上）を植物生育のために用いた。

Ｋ産１１ 実施例６及び７の浮遊生育操作を用いる３回或いは４回の二次培養後、１．５〜 ２．　ＯｘＱのＴ管及びＤｅｌｏｎｇフラスコからの細胞浮遊液を各場合におい て２１９／１２ＮＡＡを含有する寒天−凝固ＭＳ培地及び５００ｘｙ／＋２のカ ゼイン加水分解物を含有するビーズレ−及びティン培地上にプレート培養した。

３〜４週間以内に発達する胚を有する胚発生カルスが目に見えるようになった。

再び、８４０ミクロン以上の細胞塊をカルス生育培地上でプレート培養し、発達 する胚を有する胚発生塊を生じ、それは究極的に植物に成長した。

綴±ｍ豫 アゲロバクチリアＬＢＡ４４３４による腫瘍状−表現型を形成する形　転換 アヵラ綿浮遊培養液をＴ管内で培地（２１ｆ＃！ＮＡＡを含有するＭＳ培地）を ７日乃至１０日毎に成度えながら３〜４ケ月間二次培養した。その後、いずれの 培地交換後においても細胞を沈澱させ、形質転換のために栽培することができる 。上澄液をピペッティングにより除去し、細胞をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌株ＬＢＡ４４３４で形質転換した。アグロバクテリウＡ ９１株ＬＢＡ４４３４は（ｆｌｏｅｋｅｍａ＋Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ 　３０３：１７９〜１８０．１９８３、ここにおいて準用する〕に説明されてお り、Ｔｉプラスミド−由来二元植物形質転換系を含む。そのような二元系におい ては、一つのプラスミドはＴｆ−プラスミドのＴ−ＤＮＡを含有し、第二のプラ スミド４ｔＴｉ−プラスミドの山−領域を含む。

これらの二つのプラスミドが共働して植物形質転換を行う。菌株ＬＢＡ４４３４ においては、Ｔ−ＤＮＡプラスミドｐＡＬ１０５０はｐＴｉＡｃｈ５のＴＬ、オ クトビアＴｉ−プラスミドを含み、菌株ＬＢＡ４４３４中のｖｉｒ−プラスミド ｐＡＬ４４０４はｐＴｉＡｃｈ５の完全な毒性領域を含む［０ｏｓｓ＋Ｇ、ｅｔ 　ａｌ、、Ｐｌａｓｍｉｄ　７　：　１５〜２９．１９８２、ここにおいて準用 する］。菌株ＬＢＡ４４３４はオランダ、ライデン大学生化学部のＲｏｂｅｒｔ 　５ｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ博士から利用可能である。

形質転換アグロバクテリウム菌株をグリセロール原液から取り、少量の一昼夜培 養液に接種し、それから次の日５０ＲＱ培養液を接種した。アゲロバクチリアを ＮａＯＨでｐＨ７，２に調整した水中ｅ当り５ｇの牛肉エキス、１９の酵素エキ ス、５ｇのペプトン、５ｇのスクロースを含有するＹＥＢ培地上で生育させた。

消毒後、１１の２１１　ＭｇＣ１ｔを添加し、その後その他の菌株を殺すために 必要な抗生物質を添加した。５０１１Ｑの一晩培養液の６００ｎ−における吸光 度を読取り、培養液を遠心分離し、形成されたペレットを植物細胞生育培地（Ｍ Ｓ培地プラス２ｘｖ／ＱのＮＡＡ）に０．５の６００　ａｍにおける最終吸光度 まで再浮遊させた。

８１１ＱのこのアグロバクテリウムＬＢＡ４４３４の細菌浮遊液を上澄液の除去 後浮遊植物細胞を含有する各Ｔ−管に添加した。植物及び細菌細胞を含むＴ−管 を撹拌して細胞を再浮遊させ、ローラードラムに３時間戻してアゲロバクチリア を植物細胞に付着させた。これらの細胞を次いで沈澱させ、残存上澄液を除去し た。新鮮な生育培地のアリコートをＴ管に添加し、浮遊液を残存する任意のアゲ ロバクチリアの存在下においてローラードラム上で１８〜２０時間インキコベー トさせた。この時間後、細胞を再び沈澱させ、上澄液を除去し、細胞をセフォタ キシム（２００ａｇ／ｉＣ）を含有する生育培地溶液で２回洗浄した。洗浄後各 Ｔ管からの細胞をセフォタキシム（全ての場合において２００μ９／　ｘｆｆ） 含有する１０１１ｇの生育培地に再浮遊させ、浮遊液の１１１２のアリコートを ベトリ皿上でプレート培養させた。

感染細胞は植物ホルモンを添加されなかった生育培地上で成長し、組織がＴ−Ｄ ＮＡにおける野性種の植物ホルモン遺伝子を受取ったことを確立した。これらの 細胞は腫瘍を発達させ、更に培養物の形質転換を示した。

実施例９で得られた浮遊培養液をＴ−ＤＮＡ含有二元ベクターｐｃＩＢ１０　［ Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、　Ｓ、Ｊ、ｅｔ　　ａｌ、Ｇｅｎｅ５３　：１５３−１６ １．１９８７、ここにおいて準用する］並びにｐＡＬ４４０４　ｖｉｒ−プラス ミドを含有するアゲロバクチリアを用いて形質転換した。ｐｃＩ８１０のＴ−Ｄ ＮＡは酵素ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコード化するＴｎ５からの コード化領域であるツバリンシンターゼからのプロモーター及びツバリンシンタ ーゼからのターミネータ−より構成されるキメラ遺伝子を含有する。

ｐｃＩＢｌｏを含有するアゲロバクチリアはカナマイシン（５０ｕｐｌ　ｉ＆） を含有するＹＥＢ培地上で生育させた。

形質転換は細胞及びアゲロバクチリアを生ずる１　１１Ｑのアリフートをカナマ イシン（５０μ９／ｘｆｆ）或いはＧ４１８（２５μ９／　ｘｆｆ）のいずれか を含有する選択培地上に直ちにプレート培養した以外は、実施例１０と同様にし て達成された。形質転換植物組織におけるｎｏｓ／　ｎｅｏ／　ｎｏｓキメラ遺 伝子の発現はこの組織の両抗生物質の存在下における選択を可能にする。２〜４ 週間以内に形質転換組織の存在が選択プレート上で明らかとなりた。未感染組織 並びに追加されたコントロール組織は生育の徴候を示さず、褐色に変って死滅し た。形質転換組織はカナマイシン及びＧ４１８の両者の存在下において極めて良 好に成長した。

この時点で、良好に生育していた組織片を新鮮な選択培地に二次培養した。これ らの組織片上に形成された体細胞胚を新鮮な非選択性生育培地に外植した。胚が 分化及び発芽を開始した時点において、即ちそれらが根の形成を開始し２或いは ３枚の葉を有した時点において、それらを実施例１で説明した生育培地を含有す るマゼンタボックスに移した。苗が６〜８枚の枚を有するまで生育させ、その時 点でそれを寒天培地から取出した。

苗を今度ポット内の土壌に入れ、湿度を維持するためにビーカーで覆い、パーシ バルインキ−ベーターに４〜８週間入れた。この時点で植物をビーカーから取出 し、温室に移した。植物は温室で成長し開花し、結実した。

実Ｗａ４汁」」２ 用いられた形質転換アゲロバクチリアがＴ−ＤＮＡベクターＤＥＩ　　ＰＥＰ　 ｌ　Ｏ並びにｐＡＬ４４０４すｌプラスミドを含有した以外は、実施例１０の操 作に従った。第３３図に示されるＤＥＩ　　ＰＥＰ　１０は更に植物ゲノム内で 一体化するだめにＢａ５ａｌで分割されたＡ、ツメファンエンス（ムＴｕｓｅｆ ａｃｉｅｎｓ）　（菌株Ｃ−５８）からの二つのＴ−ＤＮＡＰｓｔｌ切断右境界 配列、パラセンジャーメイズホスホエノールビルベートカルボキシラーゼ遺伝子 （ペブカーゼ遺伝子）、及び植物内で発現可能で抗生物質カナマイシン及びＧ４ １８に耐性を与えるキメラ遺伝子（ＮＯＳ／　ＮＰＴ／　ＴＩ＞を利用するもの である。このキメラ遺伝子はＴｎ５からのネオマイシンホスホトランスフェラー ゼ■コード化領域であるツバリンシンセターゼプロモーター、及ヒ単純ヘルペス ウィルスチミジンキナーゼ遺伝子からのターミネーターを利用する。形質転換後 、胚発生カルス及び胚をカナマイシン（５０ｚｙ／ｆｆ　）上の選択により得た 。この濃度（５０ｊＩ９７Ｑ）におけるカナマイシン上でプレート培養された対 照（非−形質転換カルス）からは耐性カルスは得られなかった。

友１貫↓１ 綿浮遊培養液細胞のグリフォゼート耐性表現型への形（豫 用いられた形質転換アゲロバクチリアがＴ−ＤＮＡベクターｐＰｋｌＧ８５　／ 　５８７　［Ｐｉｌｌａｔｔｉ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、２０６：１９２　１９９．１９８７、ここにおいて準用する］並び にｐＡＬ４４０４　ｖｉｒプラスミドを含有した以外は実施例１０の操作に従っ た。このプラスミドｐＰＭＧ８５　／　５８７は植物内で発現が可能な３個のキ メラ遺伝子を保有する。二つの遺伝子は抗生物質カナマイシン及び０４１８に耐 性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコード化する。

Ｓ　、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｓ）の変異体紅」遺伝子からのコード化配列を含有 する第３番目のキメラ遺伝子は殺草剤グリホゼー）　［Ｃｏ５ａｉ、　ｅｔａｌ 、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２１　：　３７０　３７１．１９８３、ここにおいて準 用する］に耐性を与える。ｐＰＭＧ８５　／　５８７を含有するアゲロバクチリ アはカナマイシン（１００ｕｙ／　ｆｆ１１２）を含有する培地上で生育した。

形質転換は浮遊液を２８日間生育させ、その時点で１１１Ｑのアリコートを選択 抗生物質を含有する培地上でプレート培養した以外は、実施例１０と同様にして 達成した。形質転換植物組織内のＮＰＴキメラ遺伝子の発現がこの組織の両抗生 物質上での選択を可能にした。この場合に、選択抗生物質はカナマイシンであっ た（５０μｙ／　ｍｌ’）。

２〜４週間以内に形質転換組織が選択プレート上に明らかになった。植物組織、 個々の胚及びカルスを次いで殺草剤グリホゼート１１Ｍを含有する生育培地上に 置いたところ、形質転換組織は良好な成長を続けた。カルス及び胚の両者のタン パク質の抽出及び分析はグリホゼート耐性遺伝子の産成物の存在を確認した。

Ｋ嵐■ユ１ 綿浮遊培養細胞のハイグロマイシン耐性非−腫瘍状表現（１然星１五１ 形質転換アゲロバクチリアとしてＴ−ＤＮＡ二元べ１５３−１６１．１９８７］ 並びに四ゴブラスミドを含有するものを用いた以外は、実施例１Ｏの形質転換に 従った。ｐｃＩＢ７１５のＴ−ＤＮＡはカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭ Ｖ）　３５　Ｓ転写体［０ｄｅｌｌ　　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ３１３：８ １０−８１２．１９８５、ここにおいて準用する］からのプロモーター及びター ミネータ−及びハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーセ［ｃｒｉｔｚ、Ｌ 、及びＪ　、Ｄａｖｉｅｓ、Ｇｅｎｅ２５　：　１７９−１８８、ここにおいて 準用する］のコード化領域より構成されるキメラ遺伝子を含有する。ｐｃＩＢ７ １５を含有するアゲロバクチリアを、カナマイシン（５０ａｙ／　ｘＱ）を含有 するＹＥＢ上で生育させた。

形質転換はｌｌＣのアリコートを選択抗生物質として５０μ９／　ｍ（ｌハイグ ロマイシンを含有する培地上で直ちにプレート培養した以外は再び実施例１０と 同様にして達成した。形質転換植物組織におけるキメラハイグロマイシン遺伝子 の発現はハイグロマイシンを含有する培地上でのこの組織の選択を可能にする。

形質転換組織は選択生育培地上で実施例８と同様にして生育され、形質転換が起 ったことを確立した。

実！Ｎ　１４ユ 鱗翅目の昆虫に対する耐性を付与する綿浮遊培養細胞の４１転遺 以下に示す変更をした以外は実施例１０の操作に従った。異った形質転換アゲロ バクチリアを用いた。又、植物組織を形質転換物質の選択のために抗生物質上で 選択した後にそれを更にここに規定するＢＴ遺伝子の発現のために選択した。

用いられたアゲロバクチリアはその中に次のキメラニチルス・ツリンギエンシス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）内毒素遺伝子（“ＢＴ遺伝 子”）を挿入したＴ−ＤＮＡベクターｐｃＩＢ１０　［Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ　ｅ ｔ　ｍｌ、、Ｇｅｎｅ５３　二１５３−１６１　（１９８）、ここにおいて準用 する］を含有した。

このアグロバクテリウムベクターを調製するために、ＣａＭＶ遺伝子遺伝子上プ ロモーターロトキシンコード化配列を融合した。ファージベクターｇ＋ｐｌ　９ 　［Ｙａｎｉｓｈ　−Ｐｅｒｒｏｎ　　ａｔ　　ａｌ＋　１９８５１の誘導体を 先ず造築した。工程を第１６図及び第１７図に示す。先ず、１５５個のヌクレオ チド５′乃至プロトキシンコード化領域及び隣接の１３４６個のコード化配列の ヌクレオチドを含有するＤＮＡ断片を５ｐ１９に挿入する。ファージ５ｐ１９ｄ ｓ　　ｒｒ（二本鎖複製形態）ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ５ａｃＩ及びＳ ｅａ　Ｉで消化し、約７．２−　ｋｂｐベクター断片を低ゲル化温度アガロース による電気泳動後に標準的操作により精製した。プロトキシン遺伝子を含む約１ ０　ｋｂｐ（＋　。

ベース対）のバチルス・ツリンギエンシスＤＮＡを含有するプラスミドｐＫＵ２ ５／４を、スイス国、バーゼル、ＣＩＢＡ−Ｇｅｉｇｙ社のＪ　、　Ｎｕｅｅｓ ｃｈ博士から得た。プラスミドｐＫＵ２５／４に存在するプロトキシン遺伝子の ヌクレオチド配列を下記式１に示す。プラスミドｐＫＵ　　２５／４ＤＮＡをエ ンドヌクレアーゼＨｐａ　Ｉ及びＳａｃ　ｌで消化Ｌ、一般式ｌのヌクレオチド ２〜１５０５を含有するｔｓｏａｂｐ断片を精製した。この断片は約１５５ｂｐ のバクテリアプロモーター配列及び１３４６ｂｐのプロトキシンコード化配列の 出発部分を含有する。各断片の約１１００ｎを次いで混合し、Ｔ４ＤＮＡリガー ゼを添加し、１５℃で一晩インキニベートした。得られた混合物をＥ、フリ（Ｅ 。

Ｃｏ１１）菌株ＨＢＩＯＩ中に形質転換し、指示体細菌Ｅ。

コリＪＭＩＯＩと混合し、プレート培養した。１個の７１−ジ（ｍｐ１９／　ｂ ｔ）を更に下記造築のために用いた。

次いで、ＣｉＭＶ遺伝子遺伝子上プロモーターするＤＮＡの断片及び遺伝子■の ためのコード化配列のいくつかをｍｐ１９／ｂｔ中に挿入した。ファージ−ｐ１ ９／ｂｔ　　ｄｉ　　ｒｒＤＮＡ＠ＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼの 大断片で処理し、プラント末端を創出し、エンドヌクレアーゼＰｓｔ　Ｉで再切 断した。より大きいベクター断片を上記の如（電気泳動により精製した。プラス ミドｐＡＢＤ　ｌは［Ｐａｇｚｋｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　 ３．２７１７−２７２２（１９８４）、ここにおいて準用する］に説明されてい る。プラスミドｐＡＢＤＩＤＮＡをＰｓｔｌ及びＢ　ｉｎｄ　ＩＩＩで消化する 。ＣａＭＶ遺伝子遺伝子上プロモーター７５ｂｐの遺伝子■コード化配列を含有 する約４６５ｂｐ長の断片を精製した。これらの二つの断片を連結し、上記の如 くプレート培養した。得られた組換えファージの一つ５Ｉｐ１９　／　ｂｔｃａ は遺伝子■コード化配列の一部であるＣａＭＶ遺伝子遺伝子上プロモーター配列 トキシンコード化配列の上流の約１５５ｂｐのバチルス・ツリンギエンシスＤＮ Ａ及び約１３４６ｂｐのプロトキシンコード化領域を含有した。これらのＣａＭ Ｖプロモーター配列を正確にプロトキシンコード化配列に融合するために、介在 ＤＮＡをｍＰ　１９　／　ｂｔｃａＤＮＡのオリゴヌクレオチド−指示突然変異 誘発を用いて削除した。配列（５’　）ＴＴＣＧＧＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＡＴＧ ＧＴＴＧＧＡＧＧＴＣＴＧＡ（３）を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドは、Ａｐ ＰｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｓｓ　　ＤＮＡシンセサイザーを用いて通常の操作 により合成した。このオリゴヌクレオチドはＣａＭＡプロモーター［（■ｏｈｎ ％Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ％Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＩｍｓｕ ｎｏｌｏｇｙ、９６．１９３　２３５（１９８２）、ここにおいて準用する）中 のヌクレオチド５７６２〜５７７８］の３′末端におけるファージｍＰ１９／ｂ ｔｃａＤＮＡ及びプロトキシンコード化配列の開始部（上記一般式Ｉのヌクレオ チド１５６〜１７２）における配列と相補的である。

突然変異誘発の一般的操作は［Ｚｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、１ｌｅｔｈ 。

Ｅｎｚｙｓ−、１００，４６８−５００（１９８３）、ここにおいて準用する］ に記載されているものである。約５μ２の一本鎖ファージａｐ１９／ｂｔｃａ　 　ＤＮＡを４０ｕＱの容量で０．３１９のホスホリル化オリゴヌクレオチドと混 合した。混合物を６５℃に５分間加熱し、５０℃に冷却し、ゆっくり４℃まで冷 却した。次いで緩衝液ヌクレオチドトリホスフェ−）、ＡＴＰ、　Ｔ、ＤＮＡリ ガーゼ及びＤＩＩＡポリメラーゼの大断片を添加し、１５℃において［Ｚｏｌｌ ｅｒ及びＳｍ１ｔｈ　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、、上００．４６８−５００　（１ ９８３）　、ここにおいて準用する］に説明されるように一晩インキニベートし た。アガロースゲル電気泳動後、円形二本鎖ＤＮＡを精製し、Ｅ、コリ菌株ＪＭ Ｉ　Ｏｌ中にトランスフェクシヨンした。得られたプラークを３２Ｐ−標識化オ リゴヌクレオチドとハイブリダイズする配列についてスクリーニングし、ファー ジをＤ　Ｎ　Ａ　制限エンドヌクレアーゼ分析により分析した。得られたファー ジクローンの中にはＣａＭＶ遺伝子遺伝子上プロモータートキシンコード化配列 間の不所望の配列を正確に欠失したものがあった。このファージをｍｐ１９／ｂ ｔｃａ／　ｄｅｌと称する（第１７図参照）。

次に、プロトキシン遺伝子の３′コード化領域がＣａＭＶ程を第１８図に示す。

先ず、プラスミドｐＡＢＤＩ　Ｄ　Ｎ　ＡをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及び Ｂａ１Ｉ［で消化し、ＣａＭＶ転写ターミネータ−配列を含有する０、５ｋｂｐ 断片を単離した。次にプラスミドｐＵＣ１９［Ｙａｎｉｓｃｈ　−Ｐｅｒｒｏｎ 　ｅｔ　ａｌ、　。

Ｇｅｎｅ３Ｊ、１０３−１１９　（１９８５）　、ここにおいて準用する］をＢ ａｍＨＩで消化し、０．５ｋｂｐ断片を混合しＴ、ＤＮＡリガーゼとインキ５ベ ートした。このＤＮＡのＥ、コリ菌株ＨＢＩＯＩ中への形質転換後、プラスミド ｐ７０２と称される生じたクローンの一つが得られ、それは第１８図に示される 構造を有する。次にプラスミドＩ）７０２ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＳａｃ　 ！及びＳｅａ　１で切断し、より大きい約３．２ｋｂｐ断片をゲル電気泳動によ り単離した。プラスミドＰＫ［Ｉ２５／４ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＡｈａＩ ＩＩ及びＳａｃ　Ｉで消化し、プロトキシンコード化配列（ｎｔ１５０４〜３７ ７３）を含有する２、３−　ｋｂｌ）断片（一般式ｌのヌクレオチド１５０２〜 ３７７３）をゲル電気泳動後に石屋した。これらの二つのＤＮＡ断片を混合し、 Ｔ、ＤＮＡリガーゼとインキュベートし、Ｅ、コリ菌株ＨＢＩＯＩ中に形質転換 した。得られたプラスミドはｐ７０２／ｂｔであった（第１８図）。

最後に１フア一ジｍｐｌ　９　／　ｂｔｃａ／　ｄｅｌ　ｄａ　ｒｆ　Ｄ　Ｎ　 Ａ及ヒフラスミドｐ７０２／ｂｔの部分を連結してＣａＭＶプロモーター及びタ ーミネータ−配列の隣接した完全プロトキシンコード化配列を含有するプラスミ ドを創出した（第１８図参照）。ファージｍｐ　１９／ｂｔｃａ／ｄｅｌ　　Ｄ ＮＡをエンドヌクレアーゼＳａｃ　Ｉ及びＳｐｈ　Ｉで消化し、約１．７５ｋｂ ｐの断片をアガロースゲル電気泳動に従って精製した。

同様に、プラスミドｐ７０２／ｂｔ　　ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＳａｃ　Ｉ 及びＳａｌ　Ｉで消化し、約２．５　ｋｂｐの断片を単離した。最後に、プラス ミドｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ　［Ｂｏｌｉｖａｒｅｔ　ａｌ−、Ｇｅｎｅ、　２ ．９５−１１３　（１９７７）　、ここにおいて準用する］を５ａｉｌ及びＳｐ ｈ　Ｉで消化し、より大きい４．２ｋｂｐ断片を単離した。全ての三つのＤＮＡ 断片を混合し、Ｔ、ＤＮＡリガーゼとインキュベートし、Ｅ、コリ菌株ＨＢＩＯ Ｉ中に形質転換した。得られたプラスミドＰＢＲ３２２／ｂｔ１４はバチルス・ ツリンギエンシス結晶タンパク質コード化配列に融合したＣａＭＶ遺伝子遺伝子 上プロモーター訳開始シグナル及びそれに続いてＣａＭＶ転写停止シグナルを含 有するＰＢＲ３２２の誘導体である（第１９図に示される）。

ベクターｐｃＩＢ１０は、このキメラ遺伝子のアグロバクテリウムツメファシェ ンスを介する植物へのトランスファーに有用なＴｉ−プラスミド−由来ベクター である。

このベクターはミズリー州、セントルイス、ワシントン大学のＬ　Ｂａｒｎｅｓ 博士から得られる広宿主範囲プラスミドｐＲＩ　２５２から得られる。このベク ターは又Ｔｎ９０３からのアグロバクテリウムにおけるカナマイシン耐性に対す る遺伝子及びＴｉプラスミドｐＴｉＴ３７からの左及び右Ｔ−ＤＮＡ境界配列も 含有する。境界配列の間には、プラスミドｐＵｃ１８からのポリリンカー領域及 び植物内のカナマイシン耐性を付与するキメラ遺伝子がある。

先ず、プラスミドｐＲＫ２５２を修飾してテトラサイクリン耐性を付与する遺伝 子をトランスポランＴｎ９０３からカナマイシンに対する耐性を付与するものと 置換し［Ｏｋａ　ｅｔ　ａｌ−、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１４７．２１７−２ ２６（１９８１）、ここにおいて準用する］、又ｐＲＫ２５２における独特なＥ ｃｏＲ１部位をＢａ１Ｉ［部位で置換することにより修飾した（これらの修飾の 概要について第２０図参照）。プラスミドｐＲＫ２５２を先ずエンドヌクレアー ゼＳａｌ　！及びＳｅａ　Ｉで消化し、次いでＤＮＡポリメラーゼＩの大断片で 処理してプラント末端を創出し、大ベクター断片をアガロースゲル電気泳動で精 製した。次に、プラスミドｐ３６８をエンドヌクレアーゼＢａ５ＨＩで消化し、 ＤＮＡポリメラーゼの大断片で処理し、約ｔｏｓｏ−ｂｔ断片をアガロースゲル 電気泳動後に単離した。この断片は抗生物質カナマイシンに耐性を付与するトラ ンスポランＴｎ９０３からの遺伝子を含有する［Ｏｋａ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　１４７．２１７−２２６　（１９８１）　、ここに おいて準用する］、両断片を次いでＤＮＡポリメラーゼの大断片で処理してプラ ント末端を創出した。両断片を混合し、Ｔ、ＤＮＡリガーゼと１５℃で一晩イン キコベートした。Ｅ、コリ菌株ＨＢ　１０１中への形質転換及びカナマイシン耐 性コロニーの選択後、プラスミドｐＲＩ２５２／Ｔ　ｎ　９０３を得た（第１９ 図参照）。

プラスミドｐＲ１：２５２／Ｔ　ｎ　９０３をそのＥｃｏＲ１部位で消化後、Ｅ 、コリＤＮＡポリメラーゼの大断片で処理してプラント末端を創出した會。この 断片を合成りｉｌ　ＩＩ制限部位リンカ−に添加し、Ｔ、ＤＮＡリガーゼと一晩 インキニベートした。得られたＤＮＡを過剰のＢａ１Ｉｒ制限エンドヌクレアー ゼで消化し、より大きいベクター断片をアガロースゲル電気泳動により精製した 。得られた断片を再びＴ、ＤＮＡリガーゼとインキュベートしてその新たに添加 されたＢａ１ＩＩ付着端を介して再円形化した。Ｅ。

コリ菌株ＨＢＩＯＩ中に形質転換後プラスミドｐＲＫ２５２／Ｔ　ｎ　９０３． ／Ｂａ１ｍが得られた（第２０図参照）。

Ｔ　＋　プ５Ｘ　ミＦＴ−ＤＮＡ境界、プラスミＦｐ［ＩＣ１９のポリリンカー 領域及び植物におけるカナマイシン耐性の選択遠祖子を含有するプラスミドｐＢ Ｒ３２２の誘導体を造築した（第２１図参照）。プラスミドｐＢＲ３２５／　Ｅ ｃ。

２９はツバリンＴｉプラスミドｐＴｉＴ３７からの１．５−ｋｂｐ　　ＥｃｏＲ Ｉ断片を含有する。この断片はＴ−ＤＮＡ左境界配列を含有する［　Ｙａｄａｖ 　ｅｔ　ａｌ、、ＰｒｏｃＪａｔｌ、Ａｃａｄ−Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　７９．６３２２−６３２６（１９８２）　、ここにおいて準用する］ 。この断片のＥｃｏＲＩ末端をＨｉｎｄＩ［［末端で置換するためにプラスミド ｐＢＲ３２５／Ｅｃｏ２９　ＤＮＡをＥｃｏＲ１で消化し、次いでヌクレアーゼ Ｓ１でインキュベートし、次いでＤＮＡポリメラーゼの大断片とインキュベーシ １ンを行い、プラント末端を創出し、次いで合成ＨｉｎｄＩ［［リンカ−と混合 し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとインキュベートした。得られたＤＮＡをエンドヌクレ アーゼＣ１ａＴ及び過剰のＨｉｎｄｌ［Ｉで消化し、得られたＴ−ＤＮＡ左境界 を含有する１、１−ｋｂｐ断片をゲル電気泳動により精製した。次いで、プラス ミドｐＵｃ１９のポリリンカー領域をプラスミドＤＮＡのエンドヌクレアーゼＥ ｃｏＲｉ及び旧ｎｄｎ［による消化により単離し、より小さい断片（約５３　ｂ ｐ）をアガロースゲル電気泳動により単離した。次に、プラスミドｐＢＲ３２２ をエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＣ１ａ　Ｉで消化し、その他の二つの単離 断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとインキニベー）Ｌ、Ｅ、コリ菌株ＨＢＩＯ Ｉ中に形質転換した。得られたプラスミドＰＣｌ３５はプラスミドｐＢＲ３２２ の誘導体中にポリリンカー及びＴ−ＤＮＡ左境界を含有する（第２１図参照）。

植物中でのカナマイシン耐性の発現のための遺伝子を含有するプラスミドを造築 した（第２２図及び第２３図参照）。プラスミド旧ｎ６は英国、ケンブリッジ、 ＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅのＭ、Ｂｅｖｉｎ博士から 得られた。このプラスミドはＢｅｖａｎによる［１Ｉｕｃ１．　Ａｃ１ｄｓ、　 Ｒｅ５−　＋　１２ｓ８７１１−８７２１　（１９８４）　、ここにおいて準用 する］の文献に説明されている。プラスミドＢ１ｎ６ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＨ ｉｎｄＩ［［で消化し、キメラネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ ）遺伝子を含有する約１．５ｋｂｐの大きさの断片を単離し、アガロースゲル電 気泳動により精製した。この断片を次いでエンドヌクレアーゼＥｅｏＲＩ及びＨ ｉｎｄｌ［［で切断されたプラスミドｐｔ＋ｃｉｓＤＮＡと混合した。Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼとのインキュベーション後、得られたＤＮＡをＥ、コリ菌株ＨＢＩＯ Ｉ中に形質転換した。得られたプラスミドをｐｔｌｃｌ　８　／　ｎｅ。

と称する。このプラスミドＤＮＡはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝 子とツバリンジンダーゼのターミネータ−配列との間に不所望のＢａ腸Ｈ１認識 配列を含有する［Ｂｅｖａｎ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ　ｉｄｓ、　Ｒｅｓ、　、上２ ．８７１１−８７２１　（１９８４）（ここにおいて準用する）参照］。

この認識配列を除去するためにプラスミドｐＵｃ　１８　／　ｎｅ。

をエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化後、ＤＮＡ；ｔ？リメラーゼの大断片で 処理してプラント末端を創出した。断片を次いでＴ４ＤＮＡリガーゼとインキュ ベートして断片を再円形化し、Ｅ、コリ菌株ＨＢＩＯＩ中に形質転換した。得ら れたプラスミドｐＵＣ１８／　ｎｅｏ　（Ｂａａ）はＢａｍＨＩ認識部位を失っ ていた。

Ｔ−ＤＮＡ右境界配列を次いでキメラＮＰＴ遺伝子の次に添加した（第２４図参 照）。プラスミドｐＢＲ３２５／Ｂｉｎｄ２３はプラスミドｐＴｉＴ　３７の３ 　、４−　ｋｂｐ　ＨｉｎｄＩ［Ｉ断片を含有する。この断片は右Ｔ−ＤＮＡ境 界配列を含有する［Ｂｅｖａｎ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｎｕｃ１．Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、＋上↓、３６９〜３８５、ここにおいて準用する］。プラスミドｐＢＲ３２５ ／１１ｉｎｄ２３ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＳａｃ　ＩＩ及びＢｉｎｄｌで切 断し、右境界を含有する１、０ｋｂｐ断片を単離し、　　　゛アガロースゲル電 気泳動に従って精製した。プラスミドｐＵｃ１８／　ｎｅｏ　（Ｂａｇ）　Ｄ　 Ｎ　ＡをエンドヌクレアーゼＳａｃ　ＩＩ及びＢｉｎｄｌ［Ｉで消化し、４．０ ｋｂｐベクタ一断片をアガロースゲル電気泳動により単離した。これらの二つの 断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとインキュベートし、Ｅ。

コリ菌株ＨＢＩＯＩ中に形質転換した。得られたプラスミドｐｃＩＢ４　（第２ ３図に示す）は、プラスミドｐＵｃ１８の誘導体中にＴ−ＤＮＡ右境界及びカナ マイシン耐性のための植物−選択性マーカーを含有する。

次に、Ｔ−ＤＮＡ左及び右境界の両者を植物選択性カナマイシン耐性遺伝子及び 境界間のｐＵＣ１８のポリリンカーと共に含有するプラスミドを造築した（第２ ８図参照）。プラスミドｐｃＩＢ４　Ｄ　Ｎ　ＡをエンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ｌＩ［で消化後、ＤＮＡポリメラーゼの大断片で処理してプラント末端を創出し た後、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化した。キメラカナマイシン耐性遺伝 子及びＴ−ＤＮＡの右境界を含有するｌ　６−ｋ　ｂ　ｐ断片をアガロースゲル 電気泳動により単離した。プラスミドｐｃＩＢ５　Ｄ　Ｎ　Ａをエンドヌクレア ーゼＡａｔ　ＩＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理してプラント末端を 創出し、次いでエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断した。より大きいベクター 断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、ｐｃＩＢ４断片と混合し、Ｔ４Ｄ ＮＡリガーゼとインキュベートし、Ｅ、コリ菌株ＨＢＩＯＩ中にインキュベート した。得られたプラスミドｐｃＩ８２　（第２４図に示す）は二つのＴ−ＤＮＡ 境界間に目的配列を含有するプラスミドｐＢＲ３２２の誘導体である。

以下の工程はベクターｐｃｉ８１０の造築を完結し、第２５図に示される。プラ スミドｐｃＩＢ２　Ｄ　Ｎ　Ａをエンドヌ成リンカ−を上記の如（添加する。過 剰のＢａ１ｌｌエンドヌクレアーゼで消化後、約Ｚ６−ｋｂｐ断片をアガロース ゲル電気泳動に従って単離した。上記プラスミドｐＲＥ２５２／Ｔｎ９０３／Ｂ ａ１Ｉ［（第２０図参照）をエンドヌクレアーゼＢａ１ｌＩで消化し、次いでホ スファターゼで消化して再円形化を防止した。これらの二つのＤＮＡ断片を混合 し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとインキュベートし、Ｅ。

フリ菌株ＨＢＩＯＩ中に形質転換した。得られたプラスミドが完成ベクターｐｃ ＩＢ１０である。

キメラプロトキシン遺伝子のベクターｐｃＩ８１０中への挿入は、第２６図に示 される工程によって行われる。プラスミドｐＢＲ３２２／ｂｔ　１７　ＤＮＡを エンドヌクレアーゼＰｖｕｌ及びＳａｌ　Ｉで消化し、次いで部分的にエンドヌ クレアーゼＢａｍＨＩで消化した。キメラ遺伝子を含有する約４．２−ｋｂｐの 大きさのＢａｍＨＩ　−Ｓａｔ　Ｉ断片をアガロースゲル電気泳動に従って単離 し、エンドヌクレアーゼＢａｇＨ１及び５ａｉｌで消化されたプラスミドｐｃＩ Ｂ１０ＤＮＡと混合した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼとのインキュベーション及びＥ、 コリ菌株ＨＢＩＯＩ中の形質転換後第２６図に示されたプラスミドはプラスミド ベクターｐｃＩ８１０中にキメラプロトキシン遺伝子を含有した。

プラスミドｐｃＩＢ／　１９　ＳｂｔをＥ、コリＨＢＩＯＩからアグロバクテリ ウムに転移するために、中間体Ｅ、コリ宿主菌株５１７−１を用いた。この、コ ロラド州ボールダーのＡｇｒｉｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｒｐ 、から得られる菌株はプラスミドｐｃｉ８１０を接合を介してアグロバクテリウ ムに直接転移して裸プラスミドＤＮＡの直接アグロバクテリウム中への形質転換 させる必要性を回避する可動化機能を含有する［菌株５１７−１に対する文献は 、５ｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　 ｔｈｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ−Ｐｌａｎｔ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ”　％Ａ、Ｐ ｕｈｌｅｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ。

ベルリン、９８〜１０６頁、１９８３、（ここにおいて準用する）である〕。先 ず、プラスミドｐｃＩＢ　１０　／　１９ＳｂｔＤＮＡを塩化カルシウム処理５ １７−１細胞中に導入する。次いで形質転換５１７−１細胞の培養、液及びアグ ロバクテリウムツメファシェンス菌株Ｌ　Ｂ　Ａ　４４０４［Ｏｏｍｓ　ｅｔ　 ａｌ−、Ｇｅｎｅｒ１４　３３−５０　（１９８１）、ここにおいて準用する） ］を混合し、Ｎ寒天（Ｄｉｒｃｏ）プレート上で室温において一晩交配した。得 られた細菌の１白銀耳をＡＢ最小培地上にストリークし［Ｃｈｉ　Ｉｔｏｎｅｔ 　ａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７ヱ、７ ３４７−７３５１　（１９７４）、ここにおいて準用するコ、５０μｖ／’ｘ（ ｌのカナマイシンと共にプレート培養し、２８℃でインキュベートした。コロニ ーを同一培地上に再ストリークし、次いでＮＢ寒天プレート上に再ストリークし た。

遅い成長コロニーをつつき出し、ＡＢ最小培地上にカナマイシンと共にストリー クし、単一コロニーを単離した。

この操作はｐｃＩＢ　１０　／　１９　Ｓｂｔプラスミドを含有するアゲロバク チリアを選択するものである。

バチルス・ツリンギエンシスプロトキシンキメラ遺伝子ｆ）　ＣａＭＶ　３５　 Ｓプロモーターによる造築は、第２７図に示されたように造築されたＣａＭＶ３ ５　ＳプロモーターカセットプラスミドｐｃＩＢ７１０の造築により達成された 。このプラスミドはＣａＭＶプロモーター及び３５ＳＲＮＡ転写体に対する転写 停止配列を含有した［　Ｃｏｖｅｙ、　Ｓ、　Ｎ、、　Ｌｏｓｏ−ｎｏｓｓｏｆ ｆ、　Ｇ、　Ｐ、　＊　及びＢｕｌｌ、Ｒ，、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈＶｏ１．９．６７３５−６７４７　（１９８１）、ここにおいて 準用する］　、　ＣａＭＶＤ　Ｎ　Ａの１１４９−ｂｐ　Ｂａ１Ｉ［制限断片［ Ｈｏｈｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄｔｏＧ（１９８２）、ここにおいて準用する］をプラスミ ドｐＬＶ１１１　（サンディエゴのカリフォルニア大学のＳ。

Ｂｏｗｅｌ　ｌ博士から得られたもの；或いはこの断片は直接ＣａＭＶ　　Ｄ　 Ｎ　Ａから単離することができる）から前記の如く調製アガロースゲル電気泳動 により単離し、ＢａｍＨＩ−切断プラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡと混合し、Ｔ４Ｄ ＮＡリガーゼで処理し、Ｅ、コリ中に形質転換した。得られたプラスミド中のＢ ａａＨＩ制限部位はＢｇｌｌｌ付着端のＢａｇＨ１付着端への連結により破壊さ れた。ｐＵｃ１９／３５Ｓと称される得られたプラスミドを次いでオリゴヌクレ オチド−指示ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発において用いてＨｏｈｎ文献にお けるＣａＭＶヌクレオチド７４８３の直後にＢａｍＨＩ認識配列ＧＧＡＴＣＣを 挿入した。得られたプラスミドｐｃｔ８７１０はＢａｓ＋ＨＩ制限部位により分 離されたＣａＭＶ３５　Ｓプロモーター領域及び転写停止領域を含有する。この Ｂａｍ８１部位に挿入されたＤＮＡ配列はＣａＭＶ転写制御配列により植物内で 発現される。ｐｃＩＢ７１０は転写の開始点及びＢａｇ）（１部位の間に如何な るＡＴＧ翻訳開始フドンも含有しない。

ＣａＭＶ３５　Ｓプロモーター／ターミネータ−カモ、トのｐｃＩＢ１０中への 挿入は第２８図に概略図示される工程により行われた。プラスミドｐｃｌＢ１０ 及びｐｃＩＢ７１０ＤＮＡｓをＥｅｏＲ１及び５ａｉｌで消化し、混合し、連結 した。得られたｐＣＩＢ　１０／７１０は植物形質転換ベクターｐｃｌＢ１０に 挿入されたＣａＭＶ３５　Ｓプロモーター／ターミネータ−カセットを有する。

ＣａＭＶ３５　Ｓ配列は、ｐｃＩＢ１０のＴ−ＤＮＡ境界の間にあり、従って植 物形質転換における植物ゲノム中に挿入される。

バチルス・ツリンギエンシスプロトキシン遺伝子のｐｃＩＢ１０／７１０中への 挿入は第２９図に概略図示される工程により行われた。プロトキシン遺伝子源と しては、プラスミドｐｃＩＢ　１０／　１９ＳｂｔをＢａｍＨＩ及び）Ｉｃｏ　 Ｉで消化し、プロトキシン遺伝子を含有する３、６−ｋｂ断片を調製ゲル電気泳 動により単離した。この断片を次いで配列５’−ＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧ ＧＣ−３’を有する合成Ｎｃｏ　Ｉ　−Ｂａ５Ｈ１アダプターと混合し、次いで Ｂａ５）（１で消化した。この工程はプロトキシン断片の両末端にＢａｍＨＩ付 着端を創・出す。この断片を次いでＢａ識Ｈ１−切断ｐｃＩＢ１０／　７１０中 に挿入した。第２９図に示される得られたプラスミドｐｃＩＢ１０／３５ｓｂｔ はＣａＭＶ３５　Ｓプロモーターと転写停止配列の間にプロトキシン遺伝子を含 有する。

プラスミドｐｃＩＢ１０／３５Ｓｂｔのアグロバクテリウムツメファシェンス菌 株ＬＢＡ４４０４中への転移は前記の通りであった。

約７２５個のアミノ酸を含有する欠失バチルスツリンギエンシスプロトキシンの 造築及びこの欠失遺伝子をＣａＭＶ３５　Ｓプロモーターと共に含有するキメラ 遺ｉ子の造築は、一般式１に示された配列における位置２３２５においｒＫｐｎ ｌ制御’ｌ！エンドヌクレアーゼにおいて切断することによって、遺伝子のＣ０ ０）ｌ−末端部分を除去して行われた。プラスミドｐｃｌＢ　１０／　３５Ｓｂ ｔ　（第２９図）をＢａ５ＨＩ及びＫｐｎ　Ｉで消化し、欠失プロトキシン遺伝 子を含有する約２．２−ｋｂＰのＢａｍＨＩ　／Ｋｐｍ　Ｉ断片を調製アガロー スゲル電気泳動により単離した。３′末端におけるＫｐｎ　１部位をＢａｍＨ１ 部位に転換するために、断片をＫｐｎ１／Ｂａ＊ＨＩアダプターオリゴヌクレオ チドと混合し、連結した。この断片を次いでＢａ■ＨＩ−切断ｐｃＩＢｌＯ／７ １０と混合した（茅２８図）。

約６４５個のアミノ酸を含有する欠失プロトキシン遺伝子を一般式１に示された 配列における２０９０位におけるＢｃｌ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位におい て切断して遺伝子のＣ００Ｈ−末端部分を除去することにより作成した。プラス ミドｐｃＩＢ　１０　／　３５５ｂｔ（第２９図）をＢａ５Ｈ１／ＢｃｌＩで消 化し、欠失プロトキシン遺伝子を含有する約１．９−　ｋｂｐのＢａｍＨＩ　／ 　Ｂｃ　ＩＩ断片を調製アガロースゲル電気泳動により単離した。Ｂｅ１ｌはＢ ａ■Ｈ１と適合性の付着端を創出するので、この断片をＢａｍＨＩ−切断ｐｃＩ ８１０／７１０（第２８図）に連結する前に更に操作が必要とされない。第３１ 図に示された構造ｐｃＩＢ　１０／　３５Ｓｂｔ（Ｂｃｌ　Ｉ　）を有する得ら れたプラスミドはカナマイシン上で選択された。

ｐｃＩＢｌ　０／３５Ｓｂｔ（Ｋｐｎｌ）と命名され、第３０図に示される得ら れた形質転換体は約７２５のアミノ酸の欠失プロトキシン遺伝子を含有する。こ れらの形質転換体はカナマイシン上で選択される。

欠失プロトキシン遺伝子はＢ＆■Ｈ１切断部位（ＧＧＡＴＣＣ）を導入すること により作られた。これはｐｃＩＢｌ　０　／　３５ｓｂｔからのプロトキシン配 列を含有するＢａｍＨＩ断片を−ｐ１８中にクローニングし、及び上記標準オリ ゴヌクレオ妾ド突然変異誘発を用いることによりなされる。突然変異誘発後、二 本鎖複製形態ＤＮＡをＭ１３クローンから調製し、それを次いでＢａ５ＨＩで消 化する。欠失プロトキシン遺伝子を含有する約１．９−　ｋｂｐ断片をＢａｍＨ Ｉ−切断ｐｃＩＢ１０／７１０中に挿入する。第３２図に示される構造ｐｃＩＢ 　１０／　３５Ｓｂｔ　（６０７）を有する得られたプラスミドをカナマイシン 上で選択する。

ｐｃＩＢ　１０／Ｓｂｔ　（６０７）が用いられた。形質転換は選択性抗生物質 を含有する培地上で１　ＩＱのアリコートを直ちにプレート培養した以外は、実 施例７と同様にして達成された。この選択培地はカナマイシン（５０ｕｖ／ｘＱ ）或いは０４１８（２５μ９／峠）を含有した。両形質転換植物組織中における ＮＲＴキメラ遺伝子の発現がいずれの抗生物質上でのこの組織の選択を可能にす る。

２〜４週間以内に形質転換組織が選択プレート上に明らかとなった。植物物質は カナマイシン或いはＧ４１８上で選択した。植物組織（個々の胚或いはカルス） を次いで緩衝液で抽出し、ＢＴ遺伝子生成物の発現についてＥＬｒＳＡアフセイ により測定した。抽出の条件は次の通りである：ｌ１０Ｏｘの組織当り、５０　 ｓＭ　ＮａＣＯ５（ｐＨ９，５）、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ、　０．０５％Ｔｗ ｅｅｎ、　　１００　ｎＭ　ＮａＣｆｆ、　　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ％　１　ｍＭ ロイペプチン、及びｌ　６Ｍ　ＰＭＳＦを含有する０、１ｘｅ（’）抽出緩衝液 中でホモジナイズする。ロイペプチン及びＰＭＳＦは使用直前に１００×原液か ら添加する。組織をモーター駆動乳棒で磨砕した。抽出後、２ＭＴｒｉｓｐＨ７ を添加してｐＨを８．０〜８．５に調整し、次いでベックマンマ不りロヒニージ １２中で１２０００ｒｐ＠で遠心分離しく４℃で１０分間）、上澄液を酵素結合 免疫吸着剤アッセイ（ｒＥＬＩｓＡＪ　）のために保存した。

ＥＬＩＳＡ技術は一般的道具として［Ｍ、Ｆ、Ｃ１ａｒｋ　ｅｔ　　ａｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｌ　１８　：　７４２−７６６　 （１９８６）、ここにおいて準用する］により説明されている。

Ｂｔ毒素用のＥＬＩＳＡは標準操作を用いて開発され、トランスジェニック植物 物質をＢｔ配列の発現について分析するために用いられた。この操作のために、 ＥＬＩＳＡブ製ウサギ抗つＢｔ抗血清（５Ｃ）ｌ）をホウ酸−緩衝化塩水（下記 参照）中の３μ９／　ｘＱの濃度でプレートに添加する。これを４℃で一晩イン キニベートさせた。抗血清が勾配精製Ｂｔ結晶によるウサギの免疫化に応答して 産生され［Ａｎｇ、　Ｂ、Ｊ、＆　１ｌｉｃｋｅｒｓｏｎ、　Ｋ、１．　；　Ａ ｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ。

Ｍｉｃｒｏｈｉｏ１３６　：　６２５　６２６　（１９７８）　、ここにおいて 準用する］、ドデシル硫酸ナトリウムで可溶化し、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（下記 参照）で洗浄した。それを次いで室温で１時間ブロッキング緩衝液（下記参照） で処理し、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄した。植物抽出液を５０μ９のタンパク 質を与える量で添加した（これは典型的には約５μＱの抽出液である）。タンパ ク質としての葉抽出緩衝液は、カリフォルニア州、リッチセント、Ｂｉｏ　　Ｒ ａｄ社から得られる市販のキットを用いてＢｒａｄｆｏｒｄ法により求める［Ｂ ｒａｄｆｏｒｄ、　Ｍ、、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｓ、　７２　：　２４８（１ ９７６）、ここにおいて準用する］。葉抽出液の稀釈が必要な場合には、ＥＬＩ ＳＡ稀釈液（下記参照）を用いる。これを４℃で一晩インキユベートさせる。Ｅ ＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄後、５０μρアフィニティ精製ヤギ抗−Ｂｔ抗血清を ＥＬＩＳＡ稀釈液中の３μ９／　ｘＱタンパク質の濃度で添加する。これを３７ ℃で１時間インキニベートさせ、次いでＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄する。アル カリホスファターゼに結合した５０μＱのウサギ抗−ヤギ抗体［ミズリー州、セ ントルイス、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から市販のもの］を、ＥＬＩＳ Ａ稀釈液中に１：５００に稀釈し、３７℃で１時間インキュベートさせ、次いで ＥＬＩＳ＾洗浄緩衝液で洗浄する。５０μＱの基質［ＥＬＩＳＡ基質緩衝液（下 記参照）中０．６１９／　ｘ（ｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート］を添加し 、室温で３０分間インキニベートする。反応は５０ｕ（ｌの３ＭＮａＯＨを添加 することにより停止する。修正ＥＬＩＳＡ読取機［カリフォルニア州、スタンフ ォード、Ｈｅｗｌｅｔ　Ｐａｃｋａｒｄ社］における４０５ｎｍでの吸光度を読 取る。

ｐｃＩＢｌ　０　／　３５　ＳＢｔ　（Ｂｅｔ　Ｉ　）で形質転換した植物組織 は、このＥＬＩＳＡ操作を用いて分析した際に陽性反応を示し、Ｂｔ遺伝子の発 現を示した。

ＥＰＢＳ　（ＥＬＩＳＡリン酸緩衝塩水）１０ｕＭ　Ｎａホスフェート：　Ｎａ ＪＰＯａ　　　　　４．６８９／　４ＱＮａＨｔＰＯ４・■ｔｏ　　ｏ、　９７ ６９／　４（１１４０ｍＭ　　ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　ＮａＣ１３２ ，７９／　４Ｑｐ■は約７．４であるべきである。

ホウ酸緩衝塩水 １００ｍＭホウ酸 ２５■Ｍ　Ｎａボレート ７５ｍＭ　ＮａＣ１ ｐｌを必要に応じてＥＩＣＩ或いはＮａＯＨで８．４〜８．５に調整する。

１％　ＢＳＡ ０．０２％Ｎａアジド ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液 １０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，００，０５％Ｔｗｅｅｎ　２０ ０．０２％Ｎａアジド ０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　　２０ １％　ＢＳＡ ０．０２％Ｎａアジド 匹土込蒸】コＬ乱旅 ５００１Ｑ中 ４８１ｇジェタノールアミン ２４、５１９　ＭｇＣ１ｔ ＨＣＩでｐＨ９，８に調整。

ＥＬＩＳＡ基質 ２５ｘ（１Ｍ質ｔｌ衝液中１５１９のｐ−ニトロフェニルホスフェート。

パイオアフセイに対しては、これらのアゲロバクチリアによる形質転換から得ら れた抗生物質耐性細胞培養液からの細胞浮遊液を開始した。浮遊液をＧ４１８（ ２５ｗｙ／（１”）で補給した培地中で生育させ、７〜ｌＯ日間間隔で新鮮な抗 生物質含有培地中に二次培養した。次いでこれらの培養液の試料を培養アッセイ に用いて鱗翅目昆虫に対する毒性を試験した。２０１ｉ２のこれらの培養液のア リコートを沈澱させ（細胞容積＝３〜４ＭＱ）、抗生物質に欠ける培地中に再浮 遊させた。浮遊液を次いでこの培地中において追加の２日間生育させて細胞から 残存抗生物質を欠乏させた。３／４オンス部分のカップの底に湿潤１１ｈａｔｍ ａｎ　　２．３ｃｘｆ紙の２枚の円盤を置いた。０．２ｃｘ深さの形質転換浮遊 培養細胞の層を濾紙円盤上に置いた。

幼虫を各部分のカップ中に入れた。対照例は非形質転換浮遊培養細胞で、飼育し た幼虫により構成された。円盤は必要に応じて２日間間隔で更新された。マンデ ニカ幼虫は通常より多くの植物物質を必要とする。形質転換細胞で飼育された幼 虫の成長速度及び死亡率を、未形質転換細胞で飼育された幼虫の成長速度と対比 して５日後に評点したところ、形質転換細胞におけるＢｔ遺伝子産生物の毒性が 明らかに認められた。

Ｋ嵐五ユ１ チーズクロスのシート上に置かれたへりオティス・ビレセンスの卵は、ノースカ ロライナ州レイリーのノースカロライナ州立大学のＴａｂａｃｃｏ　Ｉｎ５ｅｃ ｔ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙから得られた。チーズクロスシー トをカバーされた大ガラスビーカーに移し、湿潤紙タオルで湿度を維持して２９ ℃でインキュベートした。卵は３日以内に岬化した。畔化後なるべく早く、幼虫 （カップ当り１匹の幼虫）をカバーされた３７４オンスのプラスチックカップに 移した。各カップは綿の葉の円盤を含有する。幼虫は細い荒毛塗料ブラシを用い て移した。

１ｃ１１直径の葉の円盤は綿植物の葉から切抜きカップ内の円形湿潤濾紙上に幼 虫と共に置いた。各植物について若い及び古い両方の葉である少なくとも６〜ｌ Ｏ枚の葉の円盤について試験した。葉の円盤は２日間間隔或いは必要に応じて取 り変えて幼虫を飼育した。形質転換された植物の葉上で飼育される幼虫の成長速 度［全レプリカ昆虫の大きさ或いは合−重ｆｆｉ］及び死亡率を未形質転換綿の 葉で飼育される幼虫のそれらと比較した。

ｐｃｌＢ１０／３５ＳＢ５（Ｂｅｌｌ）で形質転換された綿の円盤で飼育される 幼虫は、対照例と比較して成長速度の減少及び死亡率の増大を示す。

ある数の我々の再生植物（５〜ｌＯ％）は、再生過程の結果として遺伝的に継承 可能な表現型変化を獲得したように見えることが観察された。この変化はツマク ローナル変化として知られている。以下の実施例は我々の再生操作の結果として のツマクローナル変化が如何にして用いられて商業的に有用な新しい形質を綿の 品種中に導入したかを例示するものである。

友良五ユ玉 菌病源体に耐性の綿再生体 実施例１の操作に従い、品種ＳＪ５及びＳＪ４の得られた再生綿植物を硬化し、 土壌中に入れた。これらの植物は自己受粉させ、Ｆ１世代を表わす種子を集めた 。

−ティシリウム蔓延畑に植付けて、後代列分析を行った。

品種ＳＪ４及びＳＪ５の種子を畑に代照例として植付けた。パーティシリウム真 菌に対して親品種より耐性のあるツマクローナル変種は総合的植物の活力、収量 及び病気に伴う葉の徴候の不存在を評価することにより葎がの後代列（５％）中 に確認された。第３３図は、パーティシリウム蔓延畑内に植付けられた再生体の 後代列を示す。

第３４図は品種ＳＪ４のパーティシリウム耐性ツマクローナル変種を示す。この 真菌病原体に対する耐性の改良は、遺伝的に安定であることが判明し、引続く世 代に継代された。

友胤亘エユ された成長性癖を有する綿再生体 病気蔓延土壌中に植付ける代りにＦ１世代を綿育成苗床に植付けた以外は、実施 例１３の操作に従った。Ｆ１再生後代の総合的成長性癖を対照側品種のそれと対 比した。成長性癖においてより均一であり、且つ親品種より丈の短いツマクロー ナル変種が確認された。我々の試みにおいてＰｈｙ　６と同定された一つのＳＪ ５再生体は親品種より丈が２０％短かった。この種の成長性癖は狭い列（３０イ ンチ列間隔）の栽培条件下において生育される綿においては望ましいものである 。これらの形質は遺伝的に安定であり、引続く世代に継代された。

Ｆ１後代の再生体を綿育成苗床内に植付は結実させた以外は、実施例１３の操作 に従った。ボールが成熟した時点で、綿を収穫し、長さ、均一性、引張強度、弾 性及びミクロネールを含む幾つかの繊維品質形質の分析に付した。これらの形質 の１以上において親品種に対して有意に改良されたツマクローナル変種が確認さ れた。Ｆ２後代（Ｆｌの細胞受粉）からの代表的データを下記表１に含ませる。

星印を付けた値は統計学的に有意であり、引続く世代において真に生育すること が判明したＳＪ５再生体における改良を表わす。

ＳＪ５　　　１．１３　　　４８．７　　　２ｔ７　　　６．８　　４．２７３ ＳＰ１６　　１．２７°　　５１．２　　　２４．６　　　８．０”　　　４． １０”３ＳＰ２０　　１．２８”　　　５３．１”　　　２３．１　　　７．６ ”　　　４．１３”５ＳＰＩＱ　　　　　　　１．１１　　　　　　　５３．２ ”　　　　　　　２５．７豪　　　　　　　６．２　　　　　　４．５５５ＳＰ １７　　１．１ｇ　　　　５１．７　　　２６．７’　　　　７．１　　４．４ ３゛及良匠↓遣 改良した収量を有する綿再生体 品種ＳＪ４のＦ１後代の再生体を非再生対照例と共に複製収率試験において植付 けた以外は、実施例１３の操作に従った。より均一な成長性癖及びより活力のあ る成長性癖を示した一つの変種は、同一試験における親品種よりも４％多い綿を 生産した。データを下記表２に示す。

ＳＪ４対照例　　　　　２８．０　　　　　　　　３０４９Ｐｈｙ　４　　　　 　２９．１　　　　　　３１６９　　　　４％０１この差は９５％信頼水準で有 意であった。

収率の４％増大は、１００万ニーカーを越す綿が毎年栽培されているカリフｔル ニアにおいて平均釣線生産者に対してニーカー当り殆んど２０ドルの収益を表わ す。

実施例２０ 殺草剤（カナマイシン）に耐性の綿再生体綿み種Ｂ１６４４の浮遊培養液を実施 例５の方法に従って発達させた。浮遊培養液を、実施例６と同様であるが、しか し殺草剤（抗生物質）カナマイシン（２５１１９／Ｑ）を補給した寒天培地上に プレート培養した。殆んどの細胞が死滅したが、僅か（工〜５％）は耐性であり 生残った。これらを選択的に増大濃度のカナマイシンにより最終濃度が５０ｘｙ ／Ｎに到達するまで補給された寒天−固化培地上で二次培養した。胚をこのカル スから次いで発達させ耐性胚をカナマイシン耐性植物に発芽させた。

一般式１ ％式％ ＣＴＣＡＡＴＡＴＧＡ　ＴＡＧＡＴＴＡＣＡＡ　ＧＣＧＧＡＴＡＣＣＡ　ＡＣＡ ＴＣＧＣＧＡＴ　ＣＡＴＴＣＡＴＧＣＧ　ＧＣＡＧＡＴＡＡ`Ｃ ２ｇ９０　　　　　２９００　　　　　２９１０　　　　　２９２０　　　　　 ２９３０　　　　　２９４０ＧＣＧＴ丁ＣＡＴＡＧ　　ＣＡＴＴＣＧＡＧＡＡ　 　ＧＣＴＴＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＴＴＣＣＧ　　ＧＧＴ ＧＴＣＡ`ＴＧ ＣＧＧＣＴＡＴＴＴＴ　ＴＧＡＡＧＡＡＴＴＡ　ＧＡＡＧＧＧＣＧＴＡ　ＴＴＴ ＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＣＣＣＴＡ　ＴＡＴＧＡＴＧＣＧ` ＧＡＡＡＴＧＴＣＡＴ　ＴＡＡＡＡＡＴＧＧＴ　ＧＡＴＴＴＴＡＡＴＡ　ＡＴＧ ＧＣＴＴＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＧＴＧＡＡＡＧＧＧＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧ Ｔ　ＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡ　ＡＡＣＡＡＣＣＡＣＣＧＴＴＣＧＧＴＣＣＴ　ＴＧ ＴＴＧＴＴＣＣＧ　ＧＡＡＴＧＧＧＡＡf ３１３０　　　　　３１４０　　　　　　Ｂ１５０　　　　　３１６０　　　　 　３１７０　　　　　３１８０ＣＡＧＡＡＧＴＧＴＣＡＣＡＡ（ｉＡＡＧＴＴ　 　ＣＧＴＧＴＣＴＧＴＣＣＧＧＧＴＣＧＴＧＧ　　ＣＴＡＴＡＴＣＣＴＴ　　Ｃ ＧＴＧＴＣ`ＣＡＧ ＣＧＴＡＣＡＡＧＧＡ　ＧＧＧＡＴＡＴＧＧＡ　ＧＡＡＧＧＴＴＧＣＧ　ＴＡＡ ＣＣＡＴＴＣＡ　ＴＧＡＧＡＴＣＧＡＧ　ＡＡＣＡＡＴＡＣ`Ｇ ＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡ　ＧＴＴＴＡＧＣＡＡＣＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧ　ＡＧＧＡ ＡＧＴＡＴＡ　ＴＣＣＡＡＡＣＡＡＣＡＣＧＧＴＡＡＣＧＴ３３１０　　　　　 ３３２０　　　　　３３３０　　　　　３３４Ｇ　　　　　　３３５０　　　　 　３３６０ＧＴＡＡＴＧＡＴＴＡ　　ＴＡＣＴＧＣＧＡＣ丁　ＣＡＡＧＡＡＧＡ ＡＴ　　ＡＴＧＡＧＧＧ丁ＧＣＧＴＡＣＡＣＴＴＣＴ　　ＣＧＴＡＡＴbＧＡＧ ３３７０　　　　　３３ｇ０　　　　　３３９０　　　　　３４００　　　　　 ３４１０　　　　　３４２０ＧＡＴＧＴＧＡＣＧＧ　　ＡＧＣＣＴＡＴＧＡＡ　 　ＡＧＣＡＡＴＴＣ丁Ｔ　　ＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＡＴＴＡＴＧＣＡ　　Ｔ ＣＡＧＣbＴＡＴＧ ＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＴＡＣＡＧＡＴ　ＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧ　ＡＣＡＡ ＴＣＣＴＴＧ　ＴＧＡＡＴＣＴＡＡＣＡＧＡＧＧＡＴＡＴＧ３４９０　　　　　 ３５００　　　　　３５１Ｇ　　　　　　３５２０　　　　　３５３０　　　　 　３５４０ＧＧＧＡＴＴＡＣＡＣＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡ　ＧＣＴＧＧＣＴＡＴＧ 　ＴＧＡＣＡＡＡＡＧＡ　ＡＴＴＡＧＡＧＴＡＣＴＴＣＣＣＡＧＡＡＡＣＣＧＡ ＴＡＡＧＧＴ　ＡＴＣＧＡＴＴＧＡＧ　ＡＴＣＧＧＡＧＡＡＡ　ＣＧＧＡＡＧＧ ＡＡＣＡＴＴＣＡＡＣＧＴＧ　ＧＡＣＡＧＣＧＴＧf ３６１０　　　　　３６２Ｇ　　　　　　３６３０　　　　　３６４０　　　　 　３６５０　　　　　３６６０ＡＡＴＴＡＣＴＴＣＴ　　ＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡ 　　ＴＡＡＴＡＴＡＴＧＣＴＴＴＡＴＡＡＴＧＴ　　ＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡ　　 ＡＡ丁＾Ａ`ＧＡＡＴ ３６７０　　　　　３６ｇ０　　　　　３６９０　　　　　３７００　　　　　 ３７１０　　　　　３７２０ＧＡＴＴＡＣＴＧＡＣＴＴＧＴＡＴＴＧＡＣＡｌｌ ；ＡＴＡＡＡＴＡＡ　ＧＧＡＡＡＴＴＴＴＴ　ＡＴＡＴＧＡＡＴＡＡ　ＡＡＡＡ ＣＧＧＧbＡ ３７３０　　　　　　：（７４０３７５０３７６０３７７０３７８０ＴＣＡＣＴ ＣＴＴＡＡ　ＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧ　ＴＣＣＧＴＴＴＴＴＴ　ＧＴＡＴＧＡＴＴ ＴＡ　ＡＣＧＡＧＴＧＡＴＡ　ＴＴＴＡＡＡＴＧsＴ ＴＴＴＴＴＴＧＣＧＡ　　ＡＧＧＣＴＴ丁ＡＣＴ　　ＴＡＡＣＧＧＧＧＴＡ　　 ＣＣＧＣＣＡＣＡＴＧ　　ＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴ　　ＴＡＡfＡＡＴＴＴＧ ３ｇ５０　　　　　３８６０　　　　　３８７０　　　　　３８８０　　　　　 ３１１１９０　　　　　３９００ＣＡＣＴＡＣＣＣＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡ　 ＡＡＡＣＧＴＴＡＴＴ　ＣＴＴＴＣＴＡＡＡＡ　ＡＧＣＴＡＧＡＴＡＧ　ＡＡＡ ＧＧＡＴＧＡb ＡＴＴＴＴＴＴＡＴＧ　ＡＡＴＣＴＴＴＣＡＡ　ＴＴＣＡＡＧＡＴＧＡ　ＡＴＴ ＡＣＡＡＣＴＡ　ＴＴＴＴＣＴＧＡＡＧ　ＡＧＣＴＧＴＡＴbＧ ４０３０　　　　　４０４０　　　　　４０５０　　　　　４０６０　　　　　 ４Ｇ７０　　　　　４０８０＾ＣＧＡＡＡＧＴＴＴ　ＴＣＡＧＧＡＡＡＴＧ　Ａ ＡＴＴＡＧＣＴＡＣＣＡＴＡＴＧＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＴＣＡＡＣＧＴＡＣ ＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＴＣＡＡＴＡＡＡＣＧ　ＣＴＴＴＧＡＴＡＡＡ　Ａ ＡＡＧＣＧＧＴＴＧ　ＡＡＴＴＴＴＴＧＡＡ　ＡＴＡＴＡＴＴＴＴs ＴＣＴＧＣＡＴＴＡＴ　ＧＣＡＡＡＡＧＴＡＡ　ＡＣＴＴＴＧＴＡＡＡ　ＡＣＡ ＴＣＡＧＣＣＡ　ＴＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＧＣＡＣＴＣＡＣf ＴＡＴＴＴＴＣＡＡＣＧＡＡＴＣＣＧＴＡＴ　ＴＴＴＡＧＡＴＧＣＧ　ＡＣＧＡ ＴＴＴＴＣＣＴＴＧＴＡＣＣＧＡＧ　ＡＣＡＴＴＴＡＧＣＡＪて・丞 ５殴−ｉ７ θう・だ ｃ！−１９ 」汐、〃 ３う、２／ 麹、々 澱、２４ ．ｙクジ。ｊ 諏、２６ ＬＶＩＩＩ Ｊ役、Ｊ ル・２９ ↓　ＢｏｍＨＩ 硫、３１ ↓ＢｏｒｎＨＩ＋ＢｃｌＩ　　　　　　↓Ｂ０、Ｈ工↓　　　１．９−にｂｐ　 ＢｏｍＨＩ／Ｂｃｌ工↓　　　３ｊ　Ｋｂｐ　Ｂｏｒｎ　ＨＩ↓ｍｐ１１３中へ クローン化 手続ネ甫正書（方式） ％式％ 事件の表示　　ＰＣ’Ｉ’／ＵＳ８８１０４１１、発明の名称　　綿の再生及び 形質転換 性　所　東京都中央区日本橋３丁目１３番１１号補正命令通知の日付　　平成２ 年４月３日補正の対象 特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記工程よりなることを特徴とする綿植物の体細胞からの再生方法： ａ）綿外植片を与える工程； ｂ）その外植片を第一のカルス生育培地中において未分化カルスが外植片から発 達するのに十分な時間培養する工程； ｃ）そのカルスを第二のカルス生育培地に移す工程；ｄ）そのカルスを第二のカ ルス生育培地において胚発生カルスを発達させるのに十分な時間培養する工程； ｅ）胚発生カルスを植物発芽培地中に移す工程；及び ｆ）胚発生カルスを植物発芽培地上で胚発生カルスから苗を発達させるのに十分 な時間培養する工程。 ２綿の実生が ａ）第一の殺菌溶液中で種子を殺菌し；ｂ）種子を無菌水中で濯ぎ； ｃ）種子を第二の殺菌溶液中で殺菌し；ｆ）種子からの第二の殺菌媒体を無菌水 と共に再使用し； ｇ）種子を種子発芽培地中に移し；及びｈ）種子を種子発芽培地中において暗所 で実生を産生するのに十分な時間生育し；及び ｉ）外植片を実生から切出す、 ことにより発達される請求項１に記載の方法。 ３．第一の殺菌溶液が約９５容量％のエタノールを含有する水溶液であり、及び 第二の殺菌溶液が約１５重量％の次亜塩素酸ナトリウムを含有する水溶液である 請求項２に記載の方法。 ４．外植片が胚軸、子葉及びその混合物、及び未熟接合子胚よりなる群から選ば れる請求項１に記載の方法。 ５．外植片が胚軸、子葉及びその混合物よりなる群がら選ばれる請求項２に記載 の方法。 ６．外植片が胚軸、子葉及びその混合物よりなる群がら選ばれる請求項３に記載 の方法。 ７．種子発芽培地が基礎寒天培地であり、及び外植片除去前の生育が約４週間ま でである請求項２に記載の方法。 ８．胚発生カルスが外植片から約２５乃至約３５℃の温度における約１６時間の 光及び約８時間の闇の明−暗サイクルにおける生育により発達させられる請求項 １に記載の方法。 ９．光の時間の間の光強度が約２０００乃至約４０００ルクスである請求項８に 記載の方法。 １０．光の時間の間の光強度が約３０００乃至約４０００ルクスである請求項８ に記載の方法。 １１．カルスがフェノール分泌時にグルコースを含有する第一のカルス生育培地 中で生育され、培地が少なくとも１０日毎に変えられる請求項１に記載の方法。 １２．外植片が約３乃至約４週間で新鮮な第一のカルス生育培地に移される請求 項１１に記載の方法。 １３．第一のカルス生育培地がグルコースを含んでなるムラシゲ及びスクーグ（ Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ）培地である請求項１に記載の方法。 １４．第二のカルス生育培地がスクロース及び約１乃至約１０ｍｇ／ｌのナフタ レン酢酸を含んでなるムラシゲ及びスクーグ培地である請求項１に記載の方法。 １５．第二のカルス生育培地がスクロース及び約１乃至約１０ｍｇ／ｌのナフタ レン酢酸を含んでなるムラシゲ及びスクーグ培地である請求項１３に記載の方法 。 １６．培地中の植物発芽が窒素源に富んだビーズレー及びティン（Ｂｅａｓｌｅ ｙ　ａｎｄ　Ｔｉｎｇ）の培地である請求項１に記載の方法。 １７．培地中における植物発芽の工程が窒素源に富んだビーズレー及びティンの 培地である請求項１５に記載の方法。 １８．更に苗を、苗が最終成熟のために温室或いは畑への移植を可能にする迄成 熟するのに十分な時間高湿度の条件下において土壌に移植する工程を含む請求項 １に記載の方法。 １９．下記工程を含んでなることを特徴とする綿植物の体細胞からの再生方法： ａ）綿実生及び未熟胚から胚軸、子葉及びその混合物よりなる群から選ばれた綿 外植片を与える工程；ｂ）その外植片をチアミン塩酸塩、ナフタレン酢酸、及び キネチン及びイノシトールを補給された完全或いは半−強度のムラシゲ及びスク ーグ生育培地である第一のカルス生育培地において、約２５乃至約３５℃の温度 において、約２０００乃至約４０００ルクスの光強度での約１６時間の光及び約 ８時間の闇の日光サイクル下において、未分化カルスが外植片から形成するのに 十分な時間培養する工程； ｃ）カルスを第一のカルス生育培地からスクロース及び約１乃至約１０ｍｇ／ｌ のナフタレン酢酸を含んでなる完全或いは半−強度のムラシゲ及びスクーグ生育 培地である第二のカルス生育培地に移し、及びカルスを約２５乃至約３５℃の温 度において約２０００乃至約４０００ルクスの光強度での約１６時間の光及び約 ８時間の闇の日光サイクル下において黄色乃至白色胚発生カルスが形成されるの に十分な時間培養する工程；ｄ）更に胚発生カルスを二次培養させて体細胞胚を 含有するカルスまで発達させる工程； ｅ）体細胞胚を窒素源に富んだ胚発芽培地に移し、及び胚を土壌に移植するのに 十分発達した苗まで生育させる工程。 ２０．第一のカルス生育培地が約０．４ｍｇ／ｌのチアミン塩酸塩、約３０ｇ／ ｌのスクロース、約２ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸、約１ｍｇ／ｌのキネチン及び 約１００ｍｇ／ｌのイノシトールを含有するムラシゲ及びスクーグ生育培地であ る請求項１９に記載の方法。 ２１．第二のカルス生育培地が約１乃至約５ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸及び約０ 乃至約１ｍｇ／ｌのサイトキニンを含有する請求項１９に記載の方法。 ２２．第二のカルス生育培地が約１乃至約５ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸及び約０ 乃至約１ｍｇ／ｌのサイトキニンを含有する請求項２０に記載の方法。 ２３．胚発芽培地が約５００ｍｇ／ｌまでのカゼイン加水分解物及び約１２００ ｍｇ／ｌまでの硝酸アンモニウムを含有するビーズレー及びティンの培地である 請求項１９に記載の方法。 ２４．胚発芽培地をアンモニウム源を含有する請求項２４に記載の方法。 ２５．胚発芽培地が約５００ｍｇ／ｌまでのカゼイン加水分解物及び約１２００ ｍｇ／ｌまでの硝酸アンモニウムを含有するビーズレー及びティンの培地である 請求項２２に記載の方法。 ２６．カルスからのフェノール分泌期間に際して第一のカルス生育培地がフェノ ール分泌が停止するまで約１０日以内に取変えられ、その後スクロースがカルス 生育培地に含まれる請求項１９に記載の方法。 ２７．カルスからのフェノール分泌期間に際して第一のカルス生育培地がフェノ ール分泌が停止するまで約１０日以内に取変えられ、その後スクロースがカルス 生育培地に含まれる請求項２５に記載の方法。 ２８．下記工程を含んでなることを特徴とする綿植物の体細胞からの再生方法： ａ）少なくとも１個の綿の種子を９５容量％のエタノールを含有する溶液中にお いて約２乃至３分間殺菌する工程； ｂ）種子を無菌水中で濯ぐ工程； ｃ）種子を約１５重量％の次亜塩素酸ナトリウムを含有する次亜塩素酸ナトリウ ム溶液中に約１５乃至約２０分間浸漬する工程； ｄ）種子を無菌水中で濯ぐ工程； ｅ）種子をホワイツ（Ｗｈｉｔｅｓ）の修正基礎寒天培地或いは半強度ムラシゲ 及びスクーグ培地において暗環境において約１４日間まで発芽させて実生を産生 する工程；ｆ）実生からの胚軸、子葉或いはその混合物からセグメントを切出す 工程； ｇ）切出されたセグメントを約０．４ｍｇ／ｌのチアミン塩酸塩、約３０ｇ／ｌ のグルコース、約２ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸、約１ｍｇ／ｌのキネチン及び約 １００ｍｇ／ｌのイノシトールで補給されたムラシゲースクーグ培地上で３０℃ の環境内において１６時間の光及び約８時間の闇の光の時間の間約３０００乃至 ４０００ルクスの光強度である明暗サイクル下において約３〜４週間の期間培養 してカルスを発生する工程； ｈ）カルスをスクロース及び約ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸及び約１ｍｇ／ｌのサ イトキニンを含んでなるムラシゲ及びスクーグ培地に移す工程； ｉ）カルスを約３乃至４ケ月間培養して胚を発生する工程； ｊ）胚を約５００ｍｇ／ｌのカゼイン加水分解物及び窒素源を含んでなるビーズ レー及びティンの培地に移し、及び胚を約２乃至約３週間培養して苗を産生させ る工程；及び ｋ）苗を土壌に移植して苗を植物からの高温度内においてインキュベートする工 程。 ２９．下記工程を含む請求項２８に記載の方法：ａ）植物を種子を産生するよう に自己受粉する工程；及び ｂ）種子を発芽させて実生を産生する工程。 ３０．下記工程を含んでなることを特徴とする綿植物の体細胞からの再生方法： ａ）綿植物をカルス生育培地上で組織培養により胚発生カルスを発達させるのに 十分な時間培養する工程；ｂ）胚発生カルスを第二カルス生育培地中に細別及び 浮遊させ及び該カルスを生育させて少なくとも６００ミクロンの大きさの胚発生 塊を形成する工程；ｃ）６００ミクロンより大きい大きさの胚発生塊をろ別する 工程； ｄ）６００ミクロンより大きい径の胚発生塊を植物発芽培地において、塊から苗 を発達させるのに十分な時間生育させる工程。 ３１．６００ミクロン未満の大きさの塊を新鮮な第二のカルス生育培地に再浮遊 させて更に胚発生塊を生育させる請求項３０に記載の方法。 ３２．外植片が ａ）第一殺菌溶液中で種子を殺菌し； ｂ）種子を無菌水で濯ぎ； ｃ）種子を第二殺菌溶液中で殺菌し； ｄ）種子を第二殺菌培地を無菌水で濯ぎ；ｅ）殺菌種子を種子発芽培地に移し； 及びｆ）種子を種子発芽培地内で暗所において綿実生を形成するのに十分な時間 培養し；及び ｇ）外植片を綿実生から切出す、 ことにより得られる請求項３０に記載の方法。 ３３．外植片が ａ）第一殺菌溶液中で種子を殺菌し； ｂ）種子を無菌水で濯ぎ； ｃ）種子を第二殺菌溶液中で殺菌し； ｄ）種子を第二殺菌溶液中で殺菌し； ｅ）殺菌種子を種子発芽培地に移し；及びｆ）種子を種子発芽培地内で暗所にお いて綿実生を形成するのに十分な時間培養し；及び ｇ）外植片を綿実生から切出す、 ことにより得られる請求項３１に記載の方法。 ３４．第一殺菌溶液が約９５容量％のエタノールを含有する水溶液であり、及び 第二殺菌溶液が約１５重量％の塩素酸タトリウムを含有する水溶液である請求項 ３３に記載の方法。 ３５．外植片が少なくとも一部の胚軸、子葉及びその混合物から選ばれる実生部 分を含む請求項３４に記載の方法。 ３６．種子発芽培地が基礎寒天培地であり及び外植片除去前の生育が約１４日間 までの期間である請求項３５に記載の方法。 ３７．約８００ミクロンより大きい塊が植物生育のための浮遊液から除去される 請求項３０に記載の方法。 ３８．生育開始時の浮遊培養液が８ｍｌの第二胚発育培地当り７５０乃至約１０ ００ｍｇのカルス部分を含有する請求項３０に記載の方法。 ３９．生育開始時の浮遊培養液が８ｍｌの第二胚発育培地当り７５０乃至約１０ ００ｍｇのカルス部分を含有する請求項３１に記載の方法。 ４０．胚発生カルスが約２５乃至約３５℃の温度において、約１６時間の光及び 約８時間の闇の明−暗サイクルにおいて浮遊液中で生育される請求項３０に記載 の方法。 ４１．胚発生カルスが約２５乃至約３５℃の温度において、約１６時間の光及び 約８時間の闇の明−暗サイクルにおいて浮遊液中で生育される請求項３１に記載 の方法。 ４２．光の時間の間の光強度が約２０００乃至約４０００ルクスである請求項４ ０に記載の方法。 ４３．光の時間の間の光強度が約２０００乃至約４０００ルクスである請求項４ １に記載の方法。 ４４．第二のカルス生育培地がナフタレン酢酸を含有するムラシゲ及びスクーグ 培地である請求項３０に記載の方法。 ４５．第二のカルス生育培地がナフタレン酢酸を含有するムラシゲ及びスクーグ 培地である請求項３１に記載の方法。 ４６．培地中の植物発芽の工程が窒素源に富んだビーズレー及びティンの培地で ある請求項３０に記載の方法。 ４７．培地中の植物発芽の工程が、カゼイン加水分解物及びアンモニウム源を含 んでなるビーズレー及びティンの培地である請求項３０に記載の方法。 ４８．更に下記工程を含む請求項３０に記載の方法：ａ）苗を温室次いで最終的 成熟までの生育のために畑に移植することを可能にするまで成熟するのに十分な 時間高湿度の条件下に土壌に移植する工程。 ４９．下記工程を含んでなることを特徴とする綿植物の体細胞からの再生方法： ａ）綿実生及び未熟胚から得られた胚軸、子葉及びその混合物よりなる群から選 ばれた外植片を与える工程；ｂ）その外植片をチアミン塩酸塩、グルコース、ナ フタレン酢酸、キネチン及びイノシトールを補給されたムラシゲ及びスクーグ培 地である第一のカルス生育培地内において、約２５乃至約３５℃の温度において 約２０００乃至約４０００ルクスの光強度における約１６時間の光及び約８時間 の闇の日光サイクル下で、未分化カルスが外植片から形成するのに十分な時間培 養する工程；ｃ）第一カルス生育培地からのカルスをスクロース及び約１乃至約 １０ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸を含有するムラシゲ及びスクーグ培地である第二 のカルス生育培地に移し、及びカルスを約２５乃至３５℃の温度において、約２ ０００乃至約４０００ルクスの光強度における約１６時間の光及び約８時間の闇 の日光サイクル下に胚発生カルスを発達させるのに十分な時間培養する工程；ｄ ）胚発生カルスの部分を、８ｍｌの第二胚生育培地当り約７５０乃至約１００ｍ ｇのカルス部分の濃度で新鮮な第二カルス生育培地に浮遊させて胚を約８００ミ クロンより大きい径の胚発生塊を発達させるのに十分な時間生育させる工程； ｅ）約８００ミクロンより大きい胚発生塊を約８００ミクロン未満の塊から分離 する工程； ｆ）８００ミクロンより大きい径の胚発生塊を窒素源に富んだ発芽培地に移し、 及び胚を苗まで生育させる工程。 ５０．８００ミクロン未満の胚発生塊が工程ｄ）と同様に新鮮な第二のカルス生 育培地に再浮遊され、及び工程ｅ）及びｆ）が繰返される請求項４９に記載の方 法。 ５１．第一カルス生育培地が約０．４ｍｇ／ｌのチアミン塩酸塩、約３０ｇ／ｌ のグルコース、約２ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸、約１ｍｇ／ｌのキネチン及び約 １００ｍｇ／ｌのイノシトールを含有するムラシゲ及びスクーグ生育培地である 請求項４９に記載の方法。 ５２．第二胚生育培地が、スクロース及び１乃至約５ｍｇ／ｌナフタレン酢酸及 び０乃至約１ｍｇ／ｌのサイトキニンを含んでなる請求項４９に記載の方法。 ５３．第二胚生育培地が、１乃至約５ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸及び０乃至約１ ｍｇ／ｌのサイトキニンを含んでなる請求項５０に記載の方法。 ５４．第二胚生育培地が１乃至約５ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸及び０乃至約１ｍ ｇ／ｌのサイトキニンを含んでなる請求項５１に記載の方法。 ５５．胚発芽培地が約５００ｍｇ／ｌまでのカゼイン加水分解物を含有するビー ズレー及びティンの培地である請求項４９に記載の方法。 ５６．胚発芽培地が約５００ｍｇ／ｌまでのカゼイン加水分解物を含有するビー ズレー及びティンの培地である請求項５０に記載の方法。 ５７．胚発芽培地が約５００ｍｇ／ｌまでのカゼイン加水分解物を含有するビー ズレー及びティンの培地である請求項５５に記載の方法。 ５８．下記工程を含んでなることを特徴とする綿の形質転換方法： ａ）綿外植片を綿に外来性の発現性遺伝子暗号を含有するアグロバクテリウムベ クターとその遺伝子を外植片の細胞に転移するのに十分な時間接触させる工程； ｂ）その外植片をカルス生育培地中において約２５乃至約３５℃の温度において １６時間の光及び８時間の闇のサイクル下において約１５乃至約２００時間イン キュベートする工程； ｃ）インキユベートされた外植片をアグロバクテリウムに毒性である抗生物質を 含有するカルス生育培地とアグロバクテリウムを殺すのに十分な時間接触させる 工程； ｄ）アグロバクテリウムのない外植片をカルス生育培地中で培養する工程；及び ｅ）形質転換カルスを未形質転換カルスから選別する工程。 ５９．補給カルス生育培地が約１乃至約１０ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸を補給さ れたムラシゲ及びスクーグ培地である請求項５８に記載の方法。 ６０．アグロバクテリウムに毒性の抗生物質がセフォタキシムである請求項５８ に記載の方法。 ６１．下記工程を含んでなることを特徴とする綿の形質転換方法： ａ）胚軸、子葉及びその混合物から選ばれた綿実生外植片のセグメントを抗生物 質に対する耐性を含む遺伝子暗号を含有するアグロバクテリウムベクターと約１ 分間乃至約２４時間接触させる工程； ｂ）この外植片を約１乃至約１０ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸で補給されたムラシ ゲ及びスクーグ培地であるカルス生育培地に約２５乃至約３５℃の温度において 約１６時間の光及び　８時間の闇のサイクル下に約１５乃至約２００時間の間移 して外植片からカルスを発達させる工程； ｃ）カルスをセフォタキシムを、アグロバクテリウムを殺してしまうのに十分な 濃度で含有する新鮮なカルス生育培地に移す工程； ｄ）カルスを新鮮な第一のカルス生育培地上で培養する工程；及び ｅ）更に残存アグロバクテリウムを殺してしまうセフォタキシム及び形質転換カ ルスが未感受性である抗生物質を含有する新鮮なカルス生育培地と接触させてそ の抗生物質に耐性のカルスを選択する工程。 ６２．形質転換カルスがセフォタキシムを含有するカルス生育培地と接触する前 にセフォタキシムのないカルス生育培地中で濯がれる請求項６１に記載の方法。 ６３．抗生物質がカナマイシンである請求項６１に記載の方法。 ６４．抗生物質がカナマイシンである請求項６２に記載の方法。 ６５．カルス生育培地中で浮遊培養を行う綿細胞からの形質転換胚発生カルスの 製造方法であって、浮遊二次培養生育サイクル後に下記工程を含んでなることを 特徴とする方法： ａ）カルス生育培地から細胞及び如何なる形成された胚発生カルスを回収する工 程； ｂ）回収細胞及びカルスを綿に外来性の発現性遺伝子配列を含むアグロバクテリ ウムベクターを含有するカルス生育培地中に綿細胞を形質転換するのに十分な時 間浮遊生育条件を維持しながら再浮遊させる工程；ｃ）浮遊細胞及びカルスをア グロバクテリウムを含有するカルス生育培地から回収する工程；ｄ）形質転換細 胞及びカルスをアグロバクテリウムに毒性である抗生物質で処理してアグロバク テリウムを殺してしまう工程； ｅ）未形質転換細胞及び胚発生カルス細胞から形質転換細胞及びカルスを選別す る工程；及びｆ）細胞の浮遊液をろ過して約６００ミクロンより大きい胚発生カ ルスを除去する工程。 ６６．形質転換細胞及びカルスが浮遊液のろ過前に抗生物質で処理される請求項 ６５に記載の方法。 ６７．形質転換細胞及びカルスが浮遊液のろ過前に選別される請求項６５に記載 の方法。 ６８．形質転換細胞及びカルスが浮遊液のろ過前に選別される請求項６６に記載 の方法。 ６９．形質転換細胞及び胚発生カルスが浮遊液のろ過後に抗生物質で別々に処理 される請求項６５に記載の方法。 ７０．形質転換細胞及び胚発生カルスが浮遊液のろ過後に選別される請求項６５ に記載の方法。 ７１．形質転換細胞及び胚発生カルスが浮遊液のろ過後に選別される請求項６９ に記載の方法。 ７２．アグロバクテリウムに毒性の抗生物質がセフォタキシムである請求項６５ に記載の方法。 ７３．アグロバクテリウムに毒性の抗生物質がセフォタキシムである請求項６６ に記載の方法。 ７４．アグロバクテリウムに毒性の抗生物質がセフォタキシムである請求項６９ に記載の方法。 ７５．カルス生育培地中で浮遊培養を行う綿細胞から胚発生カルスを製造する方 法であって、約７乃至約１４日間の浮遊二次培養生育サイクル後に下記工程を含 んでなることを特徴とする方法： ａ）細胞をカルス生育培地から回収する工程；ｂ）細胞を綿に外来性の発現性遺 伝子配列を含むアグロバクテリウムベクターを含有するカルス生育培地中に浮遊 細胞を形質転換するのに十分な時間浮遊生育条件を維持しながら再浮遊させる工 程； ｃ）アグロバクテリウムを含有するカルス生育培地から細胞を回収する工程； ｄ）更にアグロバクテリウムのない新鮮なカルス生育培地中で細胞を二次培養す る工程； ｅ）浮遊液をろ過して約６００ミクロンより大きい胚発生カルスを除去する工程 ； ｆ）残存細胞をアグロバクテリウムに毒性である抗生物質を含有するカルス生育 培地中に再浮遊させる工程；ｇ）胚発生カルスをアグロバクテリウムに対して毒 性の抗生物質で処理する工程；及び ｈ）形質転換細胞及び胚発生カルスを未形質転換細胞及び胚発生カルスから選別 する工程。 ７６．抗生物質がカナマイシンである請求項７５に記載の方法。 ７７．カルス生育培地中で浮遊培養を行う綿細胞から胚発生カルスを製造する方 法であって、約７乃至１４日間の浮遊二次培養生育サイクル後に下記工程を含ん でなることを特徴とする方法： ａ）細胞をカルス生育培地から回収する工程；ｂ）細胞を抗生物質耐性遺伝子配 列を含むアグロバクテリウムベクターを含有するカルス生育培地中に浮遊細胞を 形質転換するのに十分な時間浮遊生育条件を維持しながら再浮遊させる工程； ｃ）アグロバクテリウムを含有するカルス生育培地から細胞を回収する工程； ｄ）アグロバクテリウムのない新鮮なカルス生育培地中で細胞を洗浄する工程； ｅ）更にアグロバクテリウムのない新鮮なカルス生育培地中で細胞を二次培養す る工程； ｆ）浮遊液をろ過して約６００ミクロンより大きい胚発生カルスを除去する工程 ； ｇ）残存細胞をセフォタキシムを含有するカルス生育培地中に再浮遊させる工程 ；及び ｈ）浮遊残存細胞及び除去胚発生カルスを形質転換細胞が非感受性である抗生物 質と接触させて形質転換細胞を選択する工程。 ７８．抗生物質がカナマイシンである請求項７７に記載の方法。 ７９．通常線植物細胞生育に抑制的な抗生物質に対して耐性を有するように形質 転換された綿植物。 ８０．バーティシリウム立枯れ病に対して増大した耐性を示す綿植物再生体。 ８１．少なくともより大きい繊維長、引張強度、低級ミクロンエアー上の弾性の 改良された繊維品質特性を親品種に対比して示す綿再生体。 ８２．殺菌剤耐性を示す綿再生体。 ８３．親品種に対比して増大した収量を示す綿再生体。 ８４．真菌病原体に対して増大した耐性を示す綿再生体。 ８５．綿中における発現が可能で且つ抗生物質カナマイシン及びＧ４１８に耐性 を与えることのできるキメラ遺伝子を側面に有する植物ゲノムとの一体化が可能 なＡ．ツュメファシエンス（Ａ．Ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）からの二本のＴ−Ｄ ＮＡ右境界配列を含んでなる綿植物に抗生物質耐性を与えるためのベクター。 ８６．キメラ遺伝子が配列中にナポリンシンセターゼプロモーター、Ｔｎ５から のネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩコード化領域及び単純ヘルペスウ イルスチミジンキナーゼ遺伝子からのターミネーターを含んでなる請求項８５に 記載のベクター。