JPH03103127A - ＣｕｃｕｍｉｓＭｅｌｏ（マスクメロン）種に属する遺伝子導入植物 - Google Patents

ＣｕｃｕｍｉｓＭｅｌｏ（マスクメロン）種に属する遺伝子導入植物

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （Ｍ業上の利用分野） 本発明は，ウリ属特にメロン（マスクメロンＣｕｃｕｍ
ｉｓ　ｍｅｌｏ　）に属する植物の遺伝子的形質転換方
法に関する。かかる方法には、アグロバクテノウム・ツ
メファシエンスによる外植体の形質転換及び形質転換さ
れた植物のミ生外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏｌの再生が関与し
ている。
かかる形質転換及び再生技術は、例えばマスクメロン種
に属する植物内にキュウリモザイク病ウィルスに対する
抵抗性遺伝子を導入するために用いることができる。
（従来の技術） ｌ植物種の遺伝子特性をもう１つの植物種に移入するこ
とは、数多くの場合において非相容性という障害によっ
て制限されている。
かかる問題は特にカボチＪＩＰ　（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ
ｃｅａｅｌ科，ウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓｌ属（メロン及び
キュウリ）及びカボチャ属（セイヨウカボチャ）につい
て見られるちのである。したがって、野生種に存在する
ウィルス性疾病又は害虫に対する抵抗性といった作物学
的に有利な性質は、一栽培種には移入することができな
い。
ウリ属の栽培種の中で可能な唯一の性交配は、Ｃ．　ｓ
ａｔｉｖｕｓ　（キュウリ）とその類似種であるＣ．ｈ
ａｒｄｗｉｃｋｉｉ及びＣ．　ｓｉｋｋｉｍｅｎｓｉｓ
間のものである（Ｄｅａｋｉｎ他、１９７１年；　ｖ３
１　１ＢＢｍｓｄｏｎｋ　．１９８９年）　．　Ｃ．　
ｓａｔｉｖｕｓとその他の野生種の間の交配はほとんど
の場合において、不稔の実しか与えないだろう；ただし
メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｍｅｌｏ）は、他のいかなる
種とも交配され得ない種である（Ｋｈｏ他，１９８０年
；　Ｖａｎ　Ｒａａｍｓｄｏｎｋ　．　　１　９　８　
９年）． 遺伝子工学の新しい技術の応用は、植物種の改良を目的
とした新しい性質の導入のための将来性ある代替案であ
る．これらの技術の中には、外来（異質）の単数又は複
数の遺伝子の導入、原形質体の融合による体細胞交雑及
びソマクローナル変化の誘導又は遺伝子的変更を誘導す
るための突然変異などがある． 植物種内への外来遺伝子の移入は、無防備のＴｉプラス
ミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスの菌
株を用いることによってかなり一般的な形で行なわれて
いる（Ｆｒａｌｅｙ他、１９８６年）　（Ｋｌｅｅ他、
１９８７年）　（Ｈｏｒｓｃｈ他、１９８５年）。実際
、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いてさま
ざまな遺伝子導入植物が得られた。この細菌は、形質転
換された植物を再生することのできる植物細胞に外来遺
伝子を移入することを可能にする。有利な作物学上の性
質に対しコード付けする遺伝子が、植物種内に導入され
た。こうして、除草剤（Ｄｅｇｒｅｅｆ他、１９８９年
）及び害虫（Ｈｉｌｄｅｒ他、１９８７年：Ｖａｅｃｋ
他、１９８７年）に対する抵抗性をもつ植物を得ること
ができた。
遺伝子の移入は、中間ベクターを用いることにより相同
組換えの後、無防備のＴｉブラスミドから（Ｆｒａｌｅ
ｙ他、１９８５年）らしくは無防備のＴｉブラスミドを
用いて二元ベクターから（Ｂｅｖａｎ、１９８４年：　
Ｆｒａｌｅｙ他、１９８６年）行うことができる。
かかる遺伝子移入は同様に、形質転換された組織から遺
伝子導入植物の代わりに根を誘導するような側根を生じ
るアグロバクテリウムを用いることによってち行うこと
ができる。これらの形質転換された根から、異常な表現
型をもつ植物を再生することができる（Ｃｈｉｌｔｏｎ
他、１９８２年、Ｄａｖｉｄ他、１９８４年）。
特に有利な性質は、ウィルス性の疾病に対する抵抗性で
ある。さまざまなウィルスに対する抵抗性を持つ遺伝子
的に形質転換された植物が得られた（Ｐｏｗｅｌｌ　Ａ
ｂｅｌ他、１９８６年）　（Ｃｕｏｚｚｏ他、１９８８
年）　（Ｔｕｎｅｔ他、１９８７年）　（Ｈｏｅｋｅｍ
ａ他、１９８９年）　（Ｖａｎ　Ｄｕｎ　＆　Ｂｏｌ．
　１　９　８　８年）。これらの植物（タバコ、ジャガ
イモ及びトマト）は、かかる植物が抵抗性を有するウィ
ルスのカプシドタンパク質に対しコード付けする遺伝子
を表現する。保護のメカニズムは今だに立証されていな
い。
ウィルス性疾病に対して植物を保護するための古典的な
方法は、より有害な菌株による感染を予防するため、ウ
ィルスの減衰された菌株を植物に接種することから成る
。交差保護と呼ばれるこの実践方法によると、ウィルス
感染に起因する生産量の損失を軽減することができた。
（Ｂｒｏａｄｂｅｎｔ、１９７６年）　（Ｆｅｒｎｏｗ
、１９６７年）　（Ｃｏｓｔａ　＆Ｍｉｌｌｅｒ　．　
　１　９　８　０年）。
遺伝子工学技術を応用するためには、培養された個々の
細胞又は外植体からの植物の再生システムが必要不可欠
である。
かかる方法は最近、形質転換されていないカボチャ（Ｃ
ｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅｓ）の再生について開示され
た。
子葉からのカルス（＠合組織）上の不定芽の誘導後のキ
ュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｓａｔｉｖｕｓ）の再生が記
述された（ｌＪｓｉｋｔｔａ他、■９８８年、Ｋｊ．ｍ
他、１９８８年）　　：　Ｗｅｌ＋ｎｅｒ及びＬｏｃｙ
（１９８１年）はすでに、子葉上の芽の誘導について記
述していた。キュウリの植物は、体細胞胚形成によって
再生させることができた。これらの体細胞胚は、葉の外
植体（Ｃｈｅｅ及びＴｒｉｃｏｌｉ、１９８８年）又は
胚軸（Ｒａｊａｓｅｋａｒａｎ他、１９８３年）から発
達させられたカルスからの細胞懸濁液内で、もしくは子
葉カルス（Ｃａｄｅ他，１９８８年）又は葉のカルス（
Ｍａｌｅｐｓｚｙ及びＮａｄｏｌｓｋａ−Ｏｒｃｚｙｋ
、１９８３年）上で直接発達させられた。上述の全ての
ケースにおいて該材料には、カルス発生及び細胞異分化
の段階を通過することが必要であった。カルス発生段階
を長時間通ると、望ましくないソマコローナル変化が誘
導されつる。或る種の場合、これらの変化は、再生され
た植物における不稔性を誘発する可能性がある。
メロン（Ｃ．　ｍｅｌｏｌ　に関しては、器官形成によ
る再生については、すでに、培養に付された子葉に対し
直接的に（Ｓｍｉｔｈ他、１９８８年；　Ｎｉｅｄｚ他
、印刷中：　Ｄｉｒｋｓ及びＶａｎ　Ｂｕｇｇｅｎｕｍ
、１９８９年）：又は、子葉からのカルスを通過した後
に（Ｍａｃｋａｙ他、１９８８年；　Ｍｏｒｅｎｏ他、
１９８５年；　Ｏｒｔｓ他、■９８７年；　Ｂｏｕａｂ
ｄａｌｌａｈ及びＢｒａｎｃｈａｒｄ、１９８６年）、
胚軸からのカルスの通過後（Ａｂａｋ及びＤｕｍａｓ　
ｄｅ　Ｖａｕｌｘ、１９８０年、Ｋａｔｈａｌ他、１９
８６年）又は葉からのカルスの通過後ｆＫａｔｈａｌ他
、１９８８年）に行なうものとして記述された。
体細胞胚からのメロンの植物の獲得についてち同様に報
告されている（Ｏｒｉｄａｔｅ及びＯｏｓａｗａ、１９
８６年；　１３１−ａｎｃｈａｒｄ及びＣＨａｔｅａｕ
．　　１　９　８　８年）。
これらの技術は全て、多少の長さの差こそあれ、芽又は
胚の分化に先行する異分化及びカルス発生の段階の通過
を必要とする。これらの芽は発育して，異常な表現型を
もつ植物又は不稔の植物をもたらす可能性がある（Ｂｏ
ｕａｂｄａｌｌａｈ及びＢｒａｎｃｈａｒｄ．　　１　
９　８　６年）。その上、カルスからの芽又は胚の誘導
は、子葉上での芽の直接的誘導に比べて弱いものである
。
もう１つのカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｓｅｓ
）種における再生技術についても４己述されている：す
なわち、セイヨウカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ　ｐｅ
ｐｏ）に関するものである（Ｊｅｌａｓｋａ、１９７２
年、１９７４年）。当該研究者は、数カ月間栽培された
カルスからの体細胞胚から植物を得た。
遺伝子的に形質転換された植物の再生に関しては、ＥＰ
−Ａ−０２６２９７２は、側根を生じるアグロバクテリ
ウムによるＣｕｃｕｍｉｓ　ｓａｔｉｖｕｓ（キュウリ
）の形質転換とそれに続く再生について記述しており、
ＥＰ−Ａ一〇２６５１００は原形質体（プロトプラスト
）の融合によるＣｕｃｕｍｉｓｓａｔｉｖｕｓの形質転
換とそれに続く再生について記述している。
Ｄｅ　Ｂｏｔｈ及びＢｅｎ　Ｔａｈａｒ　（　１　９　
８　９年）は、形質転換されたメロンのカルスの獲得に
ついて報告した。カナマイシン上で発育しβ−グルクロ
ニグーゼの遺伝子を表現するこれらのカルスは、形質転
換されていないメロンの再生においてすでに使用され成
功した実験プロトコルを使用したにもかかわらず、遺伝
子導入植物を発育させることができなかった。
マスクメロン種における遺伝子導入植物の獲得はいまだ
かつて一度も報告されていない６これまでマスクメロン
種における形質転換された組織からの再生方法が存在し
ていないからといって、ウィルス性疾病に対する抵抗性
といった作物学的に有利な性質を表現するメロンの遺伝
子導入植物を得ることが妨げられているわけではない。
（発明が解決しようとする課題） 本発明の目的の１つは、マスクメロン種に属する遺伝子
導入植物の再生を可能にすることにある。
本発明のもう１つの目的は、Ｃｕｃｕｍｉｓ　　（ウリ
）属に属する遺伝子導入植物の再生の各段階に必要な培
養培地を構成することにある。
本発明は、さらに限定的に言うと、アグロバクテルウム
・ツメファシエンスの使用によるマスクメロン種の子葉
、胚軸、葉の遺伝子的形質転換と、それに続く芽の誘導
及び遺伝子的に形質転換された植物の獲得に関する。上
述のさまざまな組織の遺伝子的形質転換及びそれに続く
器官形成により、栽培種、特に、マスクメロン種の改良
が可能となる。本発明で記述されている条件下で再生さ
れた植物は、正常な表現型を有し生殖能をもつ。
本発明のちう１つの目的は、キュウリモザイク病ウィル
ス（ＣＭＶ）に対する抵抗性の遺伝子を導入するためメ
ロンを遺伝子的に形質転換することにある。
上述の目的は、本発明に基づく方法によって達成される
。
（課題を解決するための手段） 本発明は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ　　（アグロバクテリウム・ツメファンシエ
ンス）を介して導入された少なくと６１つの遺伝子を含
むＣｕｃｕｍｉｓ　ｍｅｌｏ　　（マスクメロン）種に
属する幼形を遺伝子的に形質転換された芽から生産する
方法において、遺伝子的に形質転換された芽を連続した
２段階で栽培すること及びかかる栽培段階のうちの第１
の段階は、サイトキニン、さらに限定的に言うと，６−
ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を含む植物細胞培養培
地上で行なわれ、芽が約３ｍｍ以上の高さに達した時点
で行なわれる第２の段階は多量成分として、 ＫＨ　．ＰＯ．　　　　　　約５０〜約１００　ｍｇＬ
−’ＭｇＳ○４　　　　　　約７５〜約３００　ｍｇＬ
−’Ｃ　ａ　Ｃ　１２　＊　・２　Ｈ　２　０　　約５
００〜約２５００ｍｇＬ−　’ＫＮＯ．　　　　　　　
　約７５０〜約１２００ｍｇＬ−　’ＮＨ　４Ｎｏ．　
　　　　　約ｉ５０〜約２００ｍｇＬ−　’を含む植物
細胞培養培地上で行なわれることを特徴とする方法に関
する。
本発明は同様に、アグロバクテリウム・ツメファシエン
スにより導入された少なくとも１つの遺伝子を含み、遺
伝子的に形質転換された外植体から遺伝子的に形質転換
された芽の誘導方法であって、かかる外植物体はマスク
メロン種の植物に由来するものであり、誘導は、無機塩
としては塩化カルシウムそして細菌一寒天又は寒天一寒
天を含む遺伝子的に形質転換されていない外植体からの
芽の誘導にとって通常必要とされるビタミン及び無機塩
の組合せを有する遺伝子的に形質転換された芽の誘導培
地上で行なわれるような方？において、かかる培地のＣ
　ａ　Ｃ　ｆ２２含有量はＣａＣｌ２■　・２Ｈ．０と
して計算された場合約４４０〜約２　２　０　０　ｍｇ
Ｌ−’であり、細菌一寒天又は寒天一寒天の含有量は約
０．８〜約１。２％であり、かかる誘導培地には約０．
３〜約１．１３ｍｇＬ−　’の６−ベンジルーアミノブ
リン（ＢＡＰ）及び約Ｏ〜約１．　３ｍｇＬ−’のイン
ドール−３−酢酸（ＡＩＡ）が加えられることを特徴と
する誘導方法にも関する。
本発明の好ましい一実施態様によると、形質転換された
芽のかかる誘導方法は、カルシウム含有量が約ｌＯＯＯ
〜約２２００ｍｇＬ−’　．さらに限定的に言うと、約
１７５０〜約２　２　０　０　ｍｇＬ−’である誘導培
地上で行なわれる。
本発明の方法を実施することにより、マスクメロン種に
属する植物の外植体を形質転換して遺伝子導入植物の形
で再生することができる。本発明は同様に、本発明の方
法により生産されつるような遺伝子導入植物、遺伝子導
入幼形、形質転換された芽及び形質転換された外植体な
らびに種子にも関する。
外植体から形質転換された又はされていない植物の再生
には、複数の細胞培養段階が関与し、各々の段階が培養
培地、例えばサイトキニンといった添加剤ならびに、往
々にして再生すべき種及び再生「経路」　（つまり例え
ば器官形成によるか又は体細胞胚形成によるか）に応じ
て異なる極めて精確な培養条件を必要とする． 培地及び条件全体が、形質転換されていない１つの植物
の再生についてわかっている場合でさえ、形質転換され
た状態にある植物の再生においてかかる同一の培地及び
条件を適用して成功するかどうか予知することは不可能
である。追加の形質転換段階には、形質転換培地及びコ
カルチャ（共培養）培地といったその他の培地、及びセ
フォタキシムといったような、後の段階で適用可能な培
地及び条件における細胞の挙動に対し影響を及ぼしつる
ようなその他の添加剤を使用する必要がある．ガラス化
に対する形質転換された植物の感受性も又、時として特
殊な条件の開発を必要とする１つの要素である。
ガラス化された植物は、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）培
養条件の結果としての形態学的及び生理学的な一連の異
常により特徴づけられる。ガラス化を説明するために往
々にして挙げられる原因は、次のようなものである： ＮＨ．’イオン又はサイトキニンの過度に高い濃度。
培地中の寒天（又はその他のゲル化剤）の過度に低い濃
度。
培養培地の容積内にある植物によって生成されたエチレ
ンに対する感受性（Ｋｅｖｅｒｓ他、１９８４年）６ 培地内にサイトキニンが存在することによる生体外のメ
ロン幼形培養のガラス化は、Ｌｅｓｈｅｍ他（１９８４
年）により報告された。
従って、これらの要素の全てが、遺伝子導入植物の再生
に導く培地及び条件全体の調整をきわめて複雑なものに
している。
当該発明者は、形質転換された外植体から遺伝子的に形
質転換された芽を誘導できるようにする芽の誘導培地を
組成することに成功した。かかる培地は、無機塩として
の塩化カルシウムと細菌一寒天又は寒天一寒天を含む、
遺伝子的に形質転換されていない外植体からの芽の誘導
にとって通常必要とされる無機塩及びビタミン全体を有
する芽の誘導培地である。なおここで、かかる培地のＣ
　ａ　Ｃ　９　２含有量はＣａ（１！ｚ−２Ｈ２０とし
て計算した場合約４　４　０ｍｇＬ−’　〜約２　２　
０　０ｍｇＬ−’であり、細菌一寒天又は寒天一寒天の
含有量は約０．８〜約１．２％である。かかる誘導培地
には、約０．　３ｍｇＬ−’　〜約１　．　１　３ｍｇ
Ｌ−’の６−ペンジルアミアノプリン（ＢＡＰ）及び約
０〜約１．　３ｍｇＬ−’のインドール−３−酢酸（Ａ
ＩＡ）が添加される。
特に好ましい誘導培地は、そのカルシウム含有量が約１
　０　０　０ｍｇＬ−’　〜約２　２　０　０　ｍｇＬ
−’さらに限定的に言うと、約１　７　５　０　ｍｇＬ
−１〜約２　２　０　０ｍｇＬ−’であるような誘導培
地である。これらのカルシウム濃度は、誘導培地内で通
常用いられる濃度の約４倍から５倍の増大に相当する。
一般的に言って、該発明者は、カルシウムの高濃度が、
形質転換されたメロンの再生段階に対して極めて有益な
効果を有することを確認した。第４図は、異なる表現型
のメロンにおける芽の誘導に対するカルシウムのさまざ
まな濃度の影響を示している。
本発明の一実施態様に従うと、芽の誘導培地は、ＭＳ培
地の名で知られるＭｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ　
（　１　９　６　２年）の培地であってよく、ががる培
地のＣａＣβ２及び細菌一寒天又は寒天一寒天の含有量
は、場合によって、上述の限界を守りながら変更される
。変更無しの場合、ＭＳ培地の組成は以下のとおりであ
る： 牲旦里辿　　　　　　　　　（　ｍｇＬ刊）ＮＨ　．Ｎ
ｏ．　　　　　　　　１　６５０ＫＮ０．　　　　　　
　　　　１９００ＣａＣｌ２２”２Ｈ．０　　　　　４
４０Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ　４・７Ｈ　２０　　　　　３７０
ＫＨ２Ｓ０．　　　　　　　　　１７０ＦｅＳＯ４　・
７ＨａＯ　　　　　　　　２Ｔ−　　８Ｎ　ａ　２　Ｅ
　Ｄ　Ｔ　Ａ　　　　　　　　　　　　３　３　．　　
６ＭｎＳＯ４　・４Ｈ２０　　　　　　　　２２．３Ｚ
ｎＳＯ　４　　・７Ｈ　２　０　　　　　　　　　８．
　　６Ｈ．ＢＯ３　　　　　　　　　　　　　　　　６
．２ＫＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ．
８３Ｎａ．ＭｏＯ＜−２Ｈ２０　　　　　　　０．２５
ＣｕＳＯ−−５Ｈ．Ｏ　　　　　　　　　Ｏ．０２５Ｃ
ｏＣｆ２ｚ　　・６１−１２０　　　　　　　　　０．
０２５ミ才−イノシトール　　　　　ｉｏｏ ニコチン酸　　　　　　　　　　　０．　５ビリドキシ
ン・ＨＣβ　　　　　　０．　　５チ？ミン−ＨＣＩ２
　　　　　　　　　０．　　１グリシン　　　　　　　
　　　　　　２、０サッ力ロース（蔗糖）　　　　　　
　０．０００ｐＨ　　　　　　　　　　　　　　　　５
．７凝固したＭＳ培地は、さらに０．８％の寒天一寒天
又は細菌一寒天を含んでいる。
好ましい誘導培地は、ＭＳ培地に０．３〜１　．　１　
３ｍｇＬ−’のＢＡＰＪ特に０．　８５ｍｇＬ−’のＢ
ＡＰを加えたもので、その他のサイトキニンは全く無い
ものである。
誘導培地内に存在するビタミンは、通常ＭＳ培地中に存
在するちのであってもよい。本発明に基づくもう１つの
実施態様に従うと、これらのビタミンは「スタバ（Ｓｔ
ａｂａ）　Ｊのビタミン（Ｓｔａｂａ、１９６９年）で
あってよい。
「スタバＳｔａｂａ』のビタミン ニコチンアミド　　　　　　　　２　　　ｍｇＬ−’ビ
リドキシンーＨＣβ　　　　　２　　　ｍｇＬ引ｄ−ビ
才チン　　　　　　　　　ｌ　　　ｍｇＬ−’Ｃａ−パ
ントテン酸塩　　　　　ｌ　　　ｍｇＬ刊チアミンーＨ
ＣＩ２１　　　ｍｇＬ−’塩化コリン　　　　　　　　
　　ｌ　　　ｍｇＬ引ｐ−アミノ安息香酸　　　　　　
０．　５ｍｇＬ−’葉酸　　　　　　　　　　　　　０
．　５ｍｇＬ−’リボフラビン　　　　　　　　　０．
　５ｍｇＬ−’シアノコバラミン　　　　　　　　１．
　　５ｍｇＬ−’特に好ましい芽の誘導培地は、当該発
明者が完成した「Ｍ、Ｉ．培地」と呼ばれる培地である
。
Ｍ．Ｉ．培地は以下のような組成を有す′る：址エエエ
贋迦 多量成分：　Ｋ　Ｎ　Ｏ　３１９００　ｍｇＬ−　’Ｎ
ｌ｛４ＮＯ３　　　　　　１６５０ ＣａＣ（２　２　・２Ｈ　２０　　２２００Ｍ　ｇ　Ｓ
　Ｏ　＜・７　Ｈ　２０　　３７０ＫＨ．Ｐ○，Ｉ７０ Ｎａ　２ＥＤＴΔ　　　　　ＭＳと同し微量成分　　　
　　　　　ＭＳと同じ ビタミン　　　　　　　　Ｓｔａｂａ ミ才一イノシトール　　　　　　　　１００　ｍｇＬ−
サツ力ロース　　　　　　　　　　　３０　　ｇＬ−寒
天一寒天　　　　　　　　　　　　０．８％ＢＡＰ　　
　　　　　　　　　　　　　３．７５μＭＡＢＡ　　　
　　　　　　　　　　　　１μＭ凝固したＭ．Ｉ．培地
の寒天含有量は０．８％から１％（重量／体ｆ！）に変
更することができる。好ましくは０．８％である。本発
町に基づく誘導培地にアブシジン酸を約１ＰＭ加えるこ
とち可能である。
当該発明者が完成したもう１つの培地は、形質転換され
た芽から遺伝子導入幼形を得ることができるようにする
ちのである。
この培地は、無機多量成分として以下のちのを含む植物
細胞培養培地である： Ｋ８２Ｐ０４　　　　　約５０〜約１００　ｍｇＬＭｇ
ＳＯ４＝　７Ｈ２０　　約７５〜約３００　ｍｇＬ−１
ＣａＣｌ２．・２Ｈ２０　　約５００〜約２５００　ｍ
ｇＬ−’ＫＮＯ３　　　　　　　　約７５０〜約１２０
０　ｍｇＬ−ＮＨ　４ＮＯ３　　　　　約１５０〜約２
００　ｍｇＬ−’例えば多量成分、ビタミンなどのその
他の培地構成成分は、ＭＳ培地のような細胞培養培地に
おいて通常用いられる、通常の濃度のものである。
ザッカロース含有量は、約１０ｇＬ−’まで減らすこと
ができる。
本発明の好ましい一実施態様においては、遺伝子導入幼
形の発育のための培地には、多量成分として以下の６の
が含まれている ＫＨ　２　Ｐ　０４　　　　　　　　　　８　５　ｍｇ
ＬＭｇＳＯ＜　・７８ｚＯ　　　　　１８５　ｍｇＬ−
１ＣａＣｌ２２　・　２Ｈ　２０　　　　　　１７２０
　　ｍｇＬＫＮＯ３　　　　　　　　　　　　　　　９
５０ｍｇＬＮ　Ｈ　４　Ｎ　Ｏ　ｘ　　　　　　　　　
　　　　　１　６　５　　ｍｇＬ−　’本発明のかかる
態様に従ったＣａＣｌｆｚ２Ｈ２０含有量は、従来の培
地の場合に比べ約５倍であることに留意されたい。一方
、Ｋ　Ｈ　２　Ｐ　Ｏ　４．　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ　４　　
・７Ｈ２０及びＫＮＯ３の濃度は、その他のこのタイプ
の培地にみられるちのの約半分であり、ＮＨ．Ｎｏ　３
の濃度は約１０分の１である。
遺伝子導入幼形の発育のための本発明に基づく特に好ま
しい培地は、表ｌにその組成が示されている、ＭＢ６と
呼ばれる培地である。
培地ＭＢ６ 表　　１ 当該発明者により完成されたこの培地は、芽から遺伝子
導入幼形を得るために肝要なものである。ただし、芽の
栽培を２段階で行なうことが重要であり、これらの段階
のうちの第１のものはサイトキニンを含む第１の植物細
胞培養培地上で行なわれる。このサイトキニンは、カイ
ネチン（Ｋｉｎｅｔｉｎｅ）又はＢＡＰであってもよい
。特にＢＡＰが好まれる。適切な第ｌの細胞培養培地は
、例えばＭＳ培地に０．１〜１．２ｍｇＬ−’　．特に
約０．　　２ｍｇＬ−’のＢＡＰをカロえたものである
。かかる培養培地は通常、約０．８％の寒天一寒天又は
細菌一寒天の添加により凝固させられる。
芽がこの第１の培地上で約３ｍｍ以上の高さに達した時
点で、遺伝子導入幼形の獲得を可能にするＭＢ６培地と
いった以下に詳述するような培地である第２の培地上に
この芽を移植する。かかる培地のことを以下ではｒＭＢ
Ｓタイプの培地」と呼ぶ。
このＭＢ６タイプの培地上で、高さ３ｍｍ以上の芽は伸
び、約４週間たつと、幼形が根を付ける。
この培地上で二次根がひとたび発達すると、腐食土と粗
砂の混合物を含む鉢の中に植物を移植させて温室栽培に
付すことができる。こうして得られた遺伝子導入植物は
、正常な表現型を持ち、稔性がある。
当然のことながら、本発明の培地には場合によって、例
えば抗生物質といった形質転換体の選択を可能にする製
剤及びセフオタキシムといったＡ．ツメファシエンスの
増大を抑制する製剤が付加される。使用可能なセフオタ
キシム濃度は、約２　０　０　ｍｇＭ’から約４　０　
０ｍｇＬ−’である。カナマイシンでの選択を同時に適
用することにより、抑制のためのセフ才タキシムを約２
　０　０ｍｇＬ−’用いることが可能となる。幼形の発
育は、このむしろ低い濃度によって影響されないため、
セフ才タキシムを２　０　０　ｍｇＬ−’用いることが
きわめて好ましい。使用されるカナマイシン濃度は、約
５０から４　０　０　ｍｇＬ−’の間で変化しつる。Ｍ
．Ｉ．培地が選択培地として用いられる場合、カナマシ
イン濃度は１　５　０ｍｇＬ−’から４　０　０　ｍｇ
Ｌ−’でなくてはならない。
本発明の一実施態様によると、芽の誘導培地及びＭ８６
タイプの培地は、形質転換された外植体からのメロンの
遺伝子導入植物の再生において連続的に用いることがで
きる。誘導培地上での培養により誘導された芽は、外植
体が切除され、例えばＢＡＰのようなサイトキシンを含
む第１の幼形発育培地上に、次にＭＢ６タイプの培地上
に移植される． 本発明のもう１つの実施態様によると、マスクメロン種
に属する植物の外植体はアグロバクテリウム・ツメファ
シエンスにより形質転換され、こうして得られた形質転
換された外植体は次に芽の誘導培地上で栽培される。次
に、芽は遺伝子導入幼形の発育段階を受ける。かかる段
階はすでに説明したとおり、２段階で進められ、これら
の段階のうちの最後のものは、ＭＢ６タイプの培地上で
行なわれる．最終的に、こうして得られた遺伝子導入幼
形は、形質転換されていない幼形の発育において既知の
方法により栽培され、遺伝子導入植物が得られることに
なる。
遺伝子導入メロンの形質転換及び再生のための出発物質
として用いられる外植体は、例えば子葉、胚軸、葉とい
ったアグロバクテリウム・ツメファシエンスにより形質
転換可能ないかなる外植体でもよい。外植体としての子
葉の使用が特に有利である。当該発明者は、最高４日間
、さらに限定的に言うと、２日間の栽培がなされた胚か
ら採取された子葉上での芽の再生の可能性は、それより
若い又はそれより古い子葉が示す可能性よりも高い（第
１図参照）。この現象は、異なる数多くの変種において
みられた。子葉は、Ｏ日〜４日間発芽した屁からのもの
であり、胚はメロンの成熟した穀粒から分離されたちの
である、ということを明記しておくことが大切である。
種子からの発芽は、同じ有利な結果をもたらさない。発
芽培地は、好ましくは、滅菌水中の０．８％（重量／体
積）の寒天一寒天であり、これには５０ＰのＣ　ｏ　Ｃ
　１２　２又はＮ　ｉ　ＣＩ２２を添加すルコトカテき
、でうして次の段階における芽の誘導が改善されるよう
に思われる。上述のとおり、発芽期間はＯ日から４日で
ある。３日未満、特に、２日未満の期間が特に好ましい
。発芽は通常６０から８　０　ｕ　Ｅｍ−２ｓ−’の光
度で、１６／２４時間の光周期で、昼間はは約２６゜Ｃ
、夜間は２４℃で行なわれる。
メロンの外植体の遺伝子的形質転換は、例えば細菌懸濁
液の形でのＡ．ツメファシエンス菌株と、例えば切断に
より傷を受けた外植体との接触により行なわれる。子葉
の場合、細菌との接触は、子葉が０日から４日、さらに
限定的に言うと、２日の発育を経た時点で行なわれる。
かかる接触の時間は、きわめて重要なものではない。例
えば、この接触は約３０分から１時間であってもよいし
、Ｍ．Ｓ．培養培地内でのた濁液中などで行なわれる。
その後、外植体は滅菌されたろ紙上で乾燥され、寒天一
寒天で凝固させられたＭＳ培地でありうるコカルチャ培
地上に移植される。コカルチャの際に適用される光度及
び光周期の条件は、一Ｉｉ１９に発芽段階の際に用いら
れたちのと同じである。通常、このコカルチャ段階は約
４８時間続く。
Ａ．ツメファシエンスのノパリン及び才クトピンを有す
る数多くの菌株が知られており、マスクメロン種の遺伝
子的形質転換に用いることができる。
当該発明者は、ワシントン大学のＧ．　Ａｎｎにより提
供されている（　Ａｎｎ他、１９８５年）二元ベクター
ｐ　Ｇ　Ａ　４　７　２とＴｉブラスミドｐ　Ａ　Ｉ−
４４０４を含むオクトビンを有する菌株又はノパノンを
有する菌株（Ｂｅｎ　Ｔａｈａｒ及びＤｅ　Ｂｏｔｈ、
１９８８年）を用いた。これらの菌株はそのベクターが
かき取られ、Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｉｎｓｔ
ｉｔｕｔのＲ．　Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎにより提供されて
いる二元ベククーｐ　Ｂ　Ｉ　１　２　１　（ｊｅｆｆ
ｅｒｓｏｎ他、１９８７年）が、ベクターｐＧＡ４７２
を含まない菌株Ｌ　Ｂ　Ａ４４０４内に導入された。こ
の二元ベクターは、カナマイシン抵抗性をもつ標識遺伝
子及び「リボータ」遺伝子つまり酵素活性に対してコー
ド付けするβ−グルクロニグーゼの遺伝子を有する。
かかるカナマイシン抵抗性遺伝子は、ノバリンシンター
ゼの遺伝子のブロモータ及びターミネータが５′及び３
′において添えられたトランスボゾンＴｎ５から単離さ
れたネオマイシンリン酸転移酵素の遺伝子のコード付け
領域を含んでいる。
β−グルクロニグーゼの遺伝子のコード付け領域には、
カリフラワのモザイク病ウィルスのＲＮＡ３５Ｓブロモ
ータ及びノパリンシンターゼの遺伝子のターミネータが
添えられている。
ベクターｐＢＩｌ２１を含む菌株ＬＢＡ４４０４は１５
％のグリセリン内で−２０゜Ｃで保存される。この菌株
は５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地上で成長
する。
コカルチャ段階の後、形質転換された外植体は、前述の
芽の誘導培地上に移植される。かかる培地には通常、例
えばカナマイシンのような形質転換体の選択を可能にす
る製剤及び、例えばセフ才タクシムのようなＡ，゛ソメ
ファシエンスの生長を抑制する製剤が添加される。
本発明者等は、直径９ｃｍのペトリ皿ｒＦａｌｃｏｎＪ
ＴＭの使用により，芽の誘導段階の際にきわめて有利な
結果が得られるということを確認した。この段階中に適
用される光度及び光周ｇ１条件は、発芽段階の際に適用
されるものと同しであり、８　０ＪＪＥ−　Ｍ−２ｓ−
’の光度が特に好ましい。
芽は外植体上に直接発育し、物理的操作が可能となるサ
イズ（約０．２〜１．５ｍｍ、特に０．５ｍｍ）に達し
たとき、これらの芽を外植体から切除して、新しい培地
すなわち通常ＢＡＰ又はその他のサイトキニンを含み幼
形発育のための「第１の」培養培地を構成する培地に移
植する。
本発明に基づく方法の一変形態様においては、通常約２
１日である誘導段階の期間は、１４日に短縮することが
できる。この場合、芽は、直接第ｌの幼形発育培地上に
移植される代りに、ホルモンを含まないＭＳ培地上に１
週間移植され、その後幼形発育段階に付される。
幼形発育段階は、前述のように２段階で進められる。芽
はこの培地上において伸び、約３ｍｍ〜１．０ｃｍの高
さに達したとき、抗生物質といった形質転換体を選択す
るための選択剤とＡ．ツメファシエンスの生長を抑制す
る製剤が加わったＭＢ６培地上に移植される。ただし、
これらの製剤は、再生において必須なものではない。
この培地上で数週間経過した後、遺伝子導入幼形が根を
付ける。植物は、二次根が発育した時点で直ちに、腐食
土及び粗砂（２：１　体積／体積）を含む鉢に移植する
ことができる。
本発明の好ましい実施態様に従うと、Ａ．ツメファシエ
ンスを介してメロンの外植体内に，キュウリのモザイク
病ウィルスのカプシドタンパク質に対してコード付けす
る遺伝子が導入される。本発明はこれらの配列及び相応
するＲＮＡ配列（第２図及び第３図参照）、ならびにＣ
ＭＶに対する抵抗性を与えることのできるこれらの配列
の断片に関する。
かかるウィルスは、異なるサイズの４つのＲＮＡで構成
されている；　ＣＭＶのカプシドタンパク質の遺伝子は
、ＲＮＡ３の末端３′上及びＲＮＡ４上に存在する。カ
プシドタンパク質の翻訳は、ＲＮＡ４からしか行なわれ
ず、ＲＮＡ３の末端３′は厳密に同じヌクレオチド配列
を有している。異なる地理的地域からきた２つのウィル
ス菌株のカプシドタンパク質の遺伝子が本発明者等によ
り単離され、配列が決定された。
本発明の当該態様においては、Ｉ１７Ｆと呼ばれるフラ
ンス産の有害なＣＭＶの菌株及び感染したメロンについ
てニューヨークで単離された有害な菌株ＦＮＹのＲＮＡ
３の相補ＤＮＡを含むブラスミド（ｐＵｃ　ｌ　８）が
用いられた。当然のことながら、ＣＭＶ及びその他のウ
ィルスのその他の菌株のカプシドタンパク質に対してコ
ード付けする遺伝子といった他のいかなる遺伝子でもこ
うしてメロンの外植体内に導入することができ、この場
合、本発明の方法はかかる遺伝子を含む遺伝子導入植物
の再生を可能にする。
（実施例） Ａ）カナマイシン抵　　遺　　　びβ−グルクロニダー
ゼ遺　　を　　　る　伝　　　メロンのＬ童去羞 成熟胚を得るためメロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｍｅｌｏ　
Ｌ）の成熟種子を用いる。胚を傷つけないようにしなが
らメスで種皮を開く。純粋エタノール内に５秒間、次に
次亜鉛素酸カルシウムと０．０５％のＴｗｅｅｎ　８０
の飽和溶液２００一中に２０分間、つねに撹拌しながら
浸漬することによって、胚を滅菌する。次に胚を２０分
間、滅菌水２００ＭＩ中で洗う。その後、ろ紙上で胚を
乾燥させ、滅菌水中０．８％（重量／体積）の寒天一寒
天を含む滅菌したペトリ皿の中に置く。６０〜８０ＰＥ
・Ｍ−”ｓ−’の光度、１６／２４時間の光周期で昼間
は２６℃、夜間は２４℃で培養室内にて２日間、胚を発
芽させる。
形質転換実験のためには、ベクターｐＢＩ１２１を含む
菌株ＬＢＡ４４０４　（前述のちの）を，１２時間２８
゜Ｃで連続的に撹拌しながら（２０Ｏｒｐｍ）抗生物質
無しの１０−のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地内で培
養させる。この細菌溶液は、１　０　０　ｍｇＬ−’の
りファンビシンと５０ｍｇＬ−’のカナマイシンが補足
されたさらに大量のＬ　Ｂ　（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａ
ｎｉ培地）　　（５０ｍｆｆ）に対する接種剤として役
立つことになる。ＬＢ培地は、ｐＨ７．５で１リットル
あたりｌｏｇのＮａＣＩ２、５ｇの酵母抽出物及び１０
ｇのバクトトリブトンで構成されている。この細菌懸濁
液を、６６０ナノメートルの波長で光学的濃度が１とな
るまで、４時間から５時間２８℃で撹拌下に保つ。次に
細菌懸濁液を５分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、ＭＳ
培地内で同じ初期体積に沈渣を取り込む．かかる溶液は
、いつでち植物組織と接触させつる状態にある。
３，塁１ｊｕ４Ｌ厘 第１項で記述した培地上での２日間発芽した胚からの子
葉を頂生分裂組織を避けるよう注意して採取する。最ち
若い又は最も古い子葉は、２日間培養した胚から採取し
た子葉に比べ、芽の再生の可能性が低い。この結果は、
第１図に示されている。
２日のこの子葉を、ＭＳ培地内に取り込んだ細菌懸渇液
中で４つに切断し、傷の後の二元ベクターｐＢＩ１２１
を含む菌株ＬＢＡ４４０４と接触させる。子葉の断片を
３０分からｌ時間細菌懸濁液内に置く。各断片を滅菌ろ
紙上で乾燥させ、０．８％の寒天一寒天で凝固されたＭ
Ｓ培地を含むペトリ皿内に移植する。
第１項で記述した光度及び光周期条件で４８時間生体外
培養室内で外植体を培養させる。
４．芽の誘導 上述の２日にわたるこのコカルチャの後、子葉の断片を
、４　０　０　ｍｇＬ−’のセフ才タキシム（Ｒｏｕｓ
ｓｅｌ−ＵｃＬａｆ　）　．　５　０ｍｇＬ−’の硫酸
カナマイシン、１　．　　１　３ｍｇＬ−’のＢＡＰ及
び０．８８ｍｇＬ−’のＡＩＡが添加されたＭＳを含む
新しい培地上に移植する。セフ才クキシムの存在５は、
細菌の生長を抑制するために必要である。硫酸カナマイ
シンは、形質転換された細胞を選択するための選択剤と
して用いられる。形質転換された細胞は、そのゲノム内
に第２項で記述したβ−グルクロニダーゼ遺伝子とカナ
マイシン抵抗性遺伝子を有する細胞となる。培養培地に
加えられた植物性ホルモンＢＡＰは、上述の濃度での芽
の誘導のために必要である。これに対してＡＩＡの存在
は任意である。
こうして形質転換されたこれらの細胞は、５０ｌＴｌｇ
／ｆ！のカナマイシン上で発育することになる芽を誘導
する。
子葉の断片を、第１項に記載された光度及び光周期条件
下で生体外培養室内で保温培養する。
３週間から５週間たつと、子葉の断片から直接カナマイ
シン５０ｎｉｇＬ−’が存在する中で芽が発育する。こ
の誘導培地では、形質転換されていない子葉の断片から
５０ｍｇＬ−’のカナマイシン上でいかなる芽も発育し
得ない。かかる効果は第２図に示されている。
５．遺伝　導　玄　〉の ５０ｍｇＬ−’のカナマイシンが存在する中で第３項に
記載されている培地上で直接誘導された芽が高さ０．５
ｍｍのサイズに達した時点で、子葉の断片からこれらの
芽を切除する。これらの芽を、０．６８ｍｇＬ−　のＢ
ＡＰ、４００ｍｇＬ−’のセフ才タキシム及び５０ｍｇ
Ｌ−’の硫酸カナマイシンを添加したＭＳを含む新しい
培地上に個々に移植する。これらの芽はこの培地上で伸
び、２〜４週間後高さ３ｍｍに達した時点で、今後は５
０ｍｇＬ−’の硫酸カナマイシン及び４　０　０　ｍｇ
Ｌ−’のセフ才タキシムを含むＭＢ６培地１００ｄ（表
１参照）上で容量５００ｍｆ’の栽培用の鉢の中に再び
個々に移植する。
上述のこの培地上で、高さ３ｍｍの芽が伸び、４週間た
つと遺伝子導入幼形が根付く。二次根が上述の培地上で
ひとたび発育すると、植物を腐食土と粗砂の混合物（２
：１）を含む鉢の中に移植し、温室栽培に付す。最初の
７日間は、湿潤な大気を保つためプラスチックのふたで
植物を保謹する。植物には毎日水をやる。
こうして再生された植物（８８４−５と呼ぶ）のうちの
１本を開花させ、自殖させた。種子を収集した。４本の
植物Ｒｌを発芽させ、下記のテストを適用することによ
り、その遺伝子導入特性を確認した。
β−グルクロニダーゼ酵素（Ｇ．Ｕ．Ｓ．）　の活性を
検知する第１のテストは、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ他の方法
（１９８７年）に従って行なわれる。もう１つのテスト
には、カナマイシンを含む培地上での葉又は葉柄の外植
体上のカルスの誘導が関与する。カルスの形成は、その
植物が遺伝子導入植物であることを示している。ＢＡＰ
及びＮＡＡを含むＭＳ培地内の必要なカナマイシン濃度
は、ホルモンと組織の濃度に応じて変化する。例えば、
■ｍｇＬ−　’のＢＡＰ及びＮＡＡが付加されたＭＳ培
地内では、葉及び葉柄上のカルスの形成を抑制するため
には１　０　０　ｍｇＬ−’のカナマイシンで充分であ
る。
再生された植物における外来の遺伝子の存在も、２．５
単位のＴａｑポリメラーゼを用いてポリメラーゼ連鎖反
応（　Ｐ　．　Ｃ　．　Ｒ　．　）　　（　Ｌａｓｓｎ
ｅｒ他、１９８９年；Ｄｅ　Ｂｏｔｈ　１　９９０年）
によりテストした。使用された先導体（ａｍｏ．ｒｃｅ
）により、ＧＵＳ遺伝子とＮＰＴ遺伝子の同時増幅が可
能となった。再生された組織内にアグロバクテリアが存
在することによる偽陽性を避けるため、ＰＣＲは世代Ｒ
ｌについてのみ行なわれた。
二元ベクターｐ　Ｉ　８　１　６　．　　１　（Ｈｏｅ
ｃｈｓｔ　．　ＧｍｂＨ、フランクフルト、西ドイツ）
は、ｎｅｏ遺伝子とｍ遺伝子（ホスフィノトリシンアセ
チルトランスフェラーゼ）を含み、ホスフィノトリシン
に対する抵抗性を与えている。
実施例Ａ中に記されている形質転換及び再生方法が、該
ベクターにより形質転換されたＶｅｄｒａｎｔａｉｓ遺
伝子型の植物の生産において用いられた．こうして得ら
れた植物の遺伝子導入特性をカルス形成テスト及びサザ
ン法に従ったｎｅｏブローブの交雑によって確認した． これらの植物を自殖させ、こうして得られた種子を温室
で発芽させた。こうして得られた植物は、除草剤による
処埠に対し、いくつかは抵抗性を示した。
以下の例においては、Ｉ１７Ｆと呼ばれるフランスの有
害なＣＭＶの菌株及び感染したメロンについてニューヨ
ークで単離されたＦＮＹと呼ばれる有害な菌株のＲＮＡ
３の相補ＤＮＡを含むブラスミド（ｐＵｃ１８）が、Ｃ
ＭＶのカプシドタンパク質遺伝子の供給源として用いら
れた。
１．ＦＮＹ　　　のカプシドタンパク　のクローニング Ｐ．　Ｐａｌｕｋａｉｔｉｓにより決定されたＲＮＡ３
のＤＮＡｃを含むブラスミドｐＵｃ１８の制限地図に基
づき、末端３′においてｌｋｂのカブシドクンパク質の
配列をカバーするｌ．６ｋｂのサイズの断片を表現ベク
ターｒ　Ｂｌｕｅ　ｓｃｒｉｂｅ　Ｊ内でサブクローニ
ングした．かかるＤＮＡｃをＢｌｕｅ　Ｓｃｒｉｂｅ（
　Ｂ　Ｓ　＋　）　　（　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ目録）
内でサブクローニングし、サブクローニングされた各々
の断片をｒｓｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｒ　Ｊプロトコル（Ｕ
ＳＢのヴアージョン２　；　Ｌｌｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔ
ｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）に従って配列決定した。
配列決定された断片を、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２
年において記述されているような変性特性をもつ６％の
アクリルアミドゲル上で分析した。次に１０％の酢酸内
で１０分間固定し８０゜Ｃで３０分間真空乾燥し、次に
オートラジオグラフィに付した（　Ｍａｎｉａｔｉｓ他
、１９８２年）。
ＦＮＹ菌株のカプシドタンパク質のリーダー配列の最初
は、日本Ｙ菌株（Ｐ．　Ｐａｌｕｋａｉｔｉｓとの私信
）のちのと同じ長さを有する。Ｙ菌株のＲＮＡ４の部分
配列が発表された（　Ｈｉｄａｋａ他、１９８５年）。
この配列と比較することにより、我々は、ＦＮＹ菌株の
リーダー配列を位置づけすることができた。
リーダー配列、コード付け領域及びコード付けしない領
域３′をカバーするカプシドタンパク質の配列は、第２
図に示されている。かかる配列に基づき、３′及び５′
の３０の相補性塩基の２つのオリゴヌクレオチドを合成
し、Ｓｃｈａｒｆ他（１９８６年）により記述されたＰ
ＣＲ　（ポリメラーゼ連鎖反応）技術を用いて、カプシ
ドタンパク質配列を増幅させた。増幅の生成物を１％の
アガロースゲル上で分析し、このｌ０３４ｂｐ断片のサ
イズを確認した。５′及び３′のオリゴヌクレオチドは
、その末端に制限部位ＢａｍＨ１を有している．従って
、かかる増幅生成物をベクターｐＢＩＯｓ３の唯一の部
位ＢａｍＨｌにてクローニングすることができた。本発
明者等の実験室で構築されたこのベクターｐＢＩＯｓ３
は、植物性ターミネークとブロモータを１つずつ有して
いる。つまり、カリフラワのモザイク病ウィルスのＲＮ
Ａ３５Ｓからのプロモーク３５Ｓと、ノパリンシンター
ゼの遺伝子のコード付けしない領域３′からのターミネ
ークＮＯＳである。
２．　　　　Ｉ１７Ｆのカプシドタンパク　のクローニ
ング ＣＭＶの菌株Ｉ１７Ｆを双葉段階のトマトの幼形に接種
した。感染から１５日後に、ＤＲ．　Ｇ．Ｍａｒｃｈｏ
ｕｘの論文（１９７５年）に記されている技術に従って
、感染した葉からウィルスを純化した。ウィルスのＲＮ
Ａ　（ＲＮＡＩ、２、３及び４）の質を１％のアガロー
スゲル上で制御する。
ひとたび制御したならば４つのＲＮＡの相補ＤＮＡを、
Ａｍｅｒｓｈａｍキットｒ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍブラス」を用いて合成する。４
つのＲＮＡの放射性相補ＤＮＡを１％のアガロースゲル
上に置く。これらのＤＮＡの遊走の後、ゲルを真空乾燥
し次にオートラジオグラフィに付す（Ｍａｎｉａｔｉｓ
他、１９８２年）。純粋先端をもつ末端を有するこれら
の相補ＤＮＡを次に、脱リンされたブラスミドｐＵｃ１
　８の部位Ｓｍａｌでクローニングする。かかるブラス
ミドは、アンビシリン抵抗性をもつ。塩化カルシウム法
（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２年）により応答能を与
えられた大腸菌ＪＭＩＯＩを、ウィルスＲＮＡの相補Ｄ
ＮＡを含むブラスミドｐＵＣ１　８により形質転換させ
る。ブラスミドｐＵＣ　１　８はアンビシリン抵抗性を
有するため、一方では１　０　０ｍｇ／Ｌでアンビシリ
ンが付加されたＬｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ培地（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ他、１９８２年）上で、又他方ではコロニーの
青い色（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２年）により、形
質転換された細菌コロニーを選択する。各々のコロニー
から組換え型ブラスミドを単離させ、Ｂｉｒｎｂｏｉｎ
及びＤｏｌｙの技法に従って純化した（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ他、１９８２年）。組換え型ブラスミドを制限酵素Ｅ
ｃｏＲｌ及びＢａｍＨ１で消化させる。部位Ｓｍａｌの
まわりで切断するこれらの酵素により、一方ではブラス
ミドｐＵＣ１　８他方では相補ＤＮＡを電気泳動によっ
て分離させることができる。消化生成物を１％のアガロ
ースゲル上に置き、遁走の後、サイズｌｋｂ（相補ＤＮ
Ａのサイズ）の相補ＤＮＡを含むブラスミドを選択する
。
酵素ＨｉｎｄｌｌＩ；ＳａｌＩ及びＨｉｎｄｌｌと用い
ての制限地図により、Ｃｕｏｚｚｏ他（１９８８年）に
よって発表された菌株Ｄのものとの比較から、ＲＮＡ４
の相補ＤＮＡを有する組換え型ブラスミドを識別するこ
とができた。カプシドタンパク質に対してコード付けす
る遺伝子を有するこのクローンを、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｂ
ｅブラスミドの制限部位ＥｃｏＲＩ及びｂａｍＨＩの間
で（ＢＳ十及びＢ　Ｓ　−　）　　（　Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ目録）再クローニングした。よりサイズの小さい
断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅベクター内で再クローニン
グし、これらの組換え型プラスミドの各々の一本鎖ＤＮ
ＡをＳｔｒａｇｅｎｅが記した技法に従って調製した。
クローニングされたこれらの異なる断片の配列を、Ｕ　
Ｓ　Ｂ　ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓのプロトコルｒｓｅｑｕｅｎａｓｅ　ＲＪヴア
ージョン２内に記述されている技法に従って決定した。
配列が決定された断片を６％のアクリルアミドの変性ゲ
ル（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２年）上で分析し、次
に１０分間ｌＯ％の酢酸中でゲルを固定して次に３０分
間８０℃で真空乾燥させ、その後オートラジオグラフィ
に付した（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２年）。菌株１
１７Ｆのカプシドタンパク質の配列は第３図に示されて
いる。
その後カプシドタンパク質の配列を、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＢａｍＨＩの消化によって組換え型プラスミドか
ら出す。配列の末端でＢａｍＨＩリンカーを付加し（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ他、１９８２年）かかる配列を次に脱リ
ンされたプラスミドｐＢＩＯｓ３のＢａｍＨＩ部位でク
ローニングする（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２年）。
こうして、カプシドタンパク質に対しコード付けするこ
の配列は、ブロモーク３５ＳとクーミネータＮＯＳの間
に置かれる。
対照配列の間に置かれたカプシドタンパク質（Ｉ１７Ｆ
及びＦＮＹ）を純粋にコード付けする２つの遺伝子を、
次に、遺伝子ＧＵＳの部位ＥｃｏＲＩ３′の抑圧及び部
位Ｈ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩでの部位ＥｃｏＲＩの作成に
より変更された二元ベクターｐ　Ｂ　Ｉ　ｌ　２　１　
（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ他、１９８７年）内で別々にクロ
ーニングする。これらの変更により、ｐＢＩＯｓ３から
のブロモークー構造遺伝子−ターミネータカセットの挿
入が可能となる。
最後に、かかる最後のベクターを菌株ＬＢＡ４４０４内
に導入する。一方では菌株ＦＮＹ（ｐＢ　Ｉ　ＯＳ　Ｉ
　３２）他方では菌株Ｉ１７Ｆ（ｐＢＩＯｓＩ３５）の
カプシドタンパク質の配列を有する二元ベクターを含む
アグロバクテリウム菌株を、実施例Ａ中に記されている
ように２日の段階のメロンの子葉を感染させるのに用い
る。形質転換された子葉の再生方法は、実施例Ａに記さ
れているものと同じである．１００ｍｇ／Ｌのカナマイ
シンを含む選択培地上で再生されたメロンの植物を分析
する。再生された植物の遺伝子導入特性は、Ｇ．Ｕ．Ｓ
．活性の検出及び実施例Ａ内に記されているようなカル
スの形成技術によって確認された。
菌株１１７Ｆのカプシドタンパク質の表現は、無傷の菌
株Ｉ１７Ｆに対する抗体との「ウエスタンプロット」分
析の際に植物内に検出された。
表現されたカプシドタンパク質は葉の中で、可溶性タン
パク質全体の約０．０１％を占めていた。
その後、形質転換した植物に種子をつけさせる。形質転
換されたこれらの植物は、キュウリのモザイク病ウィル
スに対し抵抗性があることが立証されている． 第５図は、ＣＭＶ菌株Ｉ１７Ｆに対する抗体を用いて検
出された免疫反応性帯を実証するものである。
１５個のＲｌ植物を、このウィルスを機械的に接種する
ことにより、ＣＭＶ抵抗性について試験した．接種は、
一葉期の実生の第一葉に行い、ＣＭＶによる全体的な（
組織全体の）感染を、続いて形成される葉上の症状の発
現によって評価する。これらの植物のうちの１０個につ
いて、ＧＵＳ表現によって組換え体（　ｔｒａｎｓｇｅ
ｎｉｃｌ　であることが示される６これらの１０個の組
換え体・Ｒｌの植物のうちの少なくとも一つについて、
第四葉が、接種された非転換の対照植物と比較して、接
種後１９日目で、症状の軽減が見られ、葉モザイクは存
在しなかった． 隻主文見 ＡＢＡＫ　Ｋ．　ＤＵＭＡＳ　ＤＥ　ＶＡＵＬＸ　Ｒ．
著（１９８０年）「カボチャ属遺伝学共同報告書（Ｃｕ
ｃｕｒｂｉｔＧｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖ
ｅ　Ｒｅｐｏｒｔｌ　３Ｊ　；　２７−２９，ＡＮＮＧ
．，　ＷＡＴＳＯＮ　Ｂ．Ｄ．．　ＳＴＡＣＨＥＬＳ．
，　ＧＯＲＤＯＮ　Ｍ．Ｐ．．ＥＷ　Ｎ．共著（１９８
５年）　−　ｒＥＭＢｏ　Ｊ．４Ｊ　；　２７７〜２８
４．ＢＥＮ　ＴＡＨＡＲ　Ｓ．．　ＤＥ　ＢＯＴＩ｛　
Ｍ．Ｔ．Ｊ．共著（１９８８年｝一「アグロバクテリウ
ム・ツメファシエンスを用いたメロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ
　ｍｅｒｏ　Ｌ．ｌへの外来遺伝子の導入」，フランス
・カボチャ属議事録．ＢＥＶＡＮ　Ｍ．著（　１９８４
年）一「核酸研究１２Ｊ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）　　：　８７１１−８７１８．ＢＯ
ＵＡ　ＢＤＡＬＬＡＩ｛　Ｌ．，　ＢＲＡＮ（：｝ｆＡ
ＲＤ　Ｍ．共著（１９８６年）−　Ｚ．　Ｐｆｌａｎｚ
ｅｎｚｉｃｈｔｕｎｇ　９６　；　８２−８５．ＢＲＡ
ＮＣＩＡＲＯ　Ｍ．，　（：ＨＡＴＥＡＵ　Ｍ．共著（
１９８８年）Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ　Ｐａｒｉｓ
　　３０７、シリーズＩＩＩ　．　７７７−７８０， ＢＲＯＡＤＢＥＮＴ　Ｌ．著（　１９７６年）　−　Ａ
ｎｎ．　Ｒｅｖ．　Ｐｈｙｔｏ−ｐａｔｈｏｌ　（植物
病理学年報）１４；７５．ＣＡＤＥ　Ｒ．Ｍ．．　ＷＥ
ＨＮＥＲ　Ｔ．Ｃ．．　ＢＬＡＺＩＣＨ共著（１９８８
年）一カボチャ属遺伝学共同報告書１１：３〜４．Ｃ：
ＨＥＥ　Ｐ．Ｐ．，　ＴＲＩＣＯＬＩ　Ｄ．Ｍ．共著（
１９８８年）一植物細胞報告書（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ
　Ｒｅｐｏｒｔｓｌ　７；　　２７４−２７７． ＣＩ｛ＩＬＴＯＮ　Ｍ．Ｄ．．　ＴＥＰＰＥＲ　Ｄ．Ａ
．，　ＰＥＴＩＴ　Ａ．ＤＡＶＩＤ　Ｃ．，　ＣＡＳＳ
Ｅ　ＤＥＬＢＡＲＴ　Ｆ．．　ＴＥＭＰＥ　Ｊ．共著（
１９８２年）　−　ｒＮａｔｕｒｅ　（自然）　　２９
５Ｊ　　；４３２−４３４ＣＯＳＴＡ　Ａ．Ｓ．．　Ｍ
ＵＬＬＥＲ　Ｇ．Ｗ．共著（１９８０年）一Ｐｌａｎｔ
　Ｄｉｓ．　（植物の疾病（ｄｉｓｅａｓｅ））　６４
　；　５３６．ｃｕｏｚｚｏ　Ｍ．．　ｏ゜ＣＯＮＮＥ
Ｌ　Ｋ．Ｍ．．　ＫＡＮＩＥＷＳＫＩ　Ｗ．．ＦＡＮＧ
　Ｒ．Ｘ．．　ＣＨＵＡ　Ｎ．Ｈ．及びＴＵＭＥＲ　Ｎ
．Ｅ．共著（　１９８８年）一「バイオテクノロジーｆ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｌ　６　Ｊ　：　５４９−
５５７．ＤＡＶＩＤ　Ｃ．，　ＣＨＩＬＴＯＮ　Ｍ．Ｄ
．．　ＴＥＭＰＥ　Ｊ．共著（１９８４年）一「バイオ
テクノロジー２Ｊ：７３〜７６ＤＥＡＫＩＮ　Ｊ．Ｒ．
，　ＢＯＨＮ　Ｇ．Ｗ．．　Ｗ旧ＴＡＫＥＲ　Ｔ．Ｗ．
共著（１９７１年）一「経済植物学（Ｅｃｏｎｏｍｉｃ
　Ｂｏｔａｎｙ）２５Ｊ　　：　１９５〜２１！ ＤＥ　ＢＯＴＨ　Ｍ．Ｔ．Ｊ．．　ＢＥＮ　ＴＡＨＡＲ
　Ｓ．共著（１９８９年）ニューヨーク．植物育種にお
ける遺伝子操作に関する国際Ｅｕｃａｒｐｉａ会議議事
録；　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ（印刷中） ＤＥ　ＢＯＴＨ　Ｍ．Ｔ．Ｊ．著（１９９０年）一「植
物の原形質体及び組織へのｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉ
ｏｎによる遺伝子移入」　：ロンドン大学学位論文 ＤＥＧＲＥＥＦ　Ｗ．，　ＤＥＬＯＮ　Ｒ．，　ＤＥＢ
ＬＯＣＫ　Ｍ．，　ＬＥＥＡＭＡＮＳＪ．．　ＢＯＴＴ
ＥＲＭＡＮ　Ｊ．共著（１９８９年）一「バイオテクノ
ロジー７Ｊ：６１〜６４． ＤＩＲＫＳ　Ｒ．，　ＶＡＮ　ＢＵＧＧＥＮＵＭ　ｌ，
！．共著（１９８９年）一「植物細胞報告書７Ｊ＋６２
６〜６２７．ＦＥＲＮＯＷ　Ｋ．Ｈ．　　（１９６７年
）一「植物病理学５７」：１３４７． ＦＲＡＬＥＹ　Ｒ．Ｔ．．　ＲＯＧＥＲＳ　Ｓ．Ｇ．，
　ＨＯＲＳＣＨ　Ｒ．Ｂ．ＥＩＣＨＨＯＬＴＺ　Ｄ．Ｅ
．．　ＦＬＩＣＫ　Ｊ．，　ＦＩＮＫ　Ｃ．．　ｌ｛Ｏ
ＦＦＭＡＮＮ．．　ＳＡＮＤＥＲＳ共著（１９８５年）
一「バイオテクノロジー３Ｊ：６２９〜６３７． ＦＲＡＬＥＹ　Ｒ．Ｔ．．　ＲＯＧＥＲＳ　Ｓ．Ｇ．．
　ＨＯＲＳＣＨ　Ｒ．Ｂ．共著（１９８６年）一「高等
植物における遺伝子的形質転換Ｊ　　ＣＲＣ評論紙、植
物学４（ＣＲＣ　Ｃｒｉｔｉｃａｌ　ＲｅｖＰｌａｎｔ
　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　４）　；　１−４６．ＨＩＬＤＥ
Ｒ　　Ｖ．Ａ．，ＧＡＴＥＨＯＵＳＥ　　Ａ．Ｍ．Ｒ．
　　　ＳＨＥＥＲＭＡＮＳ．Ｅ．．　　ＢＡＲＫＥＲ　
　Ｒ．Ｆ．．　　ＢＯＵＬ丁ＥＲＤ．　　（１９８７年
）ｒ　Ｎａｔｕｒｅ　（自然）　　３００Ｊ　　：ｌ６
０−１６３．ＨＩＤＡＫＡ　　Ｓ．，ＴＳＵＮＡＳＡＷ
Ａ　Ｓ．，ＹＯＯＮ　Ｊ．０．，ＮＡＲＩＴＡＫ．，　
ＴＡＫＡＮＡ旧Ｙ．．　ＫＵＢＯ　Ｓ．，　ＭＩＵＲＡ
　Ｋ．Ｔ．共著（１９８５年）一「生化学ジャーナル（
Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．］９７Ｊ　　：　　１６１〜１
７１．　　ＨＯＥＫＥＩＪＡ　Ａ．．　　ＨｔｌＩＳＭ
ＡＮ　Ｍ．Ｊ．　　ＭＯＬＥＮＤＩＪＫ　Ｌ．，　　Ｖ
ＡＮ　ＤＥ　ＥＬＺＥＮ　Ｐ．Ｊ．Ｍ．，　　ＣＯＲＮ
ＥＬＩＳＳＥＮＢ．　Ｊ．　Ｃ．共著（１９８９年）一
「バイオテクノロジー７Ｊ；２７３〜２７８． ＨＯＲＳＨ　Ｒ．Ｂ．．　　ＦＲＹ　Ｊ．Ｅ．，　　Ｈ
ＯＦＦＭＡＮ　Ｎ．Ｌ．．ＷＡＬＬＲＯＴＨ　Ｍ．，　
ＥＩＣＨＨＯＬＴＺ　Ｄ．Ｚ．，　ＲＯＧＥＲＳ　Ｓ．
Ｇ．共著（１９８５年）　−　ｒＳｃｉｅｎｃｅ　　（
科学）　２２７　Ｊ　；　１２２９−１２３１． ＪＥＦＦＥＲＳＯＮ　Ｒ．Ａ．，　ＫＡＶＡＮＡＧＩ｛
　Ｔ．Ａ．　　ＢＥＶＡＮ　Ｍ．ｌ＋共著（　１９８７
年）一・ｒ　ＥＭＢＯジャーナル６Ｊ；３９０１〜３９
０７、 ＪＥＬＡＳＫＡ　Ｓ．著（１９７２年）　　−　ｒ　Ｐ
ｌａｎｔ！１１（Ｂｅｒｌ．　）１０３　Ｊ　：　２７
８〜２８０． ＪＥＬＡＳＫＡ　Ｓ．著（１９７４年）　−　ｒＰｈｙ
ｓｉａｌ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ（植物生理学）　３１　
；　２５７〜２６ｌ，ＫＡＴＨＡＬ　Ｒ．．ＢＨＡＴＮ
ＡＧＡＲ　Ｓ．Ｐ．．ＢＨＯＪＷＡＮＩ　　Ｓ．Ｔ共著
（１９８６年）一「植物生理学ジャーナル（ＪＰ］．ａ
ｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．）　１２６　Ｊ　；　５９−６
２．ＫＡＴＩＩＡＬ　Ｒ．，　ＢＨＡＴＮＡＧＡＲ　Ｓ
．Ｐ．．　ＢＨＯＪＷＡＮＩ　Ｓ．Ｔ．共著（１９８８
年）一「植物細胞報告書７Ｊ；４４９〜４５１．ＫＥＶ
ＥＲＳ　Ｃ．．　ＣＯＵＭＡＮＳ　Ｍ．．　ＣＯＵＭＡ
ＮＳ−ＧＩＬＬＥＳ　Ｍ．Ｆ．．ＧＡＳＰＡＲ　Ｔ．＊
　（１９８４年）　−　ｒＰｈｙｓｉｏｌ　Ｐｌａｎｔ
．　（植物生理学）６１Ｊ：６９〜７４ ＫＨＯ　Ｙ．０．．　ＤＥＮ　ＮＩＪＳ　Ａ．Ｐ．Ｍ．
．　ＦＲＡＮＫＥＮ　Ｊ．共著（１９８０年）　−　ｒ
Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ　２９Ｊ　　；　６６１−６７２．
ＫＩＭ　Ｓ．Ｇ．，　Ｃ｝ＩＡＮＧ　Ｊ．Ｒ．．　ＣＨ
Ａ　Ｈ．Ｃ．．　ＬＥＥ　Ｋ．Ｗ．共著（１９８８年）
一「植物細胞組織器官培ｌ（ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　Ｔｉ
ｓｓｕｅ　Ｏｒｇａｎ　（：ｕｌｔｕｒｅ）１２　Ｊ　
　；　６７−７４．ＫＬＥＥ　Ｈ．，　ＨＯＲＳＣＩＩ
　Ｒ．．　ＲＯＧＥＲＳ　Ｓ．．共著（１９８７年）一
「植物生理学年報（Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．　ＰｌａｎｔＰ
ｈｙｓｉｏｌ．］３８　Ｊ　；　４６７−４８６．ＬＡ
ＳＳＮＥＲＭ．Ｗ．．　ＰＥＴＥＲＳＯＮ　Ｐ．．　Ｙ
ＯＤＥＲ　Ｊ．Ｉ．．共著（１９８９年）　−　ｒＰ１
ａｎｔ．　Ｍａｌｅｃ．　Ｒｅｐ．　（植物分子報告）
．　　７：１１６〜１２８ ＬＥＳＨＥＭ　Ｂ．，　ＳＨＡＬＥＹ　Ｄ．Ｐ．，　Ｉ
ＺＨＡＲ　Ｓ．共著（１９８８年）一「植物学会誌（Ａ
ｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙｌ６１Ｊ２５５〜２６
０． ＭＡＩＪＡＹ　　Ｗ．Ａ．．ＮＧ　Ｔ．Ｊ．．ＨＡＭＭ
ＥＲＳＣＨＬＡＧ　　Ｆ．Ａ共著（１９８８年）一「カ
ボチャ属遺伝学共同報告書１１Ｊ；３３〜３４． ＭＡＬＥＰＳＹ　Ｓ．．　ＮＡＤＯＬＳＫＡ−ＯＲＣＺ
ＹＫ　Ｎ．共著（　１９８３年）　−　ｒＺ．　Ｐｆａ
ｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅ　１１１　：　；　２
７３−２７６． ＭＡＮＩＡＴＩＳ　Ｔ．．　ＦＲＩＴＳＣＨ　Ｅ．Ｆ．
及びＳＡＭＢＲＯＯＫ　Ｊ．（１９８２年）一「分子ク
ローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃ
ｌｏｎｉｎｇ．　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕ
ａｌ）　ＪＭＡＲＣＨＯＵＸ　Ｇ．著一自然科学博士論
文（１９７５年）一「キュウリのモザイク病ウィルスの
ＲＮＡの生理学的及び遺伝学的特性」 ＭＯＲＥＮＯ　Ｖ．，　ＧＡＲ（ＪＡ−ＳＯＧＯ　Ｍ．
，　ＧＲＡＮＥＬＬ　Ｉ．，ＧＡＲＣＩＡ−ＳＯＧＯ　
Ｂ．，　ＲＯＩＧ　Ｌ．Ａ．共著（１９８５年）一「植
物細胞組織及び器官培養（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｔｉ
ｓｓｕｅａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ１５Ｊ　
；　１３９−１４６．ＭＳＩＫＩＴＡ　Ｗ．，　ＳＫＩ
ＲＶＩＮ　Ｒ．Ｍ．，　ＪＵＶＩＫ　Ｊ．Ａ．，ＳＰＬ
ＩＴＴＳＴＯＥＳＳＥＲ　Ｗ．Ｅ．共著（１９８８年）
一「カボチャ属遺伝学共同報告書１１Ｊ；５〜７．ＭＵ
ＲＡＳＨＩＧＥ　Ｔ．，　ＳＫＯＯＧ　Ｆ．共著（　１
９６２年）一ｒ　Ｐｈｙｓｉａｌｏｇｉａ　ｐｌａｎｔ
ａｒｕｍ　　（植物生理学）Ｊ１５．４７３〜４９７． ＮＩＥＤ２　　Ｒ．Ｐ．．　　ＳＭＩ丁Ｈ　　Ｓ．Ｃ．
，　　ＤＵＮＢＡＲ　　Ｘ．Ｂ．．ＭＵＲＡＫＩＳＨＩ
　Ｈ．Ｈ．，　ＳＴＥＰＨＥＮＳ　Ｃ．Ｔ．共著（１９
８９年）一「植物細胞組織及び器官培養」　（印刷中）
ＯＲＩＤＡＴＥ　Ｔ．．　ＯＯＳＡＷＡ　Ｋ．共著（　
１９８６年）一ｒＪａｐａｎ　Ｊ．　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ
　　（日本育種改良ジャーナル３６Ｊ：４２４〜４２８
． ＯＲＴＳ　Ｍ．Ｃ．，　ＧＡＲＣＩＡ−ＳＯＧＯ　Ｂ．
，　ＲＯＣＨＥ　Ｍ．Ｖ．，ＲＯＩＧ　Ｌ．Ａ．．　Ｍ
ＯＲＥＮＯ　Ｖ．共著（１９８７年）　−　ｒＨｏｒｔ
Ｓｃｉｅｎｃｅ　　（園芸学）　２２Ｊ　；　６６６．
ＰＯＷＥＬ　ＡＢＥＬ　Ｐ．，　　ＮＥＬＳＯＮ　Ｒ．
Ｓ．，　　ＤＥ　Ｂ．，ＨＯＦＦＭＡＮＮ　Ｎ．，　　
ＲＯＧＥＲＳ　Ｓ．Ｇ．，　ＦＲＡＬＥＹ　Ｒ．Ｔ．，
ＢＥＡＣＨＹ　Ｒ．Ｎ．共著（１９８６年）　一ｒｓｃ
ｉｅｎｃｅ　２３２Ｊ　　；７３８〜７４３． ＲＡＪＡＳＥＫＡＲＡＮ　Ｋ．．　ＭＵＬＬＩＮＳ　Ｍ
．Ｇ．．　ＮＡＩＲ　Ｙ．共著（１９８３年）一「植物
学会誌５２Ｊ；４１７〜４２０．Ｓｔ｛ＡＲＦ　Ｓ．Ｊ
．，　ＨＯＩＩＮ　Ｇ．Ｔ．．　ＥＲＬＩＣＨ　Ｈ．Ａ
．共著（１９８６年）　一ｒｓｃｉｅｎｃｅ　２３３Ｊ
　　：　１０７６−１０７８．ＳＭＩＴＨ　Ｓ．．ＤＵ
ＮＢＡＲ　Ｋ．，ＮＩＥＤＺ　Ｒ．．ＭＵＲＡＫＡＳＨ
ＩＨ．共著（１９８８年）−１９８８年６月ネバダ州ラ
スベガス、ＴＣＡ年次会議議事録要約 ＳＴＡＢＡ　Ｅ．Ｊ．著（　１９６９年）一「植物化学
における最近の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ　ａｄｖａｎｃｅｓ
　ｉｎｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｌ　．第２巻」中
の「植物化学者のための技術としての植物組織培養」刊
行：　Ｓｃｉｋｅｌ＆Ｒｕｎｅｃｋｅｌｓ　Ａｐｐｌｅ
ｔｏｎ　Ｃｅｎｔｕｒｙ−ｃｒｏｆｔｓ　，ニューヨー
ク ＴＵＭＥＲ　Ｎ．Ｅ．，　Ｏ′ＣＯＮＮＥＬ　Ｋ．Ｍ．
．　ＮＥＬＳＯＮ　Ｒ．Ｓ．，ＳＡＮＤＥＲＳ　Ｐ．Ｒ
．．　　ＢＥＡＣＨＹ　Ｒ．Ｎ．．　　ＦＲＡＬＥＹ　
Ｒ．Ｔ．，ＳＨＡＨ　Ｄ．Ｍ．共著（１９８７年）　−
Ｅｍｂｏ　Ｊ．　６　；　１１８１−１１８８． ＶＡＥＣＫ　Ｍ．．　ＲＥＹＮＡＥＲＴＳ　Ａ．，　Ｉ
ＯＦＴＥ　Ｈ．．　ＪＡＮＳＥＮＳＳ．，　ＤＥ　ＢＥ
ＵＣＫＥＬＥＥＲ　Ｍ．．　　ＤＥＡＮ　Ｃ．，　ＺＡ
ＢＥＡＵ　Ｍ．，ＶＡＮ　ＭＯＮＴＡＧＵ　Ｍ．．　Ｌ
ＥＥＡＭＡＮＳ　Ｊ．共著（１９８７年）一ｒ　Ｎａｔ
ｕｒｅ　（自然）　　３２８Ｊ　　：３３−３７．ＶＡ
Ｎ　ＤＩＮ　Ｃ．Ｍ．Ｐ．，　ＢＯＬ　Ｊ．Ｆ．共著（
１９８８年）一「ウィルス学ｆＶｉｒｏｌｏｇｙｌ　１
６７Ｊ　　：　６４９〜６５２．ＷＥＨＮＥＲ　Ｔ．Ｃ
．，　ＬＯＣＹ　Ｒ．Ｄ．共著（　１９８１年）ｒＨｏ
ｒｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　（園芸学）　１６Ｊ　：　７５
９−７６０．ＶＡＮ　ＲＡＡＭＳＤＯＮＫ　Ｌ．Ｗ．Ｄ
．著（　１９８９年）ｒＰｒｏｐｈｙｔａ　６Ｊ　　：
　２３１−２３２．
【図面の簡単な説明】
第１図は、種々の遺伝子型における再生率に対する子葉
の年令の影響を示すグラフである。 第２図は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介
して植物に導入される遺伝子配列の好ましい例（本発明
の好ましい遺伝子配列）を示す。 第３図は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介
して植物に導入される遺伝子配列の好ましい例（本発明
の他の好ましい遺伝子配列）と菌株Ｉ１７Ｆのカプシド
タンパク質の配列を示す。 第４図は、種々の遺伝子型のメロンにおける芽の誘導に
対するＣ　ａ　Ｃ　Ｑ　２濃度の影響を示すグラフであ
る。 第５図は、ＣＭＶ菌株Ｉ１７Ｆに対する抗体を用いて検
出された免疫反応性帯（バンド）を示す。 メロン 子葉の年令 （発芽日数） 第　１　図 種々の遺伝子型における再生率に対する子葉の年令の影
響 ＋　のト　寸ロ　（７）の　Ｎ−　一〇　〇〜　の一　
のり　トー　ロヮ　一ト　寸ロ　のＯ　ＮＱ　一■　０
Ｎ　ロー　のり　ロＮ寸ロー　口　　ωＮ　トの　一寸
　哨一　のト　Ｎの　ロ。　〇一　寸Ｎ　のｖ　Ｎ−　
の−　０ト　マの　のロ　一一　ω一　ＮトＮトー　　
一　　Ｎ　　Ｎ　　Ｎ　　の　　（７）　　マー　守一
　マー　−一　のー　Φ一　の一　ωＮ　Ｆ−Ｎ　？−
Ｎ　ののロ■じΦ　Ｌ）ω　ｌ＋巾　Ｌ）一Ｌｌ−　←
一　《ジ　く≧　《の　ｉ＋Ｃの　←囚　０：＋＋　ロ
《　じＯ　《一　←←　←→　《《【？　：：　：．開
　お写；＝＝　　たよ　＝：；＝　北　蚕　＝＝＃＝　
邦三三ミミ　■ミミニ＝＝＝ミ−＋　　　　　−＋　　
　　　ｅ％Ｉ　　　　　ＦＪ　　　　　（％ｌ　　　　
　ｅＱ　　　　　ｅ’ｊ−　　ゞ一　　ゞ一　　ゞ８　
　１−　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
一雪　。　　＝＝＝富　に＝　亡主　乙ご　ごこ　セ＝
　に；　に芸　と：　告芸　＝二　；討　冨真　￥ニ　
ミ；　巨ど！！巳己｝＋ｗ＜　　１−＋の　Ｑ一　《ト
　ペ《　りら　ト一　ロ〉　←ら　じベ　トら　ロ《　
じ《　べ一　じロ　０ロ　ロ←《←く０う６ メロン ＴＲＦＤメロン 一．，．１−◆−−ＣＭＶ　ｃｐ　Ｉ１７Ｆ第４図 種々の遺伝子型のメロンにおける芽の誘導に対するＣａ
Ｃ文，濃度の影響 第 図

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅ
    ｎｓ（アグロバクテリウム・ツメフアシエンス）を介し
    て導入された少なくとも１つの遺伝子を含むＣｕｃｕｍ
    ｉｓｍｅｌｏ（マスクメロン）種に属する幼形を遺伝子
    的に形質転換された芽から生産する方法において、遺伝
    子的に形質転換された芽を連続した２段階で栽培するこ
    と及びかかる栽培段階のうちの第１の段階は、サイトキ
    ニンさらに限定的に言うと６−ベンジルアミノプリン（
    ＢＡＰ）を含む植物細胞培養培地上で行なわれ、芽が約
    ３ｍｍ以上の高さに達した時点で行なわれる第２の段階
    は多量成分として ＫＨ＿２ＰＯ＿４：約５０〜約１００ｍｇＬ＾−＾１Ｍ
    ｇＳＯ＿４：約７５〜約３００ｍｇＬ＾−＾１ＣａＣｌ
    ＿２・２Ｈ＿２Ｏ：約５００〜約２５００ｍｇＬ＾−＾
    １ＫＮＯ＿３：約７５０〜約１２００ｍｇＬ＾−＾１Ｎ
    Ｈ＿４ＮＯ＿３：約１５０〜約２００ｍｇＬ＾−＾１を
    含む植物細胞培地上で行なわれることを特徴とする方法
    。 （２）第２の栽培段階で用いられる培地には多量成分と
    して ＫＨ＿２ＰＯ＿４：８５ｍｇＬ＾−＾１ ＭｇＳＯ＿４：１８５ｍｇＬ＾−＾１ ＣａＣｌ＿２・２Ｈ＿２Ｏ：１７２０ｍｇＬ＾−＾１Ｋ
    ＮＯ＿３：９５０ｍｇＬ＾−＾１ ＮＨ＿４ＮＯ＿３：１６５ｍｇＬ＾−＾１ が含まれている請求項１記載の方法。 （３）培地が以下の組成をもつ培地ＭＢ６である請求項
    ２記載の方法： ＫＨ＿２ＰＯ＿４：８５ｍｇＬ＾−＾１ ＭｇＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ：１８５ ＣａＣｌ＿２・２Ｈ＿２Ｏ：１７２０ ＫＮＯ＿３：９５０ ＮＨ＿４ＮＯ＿３：１６５ ＭｎＳＯ＿４・Ｈ＿２Ｏ：１６．９ ＫＩ：０．８３ｍｇＬ＾−＾１ Ｈ＿３ＢＯ＿３：６．２ ＺｎＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ：８．６ ＣｕＳＯ＿４・５Ｈ＿２Ｏ：０．０２５ Ｎａ＿２ＭｏＯ＿４・２Ｈ＿２Ｏ：０．２５ＣｏＣｌ＿
    ２・６Ｈ＿２Ｏ：０．０２５ ＦｅＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ：２７．８５ Ｎａ＿２ＥＤＴＡ：３７．２５ ニコチン酸：０．５０ チアミン−ＨＣｌ：０．１０ ピリドキシン−ＨＣｌ：０．５０ グリシン：２．０ ミオイノシトール：１００ サッカロース（蔗糖）：１００００ ゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）：４０００ ｐＨ５．６ （４）マスクメロン種に属する遺伝子導入植物の生産方
    法において、請求項１に従って生産され二次根を有する
    遺伝子導入幼形は、幼形から非遺伝子的に形質転換され
    た植物の発育にとって通常必要とされる培養培地上で移
    植されることを特徴とする方法。 （５）アグロバクテリウム・ツメファシエンスにより導
    入された少なくとも１つの遺伝子を含み、遺伝子的に形
    質転換された外植体から遺伝子的に形質転換された芽の
    誘導方法であって、かかる外植体はマスクメロン種の植
    物に由来するものであり、誘導は、無機塩としては塩化
    カルシウムそして細菌（バクト）−寒天又は寒天−寒天
    を含む遺伝子的に形質転換されていない外植体からの芽
    の誘導にとって通常必要とされるビタミン及び無機塩の
    組合せを有する遺伝子的に形質転換された芽の誘導培地
    上で行なわれるような方法において、かかる培地のＣａ
    Ｃｌ＿２含有量はＣａＣｌ＿２・２Ｈ＿２Ｏとして計算
    された場合約４４０〜約２２００ｍｇＬ＾−＾１であり
    、細菌−寒天又は寒天−寒天の含有量は約０．８〜約１
    ．２％であり、かかる誘導培地には約０．３〜約１．１
    ３ｍｇＬ＾−＾１の６−ベンジル−アミノプリン（ＢＡ
    Ｐ）及び約０〜約１．３ｍｇＬ＾−＾１のインドール−
    ３−酢酸（ＡＩＡ）が加えられることを特徴とする誘導
    方法。 （６）誘導培地は、ＭＳ培地の名で知られているＭｕｒ
    ａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ（１９６２年）の培地に０
    ．３〜１．１３ｍｇＬ＾−＾１、好ましくは０．８５ｍ
    ｇＬ＾−＾１のＢＡＰを加えたものであり、かかるＢＡ
    Ｐが、存在する唯一の植物ホルモンである請求項５に記
    載の方法。 （７）誘導培地中に存在するビタミンが「スタバ（Ｓｔ
    ａｂａ）」のビタミン（１９６９年）である請求項５記
    載の方法。 （８）カルシウム含有量が約１０００〜約 ２２００ｍｇＬ＾−＾１であり、さらに限定的に言うと
    、約１７５０〜約２２００ｍｇＬ＾−＾１である請求項
    ５記載の方法。 （９）誘導培地は以下の組成を有する「Ｍ、Ｉ、培地」
    と呼ばれる培地である請求項（７）に記載の方法： Ｍ、Ｉ、培地 多量成分：ＫＮＯ＿３：１９００ｍｇＬ＾−＾１ＮＨ＿
    ４ＮＯ＿３：１６５０ｍｇＬ＾−＾１ＣａＣｌ＿２・２
    Ｈ＿２Ｏ：２２００ ＭｇＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ：３７０ ＫＨ＿２ＰＯ＿４：１７０ Ｎａ＿２ＥＤＴＡ：ＭＳと同じ 微量成分：ＭＳと同じ ビタミン：Ｓｔａｂａ ミオイノシトール：１００ｍｇＬ＾−＾１ サッカロース：３０ｇＬ＾−＾１ 寒天−寒天：０．８％ ＢＡＰ：３．７５μＭ ＡＢＡ：１μＭ （１０）形質転換された芽が、請求項５〜９のいずれか
    １項に従って得られたものである請求項１記載の遺伝子
    導入幼形の生産方法。 （１１）マスクメロン種に属する植物の外植体の遺伝子
    的形質転換方法において、かかる外植体は種子から単離
    された胚からの子葉であり、かかる子葉は０日〜４日間
    、さらに限定的には、２日間発芽したこと、ならびに形
    質転換はアグロバクテリウム・ツメフアシエンスを介し
    て行なわれる方法。 （１２）子葉の形質転換は、子葉の断片を￥アグロバク
    テリウム・ツメファシエンス￥の細菌懸濁液と接触させ
    、その後子葉の断片と細菌のコカルチャーを約４８時間
    行なうことによって行なわれ、￥Ａ、ツメファシエンス
    ￥が植物内に導入されるための機能的遺伝子を含んでい
    る請求項１１記載の方法。 （１３）細菌懸濁液が、ＭＳ培地内の細菌の懸濁液であ
    り、コカルチャー培地が寒天−寒天で凝固されたＭＳ培
    地である請求項１２記載の方法。 （１４）アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介し
    て植物内に導入されるべき遺伝子が、キュウリのモザイ
    ク病ウィルス（ＣＭＶ）のカプシドタンパク質に対しコ
    ード付けする遺伝子である請求項１１〜１３のいずれか
    １項に記載の方法。 （１５）遺伝子が、以下の配列又はキュウリのモザイク
    病ウィルスに対する抵抗性を付与することができる当該
    配列の断片を有している請求項１４記載の方法： 【遺伝子配列があります】 （１６）遺伝子が、以下の配列又はキュウリのモザイク
    病ウィルスに対する抵抗性を付与することのできる当該
    配列の断片を有している請求項１４記載の方法： 【遺伝子配列があります】 （１７）￥マスクメロン￥種に属する植物に由来する外
    植体から遺伝子導入植物を生産する方法において、 ｉ）請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の外植体の
    遺伝子的形質転換の段階、 ｉｉ）段階ｉ）で得られた形質転換された外植体から遺
    伝子的に形質転換された芽を誘導する段階（なおかかる
    芽の誘導は請求項５〜９のいずれか１項に従って行なわ
    れる）、 ｉ）段階ｉｉ）で得られた遺伝子的に形質転換された芽
    から遺伝子導入幼形を発育させる段階（なおかかる発育
    は請求項１〜３のいずれか１項に従って行なわれる）、 ｉｖ）段階ｉｉｉ）で得られた遺伝子導入幼形から遺伝
    子導入植物を発育させる段階（なおかかる発育は請求項
    ４に従って行なわれる）、 という連続的段階を特徴とする方法。 （１８）１つの植物の再生中の芽から幼形への発育に適
    した細胞培養培地において、多量成分としＫＨ＿２ＰＯ
    ＿４：約５０〜約１００ｍｇＬ＾−＾１ＭｇＳＯ＿４・
    ７Ｈ＿２Ｏ：約７５〜約３００ｍｇＬ＾−＾１ＣａＣｌ
    ＿２・２Ｈ＿２Ｏ：約５００〜約２５００ｍｇＬ＾−＾
    １ＫＮＯ＿３：約７５０〜約１２００ｍｇＬ＾−＾１Ｎ
    Ｈ＿４ＮＯ＿３：約１５０〜約２００ｍｇＬ＾−＾１を
    含んでいることを特徴とする培地。 （１９）多量成分として、 ＫＨ＿２ＰＯ＿４：８５ｍｇＬ＾−＾１ ＭｇＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ：１８５ｍｇＬ＾−＾１Ｃａ
    Ｃｌ＿２・２Ｈ＿２Ｏ：１７２０ｍｇＬ＾−＾１ＫＮＯ
    ＿３：９５０ｍｇＬ＾−＾１ ＮＨ＿４ＮＯ＿３：１６５ｍｇＬ＾−＾１ を含む請求項１８記載の細胞培養培地。 （２０）以下の組成を有する請求項１８記載の細胞培養
    培地： ＫＨ＿２ＰＯ＿４：８５ｍｇＬ＾−＾１ ＭｇＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ：１８５ ＣａＣｌ＿２・２Ｈ＿２Ｏ：１７２０ ＫＮＯ＿３：９５０ ＮＨ＿４ＮＯ＿３：１６５ ＭｎＳＯ＿４・Ｈ＿２Ｏ：１６．９ｍｇＬ＾−＾１ＫＩ
    ：０．８３ Ｈ＿３ＢＯ＿３：６．２ ＺｎＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ：８．６ ＣｕＳＯ＿４・５Ｈ＿２Ｏ：０．０２５ Ｎａ＿２ＭｏＯ＿４・２Ｈ＿２Ｏ：０．２５ＣｏＣｌ＿
    ２・６Ｈ＿２Ｏ：０．０２５ ＦｅＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ：２７．８５ Ｎａ＿２ＥＤＴＡ：３７．２５ ニコチン酸：０．５０ チアミド−ＨＣｌ：０．１０ ピリドキシン−ＨＣｌ：０．５０ グリシン：２．０ ミオイノシトール：１００ サッカロース：１００００ ゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）：４０００ ｐＨ５．６ （２１）非遺伝子的に形質転換された外植体からの芽の
    誘導に通常必要とされるビタミン及び無機塩の組合せを
    有し、その無機塩としては塩化カルシウムを含む植物細
    胞培地と細菌−寒天又は寒天−寒天で構成された芽の誘
    導培地において、かかる培地のＣａＣｌ＿２含有量はＣ
    ａＣｌ＿２・Ｈ＿２Ｏとして計算した場合４４０〜２２
    ００ｍｇＬ＾−＾１であり、細菌−寒天又は寒天−寒天
    の含有量は０．８〜１．２％であり、かかる培地には０
    ．３〜２．０ｍｇＬ＾−＾１のＢＡＰ及び０〜１．３ｍ
    ｇＬ＾−＾１のＡＩＡが添加される誘導培地。 （２２）ＭＳ培地と呼ばれるＭｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳ
    ｋｏｏｇ（１９６２年）による培養培地に０．３〜１．
    １３ｍｇＬ＾−＾１、より限定的には０．８５ｍｇＬ＾
    −＾１のＢＡＰを加えたもので構成され、かかるＢＡＰ
    は存在する唯一の植物ホルモンである請求項２１記載の
    芽の誘導培地。 （２３）誘導培地中に存在するビタミンが、「スタバ」
    ビタミン（１９６５年）である請求項２１記載の培地。 （２４）カルシウム含有量が約１０００ｍｇＬ＾−＾１
    〜約２２００ｍｇＬ＾−＾１、より限定的には約１７５
    ０〜約２２００ｍｇＬ＾−＾１である請求項２１記載の
    芽の誘導培地。 （２５）以下の組成を有する請求項２３記載の芽の誘導
    培地： ￥Ｍ、Ｉ、培地￥ 多量成分：ＫＮＯ＿３：１９００ｍｇＬ＾−＾１ＮＨ＿
    ４ＮＯ＿３：１６５０ ＣａＣｌ＿２・２Ｈ＿２Ｏ：２２００ ＭｇＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ：３７０ ＫＨ＿２ＰＯ＿４：１７０ Ｎａ＿２ＥＤＴＡ：ＭＳと同じ 微量成分：ＭＳと同じ ビタミン：Ｓｔａｂａ ミオイノシトール：１００ｍｇＬ＾−＾１ サッカロース：３０ｇＬ＾−＾１ 寒天−寒天：０．８％ ＢＡＰ：３７７μＭ ＡＢＡ：１μＭ （２６）マスクメロン種に属し、請求項５〜９のいずれ
    か１項に従って得ることができる、遺伝子的に形質転換
    された芽。 （２７）マスクメロン種に属し、請求項１１〜１５のい
    ずれか１項に従って得ることができる、遺伝子的に形質
    転換された子葉。 （２８）マスクメロン種に属し、請求項１〜３のいずれ
    か１項に従って得ることができる、遺伝子導入幼形。 （２９）マスクメロン種に属し、請求項１〜１６のいず
    れか１項に従って得ることができる、遺伝子導入植物。 ３０）キュウリのモザイク病ウィルスのカプシドタンパ
    ク質を表現する、請求項１５〜１６の１項に従って生産
    可能な遺伝子導入メロン。 ３１）請求項２９に記載の遺伝子導入植物の種子。 （３２）以下に示す配列の少なくとも１つの断片を有し
    キュウリのモザイク病ウィルスのカプシドタンパク質に
    対しコード付けするヌクレオチド配列において、かかる
    断片はキュウリのモザイク病ウィルスに対する抵抗性を
    付与することができるヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 （３３）以下に示す配列の少なくとも１つの断片を有し
    、キュウリのモザイク病ウィルスのカプシドタンパク質
    に対しコード付けするヌクレオチド配列において、かか
    る断片が、キュウリのモザイク病ウィルスに対する抵抗
    性を付与することができるヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】
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