JPH02503263A

JPH02503263A - ククミス種植物のインビトロでの遺伝的形質転換および制御再生

Info

Publication number: JPH02503263A
Application number: JP62506414A
Authority: JP
Inventors: トルールソン，アンナ　ジェイ．; シャヒン，エリアス　エー．
Original assignee: ザ　プラント　セル　リサーチ　インスティチュート，インコーポレイテッド
Priority date: 1986-10-01
Filing date: 1987-10-01
Publication date: 1990-10-11
Also published as: IL84066A0; AU8151887A; WO1988002405A1; EP0262972A3; EP0262972A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】分野本発明は、アグロバクテリウム　リゾゲネス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｒｎｅｓ）を使用したインビトロでのククミス（Ｃｕｃｕ＋ａｉｓ　）種植物の遺伝的形質転換、およびそれに続く遺伝学的に異なる植物への再生に関する。さらに詳しくは９本発明は、ククミス種植物の倒置した（ｉｎｖｅｒｔｅａ）胚軸切片にム　粘ｎ昼弘並を接種して形質転換し、そこに根を誘導し、その根組織から遺伝的に変化した植物を再生することに関する。再生は、誘導した根から直接的に、またはＣＴＭ−１からＣＴＭ−３の培養培地を使用して、小植物または成熟植物の根、茎９葉の組織の外植片から、あるいはＣＭＰ−１からＣＭＰ−３の培地を使用してそのような組織から単離されるプロトプラストから１行なわれ得る。本発明の形質転換技術は、再生９体細胞ハイブリダイゼーション（体細胞雑種形成）およびツマクローナル変異スクリーニングと組合せると、植物、特にククミス属（ｇｅｎｕｓ　Ｃｕｃｕ＋ｍ１ｓ）における遺伝的改善についての完全な技術範囲を達成する。

遺伝子導入植物は、コンパクトな形態（短い簡閲）を有することを特徴とする。

１員種間の不稔性障壁は、植物の育種における最大の制限因子である。これらの障壁は、性の不和合性のために、栽培植物雑草植物間の、疾病、昆虫、および除草剤に対する耐性のような多くの望ましい形質の転移を妨害する。この問題は、特にククルビタセ工科（ｆａｎ＋ｉｌｙ　Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）の植物では重大である。この科には、ククミス属（ｇｅｎｅｒａ　Ｃｕｃｕｍｉｓ）　　（キュウリ類（シー・サチプス、　Ｃ，５ａｔｉｖｕｓ）およびメロン類（シー・メＯ，Ｃ，ｏ＋ｅｌｏ）　）　、シトルルス属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ、スイカＭ）およびククルビタ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、カポチャ類）が含まれる。ククミス属の培養種のなかで性交差が可能なのは、シー・サチブスと、密接な近縁関係にあるシー・ハーウイキー（Ｃ，ｈａｒｗｉｃｋｉｉ）との間だけである。キュウリ類と、この属の他の種とを異種交配させる試みは失敗に終った〔ディーキンら（Ｄｅａｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ）　、　１９７１年〕。

遺伝子工学における最近の進歩によれば、上記の経済的に重要な作物を改良するのに、性的増殖法に代る有望な方法があるようである。このことは、遺伝的な変異、いわゆるツマクローナル（ｓｏｍａｃｌｏｎａｌ）変異の増大が認められる組織培養の場合に特によ（あてはまる〔シーキンおよびスコウクロフ）　（Ｌａｒｋｉｎ　ａｎｄ　Ｓｃｏｗｃｒｏｆｔ）　、　１９８１年〕。なお、不稔性障壁は、性的に不和合性の種の原形質体を融合させることにより克服できる。しかし、外植片組織培養法によりククミス植物を再生させる確実な方法が存在しなかったので２本願発明者らの以下の最近の開発［ａ）およびｂ）］まで大きな進歩が妨げられてきた０本願発明者らは、ａ）ＣＴＶＩ−１〜ＣＴＭ−４シリーズの外植片胚様体の発生用培地と発育用培地とを開発し。

トルールソン、ニー・ジェイおよびシャヒン、イー、ニー。

（Ｔｒｕｌｓｏｎ　Ａ、　Ｊ、　ａｎｄ　５ｈａｈｉｎ　Ｅ、　Ａ、）　、　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　　ｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｕｓ　　Ｃｕｃｕｍｉｓ　（１９８６年、印刷中）に報告している。その内容は１本願発明者らの同時係属出願（９２／９）に包含されている。さらに本願発明者らは、ｂ）ＣＰＭ−１〜ＣＰＭ　−３シリーズのプロトプラスト再生および発育用培地とを開発し、上記文献に報告しくＴｒｕｌｓｏｎ　ａｎｄ　５ｈａｈｉｎ、印刷中、　１９８６）　、そして本願発明者らの同時係属出願（９２／１３　’）に開示されている。

不稔性障壁を克服するさらに他の方法としては、遺伝子の移入およびそれに続く該遺伝子の発現によって望ましい形質を導入することがある。種間および種内の遺伝子移入は遺伝子工学における主要な目的である。形質転換した植物における移入した遺伝子の好成績の発現が可能であり、すでにいくつかの系で達成されている（フラワー（Ｆｒａｌｅｙ）ら、１９８３；ヘレラーエストレラ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ）ら、１９８３；ベバン（Ｂｅｖａｎ）　。

１９８４　：ホラシュ（）Ｉｏｒｓｃｈ）ら、１９８５；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）　　ら。

１９８５）。この成功は９種々の所望の形質を有するようになることによる将来の収穫の改善に対する大きな望みの基礎である。ククミス属、特にキュウリ類の改良における遺伝子工学の適用が特に歓迎される。なぜなら、キュウリ類と、ウリ科における他の植物と性的不和合性により９通常の生育ｓｔを用いたときには、疾病および昆虫に対する抵抗性のような特性の移入が排除される（デアキン（Ｄｅａｋｉｎ）ら、　１９７１）　。

遺伝子移入の最も広く使用される方法は、土壌菌アグロバクテリウム　ツメファシェンス（ｎ旦ア狡組■ｕｓ　ｔｕｎ＋ｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドの非武装型による。ザンブリスキーら（Ｚａｒｒ＋ｂｒｙｓｋｉｅｔ　ａｌ、　１９８３）。Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓは、傷ついた双子葉植物に対する感染後に、クラウンゴール腫瘍を引き起こす植物病原菌である。大きいプラスミド（Ｔｉプラスミド）は、細菌の催腫瘍性の原因である。クラウンゴール腫瘍はＴ− ＤＮＡと呼ばれるＤＮＡセグメントを含む。これは腫ｆｌ！誘導細菌中に存在するＴｉプラスミドの所定の部分と相同であって、植物ゲノム中に安定に融合される。Ｔ−ＤＮＡはさておき、　ｖｉｒ領域と呼ばれるＴｉプラスミドの他の部位が、腫瘍誘導に必須である（ホーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）ら、　１９８３）　、遺伝子移入の他の手段はＡ、　珪ｎ■肌竺であって、これはＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓとは腫瘍ではなく根を誘導する点で異る（チルトン（Ｃｈ　ｉ　１　ｔｏｎ）ら、１９８２；デビット（Ｄａｖｉｄ）ら、　１９８４）。

バイナリ−Ｔｉプラスミドベクター系は、アグロバクテリウムの２つのプラスミドからなる。ここで、ひとつのプラスミドは植物細胞に移入され得るＤＮＡを含み、他方はＤＮＡ移入に必要であるが、自らは移入さないビルレンス（ｖｉｒ、毒性をもたらす）遺伝子を含む、ホーケマ（Ｒｏｅｋｅｍａ）ら（１９８３）は。

２つの和合性プラスミド（一方は狽１部位を含み、他方は広いｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株が正常な腫瘍誘導能を有する。しかし、どちらのプラスミドも一方だけでは機能性をもたない、この方法によって、一方のプラスミド上のＴ−ＤＮＡは、その大きさの故に。

宿主として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を使用して遺伝的に容易に操作され得る。幻工部位を持つプラスミドを有するＬｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株中へのこのプラスミドの移入は、植物細胞中に操作されたＴ−ＤＮＡの導入を可能にする。このようにして、植物遺伝工学用の手の込んだバイナリ−ベクター系が展開され得る。

シンプソン（Ｓｉ＋５ｐｓｏｎ　）ら（１９８６，印刷中）は、植物形質転換のために、アグロバクテリウム　ツメファシェンス（ハμヒｂａｃｔｅｒｉｕｉｏ　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のバイナリ−Ｔｉプラスミド系に基づいて、２つの非催腫瘍性ベクター（ｐＡＲＣ４およびｐＡＲＣ８）を構築した。各ベクターは、　ｐＴｉＴ３７からの左および右の末端配列を含む。これらの配列は、植物細胞に移入されたＤＮＡの程度を決め、唯一の制限酵素部位および植物中で機能するマーカー遺伝子（ｐＡＲＣ４のツバリン合成酵素またはｐＡＲＣ８のネオマイシン　ホスホトランスフェラーゼ）に隣接する。インビトロで構築された後、ベクターは、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）から幻工遺伝子を含む数種のアグロバクテリウム株のいずれにも接合により移入され得る。

ちとから存在するＲｉプラスミドおよびツバリンシンターゼ？　−／’Ｊ　−ｔ：　含ムＡ　、　　庄圏匹並競Ａ　４株を用いて、シンプソン（Ｓｉ＋５ｓｏｎ　）ら（１９８６，印刷中）は、アルファルファまたはトマトへの感染で生じる毛状根の５０％までがツバリンを合成することを発見した。スクリーン可能なマーカーをコードするベクターＤＮＡは、ＲｉプラスミドＤＮＡ　と−緒にアルファルファまたはトマトの細胞にしばしば同時に移入された。これに対して、彼らは、大豆種を用いた場合には、形質転換されない根が高い割合で見い出されるため、大豆細胞への共移入の頻度を評価することが困難であることを見い出した。

はとんどの場合において、末端配列間でベクターＤＮＡのコピーは５個までが忠実に移入され、保持された。このことは、Ｒ１およびＴｉプラスミドからの末端配列およびｖｉｒ遺伝子が機能的には同等であることを示唆する。シンプソン（Ｓｉ調ｐｓｏｎ　）ら（１９８６、印刷中）はウリ（Ｃｕｃｕ＝ｂｉ　ｔａｃｅａｅ　）科またはククミス（Ｃｕｃｕ＋ｎ１ｓ）属については研究を行なっていなかった。

発明者らの知る限りにおいては、これまで、に工ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡ、　　へカ」朋翌によりククミス種植物細胞中に遺伝物質を成功裡に移入させ、移入した遺伝子を発現させて、遺伝学的に変化した植物構造（細胞、細胞コロニー、組織、ミニカルス、胚葉体、小植物または植物体）に再生させることができた者はいなかった。つまり、今日まで、ククミス（Ｃｕｃｕｍｉｓ）についての遺伝子工学へのこのルートは閉ざされたままであった。

従って、外来遺伝子をククミス（Ｃｕｃｕｎ＋ｉｓ）種植物構造または植物中に成功裡に移入するためにＡ、　　旦豆皿胚社を使用し得る。有効で容易であり、かつ再現性のある方法が必要とされている。そのことは方法論的に０作物栽培学上望ましい遺伝子の移入を可能とすることによってククミス（Ｃｕｃｕ＋＋＋ｉｓ　）種の遺伝学的な改良への新しいルートを開く。さらに、カナマイシン耐性のようなマーカー遺伝子を導入して、ククミス（Ｃｕｃｕ＋＋＋ｉｓ　）種と他の種との体細胞の２種問および種内におけるハイブリダイゼーション／サイプリダイゼーシ５ン（細胞質雑種形成）を容易に行う技術が必要とされている。

本発明目的本発明の目的のひとつは、アグロバクテリウム　リゾゲネス（ハ旦畑曵国吐」負ｎ匹弘競）の使用による植物構造および／または植物体の遺伝的形質転換、さらに詳しくは、ククミス（Ｃｕｃｕｍｉｓ）種植物組織の形質転換の方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、形質転換したククミス（Ｃｕｃｕｍｉｓ）種植物組織を遺伝的に改変されたコンピテントミニカルス、胚−葉体、根、小植物および植物体にインビトロで再生する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、成熟植物に発育することができ、遺伝的に改変されたプロトプラストまたは外植片組織から、細胞、細胞コロニー、ミニカルス、胚葉体および小植物をインビトロで発生、誘導および再生させる方法を提供することにある。

本発明の他の目的は２人工種子としてカプセル化するために遺伝的に改変された植物ミニカルスおよび胚葉体を連続的に製造する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は９本発明の新規方法および手段をククミス（Ｃｕｃｕｍｉｓ　）属の改良植物の製造に適用することにある。

本発明の他の目的は、十分に種子が形成されるまで植物を育成することなく、遺伝子工学的に操作されたおよび／またはハイブリダイズされた植物株を短時間のうちに製造することにある。

本発明の他の目的は、ホルモンを用いてまたは化学的方法により花をつけさせることなく無性生殖により植物を繁殖させることにある。

本発明の他の目的は、とりわけククミス（Ｃｕｃｕｍｉｓ）種牛に外来のまたは選択し得るマーカー遺伝子を導入して９体細胞ハイブリダイゼーションを容易に実施する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、冷凍保存した後、解凍し、育成を継続して行ない、遺伝的に変化した小植物および／または植物に導くことができる。遺伝的に改変されたミニカルスおよび胚葉体を製造することにある。

本発明の他の目的は、ククミス（Ｃｕｃｕｍｉｓ）種組織を形質転換させて、無性生殖体細胞ハイブリダイゼーションを容易に行う方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、Ａ、、肋豆皿並匹の１種またはそれ以上のベクターＴ−ＤＮＡのみ、ＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡのみ、または両ベクターおよびＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡをククミス（ＣｕｃｕｖＡｉｓ　）種植物に導入し、一方または他方あるいは両方を発現させることにある。

本発明の他の目的は、遺伝子工学および特性の選択のためのマーカー遺伝子としてのカナマイシン　クロラムフェニコールまたは他の抗生物質に対する耐性をククミスＩｃ、ｕｃｕｍｉｓ）種植物に導入することにある。

本発明のさらに他の目的は９本明細書の残りの部分および請求項から明らかとなろう。

定義本願で用いる用語法は、当該技術分野で用いられている用語法から変更しようとするものではない。しかし、当該技術分野で用いられているいくつかの用語の意味は、必ずしも同じではないので、以下の定義は、このような場合に役立つものである。

「形質転換」とは、外来（植物、細菌、ウィルスまたはキメラ）　ＤＮＡが、目的とする植物ＤＮＡに導入され、安定で遺伝可能な状態となることにより、植物が遺伝的に改変されることを指していう。

「小植物」は、細胞培養により無性的に再生され、充分に発育してシュートおよび根を有する植物を意味する。

「外植片ノは、培養するための、植物の断片または植物の一部の組織片を意味する。

「ホルモン」は、植物の成長もしくは分化に影響し９本願の種々の培地に対して用いた場合には、外因性である植物成長調節物質を意味する。

「カルス」およびその複数形の「カリ（ｃａｌｌｉ　）　Ｊは、植物に切り傷をつけるとか、切断するとか、もしくは損傷させることに応答して形成される未組織の細胞集合体を意味し。

本願では、培養中の外植片組織上に形成するか、または細胞壁を再生した原形質体の分裂により形成する未組織の細胞成長物を意味する。

「胚様体」は、外観が植物の接合胚に似た構造体である。

ｒ体細胞雑種」および「体細胞ハイブリダイゼーション」とは、一般に、細胞物質の安定した結合をいう。それは、プロトプラスト／プロトプラストまたはプロトプラスト／サイトブラストの結合であり、サイブリッド（細胞質雑種）およびサイブリダイゼーション（細胞質雑種形成）を包含する。

略記号の意味は次の通りである：ＮＡＡ　＝α−ナフタレン酢酸ＺＲ＝ゼアチンリボシドＢＡＰ　−６−ベンジルアミノプリンＧ＾、＝ジベレリン酸２．４−Ｄ＝２．４−ジクロロフェノキシ酢酸耶培地−ムラシゲースクーグ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ。

１９６２年）ＣＰＭ　＝ククミスブロトプラスト培地、　ＣＰＭ−１，ＣＰＭ−２，ＣＰｌ’ １−３（トルールソン（Ｔｒｕｌｓｏｎ）およびシャーイン（Ｓｈａｈｉｎ）、　１９８６）ＣＰＥ　＝ククミスプロトプラスト酵素溶液ＣＰＥ−Ｇ　＝グリシンを含有するククミスプロトプラスト酵素溶液ＣＴＭ　＝ククミス形質転換培地；ＣＴＭ−１，ＣＴＭ−２，ＣＴＭ−３（トルールソン（Ｔｒｕｌｓｏｎ）およびシャヒン（Ｓｈａｈｉｎ）　、　１９８６）ＰＥＴ−溶液＝トマト前酵素溶液（シャヒン、　１９８５年）ＴＭ−１＝）マド培地１　（シャヒン、　１９８５年）ＴＭ−２＝　）マド培地２（シャヒン、　１９８５年）ｐＡＲＣ８＝　Ａ、　　ｒｈ土弦■ｎｅｓに導入されるバイナリ−ベクター（シンプソン（Ｓｈｉｎ＋ｐｓｏｎ）ら、　１９８６）。

ｐＡＲｃ１６　＝改変されたｐＡＲＣ８バイナリ−ベクターであり、　Ｔ−ＤＮＡの旧ｎｃｌＩＩ［部位に９．０ｋｂの旧ｎｄＩＩｌ断片を有する。

ＨｉｎｄＩ［Ｉ＝周知の制限酵素ＡＢ培地＝アグロバクテリウムの培地（チルトン（Ｃｈｉｌｔｏｎ）ら、１９７４）。

図面本明細書の開示内容は２次の図面を参照とする：第１図は９本発明の形質転換に使用されるｐＡＲＣ８ベクタープラスミドの概略図であり；第２図は、カナマイシン耐性（＋）またはカナマイシン耐性（−）を選択するためのＮＰＴ　ＩＩテストの複写であり；第３図は、ベクターＤＮＡの植物ゲノム中への組込みを示すサザンプロットＨｉｎｄ　ｍフラグメント分析の複写であり；そして第４図は、正常な対象と比較した９本発明の遺伝子導入植物の写真の複写である。

要旨遺伝子導入キュウリ植物体は、　Ｃｕｃｕ＋＋＋ｉｓ　　旦山旦Ｃ，，ｃｖ。

Ｓｔｒａｉｇｈｔ　Ｅｉｇｈｔの倒置した（ｉｎｖｅｒｔｅａ）胚軸切片に、もとから存在するＲｉプラスミドに加えてベクターｐＡＲＣ８またはｐＡＲｃ１６を含むアグロバクテリウム　リゾゲネス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉ肥廿ｎ」弘且）を接種することにより誘導された根から再生された。

Ａ、　　■ｎ匹姐特を接種した倒置した胚軸の表面に形成された根を切除し、第１の系列は、　ＣＴＭ−２培地（０，７％寒天中にＭＳ塩、５μＨの２．４−Ｄ、５μｈのＮＡＡおよび２μｈのＢＡＰを含む）に載置した後、連続して光を照射（３５００ルクス）シ。

２７°Ｃで２〜３週間培養を行なった。接種した根の第２の系列は、２５■／２カナマイシン（シグマ社）を添加したＣＴＭ−２培地で培養した。根表面に現れた胚葉体を離して、　ＣＴＭ−３培地（０，７％寒天中ニ５．ｃｒＭＮＡＡおよび２．ｃｒＭＢＡＰを含む？ＩＳ）ニ移し、同一条件下で１０〜１４日間培養を行なった。成熟胚葉体をホルモンを含まない耶培地（１％寒天）に移した。その上にシュートが生じた。細菌の残留を除くために、１００■／１セフオドキシムを含む培地を使用した。

ベクター（Ｔ−ＤＮＡ）から植物に移入されたＤＮＡは、酵素ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■をコードする遺伝子を含み、従って、植物細胞にカナマイシン耐性を与えた。遺伝子導入植物は正常に見え、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■に陽性であった。その遺伝子導入植物のサザンプロット分析によると、全ての植物がベクターＤＮＡを含んでいるが、その一部の植物のみがＲｉプラスミドからのＤＮＡを含んでいた。

本発明の遺伝子導入植物は１発芽可能な種子を有する果実を形成した。この種子は、Ｒ２世代に持込まれていて、　　ｒＰｃＲＩＨｉＤｅｎｓｉｔｙ　Ｊと呼ばれている。その植物は、コンパクトな形Ｂ（短い簡閲）を有することを特徴とし、そのことにより。

より接近した植物空間を形成し得、ニーカー当りのより大きな生産を可能とする。

第１図は２本発明の形質転換に使用される武装解除型のｐＡＲＣ８ベクターの概略図を示す、そのベクターは広い宿主域のレプリコン（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）およびアグロバクテリウム（ハ胚江旦１吐岬）におけるプラスミドの複製を可能とする）、移入の細菌原（これはヘルパープラスミドによりベクターの可動化を可能にする）および、ベクターを含む細菌の選択を可能とする。テトラサイタリン耐性（Ｔｅｔ”）およびアンピシリン耐性（Ａｍｐ”）をコードするマーカーを含む。

唯一の制限酵素部位Ｅｃｏ　　Ｒｉおよび旧ｎｄ　　ｍは、ベクター中に「外来」のＤＮＡフラグメントのインビトロでの挿入を容易にする。図中の旗の印は、植物細胞に移入されるＤＮＡの限界を定めるためにアグロバクテリウム（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋）が使用する末端配列を表わしている。　ＮＯ５／ＮＰＴは形質転換された植物細胞中でカナマイシン耐性を与える選択可能なマーカーである。このキメラ遺伝子は、ツバリンシンターゼ（ＮＯＳ　）プロモーターおよびターミネータ−に隣接する。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）をコードする部位からなる。　ｐＡＲｃ１６は改変されたｐＡＲＣ８ベクターである。

本発明を実施する最良の様式に関する詳細な説明以下の詳細な説明は、実施例としてなされるものであって。

本発明の原理を限定するものではなく、特定の実施例について述べられている。

これら実施例には９本発明の範囲に含まれる。と　熊旦皿凱競による形質転換、それに続く再生、誘導された祖からの胚葉体の発生およびそこからの小植物体の生育が、　実施例としてのキュウリ（ククミス・サチブス・エル）について記載されている。

実施例Ａククミス（Ｃｕｃｕｍｉｓ）種の形質転換１、培地組成ここで使用される種々の培地の組成は、特に記載されない限り、前記の対応する文献に記載されたものである。

２、接種のためのククミスの胚軸部の起源米国、オレゴン州、ブルークスのアルコ・シード社（ＡＲＣＯＳｅ、ｅｄ）　のストレート・エイト（Ｓｔｒａｉｇｈｔ　Ｅｉｇｈｔ）　　というキュウリの種子を、１滴のＴｗｅｅｎ　８０を加えた１０％（ｖ／ｖ）クロロックス（Ｃ１ｏｒｏｘ；　５．２５％次亜塩素ナトリウムを含有する市販の漂白剤）中で（滅菌溶液の１００　ｄあたり１滴のＴｗｅｅｎ　８０）＋１０分間滅菌し１次いで滅菌蒸留水中で３回すすぎ、湿潤したワットマン３号１１紙を内張すした滅菌ベトリブレート中に。

１プレートあたり約３０個ずつ置いた。これらの種子の均一かつ迅速な発芽を確実に行うために、該プレートを暗所で２４〜３０時間２７°Ｃに保持する。発芽した種子（小根長約５■）を無菌的に、　１５０　ｒａｇ／　ｌのカルベニシリン（Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）　（シグマ社（Ｓｉｇｎ＋ａ）　）を補充したＴＭ−１培地（シャヒン、　１９８５年）が約４〇−人ったマジェンタボックス（Ｍａｇｅｎｔａ　ｂｏｘ）中に（各ボックスあたり６個ずつ）入れ、成長室で４日間、夜は２１°Ｃで、昼間は２６°Ｃで、かつ１４時間の光同期（４５００ルクス）で培養した。苗が緑色になり、子葉のごく一部分だけが開いたときに、マジェンタボックスを、室温の暗所に２４時間置く。

ちとから存在するＲｉプラスミドに加えてＡ、　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミド由来のベクターｐＡＲＣ８（第１図参照；シンプソン（Ｓｉｍｐｓｏｎ　）ら、　１９８６．印刷中）または、　９．０ｋｂ　Ｈｉｎｄ　　ｍサイトに挿入された。改変ｐＡＲＣ８である。ベクターｐＡＲｃ１６を含む、　Ａ、　　ｒｈｉｚ■ｅｎｅｓ　　Ａ４株を使用した。この系の方法およびバイナリ− ベクターは、　１９８４年７月２５日付出願の同時係属出願の第６３４　、２８３号に開示され、クレームされている。その内容は、必要な程度に応じてここに引用されている。第１図に示されるように、カナマイシン耐性を与えるｐＡＲＣ８（およびｐＡＲｃ１６）中の選択可能なマーカーは、　ＮＯ５／ＮＰＴであり、これは、ツバリンシンターゼ（ＮＯＳ　）プロモーターおよびターミネータ− に隣接するＴｎ５ネオマイシンホスホトランスフエラーゼ（ＮＰＴ　）をコードする部位から構築されるキメラ遺伝子である。

（以下余白）４、接種操作ベクター上の細菌のＴｅｔゝマーカーを選択するため、接種物は、５■／ｌテトラサイクリン（シグマ）を添加したＡＢ培地（チルトン（Ｃｈ　ｉ　ｌ　ｔｏｎ）　　ら、　１９７４）上で暗所にて室温で増殖させた。上記Ａ−４（ｐＡＲＣ８またはｐＡＲＣ１６）　Ａ、　　並圏郵匹競株の４日間の培養物からなるものであった。その接種物を無菌細菌用ループ上に集め、上記１の幼植物の倒置した（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）胚軸切片（約２ＣＩ１１の長さ）の切断表面上に軽く塗りつけ、それを、ホルモンを含まないＭＳ培地（ムラシゲ−スクーグ、　１９６２）に載置した０次にプレートを密封し、　２５００ルクスの光を連続的に照射しながら２７℃でインキエベートした。接種１週間後に、胚軸切片を寒天表面上で切断し、ホルモンを含まないＭＳ培地（１００ｒａｇ／ｌ抗生物質セフアトキシム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加）に移し、同一の条件下で培養を行なった。

アンピシリン類似体であるセフアトキシムは、ベクターｐＡＲＣ８またはｐＡＲｃ１６上のＡａ＋ｐ”遺伝子によりコードされるベーターラクタマーゼによって改変されないため、これを使用した。

５、ＣＴＭ培地を使用する植物再生；テスト系列ＡおよびＢ以下の全ての培地において、１２１°Ｃで１５分間オートクレーブにかける前に、　ｐＨ５，８に調整した。細菌の残留を除くため。

１００　ＩＩｇ／　Ｒをセフアトキシムを培地に加えた。

テストの第１系列（系列Ａ）では、接種表面上に生成した根（長さ５〜１（１ｍ）を切断し、　ＣＴＭ−２培地（０６７％寒天中にＭＳ塩、５μ拘２．４−Ｄ（シグマ）、５μＭＮＡＡ（シグマ）。

２μ？１ＢＡＰ（シグマ）を含有する）上に載置し、　３５００ルクスの光を連続的に照射しなから２７°Ｃにて２〜３週間培養を行なった。

第２系列（系列Ｂ）では、根を切断し、２５■／ｆ！、カナマイシン（シグマ）を添加したＣＴＭ−２培地中で培養し、形質転換された植物を選択した。

両系列のテストで、２〜３週間後に根表面上に現われた胚葉体を離し、　ＣＴＭ −３培地（０，７％寒天中に５μ？Ｉ　ＮＡＡおよび２μＭ　ＢＡＰを有するＭＳ培地）に移し、１０〜１４日間にわたり。

同一の条件下で培養し、成熟胚葉体に成長させた。

これらの成熟胚葉体をＣＴ？！−４培地（１％寒天で固化させたホルモンを含まない耶培地）上に移した。そこでシュートが生じた。

これらの再生小植物をビートライト（シフイー　プロダクツ　カンパニー、ウエストシカゴ、イリノイ）および土壌の混合物（１：　１．　ｖ／ｖ　）に移植して強＜シ、植物に成長させた。

６、ネオマイシンホスホトランスフェラ−ゼ（ＮＰＴ）検定系列ＡおよびＢの再生植物におけるベクターＤＮＡによる形質転換の頻度をＮＰＴの検定（ライス（Ｒｅｉｓｓ）　ら、　１９８４）を用いて検定した０葉組織の小片（約２５ｍａ＋”）を検定で使用した。

検定は２度行なった。最初の検定は、ホルモンを含まないＣＴＭ−４培地の小植物について行ない、２度目はポットに入れ、土壌混合物中で強くした２〜４週間後に行った。

第２図は２本発明によりＡ、　　セ亘」ｅｎｅｓを接種することにより誘導した根から再生したキュウリ植物についてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ ■テストの結果を示す０発明者らは、ライス（Ｒｅｉｓｓ　）ら（１９８４）のポリアクリルアミドゲル検定をそのまま用いた０番号１〜９は、カナマイシン耐性に基づいて選択することなく再生させたキュウリ植物のうちから無作為に抽出したサンプルを示し１番号１０は、陽性コントロール（ＮＰＴを生産する細菌）である。ｒＮＰＴ　Ｊは酵素の可動性を示す。

７、ＤＮＡの単離およびサザンプロット分析ＮＰＲ−陽性植物のＤＮＡにおけるＮＯ５／ＮＰＴ遺伝子の組込みを確認するために、サザンプロット分析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、　１９７５）を採用した。ＤＮＡは、サハイーマルーフ（ＳａｇｈａｉＪＩａｒｏｏｆ　）ら（１９８４）の方法に従って、若葉組織２ｇ（生重量）から単離され、　ＨｉｎｄＩＩ［で消化され、そして実質的にツマショー（Ｔｈｏ顛ａｓｈｏｉｖ）ら（１９８０）に記載されているように、アガロースゲルで電気泳動を行ない、プロットし、確認された。キメラ遺伝子ＮＯ３／ＮＰＴを含むプラスミドＰＮＥＯ１０５（シンプソン（Ｓｉｍｐｓｏｎ）　　ら；１９８６　；係属中の出願番号第６３４．２８３号）は、ベクターＤＮＡの移入部分のプローブとして使用された。　ＮＰＴ陽性植物のＤＮＡ中へのＲｉプラスミドＤＮＡ移入の程度を調査するためにもまた。

サザンプロット分析が採用された。ＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡのクローンである。プラスミドｐＦＷ９４およびｐＦＷ４１．　　（ハフマン（Ｈｕｆｆａ＋ａｎ）ら、　１９８４）は、　ＴＬ−ＤＮＡおよびＴ、−ＤＮＡの存在をそれぞれ確認するためのプローブとして使用された。

第３図は、キュウリ植物ＤＮＡのサザンプロット分析ハイブリダイゼーション分析を示し、このことにより、ベクターＤＮＡのキュウリゲノムへの組込みが証明される。レーンｌ：ＥｃｏＲｉおよびＢｉｎｄｌＩ［で消化されたｐＮＥｏ　１０５　（これはｐＢＲ３２２にクローン化された）ＩＯ５／ＮＰＴ遺伝子を含む）を含むキメラＮＯＳ／ＮＰＴ遺伝子の半襟製再構築物（シンプソン（Ｓｉｍｐｓｏｎ）ら、　１９８６）　。

レーン２：形質転換していない対照のキュウリ植物からのＤＮＡのＢｉｎｄｌｌｌ消化物、レーン３〜６：形質転換された根から再生したＮＰＴ−１１ｉｉ％性植物からのＤＮＡのＨｉｎｄＩ［［消化物、プローブはｐＮＥＯ１０５である。

（以下余白）９、結果および考察の細胞に感染した。そのことは、接種７〜１０日後に接種表面１こ密集したクリーム色のカルスが現れたことによって示される。１週間または２週間後に、このカルスは根を生じた。コントロールの接種していない胚軸断片は、白色で隙間の多いカルスを少量生じたが、根は生じなかった。

接種胚軸断面から収穫された。全部で６９１個の根を、胚誘導ＣＴＭ−２培地上にプレートした。これらのうち９．２５％を越える数の根（６４個の根）が再生されて小植物となった。これは。

形質転換していない根の外植片について得られたのと同様な割合である。別々の根から再生した６４の幼植物のうちで、２２の幼植物がネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■に対するテストで陽性（ＮＰＴ　Ｉｓ性）であった。これらの植物は、土壌混合物に鉢植えされた後、２度目に検定されたときにも依然としてＮＰＴ陽性であった。表１にその結果をまとめて示す。

表１ｒｈ　ｉｚｏｇｅｎｅｓによるキュウリ　（Ｃｕｃｕｍｉｓ　５ａｔｉｖｕｓ　Ｌ、、　ｃｖ、ＳｔｒａｉｇｈｔＥｉｇｈｔ　）の形質転換カナマイシン（−）　　　１２６　　　　　　１１　　　　　　２上記表１かられかるように、カナマイシンに対する抵抗性を選択しない場合には、１１の再生植物のうち２つがＮＰＴ陽性であった。これに対して、胚誘導ＣＴＭ−２培地にカナマイシン（２５ｍｇ／　１　）が添加された場合には、再生植物の約４０％がＮＰＴ陽性であった。第２図は、１１の植物のうち９つについてのＮＰＴテストの結果を示している。Ｎα１および６は陽性を示す。第２図のＮα１０は陽性のコントロールである。２５■／１のカナマイシンの添加は、形質転換組織の再生工程に影響を与えなかったし、いくつかのＮＰＴ−陽性植物の再生も妨げなかった。

このカナマイシンの濃度（２５■／１）はまた、対照の（形質転換していない）根の成長をいくぶん許容した。しかし、コントロールにおいては、カナマイシンの存在下では植物が再生しなかった。

別の系のテスト（Ｃ系列）において、カナマイシン濃度は濃度により植物再生が遅れ、異常な小植物の数が増した。

ＮＰＴ陽性植物からのＤＮＡのサザンプロット分析によって（第３図）、ベクターＴ−ＤＮＡがキュウリＤＮＡに組み込まれてしすることが確認された。各形質転換植物は、外来ＤＮＡの単一のコピーを含有していた。これは、　ＨｉｎｄＩ［［消化物に起因する２つのバンド（第１図における２つの境界のフラグメントに対応する）の存在によって示される。　ＤＮＡは５つの別々のＮＰＴ陽性植物から単離され、　ＨｉｎｄＩ［［によって消化され、サザンプロットを用いて分析された。プローブはｐＮＥＯ１０５（ベクターＤＮＡ、　　シンプソン（Ｓｉ＋ａｐｓｏｎ）ら、　１９８６）　、　ｐＦＷ９４またはｐＦＷ４］（それぞれＴＬ−ＤＮＡおよびＴ、−ＤＮＡについて；）１グマン（Ｆｕｇｇｍａｎ）ら、　１９８４）であった。ＲｉプラスミドＤＮＡの組込みにつｐｚて検定された５つの植物（これらは２つの断片のゲノム、つまりＴレフト（ＴＬ）およびＴライト（ＴＲ）　、として植物のゲノムに組込まれ得る；讐ｈｉｔｅら、　１９８５）のうち、２つの植物【よ。

ＲｉプラスミドおよびＴ−Ｄ）ＩＡのいずれをも全く含まず、１つの植物はＴＲ −ＤＮＡの５．７ｋｂ　９片を有しており、そして２つの植物は異なる量のＴＬ −ＤＮＡを有していた。このことは４本発明の方法がＴＬ−ＤＮＡまたはＴｌ− ＤＮＡについて強い選択性を持たなし）ことを示す、下記の表■は、ベクターＤＮＡおよびＲｉプラスミドＤＮＡ（いずれも断片）の組込みを証明する分析の結果を次のようにまとめている。

（以下余白）表■ ユウリ植物のＤＮＡへのベクターＤＮＡ　（ＮＰＴ）およびＲｉ−プラスミドＤＮＡ（ＴＬおよびＴ、）の組込み１　　　　ｐＡＲＣ８５，７；　４．９　　　　０　　　　　　５．７２　　　　ｐＡＣＲ８１２，０；４．８　　　　０　　　　　　０３　　　　ｐＡＲｃ１６　　　９．４；４．９　　　　０　　　　　　０４　　　　ｐＡＲｃ１６　　　４／８；３．９　　　３．４　１５．９　　　０５　　　　ｐＡＲｃ１６　　　６．４　；　３．７　　　　３．４１／プローブはｐＮＥｏ　１０５　（ベクターＤＮＡ　；　Ｓｉｍｐｓｏｎら、　１９８６）ｐＦＷ９４またはｐＦＲ４１（それぞれＴＬ−ＩＩＮＡおよびＴｌ−ＤＮＡ、　Ｈｕｆｆｍａｎら、　１９８４）であった。

２）これは、　Ｗｈｉｔｅら（１９８５）によって記載されたような。

ＴＬ−ＤＮＡの内部旧ｎｄＩＩＩ断片（Ｈ−２１）について期待された移動性と合致する。

ベクターＤＮＡのみ、ベクターに加えてＲ１−ＤＮＡ、またはＲ１−ＤＮＡのみの移入は、この形質転換系の柔軟性を示している。植物２および３において観察されたようなベクターＤＮＡのみの移入（表■）は、所望の遺伝子の移入が、　Ｒ１−ＤＮＡをそれが存在するプラスミドから除去することなく、　Ａ、ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株を用いてキュウリにおいて達成できることを示す。言いかえれば。

もとから存在するＲｉプラスミドは、武装解除されている必要がない。これに対して、Ｒｉ−プラスミドＤＮＡに関連した特長のいくつかくより短い部間および雄性不稔のような）もまた。

望ましいので９表■は、ベクターおよびＲ１−ＤＮＡの両方を有するキュウリ植物がつくり出され２選択されうろことを示している。本発明の形質転換方法もまた。　Ｒ１−ＤＮＡだけを含む植物の回収を可能にする。従ってそのような特徴だけが所望であれば、その植物はコンパクトとなり、雄性不稔となる。

第４図では、正常なコントロール植物Ｃ，５ａｔｉｖｕｓ　Ｌ、　Ｃ，ｖ。

Ｓｔｒａｉｇｈｔ　Ｅｉｇｈｔ　（左側）を１本発明の遺伝子導入植物”ＰＣＲＩＨｉＤｅｎｓｉｔｙ”　（右側）と比較して示す。一般に、　ＰＣＲＩ　ＨｉＤｅｎｓｉｔｙ植物は、伏が性の一年生広葉草木であり、枝分かれした多毛の、つるおよび巻きひげを有すると記載され得る。葉は互生であり、単純葉柄で、掌状の３〜５個に分かれたまたは角のあるものである。ある植物の場合にはより厚くかつ狭く、先の尖った葉も期待され得る。巻きひげは、単純、側生であり。

托葉は各節に１つ存在する。形質転換された植物は、対照植物または野性植物とは次の点で異なる特徴を有する。つまり正常な植物が１０〜１５ｃａ＋の部間を有するのに比較して２．５〜７．５印程度の短い部間を有しており、その結果コンパクトな形態となる。花は雌雄開花（ｍｏｎｏｅｃｉｏｕｓ）であるか′、雌花性（ｇｙ−ｎｏｅｃｉｏｕｓ）の、完全な両性雄花性（ａｎｄｒｏｍｏｎｅｃｉｏｕｓ）のおよび雄花性（ｔｒｉｒｎｏｎｅｃｉｏｕｓ）の形態も生じることが期待される。

花は、黄色またはクリーム色であり９末生または車止であり。

しばしばすべての節で花をつける。雄花は、一体になって管状花托を形成する脊部および花冠を有し、雄ずいは基本的には５つで、花弁と交互になっており、花糸がないか一体になっており、朽がないか、花頭で凝集している。雌花は、雄花と類似の脊部および花冠を有し、子房下位は通常１つの子房室、および３または４個の６皮を有し、花柱は２〜３の浅裂柱頭を有して房をなさない。果実は多汁の漿果であり、開渠である。種子は大きく、数が多く、白いかあるいは黄かつ色であり、内乳がなく、胚は大きな子葉を有する。本発明のコンパクトな（短い部間の）遺伝学的に形質転換された植物の果実は９発芽力があり、現在まで、成長してＲ２世代になっている。

（以下余白）成熟すると、遺伝子導入キュウリおよび再生対照キュウリは９種々の程度の雄花の減少と離脱を示した。コントロール植物（再生されたが形質転換はされていない）の雄花が離脱するということにより、減退した稔性は、［他の種で報告されたように、（チッソｙ　　（Ｔｅｐｈｆｅｒ）　、　１９８４）　］おそらく形質転換によるものではなく、再生工程に関連した異常によるものであったことが示される。遺伝型において、これら遺伝子の変化は、ククミス植物（特にＣ，ｊ互ｕヱ吐）の育種には重要かつ有利である。なぜなら７　コンパクトな草丈および雄性不稔が、この種では望ましいからである〔カウフマンおよびローワ−（Ｋａｕｆｆｍａｎ　ａｎｄ　Ｌｏｗｅｒ）、　１９７６）　。つまり、これらの植物に現われた短かくなった部間によって、小さな土地面積で同じ果実が生産可能になり、これに対して経費が低下する。

逆に言えば、より多くの果実を同じ土地面積から生産できる。

驚くべきことには、ム　庄旦■並競で形質転換されたタバコ、ニンジンおよびアサガオから予想されるような葉のしわような葉の形態の異常（チッソｙ　−（Ｔｅｐｈｆｅｒ）　、　１９８４）を。

遺伝子導入植物は全く示さなかった。

本発明の方法を用いて１発明者らは、１０週間以内に遺伝子導入キュウリを再生させた。この方法は、植物のプロトプラストが形質転換される共培養法（ｃｏ− ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｗ＋ｅｔｈｏｄ　）〔マートン（Ｍａｒｔｏｎ）ら、　１９７９）よりも警単で迅速である。

共培養法は、労働集約的で汚染する傾向があるが９本発明の方法は、少数で簡単な工程からなり、標準的な研究室で効果的に実施され得る。さらに、ツマクローナル変異がプロトプラストの培養から起こることが多いが、形成された組織は。

安定性を保持していることが知られている〔シェパード（Ｓｈｅｐａｒｄ）ら、１９８０；り１、・ンス（Ｋｒｅｎｓ）ら、１９８２；ホーシュ（ｌ（ｏｒｓｈ）ら、　１９８５）。

発明者らの研究は、いくつかのキュウリの栽培品種が、所定の条件下では根から植物を再生しないことを示しているが（トラルソンおよびシャーイン、　１９８６．発明者らの同時係属出願出＠９２／９）　、発明者らが発見した。根の再生が可能な栽培品種（Ｓｕｎｂｌｅｓｔ　Ｂｕｒｐｌｅｓｓ、　Ｂｕｓｈ　５１ｉｃｅｒ＋　ＧＹ１４＋　Ｓｔｒａｉｇｈｔ８）は、他の遺伝子のバックグラウンドに遺伝子を移入する際の中間体として提供することができる。さらに、根から再生可能な遺伝子型は、高度に進歩した生殖細胞質を示すので。

この生殖細胞質に行われる遺伝子操作は、すでに上位の遺伝子型の進歩を促進する。

本発明の形質転換法によって、また、ククミス種の植物。

特にキュウリの体細胞ハイブリダイゼーション（体細胞雑種形成）［ハイブリッド（雑種）およびサイブリッド（細胞質雑種）を含む］が容易になる。体細胞雑種形成の可能性はよく認識されているが、従来は選択可能なマーカーがなかったので、高等植物のプロトプラストを操作するのに大きな障害になっている〔コツキング（Ｃｏｃｋｉｎｇ）ら、　１９８１）　、従って。

本発明の方法は、医薬品耐性のマーカーを導入し、所望のプロトプラスト（もしくはｐｘ／ｃア）融合生産物の同定および選択を助けることができる。

さらに、　ＤＮＡがコードするクロラムフェニコール耐性は。

葉緑体に移入することができる〔ファン　デン　ブロック（Ｖａｌｌ　ｄｅｎ　Ｂｒｏｃｋ　）ら、　２９８５）　、従って９本発明の方法および゛、ど一カーによって、カナマイシンおよびクロラムフェニコールの耐性を、適当なベクターによって植物組織に導入することができ、クロラムフェニコールおよびカナマイシンは、所望の顕著な特徴を有する核／葉緑体融合産物の選別に使用され得る。

このように３体細胞雑種の分離と選別とが容易になる。さらに、これらのマーカーは、農業上重要な遺伝子を移入する場合は大きな価値がある。なぜなら、容易に同定可能なマーカーが農業上望ましい遺伝子に連結して存在していると９組織培養時に効果的な選別が行われるためである〔フラリイ（Ｆｒａｌｅｙ）ら、１９８３；ヘレシーエストレラ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ）ら。１９８３〕実施例Ｂ、形質転換／体細胞雑種形成体細胞雑種形成は、プロトプラスト−プロトプラストまたはプロトプラスト−サイトプラストの融合（遺伝学的に述べればｐｘ／Ｃｙ融合）で達成される。異なる種、栽培変種、または遺伝的に改変された植物（例えば１本発明の遺伝子導入植物）のプロトプラストおよび／またはサイトプラストで望ましい形質を有するものは１発明者らの同時係属特許出願９２／１３に記載されているように、別個に遊離させ、調製し、融合し。

そして再生させねばならない。

形質転換は３体細胞雑種形成の前かもしくは後に行なわれ得、またはエレクトロボレーシラン法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）　。

共培養法もしくは化学的融合法と連続して組合わせて行なわれ得、培養によってツマクローナル変異が選別され、所望の形質を有する植物の単離および選別が助けられる。

さらに、上記の融合技術は、プロトプラストをリポソーム（リン脂質二重層小胞）と融合することにより、遺伝的に形質転換するのに用いられ得る。このリポソームは、外来ＤＮＡもしくは細菌のスフ二ロプラストを含有し得る。後者は、細胞壁を欠いた細菌細胞である。

実施例Ｃ、遺伝子導入胚様体のカプセル化人工種子の生産上記実施例Ａ５に示すような体細胞胚様体のインビトロにおける生産により、保護種皮のない胚様体が得られるので。

本発明の遺伝子導入胚様体は９個々にまたは集合体で、カプセルもしくはコーティング内に包含させ、脱水を遅らせて将来の「栽培」に備えて保存され、そして発明者らの同時係属出＠９／２９または９２／１３に示すように生育させる。

実施例Ｄ、遺伝子導入胚様体／ミニカルスの凍結貯蔵後の再生１種またはそれ以上の遺伝子導入プロトプラスト起源、これら起源由来のプロトプラスト、ミニカルス、または胚様体は、長期間にわたって、凍結貯蔵することができ１次いで解凍して１発明者らの係属出願中の特許出願９２／９および９２／１３で記載した方法と培地とにより再生される。

本発明の範囲内の種々の改変は、当業者であれば２本発明の思想から逸脱することな〈実施し得ることは理解すべきである０例えば、ククミス種の植物が２本発明の培地および方法による遺伝子導入および再生に対して正の応答をすれば。

これらの植物は増殖に有用なものになる。ある重要な用途は。

雌花株集団の生産時における現在の硝酸銀による高価な処理を置換することである０本発明の他の用途は、ここに述べられた手法と、育種に利用される植物原料の価値ある多様な起源としての体細胞雑種形成および／またはツマクロナール変異と、を組み合わせて使用することである。形質転換されたプロトプラストまたはｐｙ／ｃア融合の形質転換およびそれに続く再生は、病原体、有毒金属、農薬、および除草剤に耐性を有する個体の選択に利用できる。後者は、キュウリが除草剤に対して非常に敏悪なので特に重要である。

キュウリおよびマスクメロンの育種に遺伝子工学を利用することは、特に価値がある。これらの２つの種は性的に不和合性である。耐疾病性のような多くの好ましい形質を、従来の方法で交配・転移させることは不可能であった（ディーキンら、　１９７１年）、上記の障壁は、今や本願に記載の植物形質転換法を単独で、あるいは本願発明者らの同時係属出願９２／１３に開示されている体細胞雑種形成法とを組み合わせることにより遺伝子の転移が可能になったため、取り除かれた。

園芸上望ましい遺伝子をキュウリもしくはマスクメロンに転移させることができることに加えて、遺伝子工学の手法は。

カナマイシンもしくはクロラムフェニコールに対する耐性のようなマーカー遺伝子を導入するのに特に価値がある。これらのマーカーにより、プロトプラストの融合による体細胞の雑種形成が容易になり、ククミス属植物における不稔性障壁が取り除かれたのである。

かくして９本願発明者らは、従来技術が認めるのと同じ広さで、かつ必要に応じて本願明細書を考慮することにより。

本発明が添付の請求の範囲で定義されるものと考える。

（以下余白）Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、　Ｓ、Ｂ、、　Ｈｏｆｆｍａｎｎ＋　Ｎ、Ｌ、、およびＷｏｏ、　Ｓ、Ｃ，（１９８３）：ｍ訪駄１、　　Ｂｅｖａｎ、本（１９８４）　：植物の形質転換のだめの」旦お腹匡吐肥バイナリーベクター、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５１２：８７１１− ８１２１゜２、Ｃｈｉｌｔｏｎ＋Ｍ−Ｄ、＋Ｃｕｒｒｉｅｒ＋　Ｔ、Ｃ，、Ｆａｒｒａｎｄ、　５Ｊ−１Ｂｅｎｄｉｃｈ、　Ａ、Ｊ、、　Ｇｏｒｄｏｎ、　ｈ、ｐ、ｌおよびＮｅ５ｔｅｒ、　Ｅ、Ｗ、　（１９７４）　：クラウンゴール腫瘍中に見い出されないＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＤＮＡおよびＰＳ８バクテリオファージＤＮＡ、　ＰｒｏｃＮａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ｌｌ５Ａ　７１：３６７２−３６７６　。

３、　Ｃｈｉｌｔｏｎ＋Ｍ−Ｄ、４ｅｐｆｅｒ＋　Ｄ、Ａ、＋　Ｐｅｔｉｔ、　Ａ、、　Ｄａｖｉｄ、　ｃ、。

Ｃａ５ｓｅ−Ｄｅｌｂａｒｔ、　Ｆ、、およびＴｅ＋＊ｐｅ、　ｊ、　（１９８２）　：ハ圧匡旦肛江し■亘■並並は宿主植物根細胞のゲノムにＴ−ＤＮＡを挿入する。　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９５：４３２−４３４゜４、　Ｃｏｃｋｉｎｇ、　Ｅ、Ｃ，、Ｄａｖｅｙ＋　１１．Ｒ，、Ｐｅｎｔａｌ＋　Ｄ、、およびＰｏｗｅｒ＋Ｊ、　Ｂ、　（１９８１）　：植物遺伝子操作における局面、　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９３：２６５−２６９　。

５、Ｄａｖｉｄ、　Ｃ，、Ｃｈｉｌｔｏｎ、Ｍ−Ｄ、、およびＴｅｏ＋ｐｅ、　Ｊ、　（１９８４）：毛状根培養物から再生した植物中におけるＴ−ＤＮＡの保持。

、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２ニア３−７６　ｅ６、Ｄｅａｋｉｎ＋　Ｊ、Ｒ，、Ｂｏｈ、　Ｇ、Ｗ、、およびＷｈｉｔａｋｅｒ、　Ｔ、Ｗ、　（１９７１）：ククミス種における種間の雑種形成＋Ｅｃｏｎ、　Ｂｏｔ、　２５．１９５−２ｉ１゜７、　Ｆｒａｌｅｙ、　Ｒ，Ｔ、、　Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｓ、Ｇ、、　Ｈｏｒｓｃｈ、　Ｒ，Ｂ、＋　５ａｎｄｅｒｓ。

ｐＪ、ｌ　Ｆ１ｚｃｋ＋　Ｊ、５１Ａｄａａ＋ｓ＋　ｓ、ｐ、、　Ｂ＋ｔｔｒ＋ｅｒ、　Ｍ、Ｌ、＋Ｂｒａｎｄ、　Ｌ、Ａ、＋　Ｆｉｎｋ、　Ｃ，Ｌ、、　Ｆｒｙ、　Ｊ、Ｓ、、　Ｇａ１ｌｕｐｐｉ、　Ｇ、Ｒ，。

１４、　Ｋｒｅｎｓ＋　Ｆ、Ａ、＋　Ｍｏ１ｅｎｄｉｊｋ、　Ｌ、、　Ｗｕｌｌｅａ＋ｓ、　Ｇ、Ｊ、ｓおよび植物細胞における細菌遺伝子の発現、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉＵＳＡ　８０：４８０３−４８０７゜８、　Ｂｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ＋　Ｌ、、　Ｄｅｐｉｃｋｅｒ、　ＬＩ　ＶａｎＭｏｎｔａｇｕ、　Ｍ、。

および５ｃｈｅｌｌ、　Ｊ、（１９８３）：　Ｔｉプラスミド由来ベクターを用５ｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ＋　Ｒ，Ａ、（１９８２）：　Ｔｉ７ラスミドＤＮＡによる植物プロトプラストのインビトロでの形質転換、　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０ニア２−７４　。

１５、　Ｌａｒｋｉｎ、　Ｐ、Ｊ、およびＳｃｏｗｃｒｏｆｔ、　Ｗ、Ｒ，（１９８１）：　ソマクロ２１、５ｈｅｐａｒｄ、　Ｊ、Ｆ、、　Ｂｉｄｎｅｙ＋　Ｄ、＋および５ｈａｈｉｎ、　Ｅ、（１９８０）：作物の改良におけるポテトプロトプラスト、　５ｃｉｅｎｃｅ　２０８：１７−２４　。

２２、Ｓｉｍｐｓｏｎ、　Ｒ，Ｂ、、Ｓｐｉｅｌｍａｎｎ、　Ａ１Ｍａｒｇｏｓｓｉａｎ＋　ｔ、、ｌおよびＭｃＫｎｉｇｈｔ、　Ｔ、Ｄ、（１９８６）：Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来の武装解除型バイナリ− ベクターは、　Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏ　ｅｎｅｓ中で機能する：２つの異なるＴ−ＤＮＡによる頻繁に起こる形質転換、　Ｐｌａｎｔ　？ｌｏｌ　Ｂｉｏｌ、印刷中。

２３、５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、　Ｍ、　（１９７５）ニゲル電気泳動により単離されたＤＮＡフラグメントのなかからの特定の配列の検出、　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏ１９Ｂ：５０３−５１７゜２４、　Ｔｅｐｆｅｒ、　Ｄ、（１９８４）：　Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏ　ｅｎｅｓによるいくつかの高等植物の形質転換：形質転換された遺伝子型および表現型の性的伝搬、　Ｃｅ１ｌ　３７：９５９−９６７　。

２５、　　Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ、　　Ｍ＋Ｆ、、　　Ｎｕｔｔｅｒ、　　Ｒ，、Ｍｏｎｔｏｙａ、　　Ａル＋ｌ　　Ｇｏｒｄｏｎ。

Ｍ、Ｐ、、およびＮｅ５ｔｅｒ、　Ｅ、Ｗ、（１９８０）：　クラウンゴール腫瘍におけるＴｉプラスミド配列の組込みおよび器質化、　Ｃｅ１ｌ　１９ニア２９−７３９　。

２６、　Ｔｒｕｌｓｏｎ、　Ａ、Ｊ−ｓおよび５ｈａｈｉｎ、　Ｅ、Ａ、（１９８６）＝　Ｃｕｃｕｍｉｓ属におけるインビトロでの植物の再生；その調製。

２７、　Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏｅｃｋ＋　Ｇ、　Ｔｉａ＋ｋｏ、　Ｍ、ｐ、ｌ　Ｋａｕｓｃｈ、　Ａ、ｐ、Ｉ　Ｃａｓｈｍｏｒｅ。

Ａ、Ｒ，、Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ、　Ｍ、、　　およびＨｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｅｌｌａ、　Ｌ。

（１９８５）　：　リブロース１．５−ビフォスフエートカルポキシレートの小サブユニット由来のトランジットペプチドに融合することによる。外来タンパクのクロロプラストへの標的化、　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１３：３５８ −３６３　。

２８、　Ｗｈｉｔｅ、　Ｆ、Ｆ−＋　Ｔａｙｌｏｒ、　Ｂ、Ｈ，、Ｈｕｆｆｏ＋ａｎ、　Ｇ、Ａ、、　Ｇｏｒｄｏｎ、　Ｍ。

Ｐ、、およびＮｅ５ｔｅｒ、　Ｅ、　Ｈ，（１９８５）：Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋　ｒｈｉｚｏ　ｅｎｅｓの根誘導性プラスミドの導入されたＤＮＡ　ｅｌｔ域の分子的および遺伝学的解析、　Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１６４：３３ −４４　ｍ２９、Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ＋　Ｐ、、　Ｊｏｏｓ、　Ｈ，、Ｇｅｎｅｔｅｌｌｏ、　Ｃ，、Ｌｅｅｍａｎｓ、　Ｊ、。

ＶａｎＭｏｎｔａｇｕ、　Ｍ、、および５ｃｈｅ１１．　Ｊ、（１９８３）：正常な再生能力を変化させることなく、植物細胞中にＤＮＡを導入するだめのＴｉプラスミドベクター、　ＥＭＢＯＪ　２：２１４３−２１５０゜、　　＃　Ｍ” 　”１ｊａｘｍＷｈｍ−５ｌ国際調査報告ＰＣ？１０５８７１０２５１２とΣヱ胚じ！並式ＳＬ出ユしＩＡＪＩＴ　！　ＡＮＤ　Ｈ。

Ｌ　ＣＬｋＳＳＩＦＩＣＡＴＸＯＮ　ＯＦ　Ｓ’ＪＢＪＥＣＴ　ＭＡＴＴＥＲ（ＣＯＩＪ’ｌ’ｒＮＵＥＤ）Ｕ、Ｓ、Ｃ１，：　　２４０．４５．　２４０．４６．　２４０．４７．　２４０．４８．　２４０．４９．　２４０．５゜２４０．５１．９３５１５６．６７、９６．９１３Ｉ１．　ＦＩＥＬＤＳ　５ＥｋＲＣＨ／５ＥＡＲＣＨＴＥＦＬ”ｉＳｓ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ここに示され，記載されたキュウリ植物の明らかな新変種，ＰＣＲＩ　Ｈｉ −Ｄｅｎｓｉｔｙ，およびその種子および胚葉体またはミニカルス。
２．植物組織を形質転換する方法であって，該方法は以下の工程を包含する；もとから存在するＲｉプラスミドに加えてベクターを含むＡ，リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を，該組織の細胞の少なくとも一部に該ペクターが導入ざれ少なくとも１個の遺伝子導入細胞を生成させるのに充分な時間，前記植物組織に接種する工程；および必要に応じて，少なくとも１個の該遺伝子導入細胞を適当な培地中で，コンピテント細胞コロニー，組織，ミニカルス，胚葉体，小植物，植物および種子から選択されるコンピテント植物構造を再生するのに充分な時間，培養する工程。
３．前記植物組織が胚軸組織である，請求項２に記載の方法。
４．前記植物組織が胚軸組織である，請求項２に記載の方法。
５．前記培養工程が，ＣＴＭ−２培地で培養し，続いてＣＴＭ−３で培養を行うことにより，成熟遺伝子導入胚葉体を形成させること，および該胚葉体を，小植物に成長させるためのＣＴＭ−４培地に移すこと，を包含する請求項１に記載の方法。
６．請求項２に記載の工程によって生産されるコンピテント遺伝子導入ミニカルスまたは胚葉体。
７．請求項２に記載の方法によって生産され，そして冷凍された遺伝子導入ミニカルスまたは胚葉体を培養する方法であって，該方法は以下の工程を包含する；該遺伝子導入冷凍胚葉体またはミニカルスを解凍する工程；および該解凍した遺伝子導入胚葉体またはミニカルスを培養し，成長および成熟を促進する工程。
８．遺伝子導入植物組成を得る方法であって，該方法は以下の工程を包含する；ａ）一種の受容植物からの，１個またはそれ以上のプロトプラスト，サイトプラスト，スフェロブラスト，リボソームおよびそれらの混合物から選択される１またはそれ以上の細胞由来の物質に，他の供与生物の１またはそれ以上のプロトプラスト，スフェロプラスト，リボソーム，サイトプラストおよびそれらの混合物から選択される１またはそれ以上の細胞由来の物質を融合させて，融合生成物を生成させる工程；およびｂ）該融合生成物を，生育可能で遺伝的に改変されたミニカルスまたは胚葉体を生成させるのに充分な時間，培養する工程。
９．前記融合が，ｐｘ／ｐｙ融合から選択され，かつ前記供与物質源が植物および細菌細胞物質から選択される請求項８に記載の方法。
１０．前記供与体および受容体の前記物質源がククミス（Ｃｕｃｕｍｉｓ）種植物細胞である，請求項９に記載の方法。