NL1022270C2 - Volledige echte meeldauwresistentie en volledige vrijheid van necrose in komkommer, Cucumis sativus L. - Google Patents

Description

Titel: Volledige echte meeldauwresistentie en volledige vrijheid van necrose in komkommer, Cucumis sativus L.

De uitvinding betreft het terrein van de komkommerveredeling.

Meeldauwresistente komkommerplanten lijden over het algemeen in de Noord Europese winterteelt aan necrose ontwikkeling. Er bestaan 5 weliswaar planten, die onder deze omstandigheden niet gevoelig zijn voor necrose, doch deze planten bezitten geen volledige meeldauwresistentie. Het blijkt aldus dat meeldauwresistentie met necrosegevoeligheid gepaard gaat. Ondanks beschrijvingen in de literatuur, dat en ontkoppeling van necrosegevoeligheid en volledige meeldauwresistentie onmogelijk wordt 10 geacht, heeft de uitvinder voor de eerste keer komkommerplanten gecreëerd die zowel volledig meeldauwresistent als volledig necrosevrij zijn onder necrose bevorderende omstandigheden. In een specifieke uitvoeringsvorm van deze uitvinding, verschaft de nieuwe komkommerlijn 'DCl' planten die meeldauwresistent en necrosevrij zijn. Deze planten zijn zeer waardevol 15 voor de ontwikkeling van commerciële komkommerrassen met de nieuwe eigenschappen van DCl.

Stand van de techniek 20

De komkommer plant (Cucumis sativus L.) is door veredeling ontstaan uit de oorspronkelijke augurk plant en komt daarmee phenotypisch sterk overeen. Door veredeling is in de huidige komkommer een type ontwikkeld waarop alleen volledig vrouwelijke bloemen voorkomen. 25 De komkommer groeit uit zonder dat enige vorm van bestuiving of bevruchting noodzakelijk is en is dus parthenocarp. De huidige komkommervruchten bevatten enkel wat dunne, loze zaden. Augurken, I 2 komkommer, minikomkommer, Beith Alpha en slicer behoren tot C. sativus.

I Courgetten, meloenen, pompoenen en patisson behoren allen samen met het gewas komkommer tot de komkommerachtigen of Cucurbitaceae. De meeste I komkommerrassen zijn nu hybriden.

I Een van de gekende problemen bij het telen van komkommers is het voorkomen van echte meeldauw, een schimmel-infectie door

Sphaerotheca fuliginea (Schlecht. ex Fr.) en/of Erysiphe cichoracearum (DC.

ex Mérat emend. Salm) die algemeen als "het wit" gekend is. Bij aantasting 10 kunnen en/of de bladeren, de bladstelen, het hypocotyl en de stengel een I patroon van witte vlekken (schimmelsporen) vertonen.

Geïnfecteerde planten kunnen geel worden, achterblijven in groei en tenslotte afsterven. De vruchten worden nauwelijks aangetast. Bij de 15 meeste komkommerachtigen zijn rassen beschikbaar met enige resistentie tegen echte meeldauw. Bijvoorbeeld de kaskomkommer hybride rassen Bella en Fidelio zijn meeldauwresistent terwijl de hybride rassen Farbio en

Corona vatbaar zijn voor meeldauw.

H 20 Reeds in 1969 heeft het toenmalige Nederlands Instituut voor

Veredeling van Tuinbouwgewassen (IVT) meeldauwresistente komkommer H lijnen aan de Nederlandse veredelings bedrijven uitgegeven. Vrijwel alle H bedrijven hebben daarop rassen ontwikkeld met goede meeldauwresistentie H en goede gebruikswaarde. Al deze rassen vertonen echter onder lage 25 lichtintensiteit (tussen november en maart) necrose wat ze voor de winterteelt onbruikbaar maakt.

Vervolgonderzoek van het IVT naar nieuwe bronnen van meeldauwresistentie die eventueel necrosevrij zijn heeft niet het vereiste 30 resultaat opgeleverd (Zijlstra en Groot, 1992; Mol 1992). Wel heeft men

O A

3 aangetoond dat er uit kruisingen van vatbare met resistente rassen lijnen te isoleren zijn met verminderde necrose gevoeligheid én een beperkte mate van meeldauwresistentie (Zijlstra et al., 1995).

5 Elk tot op heden op de markt gebracht ras met meeldauwresistentie vertoont in de winterteelt necrose. Deze necrose gaat gepaard met een sterk verminderde vruchtproductie, zodat het telen van meeldauwresistente rassen in de wintermaanden en het vroege voorjaar economisch niet interessant is.

10

Zijlstra et al. (1995) stelt, na analyse van de meeldauwresistentie aanwezig in de hybride ‘Profito’ (volledig meeldauw resistent) en het inkruisen van deze meeldauwresistentie in een lijn die necrose ongevoelig is (maar niet resistent tegen meeldauw), dat het twijfelachtig is dat een 15 volledige resistentie tegen meeldauw ooit gekombineerd kan worden met een volledige afwezigheid van necrose.

Zijlstra et al (1992, 1995) vond een positieve correlatie tussen meeldauwresistentie en necrosegevoehgheid. Zijlstra et al concludeerde dat 20 een of meer van de meeldauwresistentiegenen vermoedelijk necrose als een pleiotrope effect veroorzaken of sterk aan necrose gekoppeld zijn. “Wordt er uitgegaan van koppeling dan blijkt die niet absoluut en zeker voor een groot deel los te weken van de meeldauwresistentiegenen. Het lijkt erop dat er sprake is van meer genen ... waarvan sommige sterk zijn gekoppeld aan 25 meeldauwresistentiegenen” (Zijlstra et al 1992).

Deze gedetailleerde studie stelt dat het twijfelachtig is of volledige meeldauwresistentie ooit kan gecombineerd worden met een volledige afwezigheid van necrose. Het gebruik van extra fosfaat in de 1022270 voedingsoplossing heeft wel geleid tot het met meer zekerheid vaststellen I van necrose gevoeligheid (Groot et al. 1990, 1992).

Momenteel kunnen alle beschikbare komkommer rassen, op grond I 5 van hun meeldauwresistentie en necrosegevoeligheid, ingedeeld worden in 3 I klassen: (1) vatbaar voor meeldauw met afwezigheid van necrose onder necrose bevorderende omstandigheden, bijvoorbeeld de rassen Sabrina, Ventura en I 10 Nicola, Η (2) partieel meeldauwresistent met afwezigheid van necrose onder necrose H bevorderende omstandigheden, bijvoorbeeld de rassen Flamingo en Enigma, en (3) volledig meeldauwresistent maar met vertoon van necrosesymptomen 15 onder necrose bevorderende omstandigheden, bij voorbeeld de rassen

Cumlaude, Mistral, Savanna, Bella, Aramon en Bellissima.

Tot op heden zijn er geen komkommerplanten publiek beschikbaar die het hebben van volledige meeldauwresistentie combineren met een 20 totale afwezigheid van necrose onder necrose bevorderende omstandigheden.

Samenvatting van de uitvinding H 25 De uitvinding betreft het doorbreken van de koppeling tussen H meeldauwresistentie en necrosegevoeligheid in de winterteelt en het creëren H van komkommerplanten met volledige meeldauwresistentie en volledig H ontbreken van necrosegevoeligheid in de vroege winterteelt.

8Β^·:-~.· . y ;..---jpwHo-Fij>..·····- ..............—·™~ τ--,-·τ 5

De uitvinding verschaft ook planten, zaden, plantencellen of celculturen en plantweefsel van de soort Cucumis sativus L. waarin de eigenschap meeldauwresistentie samengaat met de eigenschap necrose vrij heid onder necrose bevorderende omstandigheden, zoals korte 5 dagen, lage lichtintensiteit en hoog fosfaatgehalte van de voeding (teeltsubstraat of grond), die specifiek voorkomen bij de teeltomstandigheden in de kas in Noord Europa gedurende de maanden november tot en met februari of maart.

10 Een andere specifieke uitvoeringsvorm van de uitvinding verschaft DCl planten, zaden, plantencellen of celculturen, plantweefsel en elke plant afgeleid van DC1 door zelfbevruchting van DC1 of kruising van DC1 met andere Cucumis sativus L. planten geselecteerd voor de unieke kenmerken van DC1, namelijk meeldauwresistentie gecombineerd met necrosevrijheid 15 in de winterteelt.

De uitvinding verschaft verder werkwijzen om de combinatie van de eigenschappen volledige meeldauwresistentie met volledige necrosevrijheid over te dragen naar andere Cucumis sativus L. planten die 20 of de volledige meeldauwresistentie dan wel de volledige necrosevrijheid, of die beide eigenschappen ontberen. Dit door de verschafte nieuwe DC1 planten met dergelijke planten te kruisen en nakomelingen te selecteren die de combinatie van volledige meeldauwresistentie en necrosevrijheid van DC1 behouden.

25

Een verdere uitvoeringsvorm van de uitvinding betreft het gebruik van DCl planten, of een plant van de DCl lijn, als ouderlijn voor de productie van hybride komkommer planten. Een plant van de DCl lijn kan, bij voorbeeld, in een kruising als mannelijke of als vrouwelijke ouderlijn 30 gebruikt worden. Het gebruik van DCl planten als ouderlijn voor hybride - ' / o - I 6 I planten-productie is voordelig, omdat in DC1 een ontkoppeling van necrosegevoeligheid en meeldauwresistentie tot stand is gebracht.

I Men kan de eigenschappen volledige necrosevrijheid en I 5 meeldauwresistentie overdragen naar andere komkommerplanten middels I algemeen bekende traditionele veredelingswerkwijzen zoals kruisen, I terugkruisen en zelfbevruchten (zie Fehr, 1987, and Allard, 1960). Op deze I wijze kunnen rassen worden veredeld met goede teelt- en gebruikswaarde- I eigenschappen gecombineerd met volledige meeldauwresistentie en 10 volledige necrosevrijheid in de winterteelt. Zulke komkommerrassen I kunnen de opbrengstverliezen als gevolg van echte meeldauw of ten gevolge van het optreden van necrose grotendeels beperken in de winterteelt.

I Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding

De volgende definities worden aangeboden ter verduidelijking van de uitvinding en ter interpretatie van de conclusies en de beschrijving en zijn niet bedoeld als limiterend met betrekking tot de rechtsbescherming voortvloeiend uit deze uitvinding.

I 20

Definities: H "Fenotype" is de waarneembare uiterlijke verschijningsvorm van H de plant als resultaat van de interactie tussen het genotype van de plant en H 25 zijn omgeving. Het omvat alle waarneembare morfologische en fysiologische kenmerken van de plant.

"Genotype" is het totaal aan overervende genetische informatie van een organisme, dat mede beïnvloed door omgevingsfactoren, op een bepaalde 30 wijze tot uitdrukking komt in het fenotype.

I 1022270- 7 “Komkommer-plant” als hierin gebruikt, wijst op een plant van de soort Cucumis sativus L. (zoals Cucumis sativus L subspecies sativus).

Indien verwijzing naar de vruchten gemaakt wordt, wordt specifiek de term 5 “komkommervrucht” gebruikt. Een komkommervrucht kan ook augurken, lange, korte, mini of midi komkommers omvatten. Tot deze uitvinding behoren ook de uiteindelijk verkregen komkommervruchten die geoogst worden van de planten van de uitvinding, alsook elk gebruik, en verwerking ervan.

10

Een "lijn" is een groep van planten met een sterk op elkaar gelijkend genotype en fenotype. Zij kan worden gevormd door de nakomelingschap van één plant na enkele generaties zelfbevruchting of door vegetatieve vermeerdering middels plantencellen, celculturen of 15 weefselkweek. DC1 lijn verwijst naar de DCl plant, zoals verkrijgbaar uit de zaden gedeponeerd onder NCIMB 41133, en elke plantencel, celcultuur, weefselkweek, vrucht of zaad daarvan, of daarvan afgeleid.

Een "plantenras" is een plantengroep binnen een botanisch taxon 20 van de laagst bekende rang, welke kan worden gedefinieerd aan de hand van de expressie van de eigenschappen die het resultaat is van een bepaald genotype of een combinatie van genotypen, kan worden onderscheiden van elke andere plantengroep door de expressie van tenminste één van die eigenschappen en kan worden beschouwd als een eenheid, gezien zijn 25 geschiktheid om onveranderd te worden vermeerderd. De DCl planten, zoals verkrijgbaar uit de zaden gedeponeerd onder NCIMB 41133, kunnen gebruikt worden om een komkommerras met de eigenschappen van DCl te kweken.

' - ··- ^ L· i (j - I "Fi, F2, etc." verwijst naar de opeenvolgende, verwante generaties volgend op een kruising tussen twee ouderplanten of ouderlijnen. De I planten opgekweekt uit het zaad, dat is gevormd na een kruising van twee I ouderplanten, wordt de ΤΓ genoemd. Zelfbevruchting van de F1 planten I 5 levert de F2 generatie op enz.

I De term "hybriden", "Fl hybriden" of "hybride rassen" wordt gebruikt om het zaad en de planten uit dat zaad van een kruising tussen twee genetisch verschillende ouderlijnen aan te duiden.

I "Meeldauw", "echte meeldauw" of "het wit" zoals hierin gebruikt, is I als volgt te definiëren: een schimmelziekte bij Cucurbitaceae planten, met H kenmerkende symptomen in cellen, weefsel of organen van de plant, I veroorzaakt door infectie met een schimmel van het geslacht Sphaerotheca, 15 in het bijzonder met de soort Sphaerotheca fuliginea (Schlecht. ex Fr.) en / of het geslacht Erysiphe, in het bijzonder met de soort Erysiphe cichoracearum I (DC. ex Mérat emend. Salm).

“Necrose” of "necrose symptomen" of "bladnecrose" zoals hierin 20 gebruikt, is als volgt te definiëren: veranderingen in de kleur van het plantweefsel, die worden waargenomen onder "necrose bevorderende omstandigheden", met name in de hierna te beschrijven "necroseproef'. De necrose symptomen tonen vooral vergelen en/of verbruinen van met name het bladweefsel, gevolgd door afsterving van het weefsel.

I 25

Planten worden op basis van de necroseproef geklasseerd als hetzij "necrosegevoelig", hetzij als "necrosevrij" zoals hierna wordt beschreven. De term "necrosevrij" wordt hierin afwisselend gebruikt met de termen "volledig necrosevrij" of "necrose ongevoelig". De definitie van necrose omvat 9 niet de reversibele kleurveranderingen in het plantweefsel, zoals chlorose, die niet op een genetische basis berusten.

"Necrose", zoals hier gebruikt, heeft in tegenstelling tot chlorose 5 een genetische basis. In de bestaande literatuur worden de termen "necrose" en "chlorose" vaak met elkaar verward. Chlorose is echter een weefselverkleuring veroorzaakt door milieu-omstandigheden, met name stressfactoren zoals extreme temperaturen, gebrek aan water of voedsel elementen, zware plant belasting, etc., die verdwijnt na wegnemen van de 10 milieu-oorzaak.

Necrose kan zich op verschillende manieren uiten: krimpen van het bladoppervlak gepaard gaande met boiling van het blad en lichtgele vlekjes tussen de nerven die later of bij een sterke gevoeligheid necrotisch (bruin) 15 worden. De necrose symptomen kunnen zich in allerlei gradaties voordoen, van slechts lichtere pigmentering van de bladmassa (vaak lijkend op chlorose) tot volledig necrotisering (afsterving) van het bladweefsel.

"Necrose bevorderende omstandigheden" zijn omstandigheden, 20 door welke de necrose symptomen worden bevorderd, bijvoorbeeld een hoog fosfaatgehalte (tussen 2.5 mM en 5mM fosfaat (P043), bij voorkeur meer dan 3mM fosfaat, bij voorkeur 4-5mM fosfaat) of weinig licht (3000 Lux of minder), of een korte daglengte (8 uur of minder), zoals typerend is in Noord Europa tussen november en maart.

25

De omstandigheden zoals beschreven in de "necroseproef' vormen een specifieke verzameling van necrose bevorderende omstandigheden, die een betrouwbare toets genereert om te bepalen of komkommerplanten gevoelig of ongevoelig zijn voor necrose. Necrose gevoelige planten, 30 bijvoorbeeld van het ras Bella, vertonen necrose symptomen in necrose 1.022 2 70 I 10 H bevorderende omstandigheden, zoals in de necroseproef. Necrose I bevorderende omstandigheden zijn typerend voor de winterteelt.

"Necroseproef' H 5 De necroseproef wordt uitgevoerd in de kas tussen november en maart en wordt gebruikt om een lijn als "necrosevrij" of "necrose gevoelig" te I klasseren. Substraatteelt (zoals steenwolteelt) of grondteelt kan worden I toegepast. De proef wordt in tenminste 2, bij voorkeur 3 herhalingen I uitgevoerd. In iedere herhaling worden tenminste 10 maar bij voorkeur 20 10 planten van de te toetsen lijn opgekweekt tezamen met tenminste 10 maar I bij voorkeur tenminste 20 planten van necrosegevoelige controle rassen.

I Necrosegevoelige controle rassen zijn bijvoorbeeld Cumlaude, Mistral’ Bella, I Aramon, Bellissima, Savanna, Sienna. Necrosevrije controle rassen zijn I bijvoorbeeld Flamingo, Enigma, Sabrina, Nicola, Ventura.

I De toets wordt slechts dan als geslaagd beschouwd indien gedurende de gehele teeltperiode alle bladeren van alle necrosevrije controle rassen vrijblijven van necrosesymptomen (dat wil zeggen groene bladeren behouden) terwijl de necrosegevoelige controle rassen necrosesymptomen 20 vertonen. Zodra planten van de rassen Savanna of Sienna tekenen van necrose vertonen, worden alle planten in de proef binnen 3 dagen I gecontroleerd op necrose.

Alle lijnen en rassen worden, zoals reeds vermeld, getoetst volgens 25 het onderstaande protocol: - Zaaiperiode vanaf 10 november tot 20 december - opkweek in een belichte kas met temperaturen tussen 24-28°C bij zaai tot 20° C bij einde van de opkweekfase. Belichting eerste twee weken 18 I 30 uur per etmaal met 50 W / m2 (± 3000 LUX). Na 14 dagen wordt de 11 belichting in de opkweek teruggebracht tot 8 uur per etmaal. Dit is dan gedurende ±14 dagen totdat de planten uitgeplant worden.

- plantperiode in de kas tussen 15 december en 15 januari (onbelichte kas) - voeding: normaal voedingsamenstelling voor komkommerteelt, maar met 5 absolute concentratie van 5mM fosfaat - plantdichtheid: 1.4 plant / m2 - teeltduur: maximaal 4 maanden na planten - plantbelasting zoals in de Nederlandse winterteelt gebruikelijk (aan de stam 3 tot 4 vruchten vanaf het 12e blad) 10 - normaal paraplu- of T-system van plantopbouw - necrose beoordeling: zodra planten van de rassen Savanna of Sienna tekenen van necrose vertonen, worden alle planten in de proef binnen 3 dagen gecontroleerd op necrose (± 80 dagen na zaai).

- beoordeling van het eerste echte blad op een schaal van 4-7: 15 score 7 = geen necrose-symptomen score 6 = iets necrose in het blad score 5 = gemiddelde necrose symptomen score 4 = volledige necrose 20

In deze proef zijn fosfaatgehalte in het medium, licht en de plantbelasting (het aantal vruchten aan de plant) kritische factoren, die de resultaten van de proef kunnen beïnvloeden.

25 "Necrosevrij" of "volledig necrosevrij" zoals hier wordt gebruikt wil zeggen dat op geen enkel blad van de planten onderworpen aan de bovenbeschreven necroseproef necrosesymptomen zijn waargenomen. Dit betekent dat het plantweefsel groen is.

........ '* I ' I 12 I “Vroege teelt” of “winterteelt” of “vroege winterteelt”, zoals hierin H gebruikt, duidt op het telen in een kas of ander beschermd en verwarmd milieu van planten tijdens de winter en vroege lente, meer in het bijzonder in de maanden november tot maart. Deze periode wordt gekenmerkt door I 5 korte dagen met een beperkte natuurlijke licht-intensiteit.

I Met "stookteelt" wordt de gebruikelijke Nederlandse kasstookteelt I bedoeld.

I 10 “Meeldauw resistentie” of "witziekte resistentie", zoals hier ook wordt gebruikt, duidt op het verhinderen van de ontwikkeling van de schimmel in de vorm van uitwendige myceliumgroei en sporulatie.

Er is een meeldauwresistentieproef ontwikkeld om zowel de 15 hypocotyl - als de bladresistentie te toetsen, die 3 resistentieniveau's I onderscheidt.

1. Plant is "volledig resistent" (standaardras met dit fenotype is I Bella). "Volledige resistentie" van een plant betekent dat deze "hypocotyl I 20 resistent" en "volledig blad resistent" is, zoals bepaald in de hieronder I beschreven meeldauwresistentieproef.

H 2. Plant is partieel resistent (standaardras met dit fenotype is I Flamingo). "Partiële resistentie" van een plant betekent dat deze "hypocotyl 25 resistent" is en een "partiële blad resistentie" bezit, zoals bepaald in de hieronder beschreven meeldauwresistentieproef.

3. Plant is volledig vatbaar (standaardras met dit fenotype is I Ventura). Een plant is "Volledig vatbaar" indien geen "hypocotyl 30 resistentie" (volledig vatbaar) en geen "blad resistentie" (volledig vatbaar) I i o ? ? v 13 aanwezig is, zoals bepaald in de hieronder beschreven meeldauwresistentieproef.

Merk op dat een volledige of partiële bladresistentie altijd 5 samengaat met een volledige hypocotyl resistentie. Bladresistentie zonder hypocotylresistentie komt niet voor. Hypocotylresistentie zonder bladresistentie komt wel voor.

"Meeldauwresistentieproef': 10

De meeldauwresistentieproef wordt als volgt uitgevoerd:

Het is een jonge plantentoets, waarbij vanaf het cotylstadium (dit is onmiddelijk na het uitkomen van de zaadlobben uit het zaad) 3 keer wordt geïnoculeerd met sporen van echte meeldauw. Beoordeling van 15 bladresistentie vindt plaats op het eerste echte blad volgens een schaal van 0 tot 5. Hypocotylresistentie wordt beoordeeld op een schaal van 0 tot 2. In deze proeven worden altijd referentierassen opgenomen.

De toets wordt uitgevoerd in tenminste twee herhalingen. In elke 20 herhaling staan tenminste 24 planten van de te toetsen lijn tezamen met tenminste 24 planten van de referentierassen Savanna en Sienna en tenminste 12 planten van de referentierassen Bella (volledig resistent), Flamingo (partieel resistent) en Ventura (volledig vatbaar). De toets wordt slechts dan als geslaagd beschouwd indien de referentierassen niet van het 25 verwachte fenotype afwijken.

- Toetsplanten worden in zaaibak met vochtige vermiculite uitgezaaid (40x40cm) en afgedekt met vermiculite; temperatuur 28°C (dag/nacht) (24uur donker).

30 - Toetsplanten worden 4 dagen na zaai verspeend r >.

\ \y} : ‘ - * ^.t .

I 14 Η - Vers inoculum van Sphaerotheca fuliginea (doorvermeerderd op een vatbaar ras, b.v. Ventura): sporensuspensie van minimaal 100,000 I sporen per milliliter I - Inoculum wordt over toetsplanten verdeeld met een plantenspuit, I 5 zodanig dat het blad volledig vochtig is. Temperatuur na inoculatie: 20°C/20°C (dag/nacht).

I - 7 dagen na zaai: eerste inoculatie I - 9 dagen na zaai: tweede inoculatie I -11 dagen na zaai: derde inoculatie I 10 - 11 en 18 dagen na eerste inoculatie en ca. 14 dagen na derde inoculatie: I beoordelen van blad en hypocotyl resistentie I De beoordeling van de resistentie voor meeldauw in deze I meeldauwresistentieproef is als volgt: I 15 I Hypocotylbeoordeling: I "hypocotylresistent" score 0 Geen ziektesymptomen zichtbaar op I het hypocotyl “partieel score 1 Enkele ziektesymptomen I hypocotylresistent” (lichte sporulatie) zichtbaar op het I hypocotyl I "hypocotyl vatbaar" score 2 Volop ziektesymptomen (veel I plekken sporulatie, veel sporulatie) I zichtbaar op het hypocotyl.

I Bladbeoordeling: alle symptomen worden waargenomen op het I eerste echte blad. Zowel mycelium groei, het aantal aangetaste plekken op I 20 het blad en het aantal conidiosporen per aangetaste plek zijn bij de I beoordeling van belang.

P&-- "· 1 1 · " '-'* ~'_-3EÏ3^ 15

Bladbeoordeling: "Volledig resistent" score 0-1 Lichte myceliumgroei zonder sporulatie of zeer weinig aangetaste plekjes met een zeer gering aantal sporen per plekje "Partieel resistent" score 2-3 Weinig tot veel aangetaste plekken, matig sporulerend "Volledig vatbaar of niet score 4-5 veel aangetaste plekken, sterk resistent" sporulerend "DCl plant(en)" of "DCl lijn": komkommer plant(en) met de 5 combinatie van de kenmerken "volledig necrosevrij", zoals bepaald in de hierboven beschreven necroseproef en "volledig meeldauwresistent", zoals bepaald in de hierboven beschreven meeldauwresistentieproef, en zoals gedeponeerd onder NCIMB 41133.

10 Zaden van de DCl lijn zijn gedeponeerd onder het verdrag van

Budapest door Aventis CropScience N.V. (Jozef Plateaustraat 22, B-9000 Gent, Belgie) op 29 mei 2002 bij het National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB) onder het depot nummer NCIMB 41133.

15 De gedeponeerde DCl planten zelf hebben verder de volgende kenmerken. DCl is een uniforme, ingeteelte lijn van Nederlandse lange- of kas-komkommer. DCl planten hebben grote, horizontale bladeren, en uniforme en bijna gladde vruchten met een korte nek. Vergeleken met het ras Sabrina zijn de vruchten groter en gladder. Vergeleken met het ras 20 Bellissima zijn de vruchten lichter in kleur.

1022270 I 16 I De twee kennmerken “volledig necrosevrij” en “volledig I meeldauwresistent” kunnen door kruisingen en selectie (in de necroseproef I en meldauwresistentieproef) op andere komkommerlijnen of I komkommerrassen overdragen worden.

I Verdere beschrijving van de uitvinding

Deze uitvinding betreft nieuwe planten van de soort Cucumis 10 sativus L., komkommer, die een combinatie bezitten van "volledige necrose vrijheid", getoetst middels de hiervoor beschreven necroseproef en I "volledige resistentie" tegen meeldauw, te toetsen middels de hiervoor beschreven meeldauwresistentieproef. In een specifieke uitvoeringsvom van deze uitvinding is een nieuwe komkommerplant, genoemd "DC1", 15 geproduceerd die deze twee eigenschappen combineert.

Meeldauw is een belangrijke schimmelziekte bij komkommers.

Vooral in Noord-Europese landen als Nederland veroorzaakt meeldauw vaak ernstige aantastingen bij komkommerplanten in de kasteelt, die leiden 20 tot aanzienlijke opbrengstverliezen en daardoor nopen tot bestrijdingsmaatregelen zoals fungicidebehandelingen tijdens de komkommerteelt.

Hoewel er twee schimmelsoorten zijn (Erisyphe cichoracearum en H 25 Sphaerotheca fuliginea) die meeldauwinfecties kunnen veroorzaken, is de H meest algemeen voorkomende meeldauwschimmel bij komkommers in de H Nederlandse kasteelt toch Sphaerotheca fuliginea. De andere H schimmelsoort, Erisyphe cichoracearum, is minder algemeen in de Noord-

Europese kasteeltgebieden.

17

Het is tot nu toe in de Noord-Europese landen sinds jaar en dag bekend dat meeldauwresistentie in komkommer altijd samengaat met necrose gevoeligheid onder necrosebevorderende omstandigheden, zoals de korte dagen met de lage lichtintensisteit tijdens de late Noord-Europese 5 herfst, winter en vroege voorjaar. Ondanks pogingen deze negatieve koppeling via veredelingswerkwijzen te doorbreken (Robinson 1978; Zijlstra 1995), is het tot nu toe niet gelukt een komkommerplant te creëren waarin de meeldauwresistentie van de necrose gevoeligheid is gescheiden.

10 De nieuwe planten, ontwikkeld door de uitvinder, combineren voor het eerst volledige meeldauwresistentie met volledige necrose-ongevoeligheid.

Een oogmerk van deze uitvinding is komkommer planten te 15 voorzien met "volledige meeldauwresistentie" en "volledige necrosevrijheid" in de winterteelt. Dergelijke planten werden ontwikkeld middels de kruising van het commerciële hybrideras Bella met een lijn ontwikkeld door de uitvinder Gijn 117). De F1 planten van deze kruising werden vervolgens gedurende enkele generaties zelfbevrucht tot in de F6 een plant met de 20 gewenste eigenschappen als zodanig werd ontwikkeld en geïdentificeerd.

Deze geïdentificeerde komkommer-lijn wordt DC1 genoemd, en is een van de mogelijke uitvoeringsvormen van de uitvinding. DC1 planten kunnen verder worden veredeld via algemeen bekende 25 veredelingswerkwijzen zoals kruisen, terugkruisen, zelfbevruchten etc. tot een komkommerras dat speciaal geschikt is voor de winterteelt in de kas wegens de combinatie van volledige meeldauwresistentie en volledige necrosevrijheid met goede teelteigenschappen zoals hoge opbrengsten.

I 18 I Hybride planten worden gekenmerkt door het uitsplitsen van I kenmerkende eigenschappen in de volgende generatie. Deze eigenschappen zijn dus genetisch niet stabiel in hybriden. Werkwijzen voor het I ontwikkelen van hybriden zijn welgekend in de stand van de techniek.

I 5 Bijvoorbeeld de werkwijze, zoals beschreven in het Amerikaanse octrooi US

I 4,822,949, kan gebruikt worden.

I Eveneens tot deze uitvinding behoren cellen en cel-lijnen met de I eigenschappen volledige meeldauwresistentie en volledige necrose- I 10 ongevoeligheid, welke onder in vitro omstandigheden bewaard en opgekweekt kunnen worden, en welke tot een normale plant kunnen uitgroeien. Deze cellen bevatten de genetische informatie van de gewenste I lijn en lenen zich uitermate goed tot vermenigvuldigen, transformatie met I extra DNA, en tot lange- termijn bewaring. Transformatie van zulke cellen I 15 is standaard in de stand van de techniek, waarmee bepaalde extra genen voor resistentie, groeibevordering, e.d. in de planten van de uitvinding I kunnen worden gebracht. Gekende werkwijzen voor transformatie van komkommer zijn onder andere Agrobacterium (A. rhizogenes of A.

I tumefaciens) transformatie en regeneratie, zoals bijvoorbeeld beschreven in I 20 W088/02405, W090/03725 and US 6,084,152, en directe DNA transfer, e.d., zoals onder andere beschreven voor komkommer in Europese octrooi- I aanvrage 99302909.9, en het Amerikaans octrooi US 6,015,942.

I Eveneens tot deze uitvinding behoren planten, rassen, lijnen, I 25 afgeleide rassen of lijnen, verdubbelde haploiden, hybriden, van de soort I komkommer, Cucumis sativus, die dezelfde unieke combinatie van de DC1- eigenschappen bezitten, namelijk volledige meeldauwresistentie met I volledige necrosevrijheid.

I 1022270 19

Verdubbelde haploïde komkommerplanten kunnen bijvoorbeeld gegenereerd worden volgens de werkwijze beschreven in EP034755 of in US 5,492,827.

5 Fi hybride zaden en Fi hybride komkommerplanten kunnen gegenereerd worden volgens werkwijzen bekend in de stand van de techniek, of bijvoorbeeld zoals in US 4,822,949 is beschreven.

De volgende voorbeelden geven een zicht op een van de mogelijke 10 uitvoeringsvormen van de onderliggende uitvinding maar worden niet aangeboden als enige beperking op het recht gezocht onder deze aanvrage. Ze zijn louter illustratief en aldus niet bruikbaar ter interpretatie of beperking van de beschermingsomvang.

1 0 2 2 / V, I 20

I VOORBEELDEN

I 5 Voorbeeld 1. Ontwikkeling van PCI

De DC1 lijn is ontwikkeld uit een kruising van het publiek beschikbare ras Bella met een intern ontwikkelde lijn "117".

De F1 nakomelingschap, de F2, werd verscheidene malen I 10 zelfbevrucht en de planten verder geselecteerd in de hiervoor beschreven I meeldauwresistentie- en necroseproef, tot tenslotte de DC1 plant in de F6 I generatie werd geselecteerd. DC1 heeft de nieuwe combinatie van de I kenmerken "volledig necrosevrij" en "volledig resistent" tegen meeldauw.

I 15 De DC1 lijn is tot stand gekomen door onderstaande kruisingsschema: I Bella x 117 (kruising) I jaar 1 Fi H 20 1 zelfbevruchting I jaar 2 F2 I jaar 3 F3 I jaar 4 F4 jaar 5 F5 I 25 jaar 6 F6 - uiteindelijke selectie “DC1” I Onder vroege stookteelt-omstandigheden (necroseproef) werd de I necrosevrijheid vastgesteld in de DC1 lijn.

I / Ί - 21

Na uitgebreid onderzoek naar overerving van de meeldauwresistentie en de afwezigheid van necrose-gevoeligheid werd vastgesteld dat de DC1 planten steeds een volledige meeldauwresistentie vertonen in afwezigheid van enig voorkomen van necrose. Zaden van DC1 5 werden gedeponeerd bij NCIMB (23 St. Marchar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland, UK) op 29 mei 2002, en werden het depot nummer NCIMB 41133 toegewezen.

Voorbeeld 2: karakteristieken van PCI

10

In het onderzoeksprogramma werd gebruik gemaakt van verhoogde absolute concentraties van fosfaat zodat altijd necrose opgewekt kon worden onder de gekozen proef omstandigheden. In alle proeven zijn steeds een of meer meeldauwresistente rassen meegenomen als vergelijking, 15 zoals Mistral, Cumlaude, Cordoba, etc. Genoemde rassen vertoonden allen in meerdere mate necrose. Geen van de gekende komkommer-rassen vertoonde een volledige afwezigheid van necrose in de winterteelt en volledige resistentie tegen meeldauw.

20 In onderzoeken (meerdere locaties) zijn verschillende rassen vergeleken met de DC1 lijn in een meeldauwresistentie proef en necrose proef. Elk van deze proeven werd uitgevoerd in een aantal herhalingen, overeenkomstig de eerder beschreven werkwijze. Deze proeven bevestigden de reeds aangetoonde nieuwe kenmerken die genetisch gefixeerd zijn in de 25 DC1 lijn.

(a) Locatie Nunhems Zaden. Haelen en 's Gravenzande (Holland)

Proefopzet voor necroseproef (voor algemeen proefopzet, zie ook boven): - steenwolteelt / stookteelt 30 - drie herhalingen in de kas I 22 Η - zaaidatum: 20 november 1998 - necrose beoordeling: in maart 1999 I - opkweek in belichte kas tussen 28°C bij zaai tot 20°C bij einde van de I opkweekfase I 5 - belichting 18 uur per etmaal (50W/m2), laatste 2 weken 8 uur per etmaal I - plantdatum in kas: 20 december I - teeltduur: maximaal 4 maanden na het planten (met toenemende I daglengte en lichtintensiteit); plantbelasting zoals in de Nederlandse stookteelt gebruikelijk.

I 10 - T-systeem van plantopbouw: hoofdstengel zonder zijranken tot aan de I draad (210 tot 230 cm hoogte), met twee primaire zijranken naar I beneden, volgend door secundaire zijranken als primaire ranken zijn I getopt.

I 15 Resultaten necroseproef: I Plant lijn of Necrose Symptomen Conclusie (plant fenotype) I ras beoordeling necrose I Schaal 4-7 I DC1 7 Geen volledig necrose vrij I Cumlaude 4 Wel Necrosegevoelig I Mistral 4 Wel Necrosegevoelig I Savanna 5-6 Wel Necrosegevoelig I Sienna 5-6 Wel Necrosegevoelig

Flamingo 7 Geen volledig necrosevrij I Enigma 7 volledig necrosevrij I Sabrina 7 Geen volledig necrosevrij I 1022270 23

Proefopzet voor meeldauwresistentieproef (voor algemeen proefopzet, zie ook hierboven): - 24 planten per ras of lijn per herhaling; twee herhalingen in de kas - inoculum vermeerdering op 50 Ventura planten 5 - beoordeling: eerste echte blad, ca 14 dagen na derde inoculatie

Resultaten meeldauwresistentieproef:

Plant lijn of Symptomen Symptomen eerste Conclusie (plant ras hypocotyl blad fenotype) 0 = geen symptomen Score 0-1* 1= enkele Score 2-3** symptomen ^ ^ 2 = volop symptomen DC1 0 0-1 Volledig resistent

Cumlaude 0 0-1 Volledig resistent

Mistral 0 0-1 volledig resistent

Savanna 0 0-1 volledig resistent

Sienna 0 0-1 volledig resistent

Flamingo 0-1 2-3 Partieel resistent

Enigma 0-1 Partieel resistent

Sabrina 2 4-5 Vatbaar *0-1 = lichte myceliumgroei zonder sporulatie (of zeer weinig plekjes met 10 een zeer gering aantal sporen per plekje) **2-3 = weinig tot veel plekken, matig sporulerend ***4.5 = veel plekken, sterk sporulerend II ^ - ...

d \J «4 X. .L f i I 24 (b) Locatie NAK Tuinbouw Roelofarendsveen (Holland) I Proefopzet voor necroseproef (voor algemeen proefopzet, zie ook boven): I - grondteelt in een kas met grondverwarming (minimaal 18°C); grond I wordt voor aanvang van de proef gestoomd.

I 5 10 planten per ras of lijn per herhaling; drie herhalingen I - zaaidatum: 23 november 1998; plantdatum 23 decemberl998; - necrose beoordeling: eind maart 1999 I - zaai bij 24°C, verspenen na 4 dagen - opkweektemperatuur 22-23°C na verspenen; 21-22°C na het uitzetten.

10 - Uitzetten ~14 dagen na zaai; 18 planten / m2 I - Belichting 18 uur per etmaal (50 W/ m2); geen extra bijbelichting na het planten.

- Plantbelasting 3-4 vruchten aan de stam I - Paraplusysteem (kop van de plant toppen bij de draad en twee zijranken I 15 over de draad laten groeien, deze weer toppen bij een lengte van ca I 60cm)

Resultaten necroseproef:

Plant lijn of Symptomen Conclusie (plant fenotype) I ras necrose DC1 Geen Volledig necrosevrij

Bella Wel Necrosegevoelig

Aramon Wel Necrosegevoelig

Bellissima Wel Necrosegevoelig H Savanna Wel Necrosegevoelig H Sienna Wel Necrosegevoelig

Flamingo Geen Volledig necrosevrij H Enigma Geen Volledig necrosevrij ETt^r*"?1...... F.' — --- - ....... ..................

25

Sabrina Geen Volledig necrosevrij

Ventura Geen Volledig necrosevrij

Nicola Geen Volledig necrosevrij

Proefopzet voor meeldauwresistentieproef (voor algemeen proefopzet, zie ook hierboven): 5-24 planten per ras of lijn per herhaling; twee herhalingen in de kas - inoculum vermeerdering op 50 Ventura planten - beoordeling: eerste echte blad, ca 14 dagen na derde inoculatie

Resultaten meeldauwresistentieproef:

Plant lijn Symptomen Symptomen Fenotype eerste Conclusie (plant of ras hypocotyl eerste blad blad / aantal fenotype) 0 = geen Score 0-1* planten: symptomen Score 2-3** Volle. Resist. - 1= enkele Score 4-5*** Partieel R - symptomen Vatbaar 2= volop symptomen DCl 0 0-1 48 - 0 - 0 Volledig resistent

Bella 0 0-1 24 - 0-0 Volledig resistent

Aramon 0 0-1 24 - 0 - 0 Volledig resistent

Bellissima 0 0-1 24 - 0 - 0 Volledig resistent

Savanna 0 0-1 24 - 0 - 0 Volledig resistent

Sienna 0 0-1 24 - 0 - 0 Volledig resistent

Flamingo 0-1 2-3 0-24 - 0 Partieel resistent

Enigma 0-1 2-3 0 - 24 - 0 Partieel resistent

Sabrina 2 4-5 0 - 0 - 24 Vatbaar

Ventura 2 4-5 0 - 0 - 24 Vatbaar

Nicola 2 4-5 0 - 0 - 24 Vatbaar i I 26 I *0-1 = lichte myceliumgroei zonder sporulatie (of zeer weinig plekjes met I een zeer gering aantal sporen per plekje) **2-3 = weinig tot veel plekken, matig sporulerend 5 ***4-5 = veel plekken, sterk sporulerend I DC1 is dus de enige lijn, die volledig necrose vrij in de winterteelt I en volledig meeldauwresistent is. Er is dus een ontkoppeling gerealiseerd tussen volledige meeldauwresistentie en de aanwezigheid van necrose in I 10 vroege winterteelt.

Voorbeeld 3: ontwikkeling van ‘DC2’. en nieuwe komkommer liin met de 15 combinatie volledig necrosevrii en volledig meeldauwresistent DCl zaad word tezamen met zaad van de gecultiveerde komkommer ras Sabrina (vatbaar / volledig necrosevrij) uitgezaaid. De planten worden gekweekt zoals voor komkommer gebruikelijk.

Tijdens de bloei dienen DCl plant als bestuiver op Sabrina (moederplanten). Voldoende kruisingen worden gemaakt zodat er tenminste ±100 zaden F1 geoogst kunnen worden.

25 Nadat het F1 zaad geoogst is wordt het direct weer uitgezaaid voor het maken van F2 zaad. De vrouwelijk bloeiende Fl planten worden H bestoven met de mannelijk bloeiende Fl planten, middels handbestuiving of met behulp van bestuivende insecten in een gezamenlijke isolatie. Minimaal 5 moederplanten worden gebruikt zodat zeker ±2000 F2 zaden verkregen I 1022 2 70'· m~ '·ί·. ·;-. A-1· Ju J.1111—ui' ·ι... - -»ιτι·-'· _ 27 worden (bij voorkeur voldoende kruisingen voor het verkrijgen van ±10,000 F2 zaden). Het F2 zaad word geoogst.

Vervolgens worden uit de F2 generatie planten geselecteerd met 5 volledige meeldauw resistentie én volledige vrijheid van necrose.

De meeldauwresistentieproef wordt zoals al eerder beschreven uitgevoerd. Begin november wordt zowel zaad van de ouderlijnen (DC1, Sabrina) en van de referentierassen (zoals eerder beschreven) gezaaid, 10 samen met de bijbehorende F1 en F2 zaad.

Voor DCl, Sabrina, referentierassen en de Fl worden 3 herhalingen van minimaal 24 planten uitgezaaid, voor de F2 worden minimaal 2000 zaden uitgezaaid (tot + 10,000 zaden). Alle planten worden 15 voor meeldauwresistentie (zowel hypocotyl- als bladresistentie) getoetst zoals beschreven. De ouderlijnen en de referentierassen hebben het verwachte fenotype: DCl planten en de meeldauw resistente referentierassen zij meeldauw resistent, Sabrina en de vatbare referentierassen zijn volledig vatbaar. De Fl planten zijn vatbaar en de F2 20 planten zijn splitsend op zowel hypocotyl- als bladresistentie.

F2 planten met hypocotyl én bladresistentie worden geselecteerd en in de kas geplant voor beproeving van necrose gevoeligheid volgens de necroseproef, zoals eerder beschreven. Necrosevrije planten worden 25 geselecteerd.

Alle planten die meeldauwresistent én necrosevrij zijn worden per plant apart ingeteeld. Gezien het feit dat een komkommerplant heel goed is te stekken worden per plant minstens 5 stekken genomen. Zelfbestuivingen t u é v I 28 worden per plant afzonderlijk gemaakt en het F3 zaad word in het voorjaar I geoogst.

I Een deel van het F3 zaad word gebruikt om gedurende de zomer I 5 weer een meeldauwresistentietoets uit te voeren, weer met Sabrina, DC1, I F1 en andere lijnen als referentie zoals eerder beschreven. Alleen F3 I planten die volledig meeldauw resistent zijn worden bewaard, overige I planten worden weggegooid.

I 10 Met het reservezaad van de volledig resistente planten word in de winter weer een necrosetoets gedaan, waarin Sabrina, DC1, F1 en andere I lijnen weer als referentie worden gebruikt. In deze toets worden de volledig necrosevrije planten geselecteerd en weer plant afzonderlijk ingeteelt.

15 Geselecteerde planten die voldoen aan de eis (combinatie volledig necrosevrij en volledig meeldauwresistent) zullen verder nog uit splitsen voor andere kenmerken. Daarom worden met reservezaad proeven gedaan om de algemene gebruikswaarde van de geselecteerde planten te testen. De veredelaar selecteert de juiste planten en teelt deze verder in tot deze 20 voldoende genetisch zuiver zijn (intelen tot minimaal F6).

Het resultaat van het bovenstaande kruisingsschema is dat de meeldauwresistentie van DC1 is overgedragen op Sabrina, waardoor en nieuwe lijn (‘DC2’) met de eigenschappen volledig necrosevrij en volledig 25 meeldauwresistent gemaakt is.

29

REFERENTIES

5 Allard RW (1960) Principles of Plant Breeding. John Wiley & Sons, New York.

Fehr WR (1987) Principles of Cultivar Development, Volume 1, Theory and Techniques, Collier Macmillan Publishers, London. ISBN 0-02-949920-8.

10

Groot et al. (1990) Leaf chlorosis in mildew resistant cucumbers. High phosphate application improves selection against susceptibility, Prophyta. v. 44(10) p. 318-320.

15 Groot et al. (1992) Phosphorus nutrition and selection against leaf chlorosis related to Powdery mildew resistance in Cucumber; Journal of the American Society for Horticultural Science v. 117 (3) p. 500-503.

Mol (1992) Meeldauw en chlorose ontkoppeld; Groenten + Fruit/ 20 Glasgroenten no.25, p. 16-17.

Robinson RW (1978) Linkage Relationship of Genes for Tolerance to Powdery Mildew in Cucumber; Cucurbit Genetic Cooperative Report 1:11 25 Zijlstra, Nijs, Sonneveld, Voss (1987) A new approach to the necrosis problem in mildew - resistant cucumbers; Prophyta 41 Nr 6, ppl38-140.

Zijlstra en Groot (1992) Search for novel genes for resistance to powdery mildew (Sphaerotheca fuliginea) in Cucumber (Cucumis sativus); Euphytica 30 Vol. 64, 1-2 p. 31-37.

1022270 I 30 I Zijlstra et al. (1992) Resistentie en chlorose ontkoppeld; Prophyta 1, p. 22- I 25.

5 Zijlstra et al (1995) The relationship between powdery mildew I (Sphaerotheca fuliginea) resistance and leaf chlorosis sensitivity in H Cucumber (Cucumis sativus) studied in single seed descent lines; Euphytica I Vol. 81,2, p. 193-198.

Claims (12)

1. Een plant behorende tot de soort Cucumis sativus L., gekenmerkt door 5 de combinatie van de eigenschappen (a) volledige resistentie tegen echte meeldauw, en (b) volledige necrosevrijheid bij teelt onder necrosebevorderende omstandigheden.

2. Een plant volgens conclusie 1, waarbij de necrosebevorderende omstandigheden bestaan uit winterteelt in een kas.

3. Een plant volgens conclusie 2, waarbij de winterteelt de Nederlandse stookteelt is. 15

4. Een komkommerplant met depot nummer NCIMB 41133.

5. Een plant afgeleid van de plant volgens conclusie 4, met de kenmerken (a) volledige resistentie tegen meeldauw, en 20 (b) volledige necrosevrijheid bij teelt onder necrosebevorderende omstandigheden.

6. Het gebruik van een plant volgens een der conclusies 1 tot 5 als ouder in de productie van komkommer planten of zaden. 25

7. Gebruik volgens conclusie 6, met het kenmerk dat hybride planten of zaden geproduceerd worden.

8. Een komkommervrucht van een plant volgens een der conclusies 1 tot 5. . :27Ö

9. Zaden van de planten volgens een der conclusies 1 tot 5, met het kenmerk dat de hieruit afkomstige planten I (a) volledig resistent zijn tegen meeldauw, en I 5 (b) volledig necrosevrij zijn bij teelt onder necrosebevorderende I omstandigheden.

10. Een plantencel of plantencelkweekcultuur van de planten volgens een I der conclusies 1 tot 5. I 10

11. Een werkwijze voor het verkrijgen van een komkommer plant met de I eigenschappen van (a) volledige resistentie tegen meeldauw, en I (b) volledige necrosevrijheid bij teelt onder necrosebevorderende I 15 omstandigheden, gekenmerkt door het technisch proces van: - het kruisen van een komkommerplant van een der conclusies 1 tot 5 met een andere plant van Cucumis sativus L., die hetzij niet volledig meeldauwresistent is of niet volledig necrosevrij is bij teelt onder 20 necrosebevorderende omstandigheden, I - het toetsen van het nakomelingschap van deze kruisingen op resistentie I tegen meeldauw en op necrose gevoeligheid onder necrosebevorderende I omstandigheden, I - het selecteren van een plant met de eigenschappen (a) volledige 25 resistentie tegen meeldauw en (b) volledige necrosevrijheid bij teelt I onder necrosebevorderende omstandigheden.

12. Een plantencel afkomstig van plant DC1 met depot nummer NCIMB I 41133, welke na in vitro cultivatie in de benodigde media een plant geeft > y ƒ-' die gekenmerkt wordt door de eigenschappen van volledige resistentie tegen meeldauw en volledige necrosevrijheid in de winterteelt. 1022270-