NL2000992C2 - Nieuwe komkommerplanten met compacte groeiwijze. - Google Patents

Description

Nieuwe komkommerplanten met compacte groeiwijze 5 Terrein van de uitvinding

Deze uitvinding betreft een wijziging in het komkommergenoom die tot expressie komt als een nieuwe eigenschap in komkommerplanten, vooral in Cucumis sativus ssp. sativus, meer bepaald in de lange komkommer, vooral het type “Dutch cucumber”, maar deze 10 uitvinding is van toepassing op alle soorten en types van komkommerplanten, zoals augurk, korte komkommer, lange komkommer, slicer komkommer, en dergelijke. Dit nieuwe planttype laat een minder arbeidsintensieve teeltwijze voor komkommerproductie toe en laat eveneens toe om een hoger aantal vruchten per plant op te leveren. In een werkingsvorm van de uitvinding kan men een hogere plantdichtheid realiseren in de 15 komkommerteelt. De planten van de uitvinding zijn zeer geschikt voor het systeem van hogedraadteelt, die steeds meer opkomt in de standaard komkommerteelt (Boonekamp (2006); Honkoop (2006)). Het compactere en meer open plantentype van de komkommerplanten van de uitvinding is een groot voordeel bij een hogedraadteelt. In een specifieke uitvoeringsvorm van deze uitvinding bezitten de nieuwe compacte 20 komkommerplanten, vergeleken met het gangbare komkommertype, kortere intemodiën; kleiner, donkerder en langer groen blijvend blad; kleinere bloemen en kortere vruchten bezitten en bovendien groeien ze trager. Deze nieuwe combinatie van eigenschappen is zeer waardevol voor de ontwikkeling van commerciële komkommerrassen. Deze eigenschappen zijn de expressie van een enkel genetisch locus dat monogeen, 25 intermediair overerft. Dit genetisch locus kan worden aangetoond en gevolgd door 2000992 2

Vergelijking met de stand van de techniek

De huidige komkommerplant (Cucumis sativus L.) is door veredeling ontstaan uit de oorspronkelijke wilde augurk/komkommerplant en komt daarmee fenotypisch overeen. 5 Door veredeling is het huidige komkommertype ontwikkeld waarop alleen volledig vrouwelijke bloemen voorkomen. De komkommervrucht groeit uit zonder dat enige vorm van bestuiving of bevruchting noodzakelijk is en is dus parthenocarp. De huidige komkommervruchten, die als groente voor de consument zijn bestemd, bevatten enkel wat dunne, loze zaden. Augurken, komkommer, minikomkommer, Beith Alpha en slicer 10 behoren tot Cucumis sativus. Courgettes, meloenen, pompoenen en patisson behoren allen samen met het gewas komkommer tot de komkommerachtigen of Cucurbitaceae. De meeste komkommerrassen zijn nu hybriden, die worden geproduceerd door 2 genetisch verschillende ouderlijnen met elkaar te kruisen.

15 De komkommerteelt is een zeer intensieve teelt die veel zorg en arbeid vereist voor een optimale opbrengst. In Nederland, Canada en de omringende landen vindt deze teelt het hele jaar door voornamelijk in de kas plaats. Om een hoge vruchtopbrengst te verkrijgen moet een teveel aan blad tijdig verwijderd worden zodat geen energie verloren gaat naar overbodige vegetatieve groei en het gewas voldoende open gehouden wordt om er goed 20 in te kunnen werken. Bovendien bevordert een open gewas de vruchtkwaliteit. Daarbij moet er wel op gelet worden dat toch voldoende bladeren behouden blijven voor een optimale fotosynthese, verdamping en ademhaling van de plant.

Het gangbare type komkommerplant, dat gebruikt wordt in de huidige lange 3 draad is bevestigd wordt ze “gekopt” door verwijdering van het groeipunt om verdere doorgroei te stoppen waarna zich zijscheuten ontwikkelen. Deze zij scheuten laat men tot ongeveer 1 meter boven de grond naar beneden uitgroeien, waarna de groeipunten worden verwijderd. Vervolgens vindt de bloei en de vruchtontwikkeling plaats op zowel 5 de stam als op de zijscheuten of ranken, waarbij de vrachten op de ranken zich later ontwikkelen dan op de stam. De oogst van de vrachten vindt vanaf ca. 6 weken na zaaien plaats.

Gedurende de teeltperiode worden de planten intensief verzorgd met een juiste 10 bemesting, watergift, klimaatbeheersing, ziektebestrijding en het verwijderen van overtollig, vergeeld en afgestorven blad om een optimale opbrengst van een hoge kwaliteit te waarborgen. Als gevolg van dit intensieve karakter en de kostbare kassen waarin zij plaats vindt is dit een relatief dure teelt. Daarom wordt er voortdurend gezocht naar manieren om arbeid te besparen en de productie van de komkommervruchten te 15 verhogen en te versnellen met behoud of zelfs verbetering van de vruchtkwaliteit. Er wordt daarom bijvoorbeeld geëxperimenteerd met een systeem waarbij zich geen zijranken ontwikkelen en er alleen van de stam wordt geoogst. Dit bespaart arbeid en leidt tot hogere en kwalitatief betere opbrengsten. De huidige rassen zijn echter minder geschikt voor deze methode, daar ze wegens hun snelle groei en lange intemodiën te lang 20 worden. De compact-eigenschap zoals hier beschreven maakt de ontwikkeling van komkommerplanten of -rassen mogelijk die wel beter voor deze nieuwe teeltwijze geschikt zijn. Een andere ontwikkeling is het gebruik van oogstrobots, zoals de bestaande oogstrobots ontwikkeld door de dienst GreenVision aan de UR Wageningen (http://www.greenvision.wur.nl/). Door de kleinere, horizontaal staande bladeren van dit 4 komkommerteelt). Een stengeldichtheid van rond de 2,6 - 2.8 planten per m2 in de Nederlands hogedraadteelt voor lange komkommer is zo mogelijk om ideale omstandigheden te hebben, waar dit in de huidige Nederlandse hogedraadteelt voor lange komkommer eerder 2,2 stengels per m2 is voor ideale omstandigheden. In een vorm van 5 de uitvinding kan men zo minstens 20 % meer stengels aanhouden in de hogedraadteelt, door het gebruik van compactere planten, zoals planten heterozygoot voor het compactgen van de uitvinding.

In de stand van de techniek is een type van augurk (“pickling cucumber”) geteeld in volle 10 grond gekend met kleine bladeren met meerdere zijscheuten per plant (“multiple branching”), geïdentificeerd in Arkansas en gekend onder H-19 of “Arkansas Little Leaf’ (US Plant Variety Protection nummer 8900073). Hierbij is vastgesteld dat het fenotype van de kleinere bladeren in deze korte augurkeplanten veroorzaakt werd door een enkel recessief gen (Wehner et al. (1987); Goode et al. (1980)). Dit fenotype is niet 15 beschikbaar in de gangbare lange komkommerteelt, zoals de Nederlandse lange komkommerteelt (“Dutch cucumber” type). Daar het een recessief gen betreft zijn er geen intermediaire vormen van dit fenotype mogelijk, in tegenstelling tot de planten van de huidige uitvinding. De vruchtkwaliteit van deze “little-leaf’ komkommers werd inferieur bevonden ten opzichte van andere geteste lijnen met normale bladeren in 20 Schultheis et al. (1998).

Samenvatting van de uitvinding 25 5 een lager gewicht. In een uitvoeringsvorm zijn deze planten die het compactgen bevatten van het type lange komkommer, zoals hybride lange komkommerplanten.

Een vorm van de uitvinding is een van bovenstaande komkommerplanten waarin het 5 compactgen gekarakteriseerd is door de volgende eigenschappen: a) de bladschijfgrootte van het tiende echte blad van planten met het compactgen in homozygote toestand op 39 dagen na zaai is hoogstens 50 % van de bladschijfgrootte van planten van het gangbare komkommerplanttype op 39 dagen na zaai, en b) de grootste breedte van de kroonbladeren op 39 dagen na zaai van planten met het compactgen in homozygote 10 toestand is hoogstens 75 % van de grootste breedte van de kroonbladeren van planten van het gangbare komkommerplanttype op 39 dagen na zaai, en c) de lengte van de zij scheut op 56 dagen na zaai van planten met het compactgen in homozygote toestand is hoogstens 60 % van de lengte van de zijscheut op 56 dagen na zaai bij planten van het gangbare komkommerplanttype, en d) het aantal intemodiën op de zijscheut op 56 dagen 15 na zaai van planten met het compactgen in homozygote toestand is hoogstens 70 % van het aantal intemodiën op de zijscheut op 56 dagen na zaai bij planten van het gangbare komkommerplanttype.

In een vorm van de uitvinding is een komkommerplant ter beschikking gesteld waarvan, 20 als gevolg van de heterozygote aanwezigheid van het compactgen, de nateelt bij zelfbevruchting een uitsplitsende populatie oplevert waarin, in de verhouding van ongeveer 1:2:1 planten van het gangbare lange komkommertype, planten van het heterozygote (intermediaire) type en compact groeiende planten die homozygoot zijn voor het compactgen voorkomen; of die plant die uitsplitst in ongeveer 50 % planten van 6

Tot de uitvinding behoren ook (hybride) komkommerplanten, waarin de aanwezigheid van het compactgen kan worden aangetoond door deze planten te kruisen met planten van het gewas augurk of korte komkommer, en de Fl- planten voortkomende uit deze kruising te analyseren met behulp van de AFLP methode en het gebruik van tenminste 5 één van de merkers E14/M61_M873.6, E19/M50_M280.2, E24/M49_M211.5, E17/M54_M 179.0, E16/M47 M426.1, E16/M47_M411.0, of E16/M47_M402.9, of ervan afgeleide merkers die het compactgen flankeren, vooral merkers E14/M61M873.6 en/of E19/M50_M280.2, of ervan afgeleide merkers, en waarbij er in de uitsplitsende F2 populatie van de zelfbevruchte F1-planten waarin het compactgen is aangetoond, een 10 cosegregatie is van de compacteigenschappen met tenminste een van deze AFLP merkers, of merkers ervan afgeleid.

In een vorm van de uitvinding zijn de planten van het gangbare komkommertype waarmee de planten van de uitvinding vergeleken worden, deze ongeveer 25 % van de 15 planten zonder compacte groei in een 1:2:1 uitsplitsende populatie na zelfbevruchting van een plant heterozygoot voor het compactgen, of deze ongeveer 50 % van de planten zonder compacte groei bekomen na verdubbelde haploide productie van een plant heterozygoot voor het compactgen. In een uitvoeringsvorm van de uitvinding zijn de planten van het gangbare komkommertype planten van het ras Sabrina of Korinda.

20

Ook een van de bovenstaande planten, waarbij deze planten afleidbaar zijn van de zaden gedeponeerd onder de Budapest Treaty door Nunza B.V. (nu Nunhems B.V.) op 29 maart 2005 bij het NCIMB Ltd. (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksbum Aberdeen AB21 9YA, Schotland) onder depotnummer NCIMB 41266, behoren tot deze uitvinding 7

In een vorm van de uitvinding is het compactgen dat gen dat geflankeerd is door de AFLP merkers E14/M61M873.6 en E19/M50M280.2 in een kruising van de planten gegroeid uit de zaden van depotnummer NCIMB 41266 met korte komkommer of augurk, vooral in een kruising met planten van het korte komkommerras Manar F1.

5

Ook tot deze uitvinding behoort een methode om een van bovenstaande planten te kruisen met andere komkommerplanten met het oogmerk het compactgen in te kruisen in een andere plant van de soort Cucumis sativus, waarbij gebruik gemaakt wordt van een technisch process waarbij tenminste een polymorfe AFLP merker gebruikt wordt, welke 10 AFLP merker het compactgen flankeert in een kruising met korte komkommer of augurk, of waarbij gebruikt gemaakt wordt van het microbiologisch proces van de aanmaak van verdubbelde haploiden of in vitro celcultuur.

Ook tot deze uitvinding behoort een methode om met een van bovenstaande planten, 15 waarin het compactgen in homozygote toestand aanwezig is, zaad van hybride planten te produceren in welke hybriden het compactgen heterozygoot aanwezig is, vooral een methode die gebruik maakt van in vitro celcultuur, alsook de vruchten en zaden van hybride planten van de uitvinding die het compactgen bevatten.

20 Eveneens tot de uitvinding behoort een methode om met behulp van tenminste een van de AFLP merkers E14/M61 JV1873.6, E19/M50_M280.2, E24/M49_M211.5, E17/M54_M 179.0, E16/M47 M426.1, E16/M47_M411.0, of E16/M47 M402.9, vooral de AFLP merker E19/M50 M280.2 en/of E14/M61M873.6, of ervan afgeleide merkers, de aanwezigheid van het compactgen in planten, vruchten, zaden, plantweefsel - of cellen 8 methode voor het telen van komkommerplanten in een hogedraadteelt, waarbij de komkommerplanten een van de bovenvermelde planten zijn, vooral deze methode waarbij minstens 20 % meer stengels per m2 aangehouden worden in vergelijking met de gangbare komkommerteelt.

5

Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding

De uitvinding betreft komkommerplanten met een specifiek gen, het “compactgen”, dat 10 in het fenotype tot expressie komt door planten te vormen met een lagere groeisnelheid, kortere zijscheuten, kortere intemodiënlengte en een blad dat kleiner en donkerder is en langer groen blijft dan bij het fenotype van een gangbaar type komkommerplant het geval is. Wel is het blad van dit ‘compacttype’ brosser dan van het gangbare type, waardoor het makkelijker breekt op de nerven. De gebroken bladeren blijven echter groen en gezond in 15 tegenstelling tot beschadigde bladeren van het gangbare type, die sneller vergelen en verdorren. Verder staan de bladeren van het compacttype horizontaal en niet schuin naar beneden en afhangend zoals bij het gangbare type. Hierdoor is er bij het compacttype een betere ventilatie mogelijk door het gewas heen en is er door de open structuur meer zicht op planten en vruchten en kan men er daardoor beter in werken. De planten van het 20 homozygote compacttype zelf zijn minder geschikt voor de standaard commerciële teelt van lange komkommerplanten, daar zij trager groeien, maar ze zijn zeer nuttig voor andere teeltwijzen en voor het vormen van hybride (heterozygote) lange komkommerplanten die de kenmerken van het compactgen (de compacteigenschappen) in intermediaire vorm vertonen. In de commerciële teelt worden voornamelijk hybride 9 de uitvinding te gebruiken. De heterozygote hybride planten van de uitvinding hebben door de bijzondere combinatie van eigenschappen een optimale groeiwijze, die een minder arbeidsintensieve teeltwijze toelaat in de gangbare (kas)teelt, terwijl toch een hoge opbrengst aan hoogkwalitatieve komkommervruchten verkregen wordt.

5

Deze optimale combinatie van eigenschappen, voortkomende uit de expressie van het compactgen van de uitvinding, is niet bekend in het gangbare lange komkommertype. Kruisingen met ‘korte komkommer’ planttypen en met augurken in het verleden hebben tot nog toe niet geleid tot dit unieke planttype (zie ook Tabel 2 in de voorbeelden). In de 10 veredeling is het moeilijk om door middel van kruisingen een gewenste eigenschap uit een ander gewas over te brengen zonder ook andere, ongewenste eigenschappen mee te nemen die met de gewenste eigenschap gekoppeld zijn. Het is vaak onmogelijk of bijzonder moeilijk deze ongewenste eigenschappen door middel van terugkruisingen en selectie te verwijderen. De uitvinding die hier wordt beschreven is uniek omdat zij is 15 ontwikkeld in het gangbare, hoogproducerende planttype zonder gekoppelde negatieve kenmerken, en met een eenvoudige genetische basis.

Het compactgen van de uitvinding kan ook in andere planten geïntroduceerd worden of gecombineerd worden met andere interessante eigenschappen die door een of enkele 20 genen worden veroorzaakt. Zo is het mogelijk kruisingen te maken tussen planten met het compactgen van de uitvinding en komkommerplanten met meeldauwresistentie (Sphaerotheca fuliginea (Schlecht. ex Fr.) en/of Erysiphe cichoracearum (DC. ex Mérat emend. Salm), ook “het wit” genoemd) om resistente hybriden te verkrijgen met de compacteigenschappen van de uitvinding, van zowel volledig resistent als partieel 10 planten verkregen worden met tolerantie of resistentie tegen Didymella bryoniae (bladvlekkenziekte of mycosphaerella (van Steekelenburg (1986)), of met een of meerdere pathogen-resistenties afgeleid van gekende komkommerrassen, zoals aangegeven in het CPVO protocol onder punt 44 tot en met 51 in Annex 1 van dit 5 protocol (zie literatuurlijst).

De volgende definities worden aangeboden ter verduidelijking van de uitvinding en ter interpretatie van de conclusies en de beschrijving en zijn niet bedoeld als limiterend met betrekking tot de rechtsbescherming voortvloeiend uit deze aanvrage.

10 "Fenotype" is de waarneembare uiterlijke verschijningsvorm van de plant als resultaat van de interactie tussen het genotype van de plant en zijn omgeving. Het omvat alle waarneembare morfologische en fysiologische kenmerken van de plant.

15 "Genotype" is het totaal aan overervende genetische informatie van een organisme, dat mede beïnvloed door omgevingsfactoren, op een bepaalde wijze tot uitdrukking komt in het fenotype.

“Komkommerplant” als hierin gebruikt, wijst op een plant, zaad of embryo van de soort 20 Cucumis sativus L.. Indien verwijzing naar de vruchten gemaakt wordt, wordt specifiek de term “komkommervrucht” gebruikt. Een komkommervrucht kan augurken, lange, korte, mini (Beith Alpha) of midi komkommers omvatten. Tot deze uitvinding behoren ook de uiteindelijk verkregen komkommervruchten die geoogst worden van de planten van de uitvinding, alsook elk gebruik, en elke verwerking ervan.

11

Een "plantenras" is een plantengroep binnen een enkel botanisch taxon van de laagst bekende rang, welke (ongeacht of aan de voorwaarden voor het toekennen van een kwekersrecht voldaan is) kan worden gedefinieerd aan de hand van de expressie van de eigenschappen die het resultaat zijn van een bepaald genotype of een combinatie van 5 genotypen, kan worden onderscheiden van elke andere plantengroep door de expressie van tenminste één van die eigenschappen en kan worden beschouwd als een eenheid, gezien zijn geschiktheid om onveranderd te worden vermeerderd. Een groepering van planten, zelfs deze van dezelfde soort, allen gekenmerkt door de aanwezigheid van 1 locus of gen (of een reeks fenotypische eigenschappen veroorzaakt door dit enkel locus 10 of gen), maar die verder enorm kunnen verschillen wat betreft andere loei of genen, is dus geen plantenras. De planten van het compacttype, zoals planten die het compactgen van de uitvinding bevatten en die verkrijgbaar of afleidbaar zijn uit de referentie-zaden gedeponeerd onder depotnummer NCIMB 41266, omvatten vele verschillende komkommerplanten, met zeer uiteenlopende fenotypische kenmerken en genotypische 15 samenstelling, onderscheidend van de zaden zoals gedeponeerd. Zulk een groep van fenotypisch verschillende planten met slechts één gemeenschappelijk kenmerk (het compactgen), voldoet niet aan de bovenstaande definitie van een plantenras.

De eigenschappen van de planten van de uitvinding worden hierin genoemd als de 20 “compacteigenschappen” en de planten die deze eigenschappen bevatten worden hierin dan ook de “compactplanten” of “compacttypen” of “compact planttype” genoemd. Deze planten kunnen homozygoot of heterozygoot zijn voor het compactgen en worden respectievelijk “homozygote” compactplanten, compacttypen of compact planttype, dan wel “heterozygote” of “intermediaire” compactplanten, compacttypen of compact 12 meer bepaald om de combinatie van de eigenschappen kortere zij scheuten, kortere intemodiën, kleiner blad, kleinere bloemen, en kortere vruchten. In een vorm van de uitvinding zijn de compacteigenschappen de combinatie van de eigenschappen tragere groei, kortere zijscheuten, kortere intemodiën, kleiner blad, horizontaler (opstaand) blad, 5 vlakker blad (met minder boiling), donkerder groen blad, brosser (sneller breekbaar) blad, kleinere bloem en kleinere, lichtere vruchten; vooral de eigenschappen die opvallend zijn in planten homozygoot voor het compactgen (zoals de homozygote planten gegroeid uit het zaad gedeponeerd onder depotnummer NCIMB 41266, of verdubbelde haploide planten homozygoot voor het compactgen bekomen uit een plant heterozygoot voor het 10 compactgen) die een significant kortere zijscheut, kortere intemodiën, kleiner blad, kleinere bloemen en kortere vruchten hebben; dit alles in vergelijking met wild-type planten (zonder compactgen), zoals planten van het gangbare komkommertype, bv. deze ongeveer 25 % van de planten zonder compacte groei in een 1:2:1 uitsplitsende populatie na zelfbevruchting van een plant heterozygoot voor het compactgen, of deze ongeveer 50 15 % van de planten zonder compacte groei bekomen na verdubbelde haploide productie van een plant heterozygoot voor het compactgen.

De planten homozygoot voor het compactgen van de uitvinding zijn het best herkenbaar aan de uitgesproken compacteigenschappen die een significant verschil vertonen in 20 vergelijking met de wild-type planten (zonder compactgen, bv. type Korinda), dit vooral wat betreft het aantal intemodiën van de zijscheuten (significant lager dan wild-type in de homozygoot), de lengte en breedte van het blad (significant kleiner dan wild-type in de homozygoot), de bladschijfgrootte (significant kleiner dan wild-type in de homozygoot), de lengte en breedte van het kroonblad (significant kleiner dan het wildtype in de 13

In een vorm van de uitvinding wordt een plant die homozygoot is voor het compactgen van de uitvinding gekenmerkt door de combinatie van de volgende karakteristieke compacteigenschappen, vergeleken onder dezelfde teeltomstandigheden (waarbij zaai bij voorkeur in de zomer is, maar ook het gehele jaar door kan) met een plant die het 5 compactgen niet bevat (hier een controle-plant genoemd), waarbij het gemiddelde van metingen op minstens 20 planten van elk type vergeleken wordt (enerzijds de homozygoot compactplanten, anderzijds de controleplanten): de grootste breedte van het tiende echte blad op 39 dagen na zaai van planten met het compactgen in homozygote toestand is hoogstens 70 % van de breedte van het tiende 10 blad van de controle-planten op 39 dagen na zaai, en de bladschijfgrootte (0,5 maal de grootste breedte van het blad maal de langste lengte over het blad van de onderste bladlob tot de bladpunt) van het tiende echte blad op 39 dagen na zaai van planten met het compactgen in homozygote toestand is hoogstens 50 % van de bladschijfgrootte van de controle-planten op 39 dagen na zaai, en 15 - de grootste breedte van de kroonbladeren op 39 dagen na zaai van planten met het compactgen in homozygote toestand is hoogstens 75 % van de grootste breedte van de kroonbladeren van de controle-planten op 39 dagen na zaai, en de lengte van de zijscheut op 56 dagen na zaai van planten met het compactgen in homozygote toestand is hoogstens 60 % van de lengte van de zijscheut op 56 dagen na 20 zaai bij de controle-planten (de lengte is vanaf de aanhechting van de zijscheut aan de hoofdstam tot het eindpunt van de zijscheut), en het aantal intemodiën op de zijscheut op 56 dagen na zaai van planten met het compactgen in homozygote toestand is hoogstens 70 % van het aantal intemodiën op de zijscheut op 56 dagen na zaai bij de controle-planten.

14

Zo kan men steeds planten met het compactgen herkennen op basis van de unieke combinatie van bovenstaande duidelijke fenotypische kenmerken in planten die homozygoot zijn voor het compactgen. Het homozygoot maken van planten voor het 5 compactgen is een standaard werkwijze in de stand van de techniek, net zoals het standaard is om van een plant homozygoot voor het compactgen planten te verkrijgen die heterozygoot zijn voor dit gen. Ook deze heterozygote compactplanten zijn een onderwerp van deze uitvinding.

10 Fenotypische eigenschappen van een plant - zoals de bladgrootte - kunnen verschillen vertonen afhankelijk van de teeltwijze en van omgevingsfactoren (zoals bv. temperatuur, licht, vochtigheid, hoeveelheid nutriënten), dus is het evident dat voor een vergelijking tussen wild type, heterozygote en/of homozygote planten van de uitvinding deze verschillende plant-types in vergelijkbare of in dezelfde teeltcondities geteeld worden, 15 best in een standaard komkommerteelt, vooral dan een hogedraadteelt.

De compacteigenschappen, zoals bv. in hybride planten, kunnen worden aangetoond door de kenmerken van afgeleide planten verkregen na zelfbestuiving of verdubbelde haploide-vorming - uitgaande een plant waarvan het vermoeden bestaat dat hij het 20 compactgen bevat - onderling te vergelijken en te bevestigen dat de compacteigenschappen samen overerven volgens het verwachtte patroon van heterozygote, homozygote en wild-type planten, volgens een monogene, intermediaire, overerving. Bij onderlinge kruising (of zelfbestuiving) van homozygote planten is er geen uitsplitsing van eigenschappen, het overerven van de compacteigenschappen is hier 15 "FI, F2, etc." verwijst naar de opeenvolgende, verwante generaties volgend op'een kruising tussen twee ouderplanten of ouderlijnen. De planten opgekweekt uit het zaad, dat is gevormd na een kruising van twee ouderplanten, wordt de 'Fl' genoemd. Zelfbevruchting van de Fl planten levert de F2 generatie op enz..

5 “Verdubbelde haploiden” (of DHs) zijn planten verkregen door via een technisch (in vitro) proces het genoom van haploide cellen (zoals pollen, microspore-cellen of eicellen) van een plant te verdubbelen, en daaruit diploide planten te regenereren, zoals gekend in de stand van de techniek (zoals bv. in Amerikaans octrooi 5,492,827 of in Gémes-Juhasz 10 et al. (2002)).

De term "hybriden", "Fl hybriden" of "hybride planten" wordt gebruikt om het zaad en de planten uit dat zaad van een kruising tussen twee genetisch verschillende ouderlijnen aan te duiden. (Fl)Hybride planten worden gekenmerkt door het uitsplitsen van 15 kenmerkende eigenschappen in de volgende generatie, de F2. Deze eigenschappen zijn dus genetisch niet stabiel in hybriden. Werkwijzen voor het ontwikkelen van hybriden zijn welgekend in de stand van de techniek (zie bijvoorbeeld de werkwijze beschreven in het Amerikaanse octrooi 4,822,949). Door een vrouwelijke ouderlijn van het gangbare komkommertype te kruisen met een mannelijke ouderlijn van het compacttype worden 20 hybriden verkregen met een intermediaire expressie van de compacteigenschappen, die voor de commerciële komkommerteelt, zoals de lange komkommerteelt, meer bepaald in de hogedraadteelt, zeer interessant zijn.

“Korte komkommerrassen” of “korte komkommerplanteri”, zoals hierin gebruikt, worden 16 “Augurkerassen” of “augurkplanten” zoals hierin gebruikt, worden gekenmerkt door middelgroene vruchten met soms een iets lichtere gemarmerde punt, die een lengte hebben van ca. 12-15 cm, met een gestekelde huid met wratten, vrijwel zonder ribben. De 5 bladeren zijn veelal klein tot middelgroot. Type voorbeelden van augurkerassen zijn de rassen Capra en Delphina.

“Lange komkommerrassen” of “Lange komkommerplanten”, zoals hierin gebruikt, worden gekenmerkt door iets halzige vruchten van ca. 30-37 cm lengte (of langer) met 10 een licht geribde huid, middelgroen van kleur, en met parthenocarpe uitgroei van de vruchten. De bladeren zijn veelal groot tot zeer groot. Type voorbeelden van lange komkommerrassen zijn de rassen Sabrina of Korinda, of komkommerplanten die een beschrijvingscode van 7 tot en met 9 krijgen voor de lengte van de vrucht volgens het CPVO protocol (zie Annex 1 punt 19 in dit protocol). In een vorm van de uitvinding is 15 het compactgen aanwezig in lange komkommerplanten, vooral dan lange komkommerplanten geschikt voor de commerciële komkommerteelt, vooral de kasteelt. In een vorm van de uitvinding is deze kasteelt een hogedraadteelt. In een andere vorm van de uitvinding is het compactgen van de uitvinding aanwezig in komkommerplanten die niet het Little Leaf locus (//) bevatten zoals dit aanwezig is in H-19 of Arkansas Little 20 Leaf, vooral dan zulke komkommerplanten geschikt voor de commerciële kasteelt van lange komkommer, meer bepaald de hogedraadteelt.

Het “compactgen” is het genetisch kenmerk op een bepaald locus van het komkommergenoom, dat in het fenotype van de compactplant, in vergelijking tot het 17 E19/M50 M280.2 (op ongeveer 0,67 cM), of merkers van een van deze AFLP merkers afgeleid (zoals STS of SNP merkers), meer bepaald in kruisingen van planten gegroeid uit de zaden gedeponeerd onder depotnummer NCIMB 41266, met korte komkommer of augurkeplanten, bv. de korte komkommer Manar F1.

5

Uitsplitsing van de compacteigenschappen in de 1:2:1 verhouding na zelfbevruchting van een heterozygote komkommerplant in ongeveer 25 % homozygoot compacttype, ongeveer 50 % heterozygoot compacttype en ongeveer 25 % wildtype (geen compacteigenschappen of compactgen), of de 1:1 verhouding in verdubbelde haploiden 10 (ongeveer 50 % van de DHs zal homozygoot zijn voor het compactgen, de andere ongeveer 50% zal homozygoot voor het wild type zijn (dus zonder compactgen)), geeft aan dat het compactgen van de uitvinding aanwezig is in deze heterozygote plant. Bevestiging hiervan kan gebeuren door een AFLP-merker analyse in kruisingen met korte komkommer of augurk, zoals hieronder beschreven, als deze 15 compacteigenschappen cosegregeren met de beschreven AFLP merkers die het compactgen flankeren in een kruising met korte komkommer of augurk. Bij deze fenotypische vergelijking van de uitsplitsende komkommerplanten worden natuurlijk dezelfde teelt-omstandigheden gebruikt en worden de vergelijkende metingen en waarnemingen op dezelfde wijze en hetzelfde tijdstip uitgevoerd. Als eventuele extra 20 controle-planten kunnen planten van het gangbare lange komkommertype ingesloten worden (zoals planten van het ras Sabrina of Korinda, meer bepaald planten van het ras Korinda).

De AFLP-merkers van de uitvinding kunnen gebruikt worden om te bevestigen dat 18

Voor de merkeranalyse wordt eerst een kruising gedaan tussen een (hybride) komkommer plant (waarvan vermoed wordt dat die heterozygoot is voor het compactgen) met augurk of korte komkommer. De meeste korte komkommer- en augurkerassen zijn hiervoor bruikbaar, zo lang de AFLP merkers bruikbaar zijn in die achtergrond. Voor 5 een gemakkelijke fenotypering worden best korte komkommer- of augurkeplanten genomen van een homozygote lijn met een fenotype dat zo sterk mogelijk afwijkt van dat van de compactplanten van de uitvinding waarmee gekruist wordt (bv. een grootbladig korte komkommertype type met lichtgekleurd blad). Vooral korte komkommerrassen die tenminste herkend worden door AFLP merker E16/M47_M426.1 zijn geschikt, bv. 10 planten van het gekende korte komkommerras Manar Fl, of homozygote planten met een gelijkaardig fenotype als het ras Manar Fl.

In deze kruising tussen een (hybride) komkommer plant (heterozygoot voor het compactgen) met een augurke- of korte komkommerplant splitsen de 15 compacteigenschappen 1:1 uit: ongeveer 50 % van de planten heeft de compacteigenschappen, de overige planten niet. Na zelfbestuiving van de planten met de compacteigenschappen bekomen uit deze kruising met augurk of korte komkommer bekomt men de F2 die een uitsplitsing vertoont van planten homozygoot voor het compactgen of de compacteigenschappen, heterozygoot voor het compactgen of de 20 compacteigenschappen en wildtype planten zonder het compactgen of zonder de compacteigenschappen in de verhouding 1:2:1, als de originele (hybride) plant inderdaad heterozygoot was voor het compactgen.

Merker analyse met minstens een van de AFLP merkers E14/M61_M873.6, 19 de compacteigenschappen van de uitvinding met de AFLP merkers, als het compactgen van de uitvinding aanwezig is in deze planten.

In een vorm van de uitvinding erven verscheidene van de fenotypische eigenschappen 5 van de compactplanten van de uitvinding (compacteigenschappen) samen over in de nakomelingen van compactplanten van de uitvinding. De cosegregatie van een of meer van de AFLP merkers van de uitvinding (zoals een van de AFLP merkers in Figuur 1) met het compactfenotype, toont de aanwezigheid van het compactgen in de planten van de uitvinding aan.

10

Als gevolg van het veredelingswerk vind een verdere inkruising van het compactgen in andere genetische achtergronden plaats. Het is mogelijk dat de compacteigenschappen minder gemakkelijk fenotypisch herkend worden in planten en hybriderassen die heterozygoot zijn voor het compactgen. Het compactgen is echter steeds te herkennen 15 via de hierboven vermelde uitsplitsing van de compacteigenschappen bij zelfbevruchting van planten die heterozygoot zijn voor het compactgen, of bij de vorming van verdubbelde haploiden. Deze fenotypische analyze kan bevestigd worden door de bovenstaande merkeranalyze. De combinatie van verschillende van de compacteigenschappen in planten, die homozygoot zijn voor het compactgen, in een 20 uitsplitsende populatie is herkenbaar voor elk persoon met normale bekwaamheid die werkt in het domein van de komkommerteelt. Op deze wijze kunnen planten die het compactgen bezitten steeds herkend worden.

In een specifieke uitvoering van deze uitvinding is het compactgen in homozygote 20 specifieke uitvoeringen van de uitvinding op die zich van de uitvoering in de voorbeelden onderscheiden.

Tot deze uitvinding behoort ook het gebruik van het compactgen in andere 5 komkommerrassen en -lijnen of in andere planten van de soort Cucumis, door dit compactgen volgens algemeen bekende methoden (zoals bv. recurrente selectie, embryo rescue, e.d.) in te kruisen in andere planten, zoals in andere planten van de soort Cucumis sativus, vooral in planten van het lange komkommertype.

10 Ook het opsporen en volgen van deze compacteigenschap in de verschillende kruisingsproducten - en stadia tijdens het veredelingsproces met behulp van minstens een van de AFLP merkers E14/M61_M873.6, E19/M50_M280.2, E 24/M49_M211.5, E17/M54 M 179.0, E16/M47_M426.1, E16/M47 M411.0, of E16/M47_M402.9, vooral met merkers E14/M61_M873.6 of E19/M50_M280.2, of hiervan afgeleide merkers (zoals 15 STS, SNP of andere merkers afgeleid van minstens een van deze AFLP merkers), na kruising in korte komkommer of augurk (zoals hierboven beschreven), behoort tot het terrein van deze uitvinding, alsook kits met zulke merkers. De AFLP techniek en AFLP merkers zijn ook in detail beschreven in EP0534858B1, en de inhoud van dit document en definities zoals in deel 5.1 (pagina 4-6) hiervan beschreven kunnen voor deze 20 uitvinding gebruikt worden.

De volgende voorbeelden worden gegeven ter illustratie van een van de uitvoeringsvormen van de uitvinding, en zijn niet bedoeld om de beschermingsomvang van de uitvinding te bepalen die enkel door de bijgevoegde conclusies bepaald wordt.

21

Figuur 2: vergelijking van vruchten, bloemen en bladeren van planten onder dezelfde teeltomstandigheden gegroeid (telkens verwijderd 35-40 dagen na zaai, het blad is telkens ongeveer het 15de blad): Figuur 2a: vergelijking van typische vruchten geoogst in planten homozygoot voor het compactgen (links), heterozygoot voor het compactgen 5 (midden) of controle-planten van het type Korinda (rechts); Figuur 2b: vergelijking van typische bladeren en bloemen verwijderd van planten homozygoot voor het compactgen (rechts), heterozygoot voor het compactgen (midden) of van controle-planten van het type Korinda (links); Figuur 2c: detail-vergelijking van de kroonbladeren van typische bloemen verwijderd van planten homozygoot voor het compactgen (rechts), heterozygoot 10 voor het compactgen (midden) of van controle-planten van het type Korinda (links).

Voorbeelden.

Voorbeeld 1. Fenotypische analyse van de compactplanten 15

In Nederland werd in de teelt van de Nederlandse lange komkommer in een F1-hybride populatie onverwacht een compactere plant met een afwijkend fenotype vastgesteld (dit type plant kreeg de naam “4001 type”, en het verantwoordelijke locus kreeg de naam “4001 locus”). Bij vergelijking met andere lange komkommerplanten (voorbeeld 20 Korinda) werd vastgesteld dat de groei van de compacte planten matig was en de strekking van de hoofdstam traag, vooral doordat de intemodiën korter waren. De bladeren van de compactere plant waren duidelijk kleiner en donkerder dan bij de gangbare lange komkommerrassen. De bladstand van de compactere planten was meer horizontaal en het blad was minder gebobbeld (vlakker blad). De compactere planten 22 intermediaire overerving. Naast het heterozygote, intermediaire type komen er'ook homozygote planten voor die de typische, hierboven beschreven compacteigenschappen vertonen zoals een zeer compacte groei, een klein blad, een korte vrucht en korte intemodiën.

5 De volgende splitsingsverhouding werd vastgesteld:

Ongeveer 25% homozygoot compact planttype Ongeveer 50% heterozygoot intermediair compact planttype Ongeveer 25% normaal lang komkommer planttype 10

Deze Mendeliaanse splitsingsverhouding 1:2:1 duidt op een uitsplitsing van één gen op een enkel locus, met intermediaire expressie van het heterozygote genotype. Zaden van de homozygote planten van het 4001 type (Cucumis sativus ssp sativus) werden gedeponeerd onder het Budapest Treaty door Nunza BV (sindsdien in naam gewijzigd 15 naar Nunhems BV) bij het NCIMB (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksbum, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland) onder depotnummer NCIMB 41266, op 29 maart 2005. In overeenkomst met de Rijksoctrooiwet en het Uitvoeringsbesluit (conform artikel 21, lid 3 Uitvoeringsbesluit) wenst de aanvrager dat tot de datum waarop octrooi wordt verleend of tot de datum, waarop vaststaat dat op de octrooiaanvrage geen octrooi wordt 20 verleend, de afgifte van monsters van het gedeponeerde biologisch materiaal of daarvan afgeleid biologisch materiaal, alleen kan geschieden aan een door de verzoeker aangewezen deskundige.

In haploide cellen, bv. pollen, microsporecellen or eicellen, van de komkommerplanten 23

Ongeveer 50% van de DH’s vertoonden een normaal planttype, als gevolg van het ontbreken van het gen voor de compacteigenschappen. Deze planten zijn homozygoot voor het normale lange planttype.

5 In de uitsplitsingsverhouding bij verdubbelde haploïden komen alleen de 2 verschillende homozygote genotypen voor in een 1:1 verhouding. Dit toont aan dat het hier zeker om een enkel locus gaat, meest waarschijnlijk om een monogene eigenschap.

Zoals men ook de cultuurwaarde van ander komkommermateriaal steeds verder tracht te 10 verhogen, zo zijn er kruisingen tussen homozygote compactplanten met diverse komkommerrassen van het lange type gemaakt. Door middel van deze kruisingen en verdere selectie, werden onder andere planten met betere ziekteresistentie verkregen, die langere vruchten geven dan de homozygote compactplanten, maar nog steeds het compactgen bevatten en een opener gewas vormen.

15

De hierboven beschreven specifieke uitvoering in homozygote toestand en de specifieke uitvoering in heterozygote toestand werden vergeleken met het gangbare lange komkommertype (als voorbeeld het ras Korinda) wat betreft een aantal kenmerkende eigenschappen. De resultaten zijn weergeven in Tabel 1.

20

Tabel 1 toont een vergelijking van het gangbare lange komkommertype (normaaltype, Korinda) met het homozygote ‘compacttype’ en het heterozygote, intermediaire type voor die kenmerken die deze planttypen duidelijk karakteriseren. De vergelijkingsproef waaruit deze gegevens voortkomen is gezaaid op 4 juli 2005. De zaailingplanten zijn 24 de eerste 6 oksels geschoond, dus zonder vruchten, en daarna 2 vruchten aangehouden (in het 7e/8e oksel) en vervolgens weer enkele oksels geschoond, zodat de onderste vruchten goed konden uitgroeien. De weergegeven waarnemingen zijn gedaan op minstens 20 planten van elk type, de bekomen gemiddelde waarde van deze metingen wordt 5 weergegeven in Tabel 1.

De datum waarop de metingen in Tabel 1 werden gedaan staan weergegeven in de tabel. Omdat deze absolute cijfers afhankelijk zijn van plaats en tijd van de meting of waarneming, is voor de gemeten en de berekende kenmerken bij het heterozygote en het compacttype het percentage ten opzichte van het normaaltype aangegeven.

10

Verklaring van de termen gebruikt in Tabel 1: CBP code: De nummering volgens het CPVO protocol (zie literatuurlijst)

Soort Waam.: (Soort Waarneming) 15 M = Meting in centimeters (cm) of grammen (gr.) of aantallen B = Berekening, V = Visuele waarneming % van N: De waargenomen waarde van het heterozygote of het homozygote compacttype uitgedrukt als percentage van de waarde van het 20 normale type/wild-type LSD: Kleinste significante verschil (Least Significant Difference) volgens de paarsgewijze test van Scheffe (1953, 1959) bij een overschrijdingskans van 0.5% en 0.1%, ofwel een statistische betrouwbaarheid van 95 %, 25 H/C = tussen Heterozygoot - en Compacttype Omschrijving van de kenmerken in Tabel 1: 5 Plant: groeikracht: lengte van de stam 44 dagen na zaai, gemeten vanaf het substraat lengte stam bij 15 internodiën: lengte van de stam gemeten over 15 intemodiën, gemeten vanaf het substraat lengte zijscheut: lengte vanaf aanhechting hoofdstam tot eindpunt zijscheut, 56 10 dagen na zaaien aantal internodiën zijscheut: totaal aantal intemodiën op de zijscheut, geteld 56 of 66 dagen na zaaien

Blad: 15 blad 1: het 10de blad (op ong. 1 tot 1,5 m hoogte) blad 2: het 1 lde blad (op ong. 1 tot 1,5 m hoogte) lengte: langste lengte over het blad, van onderste bladlob tot bladpunt gemeten (verschillend van de blad-lengtemaat gebruikt in het CPVO protocol) breedte: grootste breedte van het blad (zie CPVO protocol in literatuurlijst, uitleg 20 bij nummer 11 onder “Explanations and Methods” in Annex 1 ervan) ratio lengte / breedte: lengte blad gedeeld door de bladbreedte 2 bladschijfgrootte: 0,5 maal bladbreedte maal bladlengte in cm houding: 1 is verticaal naar beneden hangend, 9 is horizontaal intensiteit groene kleur: 1 is lichtgroen, 9 is donkergroen 26 ratio lengte / breedte kroonblad: lengte gedeeld door breedte kroonblad Vrucht: gewicht: het gemiddelde gewicht van 2 vruchten per plant gewogen in 5 gram, gedeeld door 2 lengte: de gemeten lengte vanaf de inplant van de vruchtsteel in de vrucht tot de inplant van de bloem in de vrucht

Omdat de compacteigenschappen zo duidelijk te zien zijn, geeft Tabel 2 een visuele 10 vergelijking tussen het normale (lange) komkommertype (voorbeeld Korinda), het korte komkommertype, augurk en het (homozygote) compacttype. Deze vergelijking geeft een overzicht van de verschillen en de overeenkomsten tussen deze verschillende komkommertypes. In de laatste kolom onder het hoofdje ‘overlap’ wordt de overlap aangegeven tussen het compacttype en augurk (C/A) en het compacttype met korte 15 komkommer (C/K). Doordat in veel eigenschappen geen overlap is wordt hiermee duidelijk de unieke combinatie van eigenschappen van het compacttype geïllustreerd. Hiervoor werd een visuele schaal gebruikt waarbij 1 de laagste/kortste expressievorm is en 9 de hoogste/langste expressievorm (afkortingen zoals voor Tabel 1).

20 In initiële metingen op de bovenstaande planten, werd er ook een significant verschil gevonden in de chlorofyl inhoud van bladeren van de homozygote compactplanten in vergelijking met de normale lange komkommer (voorbeeld Korinda), wat de donkerder groene kleur van de bladeren met het compactgen kan verklaren.

27

Voor de AFLP analyse is gebruik gemaakt van de veel gebruikte restrictie-enzyme combinatie EcoRI/Msel. De E van EcoRI en M van Msel staan in de naam van de merker beschreven, hetgeen algemeen in de literatuur wordt gedaan. De code die volgt op de E of de M correspondeert met de selectieve nucleotides aan het 3’ uiteinde van de EcoRI en 5 Msel primers; ook dit is standaard (zie de beschikbare lijst met AFLP codes op http://www.keygene.com/pdf/KF%20Primer%20enzyme%20combinations.pdf en http://wheat.pw.usda.gov/ggpages/keygeneAFLPs.html). Naast deze code is in de naam ook de grootte van de merker weergegeven. Bijvoorbeeld, E14/M61-M873.6 is een AFLP merker die met primers E14 en M61 een band van ongeveer 873.6 baseparen geeft bij 10 AFLP. Het dient opgemerkt te worden dat het gekend is in de stand van de techniek dat de grootte van de merker licht kan variëren afhankelijk van de gebruikte detectie technologie (radioactief versus fluorescent). Bovenstaande betekent dat een persoon met kennis van AFLP deze merkers kan reproduceren.

15 Voor de hier gebruikte AFLP merkers zijn dit de primer sequenties (met na de vertikale streep de 3’ selectieve nucleotides; de sequenties staan ook in de bijhorende sequentielijst): E17: 5’- GAC TGC GTA CCA ATT C|CG - 3’ (SEQ ID No. 1) 20 E24: 5’-GAC TGC GTA CCA ATT C|TC - 3’ (SEQ ID No. 2) E14: 5’-GAC TGC GTA CCA ATT C|AT-3’ (SEQ ID No. 3) E19: 5’-GAC TGC GTA CCA ATT C|GA-3’ (SEQ ID No. 4) E16: 5’-GAC TGC GTA CCA ATT C|CC-3’ (SEQ ID No. 5) M54: 5’- GAT GAG TCC TGA GTA A|CCT - 3’ (SEQ ID No. 6) 28 locus gekoppelde merkers. Op populaties van verdubbelde haploiden en inteelt-lijnen van de 4001 plant werden verschillende AFLP primercombinaties getest (256). Er werden echter geen nauw gekoppelde merkers geïdentificeerd binnen lange komkommer.

5 Vervolgens werd een merkeridentificatie opgezet voor het 4001 type in een andere achtergrond. Het compactgen is gelokaliseerd op één locus. Het gaat hier om een monogene eigenschap of - onwaarschijnlijk - om meerdere sterk gekoppelde genen.

Om het compactgen te fijnkarteren (merkers vinden op korte afstand van het locus) is de homozygote komkommer-compactplant gekruist met korte komkommer. Daar de 10 genetische afstand tussen augurk, korte komkommer en lange komkommer relatief groot is, zijn er meer merkers aanwezig in de nakomelingen van de kruisingen van lange komkommer met augurk of korte komkommer, in het gebied rond het compactgen. Hiervoor werden 126 F2 individuen getest na kruising in korte komkommer-achtergrond (zelfbestuiving van een F1 plant uit de kruising 4001 met ManarFl (een korte 15 komkommerras)). 128 verschillende AFLP primercombinaties werden gebruikt in een BSA screening. De in dit project geïdentificeerde merkers zijn nauwkeuriger in kaart gebracht door de merkers te testen op meer individuen van dezelfde populatie (632 F2 individuen (inteelt van F1 individu uit kruising 4001 x ManarFl)).

20 Na deze projecten om initiële merkers gekoppeld aan het 4001-locus te identificeren, werd een grote populatie bestaande uit 4180 individuen gescreend met 2 merkers (TaqMan® SNP genotyping assay, dit is high throughput) welke een gebied beslaan van ongeveer 12 cM met daarop het 4001 gen. Deze merkers zijn polymorf tussen lange en korte komkommer en kunnen in een kruising tussen lange en korte komkommer gebruikt 29 GC ATGC AT GG ACTG ACTT ACT AG A (primer MAS4-f, SEQ ID No. 11) GG AG ACT CAC AT AT CTTTCT G ACAC A (primer MAS4-r, SEQ ID No. 12)

Deze beide primers worden gebruikt in PCR, waarbij de volgende gelabelde probes toegevoegd worden: 5 VIC-CTAACTGCAAAAACAATGT (deze probe herkent het normaal type (zonder compactgen) en het normale (wildtype) allel in het heterozygote compactplanttype, SEQ ID No. 13), en FAM-AACTGCAAAAGCAATGT (deze probe herkent het heterozygote en het homozygote compactplanttype, SEQ ID No. 14).

10 MAS37: test met een andere flankerende merker (afgeleid van een AFLP merker): AGGATCACCTGATGTTCAAGGAGTA (primer MAS37-f, SEQ ID No. 15) CGATGATACAGTTGGAAGGATGGA (primer MAS37-r, SEQ ID No. 16)

Deze beide primers worden gebruikt in PCR, waarbij de volgende gelabelde probes 15 toegevoegd worden: VIC - TATGGACGACTTTCATGTAG (deze probe herkent het normaal type (zonder compactgen) en het normale (wildtype) allel in het heterozygote compactplanttype, SEQ ID No. 17) en FAM -TGGACGACTTTGATGTAG (deze probe herkent het heterozygote en het 20 homozygote compactplanttype, SEQ ID No. 18).

Detectie is aan de hand van de signalen van de probes zoals gekend in de stand van de techniek voor dit type assay.

Deze testen geven aan of het geteste DNA homozygoot wild-type, heterozygoot 30

Vervolgens is een BSA (Bulked Segregant Analysis) uitgevoerd op 4 pools met zeer kleine screeningsvensters van respectievelijk 2,0 cM en 2,4 cM om zowel cis (4001 type) als trans (normaal type) gekoppelde merkers te identificeren in het gebied van interesse. Er zijn in totaal 512 EcoRI/Msel AFLP primercombinaties uitgevoerd op de 4 5 pools.

De in de BSA geïdentificeerde kandidaat merkers zijn gekarteerd door Het genotype van de 137 nauwe recombinanten voor deze merkers te bepalen.

Alle scores zowel genotypisch als fenotypisch zijn geverifieerd op F3 individuen waaruit 10 F3 lijnscores werden verkregen wat een eenduidige F2 score geeft. Verificatie van het fenotype is uitgevoerd op een selectie van de 137 nauwe recombinanten. De selectie bestond uit 126 F3 lijntjes. De fenotypering is uitgevoerd op 15 individuen per F3 lijntje. Nadat het 4001 locus nauwkeurig was geplaatst zijn de merkerscores geverifieerd op 64 F3-lijntjes. Hiervoor werden 15 individuen per lijntje uitgezaaid. Hiervan is DNA 15 geïsoleerd en is het genotype van de 15 individuen per F3-lijntje bepaald voor de twee high throughput merkers. Na analyse van de verkregen genotypes zijn 4 individuen per F3-lijn geselecteerd (waarbij elke genetische klasse is vertegenwoordigd, dus zowel homozygoot 4001, heterozygoot 4001, en homozygoot normaal type). Op deze 64 x 4 individuen zijn alle nauw gekoppelde EcoRI/Msel AFLP merkers getest waaruit een 20 betrouwbaar F2 genotype voor de merkers afgeleid kon worden zodat de recombinaties nauwkeurig in kaart gebracht konden worden.

Voor sommige merkers zijn om een eenduidige score te verkrijgen nog eens 12 individuele planten van de F3-lijn voor deze merkers gegenotypeerd.

31 flankerende merker E19/M50 M280.2 ligt in deze populatie op 0,67 cM van het compactlocus. Deze merkers zijn niet polymorf binnen lange komkommer.

32

Literatuurlijst -Boonekamp (2006), Groenten & Fruit, week 31, p. 19 -“CPVO Protocol”: Protocol for Distinctness, Uniformity and Stability Tests, Cucumber, 5 Cucumis sativus L. European Union, Community Plant Variety Office, Boulevard

Maréchal Foch, FR - 49021, Angers Cedex 02. Document CPVO-TP/61/1, adopted on 27/03/2002. Ook beschikbaar op: http://www.cpvo.europa.eu, zoals op: http://www.cpvo.europa.eu/documents/TP/vegetales/TP_061_CUCUMIS_SATIVUS.pdf 10 -Gémes-Juhasz, A. et al. (2002): “Effect of optimum stage of female gametophyte and heat treatment on in vitro gynogenesis induction in cucumber (Cucumis sativus L.)”. Plant Cell Reports, 2002, Vol. 21 (2): 105-111 -Goode et al. (1980) Arkansas Farm Res. 29(3):4).

15 -Honkoop (2006), Groenten & Fruit, week 38, p. 6-7 -Scheffe, H (1953): “A Method forjudging all contrasts in the Analysis of Variance”. Biometrika (1953) 40 (1-2): 87-110.

20 -Scheffe, H (1959): “The Analysis of Variance” , John Wiley, New York.

-Schultheis et al. (1998, Can. J. Plant Sci. 78:333-340).

U · * « * < ««««««*** ««co co««« « 4 - X........*........ Z * * * c _ (Q ---------------------------- o ^ ,5£ μ m f*m m sr * * * * * «««*««««« ««« «««« « « E ε z................. ....

5>§-------------------------- (Λ X « « « « CO «««*««««« *«« *««« CO « ^ * * * * z ********* * * * * * * * Z * i? (O (M 2 N N CN MIOttlSmmMO O) N OÜ 00)0)05

Γ Λ O) " CM IC 00 03 N S q . - Ί (D ΙΟ IO ll) CO CO CM CM

^ s cd Ji c\i <\Ιινν0§^γμ^ d d d dodo (Λ---------------------------- ί 1- O ID N O) O O-q-^SSScNO N (O CO CO CO ♦ t S) O II) CO O) CM t*· -cJ-COCOqHHoM- m; o o co co cm cm o co iri os d d cvi c\i c\i 0· f3 f2 -r-'t-' odd o' d d d z E CM M O W S O)MfCoKÏ|’'SCMC0 ,, ,, (O N CO CM i; Or- J β S O O «) CO COCODfcoroNCO ' N K (O CO J. 00 00 O -*o n S' o._________________________ E — Q öl

Q .£ M O Q CO IO O CO (Λ IO lO ιΛ ιΛ Q ΙΛ O

^ ® g - cocdcno S S s s s £ ° ^(oor^^ScMN N- fs». h~. N· 2; 10

5 ί ° CO ^ CM CMCJCM ^ScOOJ CO CV r y- 1- CM

Ji Φ 7 8; z E CM CO >- O CO Oio’tNSipoi'-lM .. O CM JO O ïl 1005 0 ξ O) CO Φ CO O) CO OOOOOw^SOlOO 1 2 3 '· co co N N J 03 00 115= s —-----------------------— e == P g h- g nSSSj^^So cncoino co g o S ® 8 1 &SSg-- ^d.cd Sï5 Λ

^ I | 8 8 8 ^ }2 Sqg°g^Sg5 ,B aio ® f [; ® S

0 2“ CM ? ^ ^ 5 co rf LO in TT Tt CN rsi -r-

2 .O

Ό

c iS

:Φ ^ ^ Λ ? © ω o E O U =- CM 1_ Jj 0) co cn τι π 3 s * all I - cm s cn CC lg ·® -® -ï w ^ ^ ? :Q5 :Q) 3)0505 £ Ό T) i? iS φ

g :=. 3 =5 Έ - CM E S S ® — - £ £ E

5 nosoo ^ w 2 . f 2 S o .o -Q c c £·> 2 _ Γ" CC ^ Μ Ό ^ — O O C c C O O — É r E u ); s t) o « ® ® 3 o ra o o e 2 05 E u B " ^ ï B π ^ S ~ T, 2 £ jc jc o) 3 ra cn n .£.£ m m φ o) <= -c= -c= cd ra® Ώ .* jé φ ω c — * ciÉ ® ® ra ra S ·» ra ® ® ® S E -ï o ® ® ra ra c c raa®®OOT30)® 3 £ = « ra ra ® ® o | 01

pccmm CC®® -=C0CDC® O — Ö 2 CC®®— £ C

ra ® ® rara ®®EE25S®E ° .£ E E ® ® E E 2 S®

r -O E S

! 5 8 § 0. O δ >

t É E E E EEEE ppEE E E E E t E

giö ϋ0υ2Σ u uooc0ooou >>>> 0000,5 «o ΙΛ 5 2 2 2 2 2 2 2 o m' 2 2 2 2 2 2 5 2 £ ? E E E S rarararararara^g1 § § §> a S ? ? ? o 3 = 3« cocdcdcd® TOrorororoTOroren> ra ra ra $ cocococdco co ij _j Qg ^ ® ® S co CO COOOCOCOCOCO®® 05050)00 ® ® ® ® ® ® ® W _ _________________________ 3 a ® 2 ® "o cn cn 3® co h- 2? 3 ^ O o [?M*1 Rj rri fil 2- oöö o o o o

(Q

S ^ < > o o __o__________________________ g cocororo rtnnrtNNCDN co co co co ra o.

£ o υ in 10 co co inminintDsco® in en oj c\i rara k» · · < · I t I I III II II ^ 3 ^ CO r* r- ^ ^ Ί· Tf Tj* CO CO CO t- Q. =

S ? o S

^ rf CD

g» _______________________Q__ e ti CD lO S S 0CDCD<DlDlDli)lO CO CO COCM Q) “ 5 I I I I I I I I III II l| #— /5 (tl o IT) r- ^ί“ Tf TT Tj- CO CO CO ^ ^ «“ C c E * § ® — <3 .Ω 3 ________________________h-__

m ra CO N N N SSNSlOCOlOlO CO CO

ra g ά eh eh -g -g 3· E ™ λ -c — co o o co *: e :® - O © E o >-

Φ (Λ ^ D

= :N I I

£ i ^ :© 5=·^· 2j O© g <D :r 3 Ό g -g © © — -P « C -© © O § co -Ï O -9n ©

I sitf 1 11 5 II I

* ISS* fisSlfl? ss sa I

© en en g en© o en © ^ SR = en © 5 en o o c c s c©ocog©— e © ge o en .© co_— -Q en -© .o ,e .£ -e_© .q_ σι ©__>___ e Ό E £ m ra © o SS = 0 3 _ O.__m___ ___m >__

Is e| o«§ >>>>>>>>>>>>> >> >> co £ Q. © CO -g CM on ° ID (O N ® O o 1 . -------------------------1--- CM Γ -) ω 00

H _Mil 1_LJ_Μ Μ Μ Μ Μ 1_LI

m o 2000992'

Claims (25)

1. Een komkommerplant, welke plant in het genoom het compactgen bevat 5 waardoor, als gevolg van de expressie van dit compactgen, deze plant van het gangbare komkommerplanttype verschilt door de combinatie van de volgende fenotypische kenmerken: kortere zij scheut, kortere intemodiën, kleiner blad, kleinere bloemen en kortere vruchten.

2. De plant van conclusie 1, waarin de expressie van het compactgen gekarakteriseerd is door de volgende eigenschappen in planten homozygoot voor het compactgen: a) de bladschijfgrootte van het tiende echte blad van planten met het compactgen op 39 dagen na zaai is hoogstens 50 % van de bladschijfgrootte van planten van het gangbare komkommerplanttype op 39 dagen na zaai, en b) de 15 grootste breedte van de kroonbladeren op 39 dagen na zaai van planten met het compactgen is hoogstens 75 % van de grootste breedte van de kroonbladeren van planten van het gangbare komkommerplanttype op 39 dagen na zaai, en c) de lengte van de zij scheut op 56 dagen na zaai van planten met het compactgen is hoogstens 60 % van de lengte van de zij scheut op 56 dagen na zaai bij planten 20 van het gangbare komkommerplanttype, en d) het aantal intemodiën op de zij scheut op 56 dagen na zaai van planten met het compactgen is hoogstens 70 % van het aantal intemodiën op de zij scheut op 56 dagen na zaai bij planten van het gangbare komkommerplanttype.

3. De plant van een van de vorige conclusies, waardoor, als gevolg van de expressie van het compactgen, deze plant van het gangbare komkommerplanttype verschilt door de combinatie van de volgende fenotypische kenmerken: tragere groei, kortere zij scheuten, kortere intemodiën, kleiner blad, horizontaler blad, donkerder groen blad, brosser blad, kleinere bloem en kortere, lichtere vruchten. 30 2000992*

4. De plant van een van de vorige conclusies, waarin de fenotypische kenmerken van het compactgen monogeen, intermediair overerven en het sterkst tot uiting komen in het fenotype als het compactgen in homozygote toestand is.

5 E14/M61 M873.6, E19/M50_M280.2, E24/M49_M211.5, E17/M54_M 179.0, E16/M47 M426.1, E16/M47_M411.0, of E16/M47 M402.9, of ervan afgeleide merkers.

5. De plant van een van de vorige conclusies die het compactgen bevat, waarbij de planten van het gangbare komkommertype waarmee deze planten vergeleken worden deze ongeveer 25 % van de planten zijn zonder compacte groei in een 1:2:1 uitsplitsende populatie na zelfbevruchting van een plant heterozygoot voor het compactgen, of deze ongeveer 50 % van de planten zonder compacte groei 10 bekomen na verdubbelde haploide productie van een plant heterozygoot voor het compactgen.

6. De plant van conclusie 5 waarbij waarbij de planten van het gangbare komkommertype planten van het ras Korinda of Sabrina zijn. 15

7. De plant van een van de vorige conclusies die behoort tot het type lange komkommer.

8. De plant van een van de vorige conclusies, waarbij, als gevolg van de 20 heterozygote aanwezigheid van het compactgen, de nateelt bij zelfbevruchting een uitsplitsende populatie oplevert waarin, in de verhouding van ongeveer 1:2:1 planten van het gangbare lange komkommertype, planten van het heterozygote, intermediaire type en compact groeiende planten die homozygoot zijn voor het compactgen voorkomen; of die plant die uitsplitst in ongeveer 50 % planten van 25 het gangbare komkommertype en ongeveer 50 % compact groeiende planten die homozygoot zijn voor het compactgen na verdubbelde haploiden productie van de plant heterozygoot voor het compactgen.

9. De plant van een van de vorige conclusies, waarin de aanwezigheid van het 30 compactgen kan worden aangetoond door deze plant te kruisen met planten van het gewas augurk of korte komkommer, en de Fl- planten voortkomende uit deze kruising te analyseren met behulp van de AFLP methode en het gebruik van tenminste één van de merkers E14/M61M873.6, E19/M50M280.2, E24/M49M211.5, E17/M54_M 179.0, E16/M47_M426.1, E16/M47_M4l 1.0, of E16/M47 M402.9, of ervan afgeleide merkers die het compactgen flankeren, en 5 waarbij er in de uitsplitsende F2 populatie van die zelfbevruchte F1-planten waarin het compactgen is aangetoond, een cosegregatie is van de compacteigenschappen met tenminste een van deze AFLP merkers.

10 E19/M50_M280.2, of ervan afgeleide merkers, het compactgen flankeren in een kruising met korte komkommer.

10. De plant van conclusie 9, waarin AFLP merkers E14/M61M873.6 en

11. De plant van een van de vorige conclusies, waarbij deze plant afleidbaar is van de zaden gedeponeerd onder depotnummer NCIMB 41266. 15

12. De plant van een van de vorige conclusies, waarbij het compactgen dat gen is dat geflankeerd is door de AFLP merkers E14/M61_M873.6 en E19/M50M280.2 in een kruising van de planten gegroeid uit de zaden van depotnummer NCIMB 41266 met korte komkommer of augurk. 20

13. De plant van conclusie 10 of 12 waarin de kruising is met korte komkommer Manar Fl.

14. Zaden, cellen of weefsels van de plant van een van de vorige conclusies, welke 25 het compactgen bevatten in hun genoom.

15. De planten opgekweekt uit de zaden, cellen of weefsels van conclusie 14.

16. Een methode om een plant van een van conclusies 1 tot 13 te kruisen met andere 30 komkommerplanten met het oogmerk het compactgen in te kruisen in een andere plant van de soort Cucumis sativus, waarbij selectie gedaan wordt door tenminste een polymorfe ALFP merker die het compactgen flankeert in een kruising met korte komkommer of augurk.

17. De methode van conclusie 16, waarbij de AFLP merkers gekozen zijn uit:

18. De plant van een van conclusies 1 tot 13 die een hybride plant is. 10

19. Een methode om van een plant van een van de conclusies 1 tot 13, zaad van hybride planten te produceren, in welke hybriden het compactgen heterozygoot aanwezig is, welke methode gebruik maakt van in vitro celcultuur.

20 E16/M47 M426.1, E16/M47_M411.0, of E16/M47_M402.9, of ervan afgeleide merkers, de aanwezigheid van het compactgen in planten, vruchten, zaden, plantweefsel of plantencellen te volgen in verschillende stadia van een veredelingsproces voor komkommer.

20. De cellen, vruchten of zaden van de hybride plant van conclusie 18, die het compactgen bevatten.

21. Een methode om met behulp van tenminste een van de AFLP merkers E14/M61M873.6, E19/M50_M280.2, E24/M49_M211.5, E17/M54_M 179.0,

22. Een methode om met behulp van tenminste een van de AFLP merkers E14/M61_M873.6, E19/M50M280.2, E24/M49_M211.5, E17/M54_M 179.0, E16/M47_M426.1, E16/M47_M411.0, of E16/M47_M402.9, of ervan afgeleide merkers, de aanwezigheid van het compactgen in biologisch materiaal afgeleid van planten, zaden, cellen of weefsel van komkommer te volgen. 30

23. Een methode voor het oogsten van komkommervruchten, gebruik makende van een oogstrobot, waarin de komkommervruchten groeien op de planten van een van de conclusies 1 tot 13.

24. Een technische methode voor het groeien van komkommerplanten in een hogedraadteelt op een minder arbeidsintensieve manier, waarbij de komkommerplanten de planten van een van de conclusies 1 tot 13 zijn.

25. De methode van conclusie 24, waarbij minstens 20 % meer stengels per m2 10 aangehouden worden dan in de teelt van het gangbare komkommertype. 2000992* 6018565NLSQL.txt SEQUENCE LISTING <110> Nunhems BV <120> Nieuwe komkommerplanten met compacte groeiwijze <130> BCS 05-2006 <160> 18 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer E17 <400> 1 gactgcgtac caattccg 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer E24 <400> 2 gactgcgtac caattctc 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer E14 <400> 3 gactgcgtac caattcat 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer E19 <400> 4 gactgcgtac caattcga 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer E16 <400> 5 Pagi na 1 6018565NLSQL.txt gactgcgtac caattccc 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <22B> primer M54 <400> 6 gatgagtcct gagtaacct 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer M49 <400> 7 gatgagtcct gagtaacag 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer M61 <400> 8 gatgagtcct gagtaactg 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer M50 <400> 9 gatgagtcct gagtaacat 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer M47 <400> 10 gatgagtcct gagtaacaa 19 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> Pagina 2 6018565NLSQL.txt <223> MAS4-f primer <400> 11 gcatgcatgg actgacttac taga 24 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MA54-r primer <400> 12 ggagactcac atatctttct gacaca 26 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MAS4 - VIC probe <400> 13 ctaactgcaa aaacaatgt 19 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MAS4 - FAM probe <400> 14 aactgcaaaa gcaatgt 17 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MAS37-f primer <400> 15 aggatcacct gatgttcaag gagta 25 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MAS37-r primer <400> 16 cgatgataca gttggaagga tgga 24 <210> 17 <211> 20 <212> DNA Pagina 3 6018565NLSQL.txt <213> Artificial <220> <223> MAS37 - VIC probe <400> 17 tatggacgac tttcatgtag 20 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MAS37 - FAM probe <400> 18 tggacgactt tgatgtag 18 Pagi na 4