PT89034B - Metodo para a regeneracao e transformacao de plantas de algodao - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 89 034

PHYTOGEN,norte-americana, com sede em 101 Waverly Drive, Pasadena, Califórnia 91105, Estados Unidos da América.

MÉTODO PARA A REGENERAÇÃO E TRANSFORMA ÇÃO DE PLANTAS DE ALGODÃO .

Thirumale Srinivasa Rangan,David Maurice An derson, Kanniah Rajasekaran, John William Grula, Richard Lorne Hudspeth e Richard Lee Yenofsky.

Reivindicação do direito dc prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de feris de 20 de Março de 1883. Estados Unidos da América, em 18 de No vembro de 1987, sob o n⁵. 122,200.

INP1. MOO. 113 R F 10732

PHYTOGEN

ΝΕΤΟΡΟ PAPA A REGENERAÇÃO E TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS DB ALGODÃO

ENQUADRAMENTO GERAI DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à regeneração de plan tas de algodão e à transformação de plantas de algodão, parti, cularmente do algodoeiro da espécie Gossypium hirsutum L..

Nos anos recentes, muitos tecidos de origem diversa de plantas pertencentes a grupos taxonómicos diferentes foram estabelecidos como cultura de tecidos in_vitro. Foram também determinados alguns dos factores que controlam o crescimento e a diferenciação dessas culturas. 0 estabelecimento de intera£ çães subtis entre os diferentes grupos de hormonas vegetais e de reguladores do desenvolvimento de plantas que operam ou directamente ou indirectamente, sozinhas ou em combinação sinérgica, permitiu colher um certo grau de conhecimentos sobre algumas inter-relacionaçães que podem existir entre células, tecidos e órgãos. A informação, no entanto, não é de qualquer forma completa.

Sabe-se, desde há muito tempo, que as culturas de células de plantas se podem manter indefinidamente no estado proliferativo de não diferenciação. No entanto, só recentemente se descobriu que se pode induzir experimentalmente a rediferenciação de tecidos, órgãos ou organismos completos

das plantas. A partir das demonstrações experimentais descri tas por Skoog e colab., em Chemical Regulation of Growth and Organ Formation in Plant Tissu.es Cultured in_vitro, ¹¹ Symp.

Soc♦ Exp. Biol?, 11 : 18 - 130, 1958, que se incorpora na pre sente memória descritiva como referência, sabe-se que a proporção relativa de uma citoquinina para uma auxina determina a natureza da organogénese no tecido da medula do tabaco. A reorganização ou a regeneração de culturas de calo incluem a formação de primórdios de ramos ou embriões, ambos os quais, finalmente, originam o desenvolvimento de plântulas in_vitro.

A tendência para a organogénese em comparação com a embriogénese depende da espécie envolvida e da presença de certos factores de disparo que são de natureza química e/ou física.

Em 1902, Haberlandt, em Kulturversuche mit isolier ten Pflanzenzellen, ¹¹ Fat. Kl. Kais, Akad. Wiss. Viena¹¹, 111: 62, incorporada na presente memória descritiva como referência, postulou que as células das plantas possuiam capacidade para produzir em plantas completas e previu que isso seria um dia futuramente demonstrável em culturas de células. Em 1965, tra balhando independentemente, Reinert, Untersuchungen uber die morphogenese an Gewebekulturen, ¹¹ Ber. dt. Bot. GesV, 71 : 15 e Steward e col., Growth and organized developir.ent of cultured cells/ll, Organization in cultures grown frorc freely suspended cell, ¹¹ Am. J. Bot., 45 : 705 - 708, confirmaram a ocorrência de embriogénese somática in_vitro. Ambas as referências são incorporadas na presente memória descritiva para servirem como referência. Na embriogénese somática de manipulação experimental, acredita-se que dois componentes do meio de cultura, uma auxina e a fonte de azoto, desempenhem papéis cruciais.

Verificou-se também que o processo de embriogénese somática se realiza em duas fases: em primeiro lugar, a indu ção das células com competência embriogénica na presença de uma elevada concentração de auxina; e, em segundo lugar, o desenvolvimento de massas de células embriónicas transformando-se em embriões na ausência de ou com uma pequena concentração de auxina.

A indução da organogénese ou da embriogénese origina modelos estruturais distintos nos calos. 0 estudo pormenorizado de diversas espécies vegetais permitiu que se pudessem fazer certas generalizações sobre os caminhos de desenvolvimento que originam o desenvolvimento do rebento, do botão ou do embrião.

A aplicação das técnicas de cultura de tecidos à re. generação de plantas por meio de organogénese ou de embriogénese constitui talvez a contribuição mais importante dos estudos básicos em morfogéneso para a aplicação comercial.

Beasley referiu a formação de calo em cultura de óvulos de algodoeiro, em 1971, In vitro culture of fertili zed cotton ovules, Bioscience¹¹, 21 : 905 - 907, 1971, que se incorpora na presente memória descritiva como referência. Posteriormente, Hsu e coiab., Callus induction by (2-chlorethyl )-phosphonic (CPA) acid in cultured cotton ovules,Physiol. Plant, 36 : 150 - 153, 1975, que se incorpora na presente memória descritiva como referência, observaram uma estimulação do crescimento de calos obtidos a partir de óvulos

devido à adição de CPA e de ácido giberélico ao meio. As cul_ tunas de calo de outros explantes tais coiro a) folhas, Davis e colab., In vitro culture of callus tissues and cell suspensions from okra (Hibiscus_esculentus) and cotton (Gossypium hirsutum¹¹ In Vitro, 9 : 395 - 398, 1974, que se incorporam ambas na presente memória descritiva como referência; b) hipocótilo, Schenk e colab., 'Tedium and technique for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures, ¹¹ Can. J. Bot. , 50: 199 - 204, 1972, que se incor pora na presente memória descritiva como referência; e c) cotilédones, Rani e colab., Establishment of Tissue Cultures of Cotton, Plant Sei. Lett, 7: 163 - 169, 1976, que se incorpora na presente memória descritiva como referência, foram estabelecidos para Gossypium hirsutum e Gossypium_ arboreum.

Katterman e colab., The Influence of a Strong Reducing Agent upon Initiation of Callus from the Germinating Seedlings of Go ssypii^_barbadense , Physiol·. Plant, 40 : 98- 101, 1977, que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência, observaram que 0 calo compacto a partir de cotilédones de G. barbadense formava raízes, e num caso obteve-se a regeneração de uma planta completa. Smith e colab., Defined conditions for the iniciation and growth of cotton callus in vitro, Gossipium arboreum, In vitro¹¹, : 329 - 334, 1977, que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência, definiram as condições para a iniciação e a subcultura de calo derivado do hipocótilo de G. arboreum.Subsequentemente, Price e colab., Callus cultures of six species of cotton (Gossypium_l) on defined media,

PI Sei. Lett., 8 : 115 - 119, 1977 e Tissue culture of Gossypium especies and its potential in cotton geneties and crop improvement, Beltwide Cotton Production Research Conference Proc., páginas 51 - 55, 1977 do National Cotton Coun cil, Memphis, Estados Unidos da América, que se incorporam na presente memória descritiva a título de referência, definiram as condições para a iniciação e a subcultura de calo de cinco espécies de Goss^oium.

Um dos problemas comuns que se constata ao estabele_ cer culturas de muitas espécies vegetais é a formação de cor castanha browning do explante no meio da cultura. No algodoeiro, esta lixiviação de polifenóis foi evitada substituindo sacarose por glucose e transferindo as culturas para um meio fresco de dez em dez dias. Depois de três ou quatro passagens por meio suplementado com glucose, a cor castanha desapareceu completamente e as culturas puderam ser transferidas novamente para um meio suplementado com sacarose. Tuito embora as dificuldades com a indução, o acastanhamento e a conservação de calos durante as subculturas tivessem sido resolvidas com cer tas espécies de Go^yoium, todas as tentativas para regenerar plantas a partir de culturas de calo ou não obtiveram êxito ou envolviam diversas operações demoradas. Davidonis e Hamilton, Plant Regeneration from Callus Tissue of Gossypium hirsutum, L. Plant Sei. Lett7,32 : 89 -93,1983, que se incorpora na presente memória descritiva como referência, referiram a eventual formação de embriões dois anos depois de se iniciar a cultura.

Muito embora muitas substâncias do crescimento, tais como fito-hormonas naturais e compostos sintéticos de regula-βção do crescimento tenham sido utilizadas em rreios de cultura de tecidos cara provocar a regeneração de plantas in vitro, não se atingiu qualquer generalização e muito menos a especificidade de efeitos das diferentes substâncias sobre a regeneração das plantas. Na verdade, as mesmas substâncias, quando aplicadas a diferentes espécies vegetais, podem ou inibir o crescimento, ou incrementar o crescimento, ou não ter qualquer efeito. Portanto, além de certas maneiras de proceder pa dronizadas, mantém-se necessariamente uma tarefa difícil de resolver no estabelecimento do protocolo de trabalho para a regeneração de plantas para qualquer nova espécie e constitui um trabalho muitíssimo mais difícil ainda realizar a transfor mação das plantas.

A presente invenção refere-se a um método para a re. generação rápida das plantas de algodão a partir de segmentos cortados de plântulas. 0 método descrito oferece um elevado grau de capacidade de repetição e de fiabilidade e permite a transformação genética de plantas de algodão.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, proporcionam-se métodos para a regeneração, com transformação opcional, de uma planta de algodão a partir de células somáticas.

A semente é esterilizada e desenvolvida na escuridão para se obter uma plântula. A plântula é uma fon^e de um ex plante, usualmente o hipocétilo e o cotilédone. Outra fonte é constituída por embriões zigéticos imaturos de frutos em desenvolvimento. 0 explante é subdividido e cultivado num primeiro meio de desenvolvimento de cal'o (contendo glucose) durante um intervalo de tempo para permitir que se desenvolva um calo a partir do explante num meio de cultura que compete com as secreções fenólicas e estimula as células do explante a dividirem-se e a proliferarem. 0 calo, depois de passar através da fase de secreção fenélica, é transferido para um meio de desenvolvimento de calo fresco (contendo sacarose) que desenvolve o calo até um calo embriogénico. 0 embrião po. de então ser subcultivado para produzir mais calos erbriogénicos ou transferido para outro meio de desenvolvimento (meio de germinação da planta) e cultivado durante um intervalo de tempo suficiente para desenvolver uma plântula que, depois de um outro período de crescimento, é transferida para uma estu fa e depois para o campo e desenvolvida até à obtenção de uma planta adulta de que se podem colher as sementes.

Os embriões podem também ser cultivados em suspensão. De acordo com esta maneira de proceder, depois do perío. do de desenvolvimento, o embrião que contém massas embriogénicas maiores do que cerca de 600 micra, preferivelmente maio, res do que cerca de 800 micra de tamanho, é isolado e utiliza do para a produção de plantas. Os calos mais pequ^enos são reciclados para o meio de desenvolvimento do calo para crescimento até à obtenção de um calo que forme plantas ou se mantenha como fonte de embriões.

A transformação pode realizar-se no explante, no calo ou na fase do desenvolvimento em suspensão. A transformação envolve a exposição do explante, do calo e/ou do calo embriogénico à acçâo de um vector de Agrobaeterium que contém

-ϋ-

urra sequência genética expressível estranha ao algodoeiro durante ur intervalo de tempo suficiente para que o gene se transfira para as cálulas. 0 Agrohacteriurr residual á então rrorto com antibiótico que á tóxico para o Agrobacterium. Es ta operação é seguida pela selecção das cálulas transformadas e/ou do calo embriogánico para desenvolvimento em plântulas transformadas. Na cultura err suspensão, a transformação e/ou a selecção podem realizar-se antes ou a seguir à separação do calo embriogánico das cálulas e do calo demasiadamente imaturo para ser embriogánico.

Obtêm-se plantas com traços fenotípicos únicos e proporcionam-se novas plantas de algodão que têm resistência a antibióticos que normalmente inibem o desenvolvimento das cálulas das plantas; plantas de algodão que têm uma maior resistência ou tolerância a herbicidas, a fungos patogánicos e plantas de algodão que possuem um melhor rendimento e uma melhor qualidade de fibra.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 representa diagramaticamente maneiras de proceder preferidas para o desenvolvimento de plantas de algo_ dão a partir de semente, por técnicas de cultura de tecidos em que se mostram, as zonas de estabelecimento de transformação .

A Figura 2 á uma representação fotográfica de calo embriogánico (10) de planta de algodão com embriões somáticos (12) em várias fases de desenvolvimento, incluindo folha (14)

e raiz (16).

A Figura 3 é uma ilustração fotográfica de um embrião de planta de algodão somático numa fase globular adian tada isolada para formar a cultura de calo embriogánico como se representa na Figura 2.

A Figura 4, tal como em referência à Figura 2, é uma representação fotográfica de ambriões e de plântulas de tenra idade (18 ) de uma planta de algodão que se desenvolve num meio de germinação de embriões.

A Figura 5 é uma vista fotográfica de pequenas massas de células embriogénicas obtidas a partir de culturas em suspensão de plantas de algodão.

A Figura 6 é uma representação fotográfica de um embrião em fase globular de uma cultura em suspensão.

A Figura 7 representa embriões em germinação obtidos a partir de culturas em suspensão que mostram folhas emer gentes (14) e raízes (16).

A Figura 8 ilustra o desenvolvimento de plântulas de algodoeiro em desenvolvimento num meio de germinação de em briões.

As Figuras 9 a 15 mostram a transformação genética de algodão, em que a Figura 9 mostra o desenvolvimento de colónias de células (20) a partir de células de algodoeiro trans formadas contendo um gene para conferir resistência à canamicina.

A Figura 10 representa embriões somáticos que se d£ senvolvem a partir de células com resistência a antibióticos escolhidos da Figura 9 num meio suplementado com antibiótico.

/ em germinação de

A Figura 11 representa embriõe·.; em germinação de embriões somáticos transformados que contêm um gene que confere resistência ao herbicida glifosato.

A Figura 12 mostra plântulas de algodoeiro desenvol vidas a partir de embriões da Figura 11.

A Figura 13 mostra embriões somáticos em germinação, transformados para conferir resistência a insectos Lepidópteros, com a folha (14) e a raiz (16) em desenvolvimento.

A Figura 14 mostra plântulas desenvolvidas a partir dos embriões da Figura 13.

A Figura 15 representa uma plântula da variedade Siokra desenvolvida a partir de embriões transformados que po£ suem resistência à canamicina.

A Figura 16 mostra a construção de mp 19/bt, um plasmídeo que contém a extremidade 5' do gene da protoxina

Bt.

A Figura 17 mostra a construção de mp 19/bt ca/del, um plasmídeo que contém o promotor CaFV gene VI fundido com a extremidade 5’ da sequência que codifica a protoxina Bt.

A Figura 18 mostra a construção de p7O2/bt, um pias mídeo que tem a região de codificação 3’ da protoxina fundida com os sinais de terminação da transcrição CaTfV.

A Figura 19 mostra a construção de pBB322/bt 14, contendo a sequência que codifica a protoxina completa flanqueada pelas sequências do promotor CaNV e do terminador.

A Figura 20 mostra a construção de pRK252/Tn9O3/ /3glII.

A Figura 21 mostra a construção de PCIB 5.

bad

A Figura 22 e a Figura 23 'representar a construção de pCIB 4.

A Figura 24 mostra a construção de pCIB 2.

A Figura 25 mostra a construção de pCIB 10, um pias, mídeo de uma larga gama de hospedeiros que contém os bordos de T-DNA e o gene para a selecção das plantas.

A Figura 26 mostra a construção de pCIB10/l9Sbt.

A Figura 27 mostra a construção de pCIB 710.

A Figura 28 mostra a construção de pCIB10/710.

A Figura 29 mostra a construção de pCIB10/35Sbt.

A Figura 30 mostra a construção de pCIB10/35Sbt(Kpnl).

A Figura 31 mostra a construção de pCIB10/35Sbt(Bell).

A Figura 32 mostra a construção de pCIB10/35Sbt(607).

A Figura 33 representa o vector DEI PEP10.

A Figura 34 é uma fotografia que mostra um ensaio de campo feito com algodoeiro regenerado plantado num campo infes. tado com Verticillium.

A Figura 35 é uma fotografia que mostra a progénie de uma planta SJ4 regenerada num ensaio de campo representado na Figura 33· Uma variante somoclonal com tolerância melhorara em relação ao fungo Verticillium é indicada peia seta.

P^SCRI5Ã0_P0RrTN0EIZADA

A presente invenção refere-se à regeneração por cul. tura de tecidos de plantas de algodão, particularmente de plan tas do género Gossypium hirsutum, a partir de células somáticas para propagação no campo. Opcionalmente, as células podem

ser transformadas de maneira a incluírem informação genética estranha.

Os vários meios de desenvolvimento utilizados de acordo com a presente invenção são os seguintes:

lTZ£_PP_PPPPPi^zPí^,yíI'™P_Z’ApA_A_GERriNA_-çÃo_pB_sBrDÇTES

Composição da Solução Concentrada de Armazenagem de White T.'odifiçada (Phytomorphology 11 : 109 - 127, 1951, incorporada na presente memória descritiva como referência)

Componente	Concentração por	Comentários
1000	nilitros
rgso4. 7 h2o	3,6	g	Dissolve-se e dilui-se até
Na2S04	2,0	g	se perfazer o volume final de
NaH2P04.H20	1,65	g	1000 mililitros. Rotula-se Con- centrado de White A.Usam-se 100 ml/litro de meio final

Ca(N03)2.4 H20	o £ J >	eú	Dissolve-se e dilui-se até se
Trr-Tf'	SCO	mg	perfazer o volume final de 1000
-rfp Ί	650	mg	ml.Rotula-se Concentrado de Whi

B. Usam-se 100 ml/litro de meio fi nal.

Concentração por

Cor oonente

1000 rililitros

Na2UoC4· 2H2O	2,5	rg
CoC12.6H20	2,5	rg
FnS04.H20	300	rg
ZnSO^.7 H20	50	rg
CuS04· 5 H20	2,5	rg
II^BOj	50	rg
Fe EDTA
Orgânico

Corentários

Dissolve-se e diluí-se até se perfazer o volure final de 100 r 1. Po t ul a- s e Concentrado de White C. Usa-se 1,0 rl/litro de reio final.

Usar-se 10 rl/litro de T'SFe EDTA

Usar-se 10 rl/litro de T’S orgânico .

IT^-pS-P^ENVOLVirENTO/rANUTEN^Ã^p^CALO

Çorposição_de_Soluçães_Concentradas_de_ Arrazenager_àe_Uurashige £_Skoog__(rs_) (Physiol. Plant 15 : 473 - 479, 1962, incorporada na nresen te rerória descritiva coro referência)

Corpone.nte	Concentração por 1000 rl de solução concen-
trada de arrazenager	Corentários
nh4uo3	41,25	g	Dissolve-se e dilui-se
KNO3	47,50	g	até perfazer o volure
CaCl2.2 H20	11,00	g	final de 1000 rililitros
J'gS04.7 H20	9,25	g	Usar-se 40 rl/litro de
kh2po4	4,25	g	reio final.

• · · /· · ·

-14Concentração por 100Ό ml de solução concen-

Componente	trada de	armazenagem	Comentários
Kl	83	mg	Dissolve-se e dilui-se
H3BO3	620	mg	até perfazer o volume
I?iS04. H20	1690	mg	de 1000 mililitros. Ro.
ZnSo4.7 H20	860	mg	tula-se MS-Tenor. Usam
Na2Mo04.2 H20	25	mg	-se 10 ml/litro de meio
CuSO4-5 H20	2,5	mg	final
CoC12.6 H20	2,5	mg

Ácido Nicotínico	50	mg	Dissolve-se e dilui-se
Piridoxina HC1	50	mg	até perfazer o volume
Tiamina	10	mg	final de 1000 milili-

tro s. Rotula-se M5-Orgânico. Congela-se em alíquotas de 10 mi. lilitros. Usam-se 10 ml/ /litro de meio final.

Pe SOTA 2,78 g

Fe SO₄. 7H₂0 3,73 g

Na₂EOTA.2 H₂0

Dissolvem-se 2,78 gramas de Fe S0₄.7H₂0 em cerca de 200 mililitros de água de. sionizada. Dissolvem-se 3,73 gramas de Na₂EDTA.2H₂0 (sal dissódico do ácido etileno-diamino-tetracético dihidratado) em 200 mililitros de água desioniza da em outro copo de precipitação . Aquece-se a solução de Na₂EDTA numa placa / -15Componente

Concentração por 1000 ml de solução concentrada de armazenagem Comentários

Tiamina-HCl mg eléctrica durante cerca de 10 minutos. Enquanto se agi. ta constantemente,adiciona-se a solução de FeSO^ à so_ lução de Na2EDTA. Arrefece-se a solução até à temperatura ambiente e dilui-se até perfazer o volume de 1000 mililitros. Rotula-se F5EDTA. Cobre-se o balão com folha e guarda-se num frigorífico. Usam-se 10 ml/ /litro de meio final.

Dissolve-se e dilui-se até perfazer o volume de 500 mililitros. Rotula-se MS-Tiamina. Usam-se 4,0 ml/ /Litro de meio final. Quando for necessário.

Ino s it o 1

Glicina g

0,2 g Dissolve-se e dilui-se até perfazer o volume final de 1000 mililitros. Rotula-se FS-glicina/inositol. Us am-se 10 ml/litro de meio fi nal.

— io-

PLANTAS

Composição das Soluçoes Concentradas de Armazenagem de

Beasley e Ting (Am. J. Bot., 60 : 130 - 139, 1973, incorporada na presente memória descritiva como referência)

Componente	Concentração por
1000 mililitros	Comentários
KHpPO^		2,72	g	Dissolve-se e dilui-se até
h3bo3		61,83	mg	se perfazer o volume de 100 mililitros. Rotula-se Solu-
Na2TfoO4.	2 HgO	2,42	mg	ção Concentrada B&T-A.Usam-se 100 ml/litro de meio fJL nal.
CaClg.2	HgO	4,41	g	Dissolve-se e dilui-se até
KI		8,3	mg	se perfazer o volume de 100 mililitros. Potula-se Solu-
Co Clg.6	HgO	0,24	mg	ção Concentrada B&T-B. Usam— -se 10 ml/litro de meio final.
Mg304. 7	HgO	4,93	g	Dissolve-se e dilui-se até perfazer o volume de 100
MnSO^.Hg	0	159,02	mg	mililitros. Rotula-se Solu-
ZnS04. 7	HgO	85,27	mg	ção Concentrada da B&T-C.
CuS04·5	HgO	0,25	mg	Usam-se 10 ml/litro de meio

f inal.

-1 /Concentração por

Componente 1000 mililitros

KNO₃ 25,275 g

Ácido nicotí- 4,92 mg nico

-Piridoxina HC1 8,22 mg

Tiamina HC1 13,49 mg

Fe EDTA

Inositol nh₄no₃ (15 M

Comentários

Dissolve-se e dilui-se atá perfazer o volume final de

200 ml. Rotula-se Solução

Concentrada B&T-D. Us am-s e ml/litro de meio final.

Dissolve-se e dilui-se atá perfazer o volume final de 100 mililitros. Rotula-se Solução Concentrada B&T-Orgânica. Usam-se 10 ml/litro de meio final.

Usam-se 10 ml/litro de MS Fe EDTA

100 mg/litro de meio final

1200,6 mg/l de meio final.

Com qualquer das soluções acima mencionadas, utiliza-se a seguinte maneira de proceder para preparar 1 litro de meio:

Como uma base, proporcionam-se 200 ml de água desio. nizada e adicionam-se as várias soluções concentradas de arma zenagem nas quantidades indicadas para 1 litro. Por exemplo, se for preciso empregar 10 ml de uma solução concentrada de armazenagem, para a obtenção de um meio final, então adicionam-se 10 ml de solução concentrada de armazenagem aos 200 ml de

água destilada. Para garantir que os 'sais se mantém em solução, as soluções concentradas de armazenagem são normalmente adicionadas pela ordem indicada nas formulações acima referidas. Após mistura cuidadosa,adiciona-se água desionizada adicional à mistura para diluir até aos necessários 500 ml e ajusta-se o pH da mistura até um valor compreendido entre cerca de 5,8 e 6,0. Obtém-se o volume final de 1.000 ml e adiciona-se nor malmente agar para a cultura de tecidos ou o seu equivalente até um nível igual a cerca de 0,8$ em peso. Este destina-se a proporcionar uma certa solidez à solução para reduzir a possibilidade de escorregamento. A mistura é então aquecida em autoclave durante cerca de cinco a vinte minutos, a uma pres. são de 1,05 - 1,47 Kg/cm (15 - 21 psi) para matar quaisquer microrganismos que contaminem e é apropriadamente etiquetada e armazenada num meio esterilizado.

Resumidamente, esterilizam-se sementes de algodão e germinaram-se em meio apropriado para a germinação de sementes tal como um meio de agar, na escuridão, durante um intervalo de tempo suficiente para originar plântulas. 0 perío_ do normal de desenvolvimento vai até cerca de quatro semanas, tipicamente sete a catorze dias.

Das plântulas cortam-se segmentos de explantes. Pre. fere-se que o explante seja proveniente do hipocótilo ou do cotilédone. Como alternativa, oo-em igualmente usar-se embriões imaturos obtidos dos frutos em desenvolvimento de plan tas de algodão desenvolvidas em estufa ou no campo, como explante. Cultivam-se os segmentos de explante num primeiro meio de desenvolvimento de calo, preferivelmente um meio nutritivo

Γ bad ORIGINAL

de Furashige and Skoog (FS) completo, contendo glucose. 0 desenvolvimento realiza-se cultivando a uma temperatura compreen dida entre cerca de 25 e 35° C, num ciclo de luz/escuridão de cerca de dezasseis horas de luz e cerca de oito horas de escu ridão. A cultura é a maneira de proceder por meio da qual o meio é substituído em intervalos de tempo periódicos à medida que os nutrientes são consumidos e continua durante aproximadamente cerca de três a cerca de quatro semanas, ou até se for marem calos não diferenciados. Os calos são transferidos para um segundo meio de desenvolvimento de calos, preferivelmente um meio de FS suplementado com ácido naftaleno-acético (NAA) e com sacarose como fonte de carbono e cultiva-se durante três a quatro meses para produzir embriões.

Os embriões podem então ser mantidos num segundo meio de desenvolvimento de calos para manter uma reserva de embriões, ou transferidos para um meio de germinação de plantas, tal como um meio de Beasley e Ting contendo, preferivelmente,hidrolisado de caseína e fonte de amónio, cultivando-se durante duas a três semanas de maneira a produzir plântulas.

As plântulas são transferidas para terreno sob condições de elevada humidade; em seguida são transplantadas para vasos maiores numa estufa e, finalmente, transferidas para o campo para o crescimento até à maturação.

Os métodos resumidamente descritos foram empregados com êxito para provocar a formação de embriões somáticos em a_l godoeiros da espécie Gossyj)ium_hirsutum por culturas de tecido em suspensão e, finalmente, para obter plantas adultas a partir de culturas de calo derivado de hipocótilo e de cotilédone das variedades Acala de Goss^oium_hi'rsutum, incluindo SJ2,

3J4, SJ5, B1644, 31810, B2724, GC510 e Cl e não Açala picker Siakra e stripper variedade FC 2017. As culturas foram transformadas em plantas normais com novas características ou propriedades.

Fais particularmente, a maneira de proceder envolve primeiramente a esterilização das sementes do algodão. A esterilização apropriada pode realizar-se mergulhando as semen tes em. etanol a 95$ durante dois a três minutos, lavando com água esterilizada uma ou mais vezes, depois embebendo as sementes numa solução a 15$ de hipoclorito de sódio durante quinze a vinte minutos e depois lavando várias vezes com água esterilizada.

As sementes esterilizadas são em seguida transferidas para um primeiro meio, designado meio de germinação de sementes.

Um meio de germinação de sementes é um meio com o teor normal de sal. Um meio apropriado de germinação é um meio à base de agar, incluindo meio de White ou meio de FS de semi-concen tração (metade da concentração dos ingredientes). A germinação ocorre normalmente às escuras, durante um período de cerca de doze até cerca de catorze dias.

hipocótilo e/ou os cotilédones são preferivelmente cortados da semente germinada, subdivididos ou cortados °m segmentos e cultivados num primeiro meio de desenvolvimento do ca lotai como um meio de FS suplementado com substâncias de desenvolvimento. 0 meio presentemente preferido é o meio de 1*3 suplementado com cerca de 0,4 mg/litro de cloridrato de tiamir.a, cerca de 30 g/litro de glucose, cerca de 2 mg/litro de ácido

-21naftaleno-acético, cerca de 1 mg/litro de quinetina, um regulador do crescimento comum e cerca de 100 mg/litro de ino. sitol e agar. A concentração do cloridrato de tiamina pode geralmente variar desde cerca de 0,1 até cerca de 0,5 mg/litro; a de glucose, de cerca de 20 até cerca de 30 g/litro; a do ácido naftaleno-acético, desde cerca de 1 até cerca de 10 mg/litro; a da quinetina desde cerca de 1 até cerca de 2 mg/ /litro e a do inositol desde cerca de 50 até cerca de 100 mg/litro.

As culturas são mantidas a uma temperatura de cerca de 25 até cerca de 35° C, preferivelmente igual a cerca de 30° C e com um ciclo de luz/escuridão de cerca de dezasseis horas de luz e cerca de oito horas de escuridão. Prefere-se ter uma densidade luminosa desde cerca de 2 000 até 4 000 lux, mais preferivelmente cerca de 3 000 até 4 000 lux.

Os calos formados são periodicamente subcultivados com intervalos de três a quatro semanas e transferidos para um meio de desenvolvimento de calos fresco. Na cultura dos explantes, podem ocorrer secreções dos compostos fenélicos dos explantes como é evidenciado pelo escurecimento do meio de cultura. Neste caso, o meio é trocado mais regularmente. Evitou-se o escurecimento trocando o meio de cultura de dez em dez dias. Normalmente, depois de três a cinco mudanças do meio, as secreções fenólicas desaparecem. Quando isso acontece, o primeiro meio de desenvolvimento do calo pode ser substituído por meio de desenvolvimento do calo fresco contendo sacarose ou suplementado com sacarose como fonte de carbono.

Depois de três a quatro semanas de cultura, desenvol

22ver-se calos activos nas superfícies'de corte dos explantes.

Os calos são então transferidos para ur segundo reio de iranu tenção do desenvolvirento do calo fresco que é, preferivelren te, ur ireio de NS coirbinado cor cerca de 1 até cerca de 10 mg/litro, preferivelrente cerca de 1 até cerca de 5 mg/litro de NAA. Erprega-se citoquinina cor ura concentração corpreen dida entre 0 e cerca de 1 g/litro. Ur reio de desenvolvirento do calo é caracterizado coro ur reio de elevado teor de sal contendo tanto coro dez vezes irais sal do que o reio de gerrinação das serentes. A diferença essencial entre o prireiro e o segundo reios de desenvolvirento de calo é a fonte de car bono. A glucose é usada durante o período de secreções fenéli cas. A sacarose é utilizada quando estas secreções tenhar parado. A parte restante do reio de desenvolvirento de calo pode ser igual ou modificada.

Os calos são transferidos er intervalos de terpo regulares para ur reio de desenvolvirento de calo fresco, depois de geralrente cerca de cinco até sete passagens ou até se ter tornado evidente ura pigrentação de antocianina nura parte dos calos, que é seguida pelo desenvolvirento de ur calo erbriogé nico branco-ararelado.

calo erbriogénico é então subcultivado selectivarente e rantido por subcultura regular. 0 calo erbriogénico contér erbriões soráticos er várias fases de desenvolvirento. Alguns poder ter atingido o ponto de desenvolvirento que perrite o desenvolvirento cor forração de pequenas plântulas. A raior parte, no entanto necessita de posterior desenvolviren to. Alguns poder ser avançados para a gerrinação. Outros po-23-

der ser rantidcs coro reserva de erbriões para utilização fu tura.

Cor referência à Figura 2, nela ilustra-se esta fa se de desenvolvirento, rostrando calos de algodão Acala (10) cor. erbriões soráticos (12) de diferentes taranhos cor. alguras folhas erergentes (14) e raízes (16). A Figura 3 ilustra ur erbrião sorático isolado nura fase globular posterior.

Cor referência à Figura 4, pode conseguir-se ur po£ terior desenvolvirento transferindo os erbriões soráticos para ur terceiro reio de desenvolvirento, designado na presente re réria descritiva coro reio de gerrinação de erbriões, ur reio rico er azoto, geralrente sob a forra de ar.oníaco ou ur seu equivalente. Os reios apropriados incluer reio de Beasley e Ting, preferivelmente suplerentado cor até cerca de 500 mg/li tro de hidrolisado de caseína.

A gerrinação ocorre a partir dos erbriões soráticos e, dentro de duas a três seranas, está geralrente forrada ura plântula ber desenvolvida (l8) cor até seis folhas e ur bor sistera radicular.

Nesta fase as plântulas são transferidas para o solo er pequenos tufos e desenvolvidas nura incubadora norral, sob condições de elevada huridaôe. A ter.peratura é norralrente rantida a cerca de 25 até 30° C (ver a Figura 7 ).

Depois de ur período de desenvolvirento, as pequenas plantas são transferidas para vasos raiores colocados nura es tufa e er. seguida transferidas para o carpo e desenvolvidas até à raturação. Todas as plantas regeneradas são preferivelrente autopolinisadas quer enquanto se desenvolver na estufa

24ou nas condições do campo e as sementes são recolhidas. Germinam-se então as sementes e transferem-se as plântulas com a idade de quatro a cinco semanas para o campo para ensaios de progénie em filas e outras maneiras de proceder de cultura de plantas normais. A prática da maneira de proceder acima descrita produz plantas de algodão viáveis a partir de cer ca de 35% dos explantes durante um intervalo de tempo de' cerca de seis até cerca de oito meses.

Proliferação de Células de plantas de Algodão_Embriogénicas em Culturas em Suspensão

Como alteinativa para permitir que os calos embriogénicos em desenvolvimento se desenvolvam até à obtenção de uma planta, o calo pode ser cortado em peças mais pequenas e posteriormente desenvolvido por técnicas de cultura em suspensão.

De acordo com esta maneira de proceder, a concentra ção da suspensão está norm.almente compreendida entre cerca de 750 e 1.000 mg de partes de calo por 8 ml de meio de desenvol vimento de calo, tal como o segundo meio de desenvolvimento de calo (meio de T^rS suplementado com NAA) e deixa-se crescer em suspensão. Numa forma de realização preferida, a suspensão do calo é inserida em tubos em T e colocada num tambor de rolos que roda a cerca de 1,5 rotações por minuto, sob regime de iluminação de cerca de dezasseis horas de luz e cerca de oito horas de escuridão. 0 desenvolvimento realiza-se durante cerca de três a quatro semanas.

Depois de cerca de cada três a quatro semanas, a suspensão é filtrada para retirar grandes tufos de células de calo embriogénico visíveis em grupos na Figura 5 e como se isolaram nas últimas fases globulares, como se mostra na Figura 6. 0 filtrado é devolvido para o meio nutritivo duran te um período de desenvolvimento de três a quatro semanas. Re. pete-se este procedimento várias vezes com a colheita de tufos grandes, com intervalos de cerca de três a quatro semanas, momento em que o meio é suplementado totalmente ou em parte com meio de desenvolvimento de calo fresco. Preferivelmente, adicionam-se cerca de 4 volumes ou mais de meio fresco a cer ca de 1 volume da suspensão residual. Presentemente, prefere -se que o filtro empregado tenha um tamanho de malhas maior do que cerca de 600 micra, preferivelmente maior do que 800 micra, visto que se observou que as massas de células com um tamanho de partículas menor que 600 micra não se desenvol vem com a obtenção de plantas, enquanto massas de células com dimensões maiores do que 600 micra e preferivelmente maiores do que 800 micra sofreram uma diferenciação suficiente de mo. do a tornaram-se embriogénicas e capazes de se transformarem em plantas viáveis.

As culturas da suspensão podem também ser iniciadas transferindo calos embriogénicos para um balão, tal como um balão de Delong ou de Erlenmeyer, contendo o meio líquido de desenvolvimento de embriões em uma quantidade igual a cerca de 20 ml de FS e NAA a uma concentração de 2,0 mg/litro.

balão é colocado num agitador giratorio e é sacudido a cer ca de 100 - 110 ciclos por minuto. Depois de três a quatro

-25semanas, a suspensão é apropriada para filtração como se des, creveu antes para remover os tufos grandes de células para o desenvolvimento das plantas.

Mais tipicamente, depois da terceira ou da quarta subcultura, a suspensão de células do tubo em T ou do balão de De Long ou de Erlenmeyer é placada em meio de MS solidifi. cado com agar, contendo NAA (2,0 mg/litro) ou meio de Beasley Sc Ting contendo hidrolisado de caseína (500 mg/litro) e uma fonte de azoto. Dentro de três a quatro semanas, tornam-se visíveis calos embriogénicos com embriões em desenvolvimento. Igualmente, as massas maiores de células, quando placadas no meio acima referido, originam massas embriogénicas com embriões que se desenvolvem.

Em ambos os métodos de desenvolvimento em suspensão, o meio de MS é utilizado para promover e/ou sustentar os embriões, enquanto o meio de germinação é empregado para o desenvolvimento rápido das plantas.

Os explantes das plântulas, caso assim se pretenda, podem ser transformados. Nesta maneira de proceder, podem usar -se segmentos de cotilédones e/ou de hipocotilo da semente e£ terilizada. Preferem-se os cotilédones.

Os segmentos são colocados num meio que contém um vector de Amrobacterium contendo um codigo (marcador genético ) tal como resistência a um antibiótico como, por exemplo, canamicina, durante um intervalo de tempo suficiente para o vector transferir o gene para as células dos explantes. Geralmente, podem usar-se tempos de contacto que vão desde 1 minuto até vinte e quatro horas e podem ser acompanhados com

-2'

\ agitação intermitente ou suave. Os explantes são então retirados e colocados er meio de desenvolvimento de calo solidificado com agar, tal como meio de TS suplementado com NAA (2 mg/litro) e incubados durante cerca de quinze a duzentas horas, a 25 até 35° C, preferivelmente 30° C, num regime de dezasseis: oito horas de luz: escuridão.

Depois da incubação, os explantes são transferidos para o mesmo meio suplementado com o antibiótico cefotaxima, preferivelmente numa concentração igual a 200 mg/litro. A ce_ fotaxima é incluída para evitar que quaisquer exemplares de A££2l?acterium_ restantes proliferem e cresçam sobre os tecidos das plantas. Como alternativa, os explantes podem ser la vados com meio de ?<S suplementado com NAA (2 mg/litro) e incubados durante mais quatro a vinte e oito dias antes de serem lavados e, em seguida, incuba-se o mesmo meio contendo cefotaxima. Ao fim de quatro a cinco semanas de cultura em meio fresco, o calo de desenvolvimento, isto é, o calo prima rio, é separado da parte restante do tecido primário do explante e transferido para meio de NS contendo NAA (2 mg/litro). cefotaxima (200 mg/litro ) e um antibiótico tal como sulfato de canamicina (50 mg/litro). Escolhe-se o calo primário trans formado, identificado em virtude da sua capacidade para se de. senvolver na presença do antibiótico (canamicina) e os embriões são desenvolvidos, germinados e obtêm-se plantas seguindo a maneira de proceder acima descrita.

E também, possível realizar a transformação de uma suspensão de células. A seguir a um ciclo de desenvolvimento de subcultura normal de sete a catorze dias, geralmente sete a dez dias, as células são feitas assentar, deixando um sobrenadante que é removido. As células suspensas concentradas restantes podem ser centrifugadas a 4000 g durante cinco minutos e o meio em. excesso é rejeitado. As culturas em suspensão concentrada são suspensas de novo em 8 ml do mesmo meio que con tém o Agrobacterium. A suspensão é transferida para tubos em T e apropriadamente agitada para incubação.

Ao fim de cerca de duas a vinte e quatro horas, pre. ferivelmente ao fim de três a cinco horas de incubação, para permitir a ligação das bactérias e a transferência de DNA, a suspensão é retirada e deixada sedimentar. O líquido sobrena dante contendo as bactérias é rejeitado e as células são lavadas com meio fresco. A suspensão pode, caso assim, se pretenda, ser centrifugada durante cerca de cinco minutos e o lí quido sobrenadante removido. Em qualquer hipótese, as células são ressuspensas no mesmo meio e transferidas para um tubo em T ou para um balão e a subcultura da suspensão é retomada. 0 objectivo consiste em minimizar a quantidade de vector de Agrobacterium não ligado deixado na suspensão de células.

Apos cerca de quinze até cerca de duzentas horas, tipicamente ao fim de quinze a cerca de setenta e duas horas, preferivelmente ao fim de dezoito a vinte horas, a suspensão é filtrada para separar as massas de grandes dimensões e lavada com meio líquido fresco e deixada sedimentar. A suspensão é de novo suspensa num meio líquido fresco contendo cefo. taxima (200 mg/litro) e placada num meio solidificado em pia cas de Petri.

Como alternativa, a suspensão pode ser suspensa de

novo eir reio fresco contendo cefotaxira e ^eixada desenvolver durante rais quatro a vinte e oito dias antes de ser placada eir reio solidificado er placas de Petri. A concentração de células é igual a 1 volure de células er suspensão rais 3 vo_ lures de reio cor cefotaxira. A canaricina a níveis de 10 até 300 rg/l, pref erivelre.nte cor cerca de 20 a 200 rg/litro e, rais preferivelrente, cerca de 40 a 80 rg/litro, é incluída no reio para selecçao de células transforradas que expressar o gene de fosfotransferase de neoricina (NPT). As células e os erbriões que proliferar na concentração selectiva de canaricina são posteriorrente desenvolvidos coro se referiu antes, até aradurecerer erbriões soráticos capazes de gerrinarer e de se regenerarer cor obtenção de plantas corpletas, de acordo cor as raneiras de proceder descritas na presente rerória descritiva.

Utilizando a raneira de proceder acira referida e cor referência à Figura 9, nela rostrar-se colónias variáveis de células que são a consequência da transforração. Aí, exister células de algodoeiro (20) que exiber resistência ao anti_ biótico canaricina. Cor referência à Figura 10, nesta representar-se calos transforrados que se desenvolver er erbriões soráticos nur reio de T'3 contendo antibiótico. A Figura 11 rostra erbriões soráticos transforrados estabelecidos de raneira a terer resistência à canaricina e transforrados de raneira a terer resistência ao herbicida glifosato. A Figura 12 rostra plantas provenientes dos erbriões da ^pigura 11. A Figu ra 13 rostra células transforradas de rodo a terer resistência a insectos lepidopteros que se desenvolver nur reio de T’3

e na Figura 14 é transferido para um meio de Beasley e Ting, enquanto a Figura 15 mostra o posterior desenvolvimento das plântulas da Figura 14 com obtenção de plântulas mais maduras.

REGENERAÇÃO DF ALGODOEIROS

Exemplo 1 ^ÊS££}®£ação_de_PIantas_a_Part ir_de_Exolantes_de_Cotilédones

Esterilizaram-se sementes de variante SJ2 de algodoeiro Acala de Gossypium hirsutum por contacto com álcool a 95$ durante três minutos; lavaram-se em seguida duas vezes com água esterilizada e mergulharam-se numa solução a 15$ de hipoclorito de sódio durante quinze minutos e depois lavaram -se com água esterilizada. Germinaram-se as sementes esterilizadas num meio de agar de base, na escuridão, durante apro. ximadamente catorze dias, até se obter uma plântula a partir da semente. Os cotilédones das plântulas foram cortados em 2 segmentos de 2 - 4 mm , que foram transferidos em condiçoes assépticas para um meio que provoca a formação de calo, consistindo em meio de Turashige e Skoog (!'S) de grande e oeque_ na concentração de sais, suplementado com 0,4 mg/litro de clo_ ridrato de tiamina, 30 g/l de glucose, 2,0 mg/litro de ácido naftaleno-acético (NAA), 1 mg/litro de quinetina, 100 mg/litro de m-inositol e agar (0,8$). Incubaram-se as culturas a cerca de 30° C, sob condições ^_1e dezasseis horas de luz e oito horas de escuridão, num incubador de Fercival com luz fluores31cente (luz de dia fria), proporcionando uma intensidade lumã nosa de cerca de 20C0 - 4000 luz.

Fcrmaram-se calos nos segmentos de tecido cultivados ao fim de três a quatro semanas e tinham cor cinzenta a cinzenta esverdeada. Os calos formados foram subcultivados cada três a quatro semanas num meio de desenvolvimento de ca lo compreendendo meio de T'S contendo 100 mg/l itro de m-inosi. tol, 20 g/litro de sacarose, 2 mg/l de ácido naftaleno-acéti. co (NAA) e agar. Formaram-se erbriões somáticos ao fim de qua tro a seis meses depois da primeira colocação dos explantes de tecido em um meio de indução de calo. Fantiveram-se os ca los e os embriões num meio de desenvolvimento de calo subcul tivando em meio de desenvolvimento de calo fresco cada três a quatro semanas.

Os embriões somáticos que se formaram nas peças de tecido foram transplantados ou para meio de desenvolvimento de calo fresco ou para meio de Beasley e Ting (meio para a germinação de embriões).

As plântulas somáticas que se formaram a partir de embriões somáticos foram transferidas para meio de Beasley e Ting, que continha 1200 mg/l de nitrato de amónio e 500 mg/l_i tro hidrolisado de caseína como uma fonte de azoto orgânico. Bolidificou-se o meio por acçâo de um agente de solidificação (Oelrite) e colocaram-se as plântulas em caixas •’θ Tagenta.

Desenvolveram-se os embriões somáticos ^e modo a obterem-se olântulas dentro de cerca de três meses. Fnraiza'am-se as olântul com o o ·* c ca oito folhas :om cerca 7, a 1Ω centímetros (3 a 4 polegadas) de altura e foram transfe

-doridas para o terreno e mantidas numa -incubadora sob elevada humidade durante três a quatro semanas e, em seguida, trans feridas para uma estua. Após e.ndurecintento, as plantas foram também transferidas para solo cavado ao ar livre.

Exemplo 2

Repetiu-se a maneira de proceder que se descreveu no Exemplo 1, mas usando meio de MS de semi-concentração em que as concentrações de todos os componentes do meio foram reduzidas para metade da concentração especificada. Obtiveram -se essencialmente os mesmos resultados.

Exemplo 3

Repetiram-se as maneiras de proceder que se descre. veram nos Exemplos 1 e 2, com excepção de o explante ter sido obtido a partir de segrentos de hipocótilo. Obtiveram-se os mesmos resultados.

Exemplo 4

Repetiram-se as maneiras de proceder dos Exemplos 1 e 2, com a diferença do explante ser constituído por embrião zigótico. Obtiveram-se essencialmente os mesmos resultados.

Exemplo 5

Repetiram-se as raneiras de proceder que se descre;bad original veram nos Exemplos 1 e 2, com as variedades de a¹ modoeiro Acala SJ4, SJ5, 5J27-1, G7510, 31544,32724,31310,a variedade Siokra e a variedade 372017. Todos foram regenerados com êx_i to.

Exemplo 5

3epetiu-se a maneira de proceder que se descreveu no Exemplo 1 até se obter calo capaz de formar embriões somá ticos. Suspenderam-se peças com cerca de 757 - 1000 mg de ca lo embriogénico activamente em desenvolvimento em unidades contendo 8 ml de meio de cultura em suspensão em líquido cons tituido por Γ3 com elevada e pequena concentração de sais, su plementado com 0,4 mg/litro de cloridrato de tiamina, 20 g/l de sacarose, 100 mg/litro de inositol e ácido naftaleno-acético (2 mg/litro ) em tubos em T e colocaram-se num tambor ro tativo rodando a 1,5 rotações por minuto, sob um regime de 15/8 horas de luz/escuridão. Utilizou-se de novo uma intensif dade luminosa de cerca de 2000 - 4500 lux, proporcionada por lâmpadas fluorescentes (luz do dia fria).

Decorridas quatro semanas, filtrou-se a suspensão através de malha de nylon com um tamanho de 840 micra para se. parar as massas de células maiores. Deixaram-se assentar as fracções com menos de 840 micra, lavaram-se uma vez com cerca de 20 - 25 ml de meio de cultura em suspensão fresco. Esta suspensão foi transferida para tubos em T (2 ml por tubo) e diluíu-se cada tubo com 6 ml de meio de cultura de suspensão fresco. Uantiveram-se as culturas repetindo a maneira de pro-34-

ceder acima descrita em intervalos de IP - 12 dias. Nomeadamente, filtrou-se a suspensão e só se transferiu a fracção contendo agregados de células menores do que 840 micra para o meio de cultura em suspensão fresco. Er todos os casos, a fracção que con+ém massas de células maiores do que 840 micra foi colocada em meio de desenvolvimento de calo para se obterem embriões somáticos maduros.

Os embriões somáticos que se formaram em meio de desenvolvimento de calo foram separados e transferidos para um meio de germinação de embriões e germinaram-se usando o protocolo descrito no Eixemplo 1, desenvolveram-se com a formação de plântulas e, em seguida, obtiveram-se plantas desen volvidas no campo.

Exemplo 7

Pepetiu-se a maneira de proceder do Exemplo 5, com a excepção de se terem formado culturas em suspensão transfe. rindo 750 - 1000 miligramas de calos embriogénicos para um balão de De Long contendo 15 - 20 ml do meio líquido de TS contendo 2 mg/litro de NAA. 0 balão contendo a cultura foi colocado num agitador rotativo e agitado a 100 - 110 ciclos/ /minuto. Depois de três semanas, filtrou-se a suspensão através de uma rede de nylon de 840 micra para separar as massas de grandes dimensões de células para crescimento de plantas, como no Exemplo 4. Deixou-se assentar a suspensão com menos de 840 micra, lavou-se uma vez com meio líquido de MS e ressuspendeu-ss em 2 a 5 πΊ do meio líquido de MS. A suspensão

-JOfoi subcultivada por transferência para meio fresco num balão de De Long contendo 1 - 2 ml de suspensão e 15 ml de meio líquido ie F3. Fantêm-se as culturas repetindo esta maneira de proceder em intervalos de sete a dez dias. Em cada subcultura apenas se subcultivou a suspensão com menos de 840 micra e usaram-se as massas de grandes dimensões (840 micra ou maio_ res) para o desenvolvimento de plantas.

Exemplo 8

Depois de três ou quatro subculturas usando a manei, ra de proceder de desenvolvimento de suspensão descrita nos Exemplos 6 e 7, placaram-se respectivamente 1,5 a 2,0 ml de suspensão de células do tubo em T e do balão de De Long em meio de FS solidificado com agar contendo 2 mg/litro de NAA e de meio de Beassley e Ting contendo 500 mg/litro de hidrolisado de caseína. Dentro de três a quatro semanas, tornaram-se visíveis calos embriogénicos com embriões em desenvolvimento. Igualmente, placaram-se as massas de células com 84C micra ou maiores num meio de desenvolvimento de calo originando massas embriogénicas com embriões em desenvolvimento que, por fim, se transformaram em plantas.

THA?í3FORFA7Ã^ri ATGODOEIH?

Som pio 9

Transformação para Eormar Eenotipo Tumoroso com

Agrobacteria LBA 4434

Subcultivou-se uma cultura de suspensão de algo^oei

-JO-

ro durante três ou quatro mese-s, em tubos em T, com o meio (meio de Tb, contendo 2 mg/litro de NAA) mudado cada se te a dez dias. Depois de cada mudança do meio, as células são deixadas sedimentar e colhidas para transforração. Separou-se o líquido sobrenadante por pipetagem e as células foram trans. formadas com a estirpe LBA 4434 de Agrobacterium. A estirpe LBA 4434 de Agrobacterium é descrita por A. Hoekema e colab., em Nature, 303 : 179 -180, 1983, que se incorpora na presen te memória descritiva a título de referência, e contém um sis. tema de transformação de plantas binário derivado do plasmídeo Ti. Nestes sistemas binários, um plasmídeo contém o T-DNA de um plasmídeo Ti e o segundo plasmídeo contém a região vir do plasmídeo Ti. Os dois plasmídios cooperam para efectuar a trans formação das plantas. Na estirpe LBA 4434, o plasmídeo T-DNA, pAL1050 contém de pTiAch5, um plasmídeo Ti octopínico e o plasmídeo vir na estirpe LBA 4434, pAL4404, contém as regiões da virulência intacta de pTiAch5 (Ooms, G. e colab., Plasmid, 7 : 15 - 29, 1982, que se incorpora na presente memória descri tiva a título de referência). A estirpe LBA 4434 é fornecida pelo Dr. Robert Schilperoort do Departamento de Bioquímica da Universidade de Leiden, Holanda.

A estirpe de Agrobacterium quⁿ origina a transforma ção foi retirada de um concentrado em glicerol, inoculada numa pequena cultura durante a noite, de que se inocularam 50 ml de cultura no ^ia semuinte. Os microrganismos Agrobacterium fo. ram desenvolvidos em mei^ de YEB, contendo por litro em água ajustada a pH 7,2 com NaOH, 5 gramas de extracto de carne de vaca, 1 grama de extracto de levedura, 5 gramas de peptona e

gramas de sacarose. Depois de se esterilizar em autoclave, adiciona-se 1 ml de T'gCl-, 2 rolar, depois do que se adicionar os -.:/ ibiít ices ca·?·siri.' s para ratar as outras estirpes. De. terri.nou-se a absorvância a SCO nm na cultura realizada duran te a noite dos 50 ml, centrifugou-se a cultura e o pelete for mado é ressuspenso num meio de desenvolvimento de células das plantas (meio T’3 + NAA a 2 mg/litro ) até se obter uma absorvância final a 600 nm igual a 0,5.

Adicionou-se um volume de 8 ml desta suspensão de bactérias de Agrobacterium I-3A 4434 a cada tubo em T que con tinha as células das plantas em suspensão, depois de se sepa rar o líquido sobrenadante. Agitou-se o tubo em T contendo as células da planta e as bactérias para suspender de novo as c£ lulas e voltou a colocar-se no tambor rotativo durante três horas para permitir que as bactérias de θΖϊϋίί ^se ligassem às células da planta. Deixaram-se depois assentar as células e separou-se o líquido sobrenadante residual.

Adicionou-se uma parte aliquota fresca do meio de desenvolvimento ao tubo em T e deixou-se incubar a suspensão num tambor rotativo durante dezoito a vinte horas na presença de quaisquer Agrobactéria residuais que se mantiveram. Depois deste tempo, deixou-se de novo sedimentar as células, separou-se o líquido sobrenadante e lavaram-se as células duas vezes com uma solução de meio de desenvolvimento contendo cefotaxima (200 yUg/ml). Após lavagem, as células de cada tubo em T foram novamente suspensas em 10 ml de meio de desenvolvimento contendo cefotaxima (200 ^LLg/ml em -todos os casos) e placaram-se amostras de 1 ml de suspensão em placas de Petri.

bad original $

As células infectadas desenvolverar-se nur reio de crescirento a que não se adicionarar fifo-horronas estabelecendo o tecido que tinha recebido os genes da fito-^orrona do tipo selvager er T-DNA. As células desenvolverar turores, indicando a transforração das culturas.

Exerplo 10

Transforração de Algodoeiros para Forrar ur Fenotipo não Turcoroso Resistente à Canaricina

Transforrou-se a cultura er suspensão tal coro foi obtida no Exerplo 9, usando Agrobactéria que continhar o T-DNA contendo vector binário pCTBlO (S. J. Rothstein e calb., Gene 53 : 153 - 161, 1987, que se incorpora na presente reré ria descritiva a título de referência), assir coro o plasrídeo vir pAL4404. 0 T-DNA de pCIBlO contér ur gene quirérico corposto pelo prorotor da nopalina-sintase, a região de cod_i ficação para Tn5 que codifica o enzira neoricina-fosfotransferase, e o terrinador para a nopalina-sintase. Desenvolverar -se os Agro bactéria que conter pCIBlO er reio de YE3 contendo

do da resra raneira que se descreveu no Exerplo 10, cor a excepção de se terer placado arostras cor 1 rl resultantes de células e de Asçrobacteria ire d iat ar ente er reio selectivo

transforradas perrite realizar a escolha deste tecido na pre-39a quatro seranas de tecido transforrado tornou-se evidente nas placas de selecção. C tecido não infectado assir coro o tecido de controlo adicionado não apresentarar sinais de desenvolvirento, tornarar-se castanhos e rorrerar. 0 tecido trans forrado desenvolveu-se ruito ber na presença tanto da canaricina coro

G418

Neste rorento, subcultivarar-se as peças de tecido que se desenvolveram convenienterente er reio de selecção fres_ co. Cs erbriões soráticos forrarar-se nestas peças de tecido e forar explantados para reios de desenvolvirento não select_i vos frescos. Quando os erbriões começaram a diferenciar-se e a gerrinar, isto é, no rorento er que coreçarar a forrar raízes e tinham duas ou três folhas, foram, transferidos para cai_ xas de Fagenta contendo o meio de desenvolvimento descrito no Exemplo 1. Eeixou-se prosseguir o desenvolvimento até se obter uma plântula com seis a oito folhas, momento em que foi retira da do meio de agar.

As plântulas foram agora colocadas em solo contido em vasos, cobertas com um copo de precipitação para manter a humidade e colocadas num incubador de Percival durante quatro a oito seranas. Neste rorento, retirou-se a planta do copo de precipitação e transferiu-se para ura estufa. As plantas desenvolve rar-se na estufa, floriram e formaram sementes.

Exemolo 11

3eguiu-se a -aneira 1- proceder que s:

³veu no

Exemplo 10, com a diferença de os Amrobacteria transformantes

-403ut i: ; mados conterem o T-DNA vector DEI PEP10, assim coro o plasmideo vir pA144O4. C DEI PEP10, representado na Figura 33, utiliza duas sequências do rebordo da direita clivadas com T-ENA Pstl de A. Tumefaciens (estirpe Ç-pS), que foi posterior mente subdividido com 3am.HI para integração no genoma de plan ta, um gene de passagem fosfoenolpiruvato-carboxilase de milho (gene Pepcase ) e um gene quimérico (NCS/ΝΡΤ/ΤΚ) capaz de expressão em plantas e que confere resistência aos antibióticos canamicina e G4l8. Este gene quimérico u^ili^a um promotor de nopalina-sintetase, a região de codificação de neomicina«fosfotransferase II de Tn5 e o terminador do gene de timidina-quinase do vírus de herpes simplex. A seguir à transformação, obtiveram-se calos embriogénicos e embriões por selecção em. canamicina (50 mg/litro). Não se obteve calo resistente do con trolo (calo não transformado) placado em canamicina a este nível (50 mg/litro ).

Exemplo 12

Transformação de Células de Cultura em Suspensão de

Algodoeiro num Fenotioo Tolerante a Olifosato

Seguiu-se a maneira de proceder que se ^escreveu no Exemplo 10, com a excepção de os Agrobacteria transformantes usados continham o vec^xor de T-ONA _d ^dT'G85/?87 (J. Fillatti e coiab., Tol. Oen. Oenet., 206 : 192 - 199, 1987, que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência), assim como o plasmideo pAL4404 vir .

,'BAD ORIGINAL $ — 4±— plasmideo P?MG85/587 possui três genes quiméricos capazes de expressão em plantas. Dois genes codificam para

r.eomicina-fosfotransferase (NPT) que confere resistência aos antibióticos canamicina e G418. 0 terceiro gene quimérico, que contém a sequência de codificação de um gene mutante aro A de 3. typhimurium, confere tolerância ao herbicida glifosato (Cornai e colab., Science 221 : 370 - 371, 1983, que se incorpora na presente memória descritiva a titula de referência). Desenvolveram-se os Agrobactéria contendo PPMG85/587 em meio que contém canamicina (100 yíLg/ml). A transformação realiza-se como se descreveu pormenorizadamente no Exemplo 10 com a excepção de se permitir que a suspensão s3 desenvolvesse duran te vinte e oito dias, ao fim dos quais se placaram amostras aliquotas com o volume de 1 ml em meio contendo antibióticos selectivos. A expressão do gene quimérico NPT em tecido de plantas transformadas permitiu a selecção deste tecido em ambos os antibióticos. Neste caso, o antibiótico selectivo era a canamicina (50yilg/ml).

Ao fim de duas a quatro semanas, nas placas de selecção, era evidente o tecido transformado. 0 tecido das plan tas, os embriões individuais e o calo foram então colocados num meio de desenvolvimento contendo o herbicida glifosato numa concentração 1 milimolar e o tecido transformado continuou a desenvolver-se bem. A extracção e a análise das proteí.

nas tanto do calo como dos embriões corfirmou a presença do produto do gene que confere tolerância ao glifosato.

-4 2f X

Exemplo 13

Transformação de Células de Cultura em. Suspensão de Algodoeiro num Fenotipo não Tumoroso Resistente a Higromicina

Seguiu-se a maneira de proceder de transformação que se descreveu no Exemplo 10, com a diferença de se ter usa do como Agrobacteria transformante uma variedade que continha o vector binário T-DNA pGIB 715 (S. J. Rothstein e colab. , Gene 53 : 153 - 161, 19Ô7), assim como o plasmídeo vir. 0 T-DNA de pCIB 715 contém um gene quimérico composto do promotor e do terminador transcrito do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) 355 (Odell e colab., Nature 313 : 810 - 812, 1985, que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência) e a sequência de codificação para higromicina B fosfotran£ ferase (L. Gritz e J. Daviss, Gene 25 : 179 - 188, que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência). Agrabacteria contendo pCIB 715 foram, desenvolvidos em YE3 contendo canamicina (50 g/ml).

A transformação realizou-se como se descreveu pormenorizadamente no Exemplo 10, novamente com a modificação de que as alíquotas de 1 ml eram, placadas imediatamente em. meio que contém como antibiótico selectivo 50 g/ml de higromicina. A expressão do gene de higromicina quimérico em. tecidos de plantas transformadas permite a escolha deste tecido num. meio que contém higromicina. 0 tecido transformado foi desenvolvido da mesma maneira que se descreveu no Exemplo 8 num. meio de desenvolvimento de selecção que estabelece a transformação que

tinha ocorrido.

Exemplo 14

Transformação de Células de Cultura em Suspensão de Algodão para Conferir Resistência a Insectos Lepidópteros

Seguiu-se a maneira de proceder do Exemplo 10, com a excepção das modificações abaixo indicadas. Usaram-se Agrobacteria de transformação diferentes. Também, depois de o tecido da planta ter sido escolhido num antibiótico para a selecção de material transformado foi também seleccionado para expressão do gene BT, como se define na presente memória descritiva.

Os Agrobacteria utilizados continham ο T-DNA vector PCIB10 (Rothstein e colab., Gene 53 : 153 - 161, 1987, incorporado na presente memória descritiva a título de referên cia), em que se tinham, inserido os seguintes genes de endoto. xinas quiméricos de 3acillus_thuringiensis (genes BT).

Para preparar o vector de Agrobacterium_ fundiram-se sequências de codificação do promotor do 0η?Ύ gene VI e da protoxina. Construiu-se em primeiro lugar um derivado do vector fago mpl9 (Yanish-Perro n e colab., 1985 )· As fases es tão representadas nas ^iguras 15 e 17. Em primeiro lugar, in sere-se em m.plÇ um fragmento de BUA contendo aproximadamente 155 nucleotidos 5’ na região de codificação da protoxina e a sequência de codificação adjacente com aproximadamente 1346 nucleotidos. Digeriu-se 0 fago mpl9 de rf (forma replicativa

de hélice dupla) DNA cor endonucleases de restrição Saci e purificou-se o frigmento vector cor aproximadamente 7,2-kbp mediante electroforese através de agarose de baixa terperatu ra de gelificação utilizando técnicas habituais. Obteve-se o plasmídeo pKU25/4, contando aoroximadamente 10 kbp (quilo pa res de base ) de ^cillus_thuringiensis DNA, incluindo o gene da orotoxina fornecido oelo ^r.

Tueescr.

:i3A-Ceigy ltd.,

Basileia, Suíça. A sequência de nucleótidos do gene da proto. xina presente no plasmídeo pK7J25/4 é representado na formula I mais adiante. Digeriu-se o plasmídeo pKU25/4 DNA com as endonucleases Hpal e Saci e um fragmento de 1503 pb contendo os nucleotidos 2 a 1505 de fórmula I e purificou-se. Dste fram mento contém aproximadamente 155 pb de sequências de promoto. res de bactérias e aproximadamente 1345 bp do início da sequên cia de codificação de protoxina. Dm seguida, mistura-se aproximadamente 100 ng de cada fragmento, adiciona-se T4 DNA liga se e incuba-se a 15° 0 durante a noite. Transformou-se a mistura resultante em estirpe de Dj._coli misturada com bactérias indicadoras E_±_coli JN 101 e placou-se. Usou-se um fago (mpl9/bt ) para a construção posterior indicada a seguir.

Dm seguida, inseriu-se em mpl9/bt um fragmento e DNA contendo c promotor OaUY gene VI e algumas das sequências de codificação para o gene VI. Digere-se o fago mp!9/bt ds rf DNA com BamHI, trata-se oom o fragmento de grandes dimensões de DNA polimerase para criar extremidades niveladas e volta a clivar-se com endonuclease PstI. Du^ificou-se o fragmento do vector maior por electroforese, como se descreveu antes. 0 plasmídeo pABDl é descrito em Paszkowski e colab.,

SNBO J., 3, 2717 - 2722, 1984, que se incorpora na presente da.d original memória descritiva a título de referência. 0 alasrídeo pAHDl

DNA é digerido com PstI e HindIII. Purificou-se o fragmento ccm aproximadamente 465 pb de comprimento contendo o promotor CaUV gene VI e aproximadamente 75 pb da sequência de co. dificação do gene VI, Os dois fragmentos foram ligados e pia cados como se descreveu antes. Um dos fagos recombinantes, mpl9/btca, continha as sequências do promotor ΟηΤΨ gene VI, uma parte da sequência de codificação do gene VI, aproximada mente 155 bp de B^£illus_thringiensis DNA a montante da sequên cia de codificação da protoxina e aproximadamente 1346 pb da sequência de codificação da protoxina. Para fundir as sequên do promotor CaNV precisamente com as sequências de codificação da protoxina, eliminou-se o DNA interveniente usando mutagénese dirigida para oligonucleotidos de mpig/btca DNA. Sin tetizou-se um DNA oligonucleotido com a sequência (5’) TTCGGATTGTTATCCATGGTTGGAC-G7CTGA (3 ) segundo técnicas de rotina, usando um sintetizador de DNA da Applied Biosystems. Este oligonucleotido é complementar das sequências do fago mpig/ /btca DNA na extremidade de 3’ do promotor Ca!V /nucleotidos 5762 a 5778 em Hohn, Current Topics, em Nicrobiology and Immunology, 96, 193 - 235, 1932, que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência e no início da sequência de codificação da protoxina nucleotidos 155 a 172 de fórmula I indicada antes

A maneira de proceder geral para a mutagénese encon. tra-se descrita em Zoller e Smith, T'eth. Enzym., ICC, 458 - 500, 1983, que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência. Nisturaram-se aproximadamente 5 micro.

^ΓΡΛΡ OFUGtNAt

-4 6-

gramas de fago irplÇ/btca DMA de hélice única com 0,3 mg de oligonucleotido fosforiladc num volume de 40 ^Zíl. Aqueceu-se a mistura a 65° C durante cinco minutos, arrefeceu-se até 50° C e depois arrefeceu-se lentamente até 4° 0. Em seguida, adicionou-se tampão, nucleotido-trifosfatos, ATP, DMA ligase e o fragmento de grandes dimensões de DMA polimerase e incubou-se durante a noite a 15° C, tal como é descrito por Zoller e Smith, Meth. Enzym., 100, 458 - 500 (1983 ), que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência. Após electroforese sobre gel de agarose, purificou-se DMA circular de hélice dupla e transfectou-se para E. coli estirpe Jl' 101. As placas resultantes são escolhidas relativamente às sequências que hibridizam com oligonucleotido marcado com 32P e analisa -se o fago por análise de DMA com endonucleases de restrição. Entre os clones dos fagos resultantes encontravam-se aqueles que eliminaram correctamente as sequências não pretendidas entre o promotor de CaP/ gene VI e a sequência de codificação da protoxina. Este fago é designado mpl9/btca/del (veja-se a Figura 17).

Em seguida, construiu-se um olasmídeo em que a região de codificação 3’ do gene da protoxina foi fundida para os sinais de terminação de transcrição CaT'V. As operações es; tão indicadas na Figura 18. Em primeiro lugar, digeriu-se pias, mídeo pAEDI DMA com endonucleases 3ΑΤΉΙ e BglII e isolou-se um fragmento de C,5 Kpb contendo as sequências do terminador de transcrição de Ca?”/. Em seguida, digeriu-se plasmídeo pUC19, Yanisch-Perron e colab., Gene 33, 103 - 119, 1985, que se incorpora na presente memória descritiva a título de

-4 ί-

referência com BamHl, mistura-se com o fragmento de 0,5 kbp e incuba-se com T4 DNA ligase. Aoós transformação do DNA no E. coli estirpe H31C1, obteve-se um dos clones resultantes, designado plasmideo p702, o qual tem a estrutura representa da na Figura 13. Em seguida clivou-se o plasmideo p7C2 DNA com endonucleases Saci e Smal e isolou-se o fragmento maior com aproximadamente 3,2 kbp por electroforese em gel. Digeriu-se o plasmideo pKU25/4 DNA com endonucleases AhalII e Saci e isolou-se o fragmento de 2,3 kbp (nucleotidos 1502 a 3773 de fórmula I) que contém a porção 3* da sequência de co dificação da protoxina (ntl5O4 a 3773) por electrólise em gel. T'isturam-se estes dois fragmentos de DNA, incubam-se com T4 DNA ligase e transformam-se em S. coli estirpe H3101. 0 pla.s mídeo resultante foi designado p702/bt (Figura 18).

Finalmente, uniram-se porções de fago mp!9/btca/del ds rf DNA e plasmideo p702/bt para criar um plasmideo que con tém a sequência completa para codificação da protoxina ladeada pelas sequências promotora e terminadora OaT*Y (ver Figura 18). Digeriu-se o fago mpl9/btca/del DNA com endonucleases Saci e Sphl e purifica-se um fragmento de aproximadamente 1,75 kpb por meio de electroforese em gel de agarose. Semelhantemente, digere-se plasmideo p702/bt DNA com endonucleases Sall e Saci e isola-se um fragmento com aproximadamente 2,5 kpb. Finalmente, digeriu-se o plasmideo p3R322 D?^TA (Bolivar e colab., Gene 2., 95 - 113, 1977, que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência) com Sall e Sphl e isola-se um fragmento de 4,2 kbp maior. Ni st ura ram- se os três fragmentos de DNA e incubou-se com T4 DNA limase e transformou-se em

-405. coli estirpe H31C1. 0 plasmídeo resultante, ?3?J22/btl4, é um derivado de P3FJ22 que contém os sinais de promotor de CaVV gene VI e de translação fundidos com a sequência de codificação da proteína do 3acillus_thuringiensis cristalino seguido por sinais de terminação da transcrição CaT*Y (representado na Figura 19).

vector pCIBlC é um vector derivado do Ti-plasmídeo útil para a transferência do gene quimérico para plantas por intermédio do Agrobacterium_tumefaciens. C vector é derivado do plasmídeo da vasta gama de hospedeiros pPX252, que pode ser obtido do Dr. W. Barnes, Washington University, St. Louis, Mo., Estados Unidos da América. 0 vector também contém um gene para resistência à canamicina em Agrobacterium, de Tn9C3 e as sequências do bordo esquerdo e direito de T-DNA do plasmídeo de Ti pTiT37. Entre as sequências dos bordos, encon tra-se a região do poliligador do plasmídeo pUClS e um gene quimérico que confere resistência à canamicina nas plantas.

Primeir^mente, modificou-se o plasmídeo pPK252 para substituir o gene que confere resistência ã tetraciclina por um que confere resistência à canamicina do transposão Tn9C3 /fcka e colab., J. Mol. 3iol., 147, 21? - 22o <19·5ΐ), incor porada na presente memória descritiva a título de referência_7 e modificou-se substituindo o único sítio Eco PI em pPK252 com um sítio BglII (veja-se a Figura 2C para um resumo destas modificações. Digeriu-se primeiramente o plasmídeo pPK252 com. endonucleases 3all e 3mal; depois tratou-se com o fragmento grande de DMA polimerase I para criar extremidades lisas e purificou-se o fragmento do vector de grandes dimensões por

electroforeses er gel de agarose. Fr seguida, digeriu-se o plasrídeo p369 cor endonuclease BarHI, tratou-se o fragrento de grandes dire.osces de DNA polirerase e isolou-se u.r fragmento cor aproxiradare.ute 1050 pb por electroforese er gel de agarose é este fragrento que contér o gene de transposão Tn9O3 que confere resistência ao antibiótico canaricina £Oba e colab., J. ?*ol. 3iol.”, 147» ²¹⁷ “ ²²⁷ U98l), ^a.ue ^se incorpora na presente rerória descritiva a título de referênciaj? Arbos os fragrentos são er seguida tratados cor o fragrento de grandes dirensões de DNA polirerase, para criar extreridades lisas. Arbos os fragrentos são risturados e incubados cor T4 DNA ligase durante a noite a 15° C. Depois da transforração er D. coli estirpe H3101 e selecção para as colónias resisten tes à canaricina, obtér-se o plasrídeo pRK252/Tn903 (ver Figu ra 19 ).

Digeriu-se o plasrídeo pRX252/Tn9O3 no seu sítio de EcoRI, seguido por tratarento cor o fragrento de grandes dirensões de E. coli DNA polirerase para criar extreridades li. sas. Este fragrento foi adicionado aos ligadores do sítio de restrição sintéticos BglII e incubou-se durante a noite cor T4 DNA ligase. Digeriu-se o DNA resultante cor ur excesso de endonuclease de restrição BglII e purificou-se o fragrento do vector raior por electroforese er gel de agsrase. Incubou-se novarente o fragrento resultante cor T4 DNA ligase, para recircularizar o fragrento por interrédio das suas extreridades coesivas BglII recenterente adicionadas. A seguir à. transforração er F. coli estirpe H3101, obtér-se o plasrídeo pRK252/ /Tn9O3/3glII (ver Figura 20).

o*v

Construiu-se um derivado dó plasmideo pBR322 que contém os bordos T-DNA do plasmideo Ti, a região do poliliga dor do plasmideo pUC19 θ o gene seleccionavel para a resistên cia à canamicina em plantas (veja-se a igura 21). 0 plasmídeo p3R325/Eco29 contém um fragmento EcoRI de 1,5 Kpb de nopalina Ti plasmideo pTiT37. Este fragmento contém a sequência do bordo da esquerda de T-DNA; Yadav e colab., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, 5322 -5325 (1982 ), que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência. Para subs. tituir as extremidades EcoRI deste fragmento por extremidades HindIII, digeriu-se plasmideo p3R325/Sco29 UNA com EcoRI, depois incubou-se com. nuclease Sl, seguido por incubação com o fragmento de grandes dimensões de UNA polimerase, para criar extremidades lisas e depois misturou-se com ligadores sintéticos HindIII e incubou-se com T4 UNA ligase. Digeriu-se o

DNA resultante com endonucleases Ciai e um excesso de HindIII e purificou-se o fragmento com 1,1 Kpb resultante contendo o bordo esquerdo de T-UNA por electrofcrese em gel. Em seguida a região de poliligação do plasmideo pUU19 foi imolada por digestão do plasmideo DNA com endonucleases EcoRI e HindIII e isolou-se o fragmento mais pequeno (aproximadamente 53 pb) por electroforese em gel de agarose. Em seguida, digeriu-se plasmideo p3R322 com endonucleases EcoRI e Ciai misturou-se com os outros dois fragmentos isolados, incubou-se com T4 UNA ligase e transformou-se em E. coli estirpe HB1D1. 0 plasmideo resultante, pCIBo, contém o poliligador e o bordo esquerdo T-UNA num derivado do plasmideo p3B322 (ver ^igura 21).

Construiu-se um plasmideo contendo o gene para a expressão de resistência â canamicina em plantas (ver Figuras e 23). 7 plasmídeo Bin:

o otido

Τ'. Bevan, Plant

Breeding Instituis, Cambridge, Grã-Bretanha. Este plasmídeo é descrito na referência de Bevan, Nucl. Acids Res., 12, 8711 - 8721 (1984), que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência. Digeriu-se 0 plasmídeo Bino DNA com EcoRI e HindIII e isola-se 0 fragmento com aproximada mente 1,5 Kpb de tamanho contendo 0 gene quirérico neomicina-fosfotransferase (NPT) e purificou-se de acordo com 0 proces. so de eleotroforese em gel de agarose. T'isturou-se então este fragmento com plasmídeo pUCl8 DNA que tinha sido clivado com endonucleases EcoRI e HindIII. A seguir à incubação com T4 DNA ligase, transformou-se 0 DTTA resultante em E. coli estirpe HB1O1. O plasmídeo resultante é denominado pUCl8/neo. Este plasmídeo de DNA contém uma sequência de reconhecimento de BamHI não desejada entre 0 gene de neomicina-fosfotransferase e a sequência terminadora para nopali.na-sintase ; ver Bevan, Nucl. Acids Res., 12, 8711 - 8721 (1984), que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência

Para eliminar esta sequência de reconhecimento, digeriu-se 0 plasmídeo pUCl8/neo com endonuclease BamHI, seguida por tratamento com 0 fragmento de grandes dimensões de DNA polimerase, para criar extremidades lisas. Incubou-se então 0 fragmento com T4 DNA ligase para recircularizar 0 fragmento e transformou-se em E. coli estirpe H3171. 7 plasmídeo resultante, pUCl8/neo (Bam), perdeu a sequência de reconhecimento de BamHI.

A sequência do bordo direito de T-DNA foi então adi.

cionada a seguir ao gene quimérico NPT (ver Figura 24). Q plasmideo p3R3 25/^zHind23 contém o fragmento com 3,4 Kpb de HindIII do plasmideo pTiT37. Este fragmento contem a sequência do bordo direito de T-DNA; 3evan e colab., Nucl. Acids Res., 11, 359 - 385, que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência. O plasmideo p3R325/Hind23 DNA foi clivado com endonucleases SacII e HindIII, isolou-se o bordo direito contendo um fragmento de 1,0 Kpb e purificou -se em seguida por electroforese em gel de agarose. Digeriu-se o plasmideo pUCl8/neo(3am) DNA com endonucleases SacII e HindIII e isolou-se o fragmento vector de 4,0 Kpb por electro. forese em. gel de agarose. Isolaram-se os dois fragmentos, incubaram-se com T4 DNA ligase e transformou-se em E. coli estirpe HB101. 0 plasmideo resultante, pCI34 (representado na Figura 23), contém o bordo da direita de T-DNA e o marcador seleccionável em plantas para resistência à canamicina num derivado do plasmideo pUDlS.

Em seguida construiu-se um plasmideo que contém am bos os bordos da direita e da esquerda de T-DNA com o gene de resistência à canamicina seleccionável nos plantas e o poliligador de p^TJCl8 entre os bordos (ver Figura 23). Digeriu-se o plasmideo pCI34 D?TA com endonuclease HindIII, seguida por tratamento com o fragmento de grandes dimensões de DNA polimerase, para criar extremidades lisas, seguidc por diges:oRI. Isolou-se o gene quimérico 5e resistência à canamicina contenío o fragmento de 2,5 Kpb e bordo da direita de T-DNA por electroforese em gel de agarose. Digeriu—se o plasmideo pCI35 DNA com endonuclease AatlT; ‘rroooL tou-se com T4 DNA polimerase para criar extremidades lisas e, em seguida, clivou-se com endonuclease Eco^OI. 0 fragmento do vector de maiores dirensões foi purificado por electroforese em gel de agarose, misturou-se com o fragmento de pCI34, incubou-se com T4 DNA ligase e transformou-se em E. coli estirpe H31C1. 0 plasmideo resultante, pCIB2 (representado na Figura 24) é um derivado do plasmideo p3?322 contendo as sequên cias pretendidas entre os dois bordos de T-DNA.

As operações seguintes completam a construção do vector pCI310 e estão representadas na Figura 25. Digeriu-se o plasmideo pGI32 DNA com endonuclease EcoFV e adicionaram-se ligadores sintéticos contendo sítios de reconhecimento de BglII, como se descreveu antes. Apés digestão com excesso de BglII endonuclease, isolou-se o fragmento com aproximadamente

2,6 Kpb por electroforese em gel de agarose. Digeriu-se o pias mídeo ρΒΧ252/Τη903/3δ1ΙΙ, descrito antes (ver Figura 20) com endonuclease BglII e, em seguida, tratou-se com fosfatase para evitar a recircularização. ?'isturaram-se estes dois fragmentos de DNA, incubam-se com T4 DNA ligase e transformaram-se em E. coli estirpe H3101. 0 plasmideo resultante é o vector completado, pCIBIC.

A inserção do gene de protoxina quimérico no vector pCIBlO faz-se por meio das operações representadas na Figura 26. Digeriu-se o plasmideo pBF322/btl4 DNA com endonucleases Fvul e Sall e, em seguida, digeriu-se parcialmente com endonuclease BamHI. Um fragmente BamHI-SalI com aproximadamente 4,2 Kpb de t imanho, contendo o gene quimérico, foi isolado a seguir à electroforese em gel de agarose e misturou-se com

plasmídeo pCI310 DNA que tinha sido digerido com endonucleases 3amHI e Sall. Depois da incubação com T4 DNA liga-se a transformação em E. coli estirpe H31C1. Obteve-se o plasmídeo representado na Figura 26 e que continha o gene da protoxina quimérico no vector plasmídeo pCI31O.

A fim de transferir o plasmídeo pOI31O/l9Sbt de 3, Coli H3101 para Agrobacterium, utilizou-se um hospedeiro intermédio 5. coli estirpe 317-1. Esta estirpe, que se pode obter de Agrigenetics Research Oorp., Boulder Co., contém, funções de mobilização que transferem plasmídeo pC1310 directamente para Agrobacterium_ por meio de conjugação, evitando assim a necessidade de transformar plasmídeo DNA nu directaπ-ente e. A_árob_Sçteriur_ _{( a referêncla à estirpe sl7}_i encon tra-se em Simon e colab., Tblecular Genetics of the Bactéria -Plant Interaction , A.Puhler Ed. , Springer Verlag, Berlim, páginas 98 - 106, 1983, que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência. Em prime ir··, lugar, introduz-se plasmídeo pCI310/l95bt DNA em células 317-1 tratadas com. cloreto de cálcio. Em seguida, misturaram-se culturas de células de 317-1 transformadas e Agrobacterium_tumefaciens_ estirpe LBA44O4 / Ooms e colab., Gene 14, 33 - 50 (1931 ), que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência J e acasalaram-se numa placa de agar N (Difco), durante a noite, à temperatura ambiente. Picou-se uma pitada das bactérias resultantes em meio AB mínimo / Chilton e col., Proc. Natl. Acad. 3ci. U3A, 77., 7347 - 7351 (1974 ), que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência^, placou-se com 50yítg/ml de canamicina e incubou-se a

OWG'^nM- \

-5528° C. P.e picaram-se as colónias nos mesmos meios e depois repicaram-se em placas de agar N3. Repicaram-se colónias que se desenvolveram, lentamente, repicaram—se para meio de AB mí niir.o com. canamicina e isolaram-se as colónias individuais.

Este procedimento permite escolher os Agrobacteria que contem o plasmídeo pCIB10/l9S3t.

Conseguiu-se a construção do gene quimérico de protoxina de Bacillus thuringiensis com o promotor Ca MV 35 S por construção de um plasmídeo de cassete promotora CaíT/353· C pCI3710 construiu-se como se mostra na Figura 27. Este plasmídeo que continha promotor de CaT¹”/ e as sequências de terminação de transcrição para o transcrito 35S RNA S. N. Covey, G. P. Lom.onossoff e R. Hull, Nucleic Acids Research, Vol. 9, 6735 - 6747 (1981jj! que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência. Isolou-se um fragmento de res. trição 1149-bp BglII de CaTT DNA, referido em Hohn e colab., Current To pies in Ficrobiology and Immunology, 96, 194 - 220 e Apêndices A a G (1982), que se incorporam na presente memória descritiva a título de referência, a partir de plasmídeo pLVlll (obtido do Dr. S. Howell, University of Califórnia, San Diego, Estados Unidos da América; como alternativa, o fragmento pode isolar-se directamente a partir de CaTV DNA) por electroforese preparativa em gel de agarose, como se descreveu antes, e misturou-se com plasmídeo pUC19 DNA clivado com BamHI, tratou-se com T4 DNA ligase e transformou-se em E. coli. 0 si. tio de restrição de BamHI no plasmídeo resultante foi destruído por ligação das extremidades coesivas de BglII às extremidades coesivas BamHI. 0 plasmídeo resultante, denominado

pUC19/35S, foi então usado na rutagénese in vitro dirigida ao oligonucleotido para inserir a sequência de reconhecirento de BarHI GGATCC ir.ediatarents a seguir ao nucleótido 7423 de Cal-Ύ na referência de Hohn. 0 plas~ídeo resultante,pCI3710, contér a região do prorrotor CaTT/355 θ a região de terrinação da transcrição separada pelo sítio de restrição por BarHI. As sequências de DNA inseridas neste sítio de BarHI serão exores, sas er plantas pelas sequências de regulação de transcrição de CaldV. O plasrideo pCI371C não contér quaisquer códãos de iniciação de translação de ATG entre o início da transcrição e o sítio de BarHI.

A inserção da cassete de prorotor/terrinador CaT//353 er. pCIBlO ocorreu por reio das operações delineadas na Figura 28. Digeriram-se os plasr.ídeos pCIBlO e pCI3710 de DNA cor EcoRI e Sall, risturou-se e ligou-se. 0 plasrideo resultante, pCI310/710, ter a cassete de prorotor terrinador de CaTⁿ7/353 inserida no vector de transforração de plantas pCIBlC. As sequências de CaTT/353 encontrar-se entre os bordos T-DNA er pCIBlO e, assir, serão inseridas no genora das plantas na transforração das plantas.

A inserção do gene de orctoxina de 7açillus_thurin£iensis no plasrideo pCI31C/71C ocorreu por reio das operações delineadas na Figura 29. Coro fonte do gene de protoxina, digeriu-se plasrideo pCI31(?/l93bt cor 3arHI e Ncol e isolou-se o fragrento de 3,5 ICo contendo o gene de protoxina por electiqo forese er gel oreoarativa. Nisfurou—se então o fragrento cor adaptador de NcoI-BarHl sintético cor a sequência 5’-CATGGCCGC-ATCCGGC-3 ’ e, er seguida, digeriu-se cor. 3arHI. Esta opera-

ção cria extremidades	coesivas de	3am	HZ er arbas as	extre m i —
dades do fragmento de	protoxina.	Fste	f C Z	em segui.
da inserido em pCI31C	/710 clivado	cem	3amHZ. 0 plasm	ídeo re-

sultante, pCI31O/3 53bt, representado na Figura 22, contém o gene da protoxina entre as sequências de promotor de CaT7^;/353 e de terminação da transcrição.

A transferência do plasmideo pCI31O/353bt para Agrok^HxêZiHHLÍu-sfaciens estirpe L3A44O4 realizou-se como se descreveu antes.

Realizou-se a construção de um gene de protoxina de 3acillus_thuringiensis adiado contendo aproximadamente setecentos e vinte e cinco aminoácidos e a construção de um gene quimérico contendo este gene adiado com o promotor de CaTT 35S removendo a parte terminal COOH do gene por clivagem no sítio de endonuclease de restrição Xpnl na posição 2325 na sequência representada na fórmula I. Digeriu-se plasmideo pCI31O/353bt (Figura 29) com BamHI e Xpnl e isolou-se o fragmento de 3airHl/XpnI de 2,2 Xpb aproximadamente, contendo o gene de protoxina adiado por electroforese em gel de agarose pre_ parativa. Para transformar o sítio de Xpnl na extremidade 3' num sítio de BarnHI, misturou-se o fragmento com um oligonucleo. tido adaptador Xpnl/3amHI e ligou-se. Fste fragmento é então misturado com pCI310/710 clivado com 3amHI (Figura 23).

Fez-se um gene de protoxina adiado contendo aproximadamente seiscentos e quarenta e cinco aminoácidos removendo o agrupamento COOH terminal do gene per clivagem no sítio da endonuclease de restrição 3cll na posição 2090 na sequência re. oresentada na formula 1. Digeriu-se o plasmideo pCT310/353bt bad original

(Figura 29) cor. BamHI e cor. Bell e isolou-se 0 fragmento de BamHl/BcII com aproximadamente 1,9 Kpb contendo 0 gene de protoxina adiada por electroforese em gel de agarose preparativa. Com 0 Bell cria uma extremidade coesiva compatível com BamHI, não é necessária qualquer manipulação posterior antes de se proceder à ligação deste fragmento em pCI310/710 clivado com 3amHI (Figura 23). 0 plasmideo resultante, que tem a estrutura pCIB10/35Sbt (Bell), representado na Figura 31, foi escolhido como base na canamicina.

Os transformantes resultantes, designados pCIBlO/ /35Sbt(Kpnl) e representados na Figura 30, contêm. 0 gene de protoxina adiado com aproximadamente setecentos e vinte e cin co aminoácidos. Estes transformantes são escolhidos com base na canamicina.

Fez-se um gene de protoxina adiado introduzindo um sítio de clivagem por BamHI (GGATCC). Isto faz-se por clonagem do fragmento de BamHI contendo a sequência de protoxina de pCI310/35Sbt em. mplS e usando técnicas de mutage'nese de oligonucleótidos tradicionais, descritas antes. Depois da mutagénese, prepara-se a forma DNA replicativa com. hélices duplas a partir do clone ΤΊ3, que, em seguida, se digere com. BamHI. 0 fragmento com aproximadamente 1,9 Epb contendo 0 gene de protoxina adiado é inserido em pCI31C/710 clivado com 3amHI. 0 plasmideo resultante, que é a estrutura pCIB10/353bt(507) representada na Figura 32, é escolhido ccm base na canamicina.

Usou-se 0 pCIBlC/obt 507. A transformação realizou-se como se descreve pormenorizadamente no Exemplo 7, com a diferença de os volumes das alíquotas de 1 ml serem placados

(5Cyzg/ml) ou G4lS (25 meio de selecção continha canamicina (5Cy 2Ag/ml). A expressão do gene quimérico de de NPT em ambos os tecidos de plantas transformadas permite a selecção deste tecido com base em qualquer dos antibióticos.

Ao fim de duas a quatro semanas, o tecido transfor mado tornou-se evidente nas placas de selecção. Escolheu-se o material da planta com base na canamicina ou G4lS. Em seguida, extraiu-se o tecido da planta (ou embriões individuais ou calo) com tampão e ensaiou-se relativamente à expressão do produto do gene 3T por ensaio ELI3A (ensaio de imunoadsorção de enzima ligado). As condições de extracção foram as seguintes: por 100 mg de tecido, homogeneiza-se em 0,1 ml de tampão de extracção contendo NaCO-j 50 mM (pH 9,5), Triton 0,05$, Tween 0,05$, NaCl 100 nM, EDTA 10 mM, leupeptina 1 mM e PMSF 1 mM.

A leupeptina e PMSF são adicionados imediatamente antes da utilização a partir de soluções de armazenagem, concentradas cem vezes. 0 tecido foi moído com um pilão accionado por motor. Depois da extracção, adicionou-se Tris 2 M de pH 7 até se ajustar a pH 8,0 - 8,5 e depois centrifugou-se numa microcentrífuga Beckman 12, a 12^00 rotações por minuto (dez minutos a 4°C) e guardou-se o líquido sobrenadante para o ensaio de imunoadsorção ligada de enzima ligado (ELISA).

As técnicas do processo ELISA como ferramenta geral são descritas por Τ'. F. Clarck e colab., em Methods in Enzymology 118 : 742 - 766 (1985), que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência.

Desenvolveu-se um método de ensaio E1I3 para a to— οϋ—

xina Bt usando técnicas normalizadas e utilizou-ss para analisar o material das plantas transgenico relativamente à expressão das sequências Bt. Para a realização deste procedimen to, pré-trata-se uma placa para ELI3A com etanol e à placa adiciona-se anti-soro a.nti-3t de coelho purificado por afinidade (50 JJk ) com uma concentração de g/ml em solução salina tamponizada com borato (veja-se mais adiante) à placa. Incubou-se durante a noite a 4° C. 0 anti-soro foi produzido em resposta à imunização de coelhos com cristais de Bt purificados em gradiente fi3. J. Ang e K. W. Nickerson, Appl. Environ. 1’icrobiol., 36 625 - 625 (1978 )/%, que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência, solubilizou-se com dodecil-sulfato de sódio e lavou-se com tampão de lavagem de ELISA (veja-se abaixo). Tratou-se então durante uma hora à temperatura ambiente com. tampão de bloqueio (veja-se abaixo ) e lavou-se com tampão de lavagem ELISA. Adicionou-se o extracto de plantas numa quantidade apropriada para se obte. rem 50 microgramas de proteína (isto é, tipicamente cerca de 5 microlitros de extracto). Determina-se o tampão de extracção de folhas como proteína pelo método de 3radford fifi. Bradfcrd, Anal. Biochem., 72 : 248 (1975), que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência fi, usando um. estojo de análise comercialmente disponível fornecido por Bio-Pad, P.ichmond, Califórnia, Estado Unidos da América. Se olhas, utiliza-se diluen te de EL te a 4“

ssar	10	?. i^nir o ex :
T Γ· A 5 Λ	(ve	ja-ss abai?: o )	. Deix
C. A	'0 3	lo varem com	/ 2.Γ 02.0

nam-se 5C^Atl de anti-soro ar.ti-Bt d —r t? a a·-· ic íoe cabra nuri-ica

BAO OWGINM- _i nidade er ur ,Ο , Ο Ί O e CSÇO

- 3 9 5 0 /·'- ^3e :-e _ este durante ura gora £ _Γ ~ C ^r' C ~ D ' ~ b · r α · ό *’ 5 ^ς- L. ** 3 “ · — corro de a.nti-cabra de coelho lixado fatase alcalina fcorercialrente vendida oela firra Sigra

T /·>

Unidos da Arérica) 1

CO

Chericals, St. louis, . cor diluente de ELISA, deixou—se incubar durante ura lacra a 37° Ce, er. seguida, lavou-se ocr tarpão de lavager de ELISA. Adicior.arar-se 5C ricrolitros de substrato (0,5 rg/rl de fosfato de p-nitrofenilo er tarpão de substrato de ELISA; veja-se abaixo) e incuba-se durante trinta rinutos A terperatura arbiente. Interror.pe-se a reacção adicionando 50 ricrolitros de NaOH 3 U. Deterrina-se a obsorvãncia a 405 nr. nuir. leitor de ELISA rodificado (Hewlett Packard, Stanford Ca. Estados Unidos da Arérica).

tecido da planta trar.sforrado cor o pCI31O/353bt (3cll), quando ensaiado usando esta técnica EIISA, rostrou reacção positiva, indicando a expressão do gene 3t.

1P3S Solução Salina Earponizada cor Eosfato de ELISA

ros fato de Na	IC r.U : Na/lPC^	4,SS graras/4
	NaH2?C4.H2O	0,975 grara/4
NaCl 14C r.N	NaCl	32,7 graras/
0 oH deve ser	arroxi~adarer.ie igual a n,	— «
		BAD ORIGINAL ' V-

/ 1 4 +· ·

Solução Salina Tamponizada com 3orato

Ácido bórico ICO m.T'

3orato de sódio 25 mM

NaCl 75 mM

Ajusta-se a pH 8,4 - 8,5 com HC1 ou NaOH, conforme for preciso .

Tampão de Bloqueio de EI15A

Em EPBS dissolvem-	se :
1% de 33A
0,02% de azida	de	Na
Tampão de Lavag	em	de ELISA
Tris-HCl 10 mM;	pH 8,0
0,05% de Tween	20
0,02% de azida	de	Na
Tris 2,5 M
Diluente ELISA
Em EPBS dissolvem-	se :
0,05% de Tween	20
1% de BSA
0, 02% de azida	de	sódio
Tampão de Subst	rato de ELISA

Em 500 ml dissolvem-se:

ml de dietanolamina,

24,5 mg de T'gCl₂;

Ajustar a pH 9,8 com HC1.

-ό3-

Substrato de EIT5A mg de fosfato de p-nitrofenilo em 25 ml de tampão de substrato .

Para os ensaios biológicos, iniciaram-se suspensões de células de culturas de células resistentes a antibióticos obtidas por transformações com estes Agro bactéria. Desenvolveram-se as suspensões em meio suplementado com G4l8 (25 mg/litro ) e subcultivaram-se em meio fresco contendo o antibiótico, em intervalos de sete a dez dias. Usaram-se então amostras destas culturas em ensaios biológicos para determinar toxicidade em relação a insectos lepidópteros. Deixaram-se assentar amostras de 20 ml destas culturas (volume das células =3- 4 ml) e ressuspenderam-se em meio em que faltavam os antibióticos. Deixaram-se então desenvolver as suspensões durante dois dias adicionais neste meio, para isentar as células de qualquer antibiótico residual. Colocaram-se dois círculos de papel de filtro Whatman com 2,3 centímetros de diâmetro molha dos, no fundo de um copo contendo 21,4 gramas (3/4 onça). Mo disco de papel de filtro colocou-se uma camada de células de cultura em suspensão transformadas com a espessura. de 0,2 cen tímetro. Em cada copo, colocaram-se larvas de Manduca_sexta

O ti ie Heliothis viresoens recentemente saídas dos ovos. Eize ram-se controlos de larvas alimentadas em células de cultura em suspensão não transformadas. Substituíram-se os discos com intervales de tempo de dois dias ou quando necessário.

As larvas de Manduca geralmente necessitam mais material de plantas. A taxa de crescimento e a mortalidade ~as

BAD ORIGINAL^ — ο· /

larvas alimentadas com células transformadas em comparação com a taxa de crescimento das larvas alimentadas com célul não transformadas foram registadas ao fim de cinco dias e rificou-se claramente a toxidade do produto com genes de nas células de algodoeiro transformadas.

ve

3T

Exemplo 15

Obtiveram-se ovos de Heliothis_virescens postos em bocados de gaze do Tobacco Insect Control Laboratoiy da Morth Carolina State University, Raleigh, North Carolina, Estados Unidos da América. Transferem-se os pedaços de tecido de gaze para um. copo de vidro grande tapado e incuba-se a 29° C com. toalhas de papel húmido para manter a humidade. Os ovos eclo. diram ao fim de três dias, logo que possível após a saída dos ovos, as larvas (uma larva por copo) são transferidas para co. pos de plástico de 3/4 de onça cobertos. Cada copo contém dis. cos de folhas de algodoeiro. As larvas são transferidas usando um pincel de tinta fino.

Cortam-se discos com. 1 centímetro de diâmetro de folhas de plan tas de algodão e colocam-se num círculo de papel de filtro humedecido no copo com as larvas. De cada planta, ensaiam-se pelo menos 5 - 10 discos de folhas, representando tanto folhas de tenra idade como também folhas velhas. Substituem-se os discos de folhas em intervalos de dois dias, ou quando necessário, para alimentar as larvas. Comparam-se as velocidades de crescimento (tamanho ou osso combinado de todas as amos, tras de lagartas) e a mortalidade das larvas que se alimentam

Ό7com folhas de plantas transformadas com as das larvas que se alimentam, com folhas de algodoeiro não transformado.

As larvas alimentadas ccm discos de algc/oeiro transformado com pCI31C/355b5(Bell) apresentam uma diminuição da velocidade de crescimento e um aumento de mortalidade em comparação com os controlos.

Observou-se que um certo número de plantas regeneradas (5 - 10%) pareceu ter variações fenotípicas geneticamen te hereditárias adquiridas em consequência do processo de regeneração. Esta variação é conhecida como variação somaclonal. Os Exemplos seguintes mostram, como a variação somaclonal como consequência do processo de regeneração foi usada para introduzir novas caracteristicas comercialmente úteis em variedades de algodoeiro.

Exemplo 16

Eegenerantes de Algodoeiro Tolerantes em Relação a Eungos

Patogénicos

Seguiu-se a maneira de proceder que se descreveu no Exemplo 1 e endureceram-se plantas de algodoeiro regeneradas obtidas da variedade 3J5 θ 3J4 e colocaram-se no solo. Estas plantas foram, auto-polinizadas e recolheu-se a semente repre. sentando a geração Fl.

°ara obt^^ ^emenerantes (v tolerantes a VgríÃndlj-diun, semeou-se infestado com jertiçilliu.m_ para anál Como controlos, semearam-se sementes s ) mai •••re no f idas.

e 3J5 ariantes somaolonai a geração Fl em te ise da progénie em das var iadade s 3J4

-ο ο-

ηο carpo. As variantes somaclonais mais tolerantes do que as V29 3 2'^ ° 3 3 6Γ * ° Q 20 ^rQ i C ί. 3_ '2Γ 0 ^23 l· 9 l· 51 3 3 ?! 3 3 9 21^21Γ?23 11123 22 0202*^219 (5/0 Ο Ο392?ν22/?1θ 0 vigor global das plantas, o rendimento e a ausência de sinto, mas foliares associados com a doença. A Figura 33 mostra as filas da progénie de regenerantes semeados num campo infestado com Verticillium. A Figura 34 mostra uma variante somaclonal tolerante a Verticillium da variedade 3J4. Verificou-se que este aumento de tolerância em relação ao fungo patoénico era geneticamente estável e passava para as gerações subsequen tes.

Exemplo 17

Regenerantes de Algodoeiro com Hábitos de Crescimento

Alterados

Seguiu-se a maneira de proceder que se descreveu no Exemplo 13, com a diferença de, em vez de se semear em solo infestado com doença, se ter semeado a geração F1 num alfobre de desenvolvimento de algodoeiros. Comparou-se o hábito de de. senvolvimento global da progénie regenerada de F1 com o das variedades de controlo. Identificaram-se variantes somaclonais que eram mais uniformes nos hábitos de desenvolvimento e de estatura mais curta do que a variedade parental. 0 rege.nerante 3J5, identificado nas experiências como Ehy 6, era 2C? mais curto do que a variedade parental. Este tipo de hábito de de. senvolvimento é desejável em algodão desenvolvido em condições

OfUG^¹· rl o Q* Τ'3. ΘΓ ** Ζ_ Σ S 3 centímetros = 30 polegadas). Estas -se serem seneticamente estáveis e anciamento entre filas 76 características verificou passaram para as gerações subsequentes.

Exemplo 18

Regenerantes de algodoeiro com Características de ^pibra

Aperfeiçoadas

Seguiu-se a maneira de proceder que se descreveu no Exemplo 13, com a diferença de se ter semeado a progénie El de regenerantes num alfobre de criação de algodoeiros e deixou-se produzir fruta. Quando os casulos estavam maduros, co. lheu-se o algodão e submeteu-se a una análise de várias propriedades da fibra, incluindo comprimento, uniformidade, resistência à tracção, elasticidade e área micronica. Identificaram-se variantes somaclonais que tinham propriedades significativamente melhores em relação à variedade parental em uma ou mais destas características.No Quadro 1 seguinte, incluem-se dados representativos para a progénie E2 (polinização de células de El). Os valores assinalados com um asterisco cons. tituem melhoramentos em regenerantes S-T5 que são estatisticamente significativos e se verificou passarem para as gerações subas luentes.

Propriedades das fibras

Quadro 1

Variedade	Compri-	índice de uni.	Resistência	Elasti-	Área em
ou estirpe	mento	formidade	à tracção	cidade	mícrones
3J5	1,13	48,7	24,7	5,8	4,27
3SP16	1,27*	51,2	24,5	8,0*	4,10*
3SP2O	1,28*	53,1*	23,1	7,5*	4,13*
53P1O	i,n	53,2*	25,7*	6,2	4,55
5SP17	1,13	51,7	25,7*	7,1	4,43

Exemplo 19

Regenerantes de Algodoeiro com Rendimento Melhorado

Seguiu-se a maneira de proceder que se descreveu no Exemplo 13, com a diferença de se semear a progénie ?1 de regenerantes da variedade SJ4 em ensaios -’β campo múltiplos jun tamente com controlos não regenerados, 'mn variante, que apre. sentou um hábito de crescimento mais uniforme e um hábito de crescimento mais vigoroso, produziu 4% mais algodão dc que a variedade parental, na mesma experiência, Os dados estão indicadas no Quadro 2 seguinte.

'BAD ORIGINAL

Quadro 2

Variedade ou estirpe

5J4 Controlo

Phy 4

Rsndirrso oor talhão (lb)

X Rendimento Ibs/Acre /de

Aumento

23,0 3049

29,1 3169 4/* x Esta diferença era significativa com um nível de confiança de 95^·

Um aumento de 4% de rendimento representa um ganho de cerca de 20 dólares por acre para o cultivador módio de al_ godão, na Califórnia, onde se cultivam anualmente mais de um milhão de acres.

Exemplo 20

Regenerantes de Algodoeiro Tolerantes em Relação a um Herbicida (Canamic ina)

DeservoIverar-se cultoras em suspensão de variedade de algodoeiro 31544 de acordo com o método que se descreveu no Exemplo 5. Rlacarar-se então as culturas em suspensão num reio de agar, como se descreveu no Exemplo 5, mas suplementado com o herbicida (antibiótico) canamicina (25 rg/litro ). A maior parte das células da população morreu, mas algumas

(l a 5%) eram tolerantes e sobreviveram. Subcultivaram-se es tas selectivamente em meio solidificado com agar suplementado com concentrações crescentes da canamicina até a concentra ção final ter atingido 50 mg/litro. Desenvolveram-se então os embriões a partir deste calo e germinaram-se os embriões resistentes, originando plantas resistentes à canamicina.

Claims (80)

1. Reivindicaçõe

   1.- Método para a regeneração de uma planta de algodão a partir de células somáticas, caracterizado pelo facto:

   a) de se proporcionar um explantado de plantas de algodão;

   b) de se cultivar o explantado em um primeiro meio de desenvolvimento de calo durante um intervalo de tempo suficiente para se desenvolver calo indiferenciado a partir do explantado;

   c) de se transferir o calo para um segundo meio de desenvolvimento do calo;

   d) de se cultivar o calo no segundo meio de desenvolvimento de calo durante um intervalo de tempo suficiente para permitir o desenvolvimento de calo embriogénico;

   e) de se transferir o calo embriogénico para um meio dc germi. naçao de plantas; e

   f) de se cultivar o calo embriogénico no meio de germinação

   -72de plantas durante um intervalo de tempo suficiente para se desenvolver uma plãntula a partir do calo embriogênico.
2. 2. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se desenvolver a plãntula de germinação do algodão por meio das seguintes operações:

   a) esterilização da semente em uma primeira solução de esterilização;

   b) lavagem da semente com ãgua esterilizada;

   c) esterilização da semente em uma segunda solução de esterilização;

   f) re-utilização do segundo meio de esterilização da semente com ãgua esterilizada;

   g) transferência da semente para um meio de germinação da semente ; e

   h) desenvolvimento da semente no meio de germinação da semente âs escuras durante um intervalo de tempo suficiente para se obter uma plãntula; e

   i) corte do explantado da plantula.
3. 3. - Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a primeira solução de esterilização ser uma solução aquosa que contém cerca de 95 ’ em volume de etanol e de a segunda solução de esterilização ser uma solução aquosa que contém cerca de 15 5 em peso de hipoclorito de sódio.
4. 4.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o explantado ser escolhido do grupo que consiste em hipocótilo, cotilédone e suas misturas, e embriões zigõticos imaturos.
5. 5. - Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o explantado ser escolhido do grupo que consiste em hipocótilo, cotilédone e suas misturas.
6. 6. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o explantado ser escolhido do grupo que consiste em hipocótilo, cotilédone e suas misturas.
7. 7. - Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o meio de germinação da semente ser um meio à base de agar e de o desenvolvimento antes da remoção do explantado demorar até cerca de 4 semanas.
8. 8. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se desenvolver o calo embriogénico a partir do explantado por desenvolvimento com um ciclo de luz-escuridão de cerca de 16 horas de luz e cerca de 8 horas de escuridão a uma temperatura compreendida entre cerca de 25° e cerca de 35°C.
9. 9,- Método de acordo com a reivindicação 8, caracteri74zado pelo facto de a intensidade luminosa durante as horas de luz ser igual a cerca de 2 000 atê cerca de 4 000 lux.
10. 10. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de a intensidade luminosa durante as horas de luz estar compreendida entre cerca de 3 000 e cerca de 4 000 lux.
11. 11. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se desenvolver calo no primeiro meio de desenvolvimento de calo que contém glucose durante um período de secreções fenólicas, sendo o meio substituído pelo menos de 10 em 10 dias.
12. 12. - Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de se transferir o explantado para um meio de desenvolvimento fresco do primeiro calo a cerca de 3 a cerca de

    4 semanas.
13. 13. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o primeiro meio de desenvolvimento do calo ser um meio de Murashige e Skoog que compreende glucose.
14. 14. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o segundo meio de desenvolvimento do calo ser meio de Murashige e Skoog que compreende sacarose e desde 1 até

    -75cerca de 10 mg/litro de ácido naftalenoacético.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de o segundo meio de desenvolvimento do calo ser meio de Murashige e Skoog que compreende sacarose e desde cerca de

    1 até cerca de 10 mg/litro de ácido naf taienoacético.
16. 16. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a germinação das plantas se realizar em meio de Beasley e Ting, rico numa fonte de azoto.
17. 17. - Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o meio de germinação das plantas ser um meio de Beasley e Ting, rico numa fonte de azoto.
18. 18. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de incluir ainda as operações que consistem na transferência das plântulas para o terreno sob condições de elevada humidade durante um intervalo de tempo suficiente para que cada plântula se desenvolva de modo a poder ser transferida para uma estufa aquecida ou para o campo e desenvolver-se até ã maturidade final.
19. 19.- Método para a regeneração de plantas de algodão a partir de células somáticas, caracterizado pelo facto:

    -76L

    a) de se proporcionar um explantado de algodoeiro do grupo que consiste em hipocótilo, cotilédone ou suas misturas resultante de uma semente de algodão e de embriões não amadurecidos;

    b) de se cultivar o explantado em um primeiro meio de desenvolvimento do calo que é um meio de cultura de Murahige e Skoog completo ou de meia concentração suplementado com cloridrato de tiamina, ácido naftalenoacético e quinetina e inositol a uma temperatura compreendida entre cerca de 25° e cerca de 35°C sob um ciclo de luz de dia de cerca de 16 horas de luz com uma intensidade luminosa compreendida entre cerca de 2 000 e cerca de 4 000 lux e cerca de 8 horas de escuridão durante um intervalo de tempo suficiente para se formar calo indiferenciado a partir do explantado ;

    c) de se transferir o calo do primeiro meio de desenvolvimento do calo para um segundo meio de desenvolvimento do calo que ê um meio de cultura de Murashige e Skoog completo ou de meia concentra ção compreendendo sacarose e desde cerca de 1 a cerca de 10 mg/ /litro de ácido naftalenoacético e de se cultivar o calo a uma temperatura desde cerca de 25° a 35°C sob um ciclo de luz do dia de cerca de 16 horas de luz com uma intensidade luminosa de cerca de 2 000 a cerca de 4 000 lux e cerca de 8 horas de escuridão durante o tempo suficiente para formar calo embriogénico amarelo a branco:

    d) de se subcultivar o calo embriogénico para se desenvolver calo que contém embriões somáticos;

    X

    e) de se transferirem embriões somáticos para um meio de germinação de embriões rico numa fonte de azoto e de se desenvolverem os embriões para se obterem plântulas suficientemente desenvolvidas para serem transferidas para solo.
20. 20. - Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de o primeiro meio de desenvolvimento de calo ser um meio de Murashige e Skoog contendo cerca de 0,4 mg/litro de cloridrato de tiamina, cerca de 30 g/litro de sacarose, cerca de

    2 mg/litro de ãcido naftalenoacético, cerca de 1 mg/litro de quinetina e cerca de 100 mg/litro de inositol.
21. 21. - Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de o segundo meio de desenvolvimento do calo con ter entre cerca de 1 e cerca de 5 mg/litro de ãcido naftalenoacéty co e entre 0 e cerca de 1 mg/litro de citoquinina.
22. 22. - Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de o segundo meio de desenvolvimento do calo conter entre cerca de 1 e cerca de 5 mg/litro de ácido naftalenoacético e entre 0 e cerca de 1 mg/litro de citoquinina.
23. 23. - Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de o meio de germinação de embriões ser um meio dc Beasley e Ting que contém até cerca de 500 mg/litro de hidroli-78- sado de caseína e atê cerca de 1200 mg/litro de nitrato de amónio.
24. 24. - Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de o meio de germinação de embriões conter uma fonte de amónio.
25. 25. - Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de o meio de germinação de embriões ser um meio de Beasley e Ting contendo até cerca de 500 mg/litro de hidrolisado de caseína e até cerca de 1200 mg/litro de nitrato de amónio.
26. 26. - Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de se modificar o meio de primeiro crescimento do calo durante o período de segregação de fenol do calo de cerca de dez em dez dias até que a segregação de fenol pare depois do que se inclui sacarose no meio de desenvolvimento do calo.
27. 27. - Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo facto de, durante um período de segregação de fenol pelo calo, o primeiro meio de desenvolvimento do calo ser substituído dentro de cerca de dez em dez dias até que a segregação de fenol pare depois do que se inclui sacarose no meio de desenvolvimento do calo.
28. 28.- Método para a regeneração de plantas dc algodão a partir de células somáticas, caracterizado pelo facto:

    a) de se esterilizar pelo menos uma semente de algodão em uma solução que contém 95 % em volume de etanol durante um intervalo de tempo de aproximadamente 2-3 minutos;

    b) de se lavar a semente com ãgua esterilizada;

    c) de se embeber a semente numa solução de hipoclorito de sódio contendo cerca de 15 por cento em peso de hipoclorito de sódio durante um intervalo de tempo de cerca de 15 até cerca de 20 minutos ;

    d) de se lavar a semente com água esterilizada;

    e) de se germinar a semente em um ambiente escuro em meio de agar básico de Whites modificado ou em meio de Murashige e Skoog de meia concentração durante um intervalo de tempo de até catorze dias para se obter uma plântula germinada;

    f) de se cortarem segmentos escolhidos do hipocótilo, cotilédone ou suas misturas da plântula germinada;

    g) de se cultivarem os segmentos cortados em um meio de

    Murashige e Skoog suplementado com cerca de 0,4 mg/litro de cloridrato de tiamina, cerca de 30 g/litro de glucose, cerca de 2 mg/ /litro de ãcido naftalenoacético, cerca de 1 mg/litro de quinetina e cerca de 100 mg/litro de isonitol durante um intervalo de tempo compreendido entre aproximcxdamente três e quatro semanas em um ambiente a 30°C sob um ciclo de luz-escuridão de 16 horas de luz e cerca de 8 horas de escuridão a cerca de 3 000 a 4 000 lux de intensidade de luz durante o período de exposição à luz para produ-80- zir calo;

    h) de se transferir o calo para meio de Murashige e Skoog compreendendo sacarose e cerca de 2 mg/litro de ácido naftalenoacético e cerca de 1 mg/litro de citoquinina;

    i) de se cultivar o calo durante um intervalo de tempo de cerca de três a quatro meses para produzir embriões;

    j) de se transferirem os embriões para meio de Beasley e Ting compreendendo cerca de 500 mg/litro de hidrolisado de caseína e uma fonte de azoto e de se cultivarem os embriões durante um intervalo de tempo de cerca de 2 a cerca de 3 semanas para produzir plântulas; e

    1) de se transferirem as plântulas para o solo e de se incubarem as plântulas sob uma humidade elevada para se formarem plantas .
29. 29. - Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo facto:

    a) de se autopolinizarem as plantas de modo a produzir sementes; e

    b) de se germinarem as sementes para produzir plântulas.
30. 30. - Método para a regeneração de uma planta de algodão a partir de células somáticas, caracterizado pelo facto:

    a) de se cultivar um explantado de algodão mediante cultura de tecidos em um meio de desenvolvimento de calo durante um intervalo de tempo suficiente para se desenvolver calo embriogénico;

    -81b) de se subdividir e suspender calo embriogênico em um segundo meio de desenvolvimento de calo e de se desenvolver o mencionado calo para se formarem blocos embriogénicos com pelo menos

    600 micra de tamanho;

    c) de se separarem por filtração os blocos embriogénicos com um tamanho maior do que 600 micra;

    d) de se desenvolverem os blocos embriogénicos com um tamanho maior do que 600 micra em um meio de germinação de plantas durante um intervalo de tempo suficiente para desenvolver plântulas a partir dos blocos.
31. 31. - Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de se suspenderem de novo os blocos com um tamanho inferior a 600 micra em segundo meio de desenvolvimento do calo fresco para um desenvolvimento ulterior de blocos embriogénicos.
32. 32. - Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de se obter o explantado por meio das operações que consistem em:

    a) esterilizar as sementes em uma primeira solução de esterilização;

    b) lavar as sementes com ãgua esterilizada;

    c) esterilizar as sementes em uma segunda solução de esteri1i zação;

    d) enxaguar o segundo meio de esterilização das sementes com ãgua esterilizada;

    e) transferir as sementes esterilizadas para um meio de germinação das sementes; e

    f) cultivar as sementes no meio de germinação de sementes no escuro durante um intervalo de tempo suficiente para se formarem plântulas germinadas de algodão; e

    g) cortar o explantado das plântulas germinadas de algodão.
33. 33.- Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo facto de se obter o explantado por meio das operações que consistem em:

    a) esterilizar as sementes em uma primeira solução de esterilização;

    b) lavar as sementes com ãgua esterilizada;

    c) esterilizar as sementes em uma segunda solução de esterilização ;

    d) enxaguar o segundo meio de esterilização das sementes com ãgua;

    e) transferir as sementes esterilizadas para um meio de germinação de sementes; e

    f) cultivar as sementes no meio de germinação das sementes ãs escuras durante um intervalo de tempo suficiente para sc formarem plântulas de algodão germinadas: e

    g) cortar o explantado das plântulas germinadas ce algodão.
34. 34. - Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo facto de a primeira solução de esterilização ser uma solução aquosa que contém cerca de 95 por cento em volume de etanol;

    e de a segunda solução de esterilização ser uma solução aquosa que contém cerca de 15 por cento em peso de hipoclorito de sõdio.
35. 35. - Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo facto de o explantado incluir pelo menos uma porção de partes de plântulas germinadas escolhidas do hipocótilo, coltilédone e suas misturas.
36. 36. - Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo facto de o meio de germinação das sementes ser um meio de agar básico e de o desenvolvimento antes de se cortar o explantado se realizar durante um intervalo de tempo de até cerca de 14 dias.
37. 37. - Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de se separarem da suspensão os blocos maiores do que cerca de 800 micra para proceder ao desenvolvimento de plantas.
38. 38. - Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de a suspensão da cultura no início do desenvolvimento conter entre 750 e cerca de 1000 miligramas de partes de calo por 8 mililitros do segundo meio de desenvolvimento de embriões .
39. 39. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo facto de a suspensão da cultura no início do desenvolvimento conter entre 750 e cerca de 1000 miligramas de partes de calo por 8 mililitros do segundo meio de desenvolvimento de embriões.
40. 40.- Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de se desenvolver o calo embriogénico na suspensão num ciclo de luz-escuridão com cerca de 16 horas de luz e cerca de 8 horas de escuridão a uma temperatura compreendida entre cerca de 25° e cerca de 35°C.
41. 41. - Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo facto de o calo embriogénico ser desenvolvido em suspensão com um ciclo de luz-escuridão de cerca de 16 horas de luz e cerca de 8 horas de escuridão a uma temperatura compreendida entre cerca de 25° e cerca de 35°C.
42. 42. - Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo facto de a intensidade luminosa durante as horas de exposição ã luz estar compreendida entre cerca de 2 000 e cerca de 4 000 lux.
43. 43. - Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo facto de a intensidade luminosa durante as horas de exposição 5 luz estar compreendida entre cerca de 3 000 e cerca de 4 000 lux.
44. 44. - Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de o segundo meio de desenvolvimento do calo ser meio de Murashige e Skoog contendo ácido naftalenoacético.
45. 45. - Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo facto de o segundo meio de desenvolvimento do calo ser meio de Murashige e Skoog contendo ácido naftalenoacético.
46. 46. - Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de a operação de germinação das plantas se efectuar num meio de Beasley e Ting, rico numa fonte de azoto.
47. 47. - Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de a operação de germinação das plantas se realizar num meio de Beasley e Ting, compreendendo hidrolisado de caseína e uma fonte de amónio.
48. 48. - Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado ainda pelo facto:

    a) de se transferir as plântulas para o solo sob condições de elevada humidade durante um intervalo de tempo suficiente para amadurecer as plantas e permitir a sua transferência para uma estufa quente e depois para o campo para se desenvolverem até ã maturidade final.
49. 49.-86-

    49.- Método para a regeneração de uma planta de algodão a partir de células somáticas, caracterizado pelo facto:

    a) de se proporcionar um exp.¹ antado escolhido no grupo que consiste em hipocótilo, cotilédone e suas misturas derivadas de uma plântula de algodão germinada e de embriões imaturos;

    b) de se cultivar o explantado em um primeiro meio de desenvolvimento de calo que é um meio de desenvolvimento de Murashige e Skoog suplementado com cloridrato de tiamina, glucose, ácido naftalenoacético, quinetina e inositol, a uma temperatura compreendida entre cerca de 25° e cerca de 35°C sob um ciclo de luz do dia com cerca de 16 horas de luz a uma intensidade luminosa compreendida entre cerca de 2 000 e cerca de 4 000 lux e cerca de 8 horas de escuridão durante um intervalo de tenrno suficiente para que se forme calo indiferenciado a partir do explantado;

    c) de se transferir o calo do primeiro meio de desenvolvimento do calo para um segundo meio de desenvolvimento do calo que é um meio de desenvolvimento de Murashige e Skoog contendo sacarose e entre cerca de 1 e cerca de 10 mg/litro de ácido naftalenoacético e de se cultivar o calo a uma temperatura compreendida entre cerca de 25° e 35°C sob um ciclo de luz do dia com cerca de 16 horas de luz com uma intensidade luminosa de cerca de 2 000 a cerca de 4 000 lux c ccrca de 8 horas de escuridão durante c tempo suficiente para desenvolver o calo cmòriogõnico;

    d) dc se suspender partes do calo embriogánico em um segundo meio dc desenvolvimento do calo fresco a uma concentração compre-57- endida entre cerca de 750 e cerca de 100 mg de partes de calo por

    8 mililitros do segundo meio de desenvolvimento de embriões e de se deixar que o embrião se desenvolva durante um tempo suficiente para desenvolver blocos embriogénicos com um tamanho maior do que cerca de 800 micra;

    e) de se separar os blocos embriogénicos maiores de cerca de 800 micra dos blocos com menos de cerca de 800 micra;

    f) de se transferir os blocos embriogénicos de um tamanho maior do que 800 micra para um meio de germinação rico numa fonte de azoto e de se desenvolverem os embriões até ã obtenção de plântulas.
50. 50. - Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo facto de os blocos embriogénicos com menos do que 800 micra serem ressuspensos em um segundo meio de desenvolvimento fresco como na operação d) e de se repetirem as operações e) e f).
51. 51. - Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo facto de o primeiro meio de desenvolvimento do calo ser um meio de desenvolvimento de Murashige e Skoog que contém cerca de 0,4 mg/litro de cloridrato de tiamina, cerca de 30 g/litro de glucose, cerca de 2 mg/litro de ácido naftalenoacético, cerca de 1 mg/litro dc quinetina e cerca de 100 mg/litro dc inositol.
52. 52.- Método de acordo com a reivindicação 49, caracteriza-88- do pelo facto de o segundo meio de desenvolvimento de embriões compreender sacarose e entre 1 e cerca de 5 mg/litro de ácido naftalenoacético e entre 0 e cerca de 1 mg/litro de citoquinina.
53. 53.- Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo facto de o segundo meio de desenvolvimento de embriões conter 1 e cerca de 5 mg/litro de ácido naftalenoacético e entre O e cerca de 1 mg/litro de citoquinina.
54. 54. - Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo facto de o segundo meio de desenvolvimento de embriões conter entre 1 e cerca de 5 mg/litro de ácido naftalenoacético e entre 0 e cerca de 1 mg/litro de citoquinina.
55. 55. - Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo facto de o meio de germinação de embriões ser um meio de Beasley e Ting que contém até cerca de 500 mg/litro de hidrolisado de caseína.
56. 56.- Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo facto de o meio de germinação dos embriões ser um meio de Beasley e Ting que contém até cerca dc 500 mg/litro de hidrolisado dc caseína.
57. 57.- Método de acordo com a reivindicarão 55, caracteriza-89- do pelo facto de o meio de germinação dos embriões ser um meio de

    Beasley e Ting que contém até cerca de 500 mg/litro de hidrolisado de caseína.
58. 58. - Método para transformar plantas de algodão, caracterizado pelo facto:

    a) de se fazer contactar um explantado de algodão com um vector de Agrobacterium contendo um código genético expressível estranho ao algodoeiro durante um intervalo de tempo suficiente para transferir os genes para as células do explantado;

    b) de se incubar o explantado em um meio de desenvolvimento de calo durante cerca de 15 até cerca de 200 horas a uma temperatura compreendida entre cerca de 25 e cerca de 35°C sob um ciclo de 16 horas de luz e 8 horas de escuridão;

    c) de se fazer contactar os explantados incubados com um meio de desenvolvimento do calo contendo um antibiótico que ê tóxico para o Agrobacterium durante um intervalo de tempo suficiente para matar o Agrobacterium;

    d) de se cultivar o explantado isento de Agrobacterium no meio de desenvolvimento do calo; e

    e) de se separar calo transformado de calo não transformado.
59. 59. - Método de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo facto de o meio de desenvolvimento do calo suplementado sor um meio de Murashige e Skoog suplementado com cerca de 1 a cerca de 10 mg/litro de ãcido naftalenoacêtico.
60. 60.- Método de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo facto de o antibiótico tóxico para o Agrobacterium ser Cefotaxime (ãcido 3-/ (acetiloxi)-meti1 _7^-7- / (2-amino-4-tiazolil)-(metoxi-imino)-acetil_7~aminoj -8-oxo-5-tia-l-azabiciclo /74.2.0_7-oct-2-eno-2-carboxílico) .
61. 61.- Método para transformar plantas de algodão, caracterizado pelo facto:

    a) de se fazer contactar, durante um intervalo de tempo compreendido entre cerca de 1 minuto e cerca de 24 horas, segmentos de explantados de plântulas resultantes da germinação de algodão escolhidos de entre hipocótilo, cotilédone e suas misturas, com um vector de Agrobacterium contendo um codão genético que inclui resistência a um antibiótico;

    b) de se transferirem os explantados para um meio de desenvolvimento do calo que é um meio de Murashige e Skoog suplementado com cerca de 1 a cerca de 10 mg/litro de ãcido naftalenoacêtico durante um intervalo de tempo compreendido entre cerca de 15 e cerca de 200 horas a una temperatura compreendida entre cerca de 25 e cerca de 35°C sob um ciclo de cerca de 16 horas de luz e 8 horas de escuridão para desenvolver calo a partir dos explantados;

    c) de se transferir o calo para uni meio de cultura de calo fresco que contém Cefotaxime em unia concentração suficiente para

    -91/ matar o Agrobacterium;

    d) de se cultivar o calo em um primeiro meio de desenvolvimento de calo fresco; e

    e) de se fazer contactar calo com meio de desenvolvimento de calo fresco contendo adicionalmente Cefotaxime para matar o Agrobacterium residual e um antibiótico ao qual o calo transformado é insensível para se escolher calo resistente ao antibiótico.
62. 62. - Método de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo facto de se lavar o calo transformado, antes de ser feito contactar com o meio de desenvolvimento do calo contendo Cefotaxime, com meio de desenvolvimento do calo isento de Cefotaxime.
63. 63. - Método de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo facto de o antibiótico ser Kanamicina.
64. 64. - Método de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo facto de o antibiótico ser Kanamicina.
65. 65. - Método para a produção de calo embriogénico de plantas de algodão transformado a partir de células de algodão que sofrem uma cultura em suspensão num meio de desenvolvimento de calo, caracterizado pelo facto de compreender as seguintes operações realizadas depois de um ciclo de desenvolvimento de subcultura em suspensão:

    -92κ

    a) recuperação das células e de qualquer calo embriogênico formado a partir do meio de desenvolvimento de calo;

    b) ressuspensão das células e do calo recuperados em um meio de desenvolvimento de calo contendo um vector de Agrobacterium que inclui uma sequência genética expressível estranha ao algodão, enquanto se mantêm as condições de desenvolvimento em suspensão durante um intervalo de tempo necessário para transformar as célu·· las de algodão;

    c) recuperação das células suspensas e do calo do meio de desenvolvimento do calo contendo o Agrobacterium;

    d) tratamento das células transformadas e do calo com um antibiótico que é tóxico em relação ao Agrobacterium para matar o Agrobacterium;

    e) escolha das células de algodão transformadas e do calo de células de algodão não transformadas e de células de calo embriogénico; e

    f) filtração de uma suspensão das células para remover o calo embriogênico com dimensões maiores do que cerca de 600 micra.
66. 66. - Método de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo facto de, antes de se filtrar a suspensão, se tratar as células transformadas e o calo com o antibiótico.
67. 67. - Método de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo facto de se escolherem as células transformadas e o calo antes da filtração da suspensão.
68. 68.- Método de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo facto de se escolherem as células transformadas e o calo antes da filtração da suspensão.
69. 69.- Método de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo facto de se tratarem separadamente as células transformadas e o calo embriogénico com o antibiótico a seguir ã filtração da suspensão.
70. 70. - Método de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo facto de as células transformadas e o calo embriogénico serem escolhidos depois da filtração da suspensão.
71. 71, - Método de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo facto de as células transformadas e o calo embriogénico serem escolhidos depois da filtração da suspensão.
72. 72, - Método de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo facto de o tóxico antibiótico para o Agrobacterium ser

    Cefotaxime.
73. 73. - Método dc acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo facto de o tóxico antibiótico para o Agrobacterium ser

    Cefotaxime.
74. 74. - Método de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo facto de o tóxico antibiótico para o Agrobacterium ser Cefotaxime.
75. 75. - Método para a produção de calo embriogénico de plantas de algodão a partir de células que sofreram a cultura em suspensão num meio de desenvolvimento de calo, caracterizado pelo facto de compreender, depois de um ciclo de subcultura de desenvolvimento em suspensão de cerca de 7 a cerca de 14 dias, as seguintes operações:

    a) recuperação das células do meio de desenvolvimento do calo;

    b) ressuspensão das células em um meio de desenvolvimento do calo que contém um vector de Agrobacterium incluindo uma sequência genética expressável estranha ao algodão enquanto se mantêm as condições de desenvolvimento em suspensão durante um intervalo de tempo suficiente para transformar as células suspensas;

    c) recuperação das células do meio de desenvolvimento do calo que contém o Agrobacterium;

    d) subcultura ulterior das células no seio de meio de desenvolvimento de calo fresco isento do Agrobacterium;

    e) filtração da suspensão para isolar calo embriogénico maior do que cerca de 600 micra;

    -95f) ressuspensão das células residuais em um meio de desenvolvimento que contém um antibiótico que é tóxico para o Agrobacterium;

    g) tratamento do calo embriogênico com um antibiótico que ê tóxico para o Agrobaterium; e

    h) separação das células transformadas e calo embriogênico de células não transformadas e de calo embriogênico.
76. 76,- Método de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo facto de o antibiótico ser Kanamicina.
77. 77.- Método para a produção de calo de plantas de algodão transformado a partir de células de algodão que sofrem cultura em suspensão num meio de desenvolvimento de calo, caracterizado pelo facto de compreender, depois de um ciclo de desenvolvimento de subcultura em suspensão de cerca de 7 até cerca de 14 dias, as seguintes operações:

    a) recuperação das células do meio de desenvolvimento do calo;

    b) ressuspensão das células em um meio de desenvolvimento do calo contendo um vector de Agrobacterium que inclui uma sequência genética resistente a antibióticos enquanto se mantêm as condições de desenvolvimento cm suspensão durante um intervalo de tempo suficiente para transformar as células suspensas;

    c) recuperação das células do meio de desenvolvimento do calo que contém o Agrobacterium;

    d) lavagem das células com meio de desenvolvimento de calo isento de Agrobacterium;

    e) subcultura ulterior das células em meio de desenvolvimento do calo fresco isento do Agrobacterium;

    f) filtração da suspensão para separar o calo embriogénico maior do que cerca de 600 micra;

    g) ressuspensão das células residuais em um meio de desenvolvimento do calo que contém Cefotaxime; e

    h) contacto das células residuais suspensas e do calo embriogénico separado com um antibiótico ao qual as células transformadas são insensíveis para escolher as células transformadas.
78. 78. - Método de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo facto de o antibiótico ser Kanamicina.
79. 79. - Vector para conferir resistência antibiótica a uma planta de algodão, caracterizado pelo facto de compreender duas sequências da margem da direita de T-DNA de A. Tumefaciens capaz de integração com o genoma de plantas ladeando um gene quimérico capaz de expressão em algodão e de conferir resistência aos antibióticos Kanamicina e G418.
80. 80. - Vector de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo facto de o gene quimérico compreender, em sequência, um promotor de napolina-sintetase, uma região de codificação de neomicina fosfotransferase II de Tn5 e o terminador do vírus de herpes simplex-timidina-quinase,

    Lisboa, 18 de Novembro de 1988 •0 Agente Oficiei do Propnedcide Industrioi

    RESUMO

    Método para a regeneração e transformação de plantas de algodão

    A invenção refere-se a métodos para regenerar plantas de algodão por cultura de tecidos e suspensão a partir de explantados que são hipocõtilos, cotilédones ou embriões imaturos.

    Também proporciona métodos para transformar algodão e melhorar algodão por desenvolvimento selectivo.